Bactéries anaérobies oxydantes de l’ammonium : des

micro-organismes uniques aux propriétés exceptionnelles

INTRODUCTION :

Des années 1940 aux années 1970, plusieurs études ont indiqué qu'il
manquait dans la nature un microbe capable d'oxyder de manière anaérobie
l'ammonium, avec du nitrate ou du nitrite, en diazote gazeux et que le cycle de
l’azote, contenait donc plus de réactions qu'on ne le savait à l'époque (8,29 ,73).
Cette hypothèse était basée sur des observations sur le terrain selon lesquelles
beaucoup moins d'ammonium s'accumulait dans les plans d'eau anoxiques que
ce que la stœchiométrie et les calculs thermodynamiques de Redfield
prévoyaient. Au début des années 1990, les premières indications
expérimentales de ce procédé ont été obtenues lorsqu'on a découvert que
l'ammonium était converti en diazote gazeux aux dépens du nitrate dans un
bioréacteur anoxique à lit fluidisé de l'usine de levure Gist-Brocades aux
PaysBas.

Les bactéries Anammox ne se conforment pas aux caractéristiques typiques des

bactéries mais partagent plutôt des caractéristiques avec les trois domaines de la
vie, Bactéries, Archées, et Eucarya, ce qui les rend extrêmement intéressants
d'un point de vue évolutif. En outre, les bactéries anammox se sont révélées d'un
grand intérêt en raison de leur métabolisme inhabituel et de leur importance
dans les domaines de l'épuration des eaux usées et de l'écologie microbienne.

 Qu’est-ce qu’un cycle d’azote ?

 Comment ce fait l’oxydation anaérobie de l’ammonium par les
bactéries « ANAMMOX » ?
 Quel est l’effet de ces bactéries ?
 Chapitre 1 : cycle d’azote

Le cycle de l’azote est un cycle biogéochimique qui correspond à l’ensemble

des échanges d’azote sur la planète. Le diazote est le plus abondant des gaz
atmosphériques (l'air contient 78% de ce gaz). L'azote est essentiel au
fonctionnement des êtres vivants. Il sert notamment à fabriquer des protéines et
à produire les bases azotées présentes dans l'ADN. Il ne peut toutefois pas être
assimilé directement sous cette forme par la majorité des vivants. Ce sont des
bactéries qui transforment l'azote de l'atmosphère en une forme assimilable par
les autres organismes vivants. C'est grâce à son cycle biogéochimique que
l'azote peut passer d'une forme à une autre.

Le cycle de l'azote est un processus biogéochimique complexe et essentiel

qui régule la disponibilité de l'azote, un élément vital, dans les écosystèmes
terrestres et aquatiques. Ce cycle implique plusieurs étapes interconnectées,
débutant par la fixation de l'azote atmosphérique par des microorganismes tels
que les bactéries fixatrices d'azote, qui le convertissent en ammoniac (NH3) ou
en nitrate (NO3-), des formes utilisables par les plantes. Les plantes absorbent
ensuite ces composés azotés du sol par leurs racines, les incorporant dans leurs
tissus lors du processus d'assimilation. Les consommateurs primaires et les
décomposeurs, tels que les herbivores et les bactéries, consomment les plantes et
les débris végétaux, respectivement, libérant ainsi de l'azote organique sous
forme de composés tels que les protéines et les acides aminés. Ceux-ci sont
ensuite dégradés en ammonium (NH4+) par les microorganismes décomposeurs
dans le sol, puis convertis en nitrate par un processus appelé nitrification. Le
nitrate peut être absorbé à nouveau par les plantes ou percoler dans les eaux
souterraines. La dénitrification, un processus réalisé par des bactéries
anaérobies, convertit le nitrate en azote gazeux (N2), le renvoyant dans
l'atmosphère et complétant ainsi le cycle. Ce cycle complexe est essentiel pour
maintenir la fertilité des sols, la productivité des écosystèmes et la qualité de
l'eau. Cependant, les activités humaines telles que l'agriculture intensive et
l'utilisation excessive d'engrais azotés ont perturbé ce cycle, entraînant des
problèmes tels que la pollution de l'eau et la perte de biodiversité. Ainsi,
comprendre et gérer le cycle de l'azote est crucial pour assurer la durabilité des
écosystèmes et des sociétés humaines. Donc :
  Quelles sont les étapes du cycle d’azote ?
 Quels sont les éffets de la polution azotéé sur les écosystèmes
terrestres et aquatiques ?

