Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE REPUBLIQUE DU MALI

Un Peuple - Un But - Une Foi

---------=0=----------

UNIVERSITE DE BAMAKO
Faculté de Médecine de Pharmacie et d’Odonto-Stomatotologie

ANNEE UNIVERSITAIRE 2004-2005 Nº---------/

Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT.

Place de la biologie moléculaire dans l’évaluation du
polymorphisme génétique de la lactate déshydrogénase
(LDH) de Plasmodium falciparum.

Présentée et soutenue publiquement le……………… devant la Faculté de

Médecine de Pharmacie et d’Odonto-Stomatologie du Mali
par Madame AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa
pour obtenir le grade de Docteur en Pharmacie (DIPLOME D’ETAT)

Jury :
Président : Professeur Ousmane DOUMBIA
Membres : Docteur Seydou DOUMBIA
Docteur Mada ma BOUARE
Co-directeur de thèse : Docteur Ousmane KOITA
Directeur de thèse : Professeur Amadou DIALLO
Les travaux ont été effectués au Laboratoire de Biologie Moléculaire Appliquée avec le
soutien de Tulane University et le NIAID/NIH.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

1
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

FACULTE DE MEDECINE, DE PHARMACIE ET D’ODONTO-STOMATOLOGIE

ANNEE UNIVERSITAIRE 2004-2005

ADMINISTRATION

DOYEN : MOUSSA TRAORE – PROFESSEUR

1er ASSESSEUR : MASSA SANOGO – MAÎTRE DE
CONFERENCES
2ème ASSESSEUR : GANGALY DIALLO – MAÎTRE DE
CONFERECES AGREGE
SECRETAIRE PRINCIPAL : YENIMEGUE ALBERT DEMBELE – MAÎTRE D
CONFERECES AGREGE
AGENT COMPTABLE : MADAME COULIBALY FATOUMATA TALL-
CONTROLEUR DES FINANCES

PROFESSEURS HONORAIRES

Mr Alou BA : Ophtalmologie
Mr Bocar SALL : Orthopédie Traumatologie -
Secourisme
Mr Souleymane SANGARE : Pneumo-phtisiologie
Mr Yaya FOFANA : Hématologie
Mr Mamadou L. TRAORE : Chirurgie Générale
Mr Balla COULIBALY : Pédiatrie
Mr Mamadou DEMBELE : Chirurgie Générale
Mr Mamadou KOUMARE: Pharmacognosie
Mr Mohamed TOURE : Pédiatrie

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

2
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Mr Ali Nouhoum DIALLO : Médecine interne

Mr Aly GUINDO : Gastro-entérologie

LISTE DU PERSONNEL ENSEIGNANT PAR D.E.R. & PAR GRADE

D.E.R. CHIRURGIE ET SPECIALITES CHIRURGICALES

1. PROFESSEURS

Mr Abdel Karim KOUMARE : Chirurgie Générale

Mr Sambou SOUMARE : Chirurgie Générale
Mr Abdou Alassane TOURE : Orthopédie – Traumatologie
Chef de D.E.R.

Mr Kalilou OUATTARA : Urologie

Mr Amadou DOLO : Gynéco Obstétrique
Mr Alhousseini Ag MOHAMED ORL

2. MAITRES DE CONFERENCES AGREGES

Mr Abdoulaye DIALLO : Ophtalmologie

Mr Djibril SANGARE : Chirurgie Générale
Mr Abdel Kader TRAORE dit DIOP : Chirurgie Générale
Mr Abdoulaye DIALLO : Anesthésie – Réanimation
Mr Gangaly DIALLO : Chirurgie Viscérale

3. MAITRES DE CONFERENCES

Mme SY Aïda SOW : Gynéco-Obstétrique

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

3
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Mr Salif DIAKITE : Gynéco-Obstétrique

4. MAÎTRES ASSISTANTS

Mme DIALLO Fatimata S. DIABATE : Gynéco-Obstétrique

Mr Mamadou TRAORE : Gynéco-Obstétrique
Mr Sadio YENA : Chirurgie Générale
Mr Filifing SISSOKO : Chirurgie Générale
Mr Issa DIARRA : Gynéco-Obstétrique
Mr Youssouf COULIBALY : Anesthésie - Réanimation
Mr Samba Karim TIMBO : O.R.L.
Mme TOGOLA Fanta KONIPO : O.R.L.