I. Les étapes du cycle d’azote :

1. La fixation de l’azote :
a) Fixation photochimique :

La fixation photochimique par l'orage est un processus complexe et fascinant qui

implique l'interaction entre l'azote atmosphérique (N2) et les éclairs pendant les
tempêtes. Lorsque la foudre frappe, elle génère des températures et des pressions
extrêmement élevées, provoquant la dissociation de l'azote moléculaire (N2) en
atomes d'azote (N). Ces atomes d'azote réactifs peuvent ensuite réagir avec l'oxygène
(O2) pour former de l'oxyde nitrique (NO), qui réagit ensuite avec l'oxygène
atmosphérique pour former du dioxyde d'azote (NO2).
 Le dioxyde d'azote peut alors réagir avec l'eau de pluie pour former de l'acide
nitrique (HNO3), qui est ensuite déposé au sol sous forme de précipitations. Une fois
dans le sol, l'acide nitrique peut être utilisé par les plantes comme source d'azote,
favorisant ainsi leur croissance.

Ce processus joue un rôle essentiel dans le cycle de l'azote en fournissant une

source d'azote disponible pour les écosystèmes terrestres. Il est également important
dans le contexte de la pollution de l'air et de la qualité de l'eau, car il peut contribuer à
l'acidification des sols et des eaux de surface.

b) Fixation biologique :

Bien qu'environ 80 % de l'atmosphère terrestre soit composée d'azote, il est trop

stable pour que la plupart des plantes et des animaux se décomposent. Mais c'est là
que les microbes entrent en jeu. Les bactéries du sol fixent l'azote. Cela signifie qu'ils
le combinent avec de l'oxygène ou de l'hydrogène en composés que les plantes
peuvent utiliser. Certains microbes fixateurs d'azote ont même développé une relation
symbiotique avec certaines plantes, comme les pois et les haricots. L'azote entre dans
la chaîne alimentaire du fait que les microbes le prennent de l'air et le convertissent
en un composé plus accessible - comme l'ammoniac - que les plantes peuvent ensuite
absorber.

Ces bactéries fixatrices d'azote vivent souvent dans les racines des légumineuses
- comme les plants de haricots - et les plants de haricots sont très intelligents. Ils
envoient des poils de leurs racines qui suivent ces bactéries. Et les bactéries
s'installent essentiellement dans les racines de ces plantes.

Ces bactéries sont incorporées dans les nodules racinaires et dans ces maisons
protectrices spéciales, les bactéries travaillent de manière anaérobie pour fixer l'azote
dans l'ammoniac, en utilisant une enzyme spéciale appelée azotée - qui combine
l'hydrogène et l'azote.
 2. L’ammonification :

MO NH4
Les organismes hétérotrophes notamment les bactéries et certains
champignons convertissent la matière organique en ammonium NH4.

L'ammonification est un processus biologique crucial dans le cycle de l'azote, où

les composés azotés organiques sont décomposés en ammonium (NH4+), une forme
d'azote utilisable par les plantes. Ce processus est principalement effectué par des
microorganismes tels que les bactéries et les champignons présents dans le sol.
Lorsque les matières organiques telles que les feuilles mortes, les débris végétaux et
les excréments d'animaux se décomposent, les protéines et autres composés azotés
sont dégradés en ammonium par des enzymes produites par les microorganismes
décomposeurs. L'ammonium ainsi libéré peut être absorbé par les plantes et utilisé
pour la synthèse de protéines, de chlorophylle et d'autres composés nécessaires à leur
croissance et à leur développement. Ce processus est essentiel pour maintenir la
fertilité du sol et assurer la disponibilité de l'azote pour les organismes vivants dans
les écosystèmes terrestres. De plus, l'ammonification contribue à la décomposition
des déchets organiques et à la libération d'éléments nutritifs essentiels dans le sol,
favorisant ainsi la santé et la productivité des écosystèmes.

L'urée, un composé organique couramment présent dans l'urine des mammifères

et utilisé comme engrais dans l'agriculture, joue un rôle important dans le cycle de
l'azote. Lorsque l'urée est introduite dans le sol, elle devient disponible pour les
microorganismes du sol. Certains de ces microorganismes possèdent des enzymes
appelées uréases, qui catalysent la dégradation de l'urée en ammonium (NH4+), une
forme d'azote minéral. Ce processus est connu sous le nom d'ammonification de
l'urée.

L'ammonification de l'urée est un élément clé du cycle de l'azote dans les sols
agricoles et naturels. L'ammonium ainsi produit est rapidement disponible pour les
plantes comme source d'azote, un élément essentiel à leur croissance et à leur
développement. Les plantes absorbent l'ammonium par leurs racines et l'utilisent pour
synthétiser des protéines, des acides aminés et d'autres composés organiques
nécessaires à leur métabolisme.
 Le processus d'ammonification de l'urée est influencé par divers facteurs
environnementaux, tels que la température du sol, le pH et la disponibilité en
oxygène. Par exemple, les conditions de sol chaudes et humides favorisent
généralement une activité enzymatique plus élevée, accélérant ainsi la dégradation de
l'urée en ammonium. De plus, la disponibilité en uréase dans le sol peut être affectée
par les pratiques agricoles, telles que l'apport d'engrais ou la gestion des cultures.

3. La nitrification :

C’est la transformation de l’azote de l’ammonium (NH4) en nitrites (NO2)

puis en nitrates (NO3).

Elle se fait par les bactéries nitrifiantes dans les sols et dans l’eau.

La nitrification est la transformation de l'azote, avec passage en de l'ammoniac

et de ses sels en nitrates, se faisant en deux phases : nitrosation (ou nitritation) et
nitratation. Cette double phase suit l'ammonification dans le cycle de l'azote, mais
précède la phase de dénitrification. La nitrification existe aussi dans un sol agricole
terrestre que dans les substrats de milieu aquatique : il faut que les bactéries
nitrifiantes puissent se fixer sur un substrat.
La nitrification est l'oxydation bactérienne de l'ammoniac NH3 ou des ions
ammonium NH4- pour former du nitrate NO3-. Elle se compose de deux sous-
processus couplés : dans la première partie, l'ammoniac est oxydé en nitrite, qui est
oxydé en nitrate dans le deuxième sous-processus.

L'oxydation de l'ammonium en nitrite et l'oxydation ultérieure en nitrate sont

effectuées par deux espèces de bactéries nitrifiantes. La première étape est faite
par des bactéries des genres microbiologiques Nitrosomonas et Nitrosococcus
(entre autres). La deuxième étape (oxydation du nitrite en nitrate) est réalisée
principalement par des bactéries du genre Nitrobacter. Dans les deux étapes,
l'énergie produite est destinée à la synthèse de l'ATP. Ces micro-organismes
nitrifiants sont chimio-autotrophes et utilisent le dioxyde de carbone comme source
de carbone pour leur croissance.

 Les bactéries nitrifiantes sont les principaux acteurs de la

nitrification.

La nitrification joue un rôle important dans l'élimination de l'azote organique

des eaux usées, généralement par le biais de cette nitrification bactérienne suivie
d'une dénitrification. Le coût de ce processus réside principalement dans l'aération
(apport d'oxygène dans le réacteur) et l'ajout d'une source externe de carbone (par
exemple du méthanol) pour la dénitrification.

Dans de nombreux environnements, les deux organismes sont ensemble,

donnant du nitrate comme produit final. Cependant, il est possible de concevoir des
systèmes dans lesquels le nitrite est formé de manière sélective (processus de
Sharon).

Parallèlement à l'ammonification, la nitrification fait partie du processus de

minéralisation, qui fait référence à la décomposition complète de la matière
organique, avec libération de composés azotés disponibles pour les légumes
(formes minérales et non organiques). Ceci termine le cycle de l'azote.
 4. La dénitrification :

C’est le retour de l’azote organique (NO3) en azote gazeux (N2) libéré dans
l’atmosphère. Elle se fait par des bactéries dénitrifiantes anaérobies
(Pseudomonas,…).

La dénitrification est l'action de dénitrifier, c'est à dire une réduction des

ions nitrates NO3- en ions ammonium NH4+ ou en azote gazeux N2 par les
bactéries dénitrifiantes ou des organismes dénitrifiants.