5. ASSISTANTS CHEFS DE CLINIQUE

Mme Djénéba DOUMBIA Anesthésie / Réanimation

Mr Mamadou L. DIOMBANA : Stomatologie
Mr Sékou SIDIBE : Orthopédie - Traumatologie
MrAbdoulaye DIALLO : Anesthésie - Réanimation
Mr Tiéman COULIBALY : Orthopédie - Traumatologie
Mme TRAORE J. THOMAS : Ophtalmologue
Mr Nouhoum ONGOÏBA : Anatomie & Chirurgie Générale
Mr Zanafon OUATTARA : Urologie
Mr Zimogo Zié SANOGO : Chrirugie Générale
Mr Adama SANGARE : Orthopédie - Traumatologie
Mr Sanoussi BAMANI : Ophtalmologie
Mr Doulaye SACKO : Ophtalmologie
Mr Ibrahim ALWATA : Orthopédie - Traumatologie
Mr Lamine TRAORE Ophtalmologie
Mr Mady MAKALOU Orthopédie/ Traumatologie
Mr Aly TEMBELY Urologie

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

4
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Mr Niani MOUNKORO Gynécologie/ Obstétrique

Mr Tiémoko D. COULIBALY Odontologie
Mr Souleymane TOGORA Odontologie
Mr Mohamed KEITA ORL

D.E.R. DE SCIENCES FONDAMENTALES

1. PROFESSEURS

Mr Daouda DIALLO : Chimie Générale & Minérale

Mr Siné BAYO : Anatomie-Pathologie-Histoembryologie
Mr Amadou DIALLO : Biologie
Mr Moussa HARAMA : Chimie Organique
Mr Ogobara DOUMBO : Parasitologie – Mycologie

2. MAÎTRES DE CONFERENCES AGREGES

Mr Yénimégué Albert DEMBELE : Chimie Organique

Mr Anatole TOUNKARA : Immunologie- Chef de D.E.R.
Mr Amadou TOURE : Histoembryologie
Mr Flabou BOUGOUDOGO : Bactériologie – Virologie

3. MAÎTRES DE CONFERENCES

Mr Bakary M. CISSE : Biochimie

Mr Abdrahamane S. MAÏGA : Parasitologie
Mr Adama DIARRA : Physiologie
Mr Mamadou KONE : Physiologie
Mr Massa SANOGO : Chimie Analytique

4. MAÎTRES ASSISTANTS

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

5
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Mr Mahamadou CISSE : Biologie

Mr Sékou F. M. TRAORE : Entomologie médicale
Mr Abdoulaye DABO : Malacologie – Biologie Animale
Mr Abdrahamane TOUNKARA : Biochimie
Mr Ibrahim I. MAÏGA : Bactériologie – Virologie
Mr Moussa Issa DIARRA : Parasitologie
Mr Amagana DOLO : Biophysique
Mr Kaourou DOUCOURE : Biologie
Mr Bouréma KOURIBA Immunologie
Mr Souleymane DIALLO Bactériologie/ Virologie
Mr Cheick Bougadari TRAORE Anatomie pathologie
Mr Lassana DOOUMBIA Chimie Organique

5. ASSISTANTS

Mr Mounirou BABY : Hématologie

Mr Mahamadou A. THERA : Parasitologie
Mr Mangara M. BAGAYOKO Entomologie Moléculaire
Médicale
Mr Guimogo DOLO Entomologie Moléculaire
Médicale
Mr Abdoulaye TOURE Entomologie Moléculaire
Médicale
Mr Djbril SANGARE Entomologie Moléculaire
Médicale
Mr Mouctar DIALLO Biologie/ Parasitologie
Mr Boubacar TRAORE Immunologie
Mr Bokary SACKO Biochimie

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

6
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D.E.R. DE MEDECINE ET SPECIALITES MEDICALES

1. PROFESSEURS

Mr Abdoulaye Ag RHALY : Médecine Interne

Mr Mamadou K. TOURE : Cardiologie
Mr Mahamane MAÏGA : Néphrologie
Mr Baba KOUMARE : Psychiatrie – Chef de D.E.R.
Mr Moussa TRAORE: Neurologie
Mr Issa TRAORE : Radiologie
Mr Mamadou M. KEITA : Pédiatrie
Mr Hamar A. TRAORE : Médecine Interne
Mr Dapa Aly DIALLO : Hématologie
Mr Moussa Y. MAIGA Gastro-entérologie/ Hépatologie