Par dénitrification, on entend la conversion de l'azote lié dans le nitrate

en azote moléculaire NO2 gazeux et en oxydes d'azote, par certaines
bactéries hétérotrophes et certaines bactéries autotrophes, dénommées par
conséquent bactéries dénitrifiantes.

Pour l'azote, c'est l'une des phases essentielles du cycle de l'azote, on

l'appelle parfois, sous la forme d'une respiration anaérobie, la respiration
nitrate. La dénitrification suit la phase de nitrification dans le cycle de l'azote.
Elle se passe essentiellement en milieu anaérobie, à une concentration
d'oxygène moléculaire (dioxygène) O2 inférieure à 0,2 mg/l. Le processus est
lié aux membranes des bactéries, au cours desquelles l'énergie est
conservée sous la forme d'une différence de concentration en protons entre
les espaces séparés par la membrane.

Le processus sert les bactéries pour la production d'énergie. Dans ce

cas, en l'absence d'oxygène moléculaire O2 (conditions anoxiques ou
anaérobies) et de diverses substances oxydables (donneurs d'électrons),
telles que les substances organiques, sulfure d'hydrogène H2S et hydrogène
moléculaire H2, oxydées avec nitrate comme oxydant.
 II. Les éffets de la polution azotéé sur les écosystèmes terrestres et
aquatiques :

L'azote est un élément clé du vivant puisqu'il est constitutif des protéines. Sous
différentes formes, l’azote peut contribuer à la production des particules fines et à
l'acidification des eaux (ammoniac), à leur eutrophisation (nitrates), au réchauffement
climatique et à la destruction de la couche d’ozone (protoxyde d’azote). l'azote peut
également générer plusieurs formes de pollutions :

La volatilisation de l'ammoniac : l'ammoniac est un gaz polluant précurseur de

particules fines, Il contribue également à l’acidification des eaux.

Le lessivage des nitrates : l'excès de nitrates dans les eaux conduit au

phénomène d'eutrophisation. Les nitrates ingérés en trop grande quantité présentent
également un risque de toxicité sur la santé humaine.

la production de protoxyde d’azote (N2O):puissant gaz à effet de serre (300

fois le potentiel de réchauffement global du gaz carbonique), est liée aux cycles
biologiques de l'azote et aux phénomènes de volatilisation de l'ammoniac et de
lessivage des nitrates. Il est également responsable de la réduction de la couche
d’ozone.

 Ammoniac (NH3) :

Le NH3 réagit avec certaines molécules acides présentes dans l’air (oxyde
d’azote, oxyde de soufre) pour former des particules fines de sulfate d’ammonium ou
de nitrate. Ces particules ont des effets encore peu estimés, mais préoccupants, à la
fois sur la santé humaine en provoquant des maladies respiratoires ou
cardiovasculaires (environ 48 000 morts par an selon Santé Publique France (ANSP)
en France), sur la santé des animaux d’élevage et sur l’équilibre des écosystèmes.

Il fait également l’objet d’une redéposition au sol sous forme sèche et humide, et
est donc susceptible d’être un précurseur de NO3 et N2O. En outre, le NH3 provoque
une acidification du milieu où il est redéposé.
 Nitrates (NO3) :

Les nitrates se présentent essentiellement sous forme dissoute dans l’eau.

Lorsqu’ils ne sont pas captés par les cultures, ils peuvent atteindre les cours d’eaux
lors d’un lessivage par l’eau de pluie, et par le biais des écoulements de surface.
Ils peuvent ainsi provoquer un phénomène d’eutrophisation, c'est-à-dire une
accumulation de nutriments qui favorise un développement excessif de la végétation
et entraine une modification de l'écosystème. Cet enrichissement en azote provoque
une disparition des espèces adaptées aux faibles concentrations en azote, au profit des
espèces pouvant s’accommoder de ces fortes concentrations.
L’eutrophisation provoque donc une perte de biodiversité. Elle peut également
compromettre la pêche, la pisciculture, la baignade, ou augmenter le coût de la
potabilisation. Les nitrates et nitrites ingérés en trop grande quantité présentent
également un risque de toxicité sur la santé humaine bien que les effets soient
complexes.

 Protoxyde d’azote (N2O) :

Le protoxyde d’azote (N2O) est un gaz à effet de serre, dont le pouvoir
réchauffant global est d’environ 300 fois celui du CO2. Il a également un impact
important sur la couche d’ozone : le N2O est aujourd’hui l’élément provoquant la
plus forte dégradation de la couche d’ozone.

On estime qu’en 2017 en France 87% du N2O sont émis par l’agriculture. Cette
proportion était de 59% en 1990, mais les émissions de N2O provenant de
l'agriculture n'ont pas diminué, contrairement aux autres secteurs.
 Chapitre 2 : ANAMMOX

I. Introduction :

Depuis leur découverte dans les années 1990, les bactéries anammox ont été
trouvées dans de nombreux environnements différents, tels que les stations
d'épuration des eaux usées, des lacs, zones suboxiques marines et les sédiments
côtiers. Les bactéries Anammox sont des acteurs clés du cycle de l’azote , où ils se
sont révélés être une source majeure de diazote gazeux à l'échelle mondiale .La
contribution des bactéries anammox a été étudiée dans toutes les principales zones de
minimum d'oxygène (OMZ) de l'océan (mer Noire, OMZ chilienne et péruvienne,
OMZ namibienne et mer d'Oman) qui contribuent de manière significative à la perte
d'azote fixe de l'océan .Dans toutes ces études, le processus anammox était la
principale voie de perte d'azote fixe, comme l'ont démontré les mesures d'isotopes
stables, les lipides ladderane, la fluorescencesur place hybridation (FISH) et PCR
quantitative (qPCR) de gènes fonctionnels .Jusqu'à présent, la capacité d'anammox
est limitée à un groupe très spécifique deBrocadales(voir ci-dessous), tandis que la
dénitrification se produit chez les bactéries, les archées et même les eucaryotes . En
général, les écosystèmes avec des donneurs d'électrons organiques excédentaires
favoriseront les processus de dénitrification et de réduction dissimilatrice des nitrates
en ammoniac, tandis que les systèmes oligotrophes avec de faibles concentrations
d'oxygène mais avec un apport suffisant d'ammonium provenant de la minéralisation
anaérobie stimuleront très probablement le processus anammox. Les bactéries
Anammox ont également été utilisées dans le traitement des eaux usées pour éliminer
l'ammonium.
 Quelle est la structure ,le métabolisme et la division cellulaire des
bactéries ANAMMOX ?
 Où trouve –t-on les bactéries ANAMMOX ?et quelles sont les
conditions qui favorisent leur croissance ?
 Quel est leur rôle dans le cycle d’azote ?
 Comment les bactéries ANAMMOX réalisent l’oxydation de
l’ammonium sans besoin d’oxygène ?et quelles sont les mécanismes
moléculaire impliqués ?
  Comment les bactéries ANAMMOX pourraient-elles utilisées dans le
traitement des eaux usées et la dépollution des environnements
contaminés par l'azote ?

II. Biologie des ANAMMOX :

1) Structure et division cellulaire :
a. Structure cellulaire :
Les bactéries Anammox sont des bactéries coccoïdes d'un diamètre moyen
compris entre 800 et 1 100 nm (97). Ce sont des chimiolithoautotrophes anaérobies et
sont donc physiologiquement distincts des autres espèces connues.Planctomycètes.
Les bactéries Anammox utilisent le nitrite comme accepteur d'électrons pour former
du diazote gazeux comme produit final (91). L’hydrazine (N), un « carburant de fusée
» hautement toxique2H4) et l'oxyde nitrique (NO) sont les deux intermédiaires de ce
processus (40, 74,75, 87,91). La fixation du carbone s'effectue par la voie de
l'acétylcoenzyme A (CoA) (80,89). La réaction catabolique anammox est effectuée
15 fois pour fixer 1 molécule de
Dioxyde de carbone avec du nitrite comme donneur d'électrons, conduisant à la
production anaérobie de nitrate dans l'anabolisme (15,87).
À côté de l'ammonium, des composés organiques et inorganiques peuvent être
utilisés comme donneurs d'électrons alternatifs, par exemple le propionate, l'acétate et
le formiate par «CandidatKuenenia stuttgartiens », «Candidat Anammoxoglobus
propionicus », «CandidatScalindua" spp., et "CandidatBrocadia”spp.; méthylamines
par «Candidat Brocadia fulgida » ; ainsi que le fer ferreux par «CandidatKuenenia
stuttgartiens” (41,42,89,96).
Au moins pour "CandidatKuenenia stuttgartiens » et «CandidatScalindua” spp.,
il a été démontré qu’outre les nitrites, les oxydes de fer et demanganèse peuvent
également être utilisé comme accepteur d'électrons (89,96). De plus, une pénurie
d’ammonium peut être surmontée par la réduction dissimulatoire du nitrate en
ammonium (DNRA) par «CandidatKuenenia stuttgartiens » et «CandidatScalindua”
spp. en utilisant le formiate comme donneur d'électrons (39,96).

b. Division cellulaire :

Les bactéries Anammox se divisent par fission binaire constrictive (98),

contrairement aux autresPlanctomycètes, qui se reproduisent par bourgeonnement
(22). Le temps de doublement des bactéries Anammox est de l’ordre de plusieurs
semaines (87) plutôt que les procès-verbaux des organismes modèles tels
queEscherichia coli. Le premier signe de division cellulaire est l’apparition d’un
anneau de division dans le compartiment le plus externe (Figure 6Eet F), le
paryphoplasme, suivi d'une légère invagination de la paroi cellulaire.
La cellule double alors de taille par l'élongation des deux pôles, au cours duquel
l'anammoxosome s'allonge également et s'invagine légèrement. Après allongement, la
constriction se poursuit jusqu'à ce que les cellules soient presque entièrement pincées.
De cette manière, l’anammoxosome est réparti également entre les cellules filles.
Dans la recherche de candidats possibles pour les gènes codant pour les
protéines des anneaux de division, le «CandidatGénome de Kuenenia stuttgartiens »
(89) a été étudié pour les 10 gènes divisomes essentiels connus. Le divisome est un
complexe multiprotéique avec FtsZ (Fts, filamenteux sensible à la température)
comme acteur clé (13). Poussé par l'hydrolyse du GTP, FtsZ s'assemble en une
structure annulaire au niveau de la cellule médiane (5,16,57,63,71), recrute au moins
9 autres protéines essentielles (26,103), et se resserre pour séparer les deux cellules
filles. Il est intéressant de noter que les membres duPlanctomycètesetChlamydiae
sont les seuls phylums parmi les bactéries sans homologue évident pour le gène de
division cellulaire par ailleurs omniprésentftsZ(59,104).
Dans le "CandidatKuenenia stuttgartiens », le complexe divisomal indépendant
de FtsA (27,102) (ftsK,ftsQ, ftsB,ftsL,ftsW, etftsI) était complet. LeftsL,ftsI,ftsW,
etftsQ les gènes faisaient partie d'une paroi cellulaire putative de division (DCW)
opéron (voir aussi référence67), qui dansEscherichia coliet la plupart des autres
bactéries hébergent des gènes impliqués dans la division cellulaire et la biosynthèse
des précurseurs du peptidoglycane. On pense que le complexe divisomal indépendant
de FtsA s'assemble indépendamment du complexe de l'anneau Z et est recruté dans la
cellule médiane une fois que le complexe de l'anneau Z est établi (27,102).
Homologues clairs des gènes codant pour le complexe Z-ring (ftsZ,ftsA, etzipA)
etftsNn'ont pas été trouvés dans le "CandidatGénome de Kuenenia stuttgartiens ».
Malgré l'absence deftsZdans le "CandidatKuenenia stuttgartiens », un anneau de
division est présent lors de la division cellulaire de l'anammox. Le génome a donc été
étudié, et basé sur la présence d'un site de liaison ATP/GTP (boucle P) et de boucles
de synergie associées (également appelées boucles T7, impliquées dans l'activité
GTPase), un possible nouveau gène d'anneau de division cellulaire qui n'était pas lié
àftsZa été identifié. Ce gène (kustd1438) code pour une protéine longue de 3 690
acides aminés (aa) qui contient un peptide signal de 22 aa, ce qui correspond à
l'emplacement de l'anneau de division dans le paryphoplasme. Cependant, au niveau
de la structure primaire, kustd1438 et FtsZ ne sont pas homologues. La localisation
par Immunogold à l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine codée kustd1438 a
montré qu'elle faisait effectivement partie de l'anneau de division et, sur la base de
l'analyse de séquence, pourrait contribuer activement à la constriction ou à
l'assemblage de l'anneau.
2) Métabolisme :