2. MAÎTRES DE CONFERENCES AGREGES

Mr Toumani SIDIBE : Pédiatrie

Mr Bah KEITA : Pneumo-Phtisiologie
Mr Boubacar DIALLO : Cardiologie
Mr Somita KEITA : Dermato-Léprologie
Mr Abdel Kader TRAORE : Médecine Interne
Mr Siaka SIDIBE : Radiologie

3. MAÏTRES ASSISTANTS

Mr Mamadou DEMBELE : Médecine Interne

Mr Mamady KANE : Radiologie
Mr Tatiana KEITA : Pédiatrie
Mme TRAORE Mariam SYLLA : Pédiatrie
Mr Adama D. KEITA : Radiologie

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

7
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Mme SIDIBE Assa TRAORE : Endocrinologie

Mme Habibatou DIAWARA : Dermatologie

4. ASSISTANTS CHEFS DE CLINIQUE

Mr Bou DIAKITE : Psychiatrie

Mr Bougouzié SANOGO : Gastro-entérologie
Mr Saharé FONGORO : Néphrologie
Mr Bakoroba COULIBALY : Psychiatrie
Mr Kassoum SANOGO : Cardiologie
Mr Seydou DIAKITE : Cardiologie
Mr Mahamadou B. CISSE : Pédiatrie
Mr Arouna TOGORA : Psychiatrie
Mme Diarra Assétou SOUCKO Médecine interne
Mr Boubacar TOGO Pédiatrie
Mr Mahamadou B. TOURE Radiologie
Mr Idrissa A. CISSE Dermatologie
Mr Mamadou B. DIARRA Cardiologie
Mr Anselme KONATE Hépato-gastro-entérologie
Mr Moussa T. DIARRA Hepato-gastro-entérologie
Mr Souleymane DIALLO Pneumologie
Mr Souleymane COULIBALY Psychologie
Mr Daouda MINTA Maladies infectieuses
Mr Soungalo DAO Maladies infectieuses

5. ASSISTANT

Mr Cheick Oumar GUINTO : Neurologie

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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D.E.R. DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES

1. PROFESSEUR

Mr Boubacar Sidiki CISSE : Toxicologie

Mr Gaoussou KANOUTE Chimie Analytique. Chef de D.E.R

3. MAITRES DE CONFERENCES AGREGES

Mr Ousmane DOUMBIA Pharmacie Chimique

3. MAITRES DE CONFERENCES

Mr Boulkassoum HAIDARA Législation

Mr Elimane MARIKO Pharmacologie

4. MAÎTRES ASSISTANTS

Mr Bénoit KOUMARE Chimie analytique

Mr Drissa DIALLO : Matières Médicales
Mr Alou KEITA : Galénique
Mr Ababacar I. MAÏGA : Toxicologie
Mr Yaya KANE : Galénique

5. ASSISTANTS

Mme Rokia SANOGO Pharmacognosie

Mr Saibou MAIGA Législation
Mr Ousmane KOITA Parasitologie Moléculaire

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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D.E.R. SANTE PUBLIQUE

1. PROFESSEUR

Mr Sidi Yaya SIMAGA : Santé Publique – Chef de D.E.R.

2. MAÎTRE DE CONFERENCES AGREGE

Mr Moussa A. MAÏGA : Santé Publique

3. MAÎTRE DE CONFERENCES

Mr Sanoussi KONATE : Santé Publique

4. MAÎTRES ASSISTANTS

Mr Bocar G. TOURE : Santé Publique

Mr Adama DIAWARA : Santé Publique
Mr Hamadoun SANGHO : Santé Publique
Mr Massambou SACKO : Santé Publique

Mr Moussa A. DICKO Santé Publique

5. ASSISTANTS

Mr Samba DIOP Anthropologie Médicale

Mr Seydou DOUMBIA Epidémiologie
Mr Oumar THIERO Biostatistique

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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CHARGES DE COURS & ENSEIGNANTS VACATAIRES

Mr N’Golo DIARRA : Botanique

Mr Bouba DIARRA : Bactériologie
Mr Salikou SANOGO : Physique
Mr Boubacar KANTE : Galénique
Mr Souleymane GUINDO : Gestion
Mme DEMBELE Sira DIARRA : Mathématiques
Mr Modibo DIARRA : Nutrition
Mme MAÏGA Fatoumata SOKONA : Hygiène du Milieu
Mr Mahamadou TRAORE : Génétique
Mr Yaya COULIBALY : Législation

ENSEIGNANTS EN MISSION

Pr. Doudou BA : Bromatologie

Pr. Babacar FAYE : Pharmacodynamie
Pr. Eric PICHARD : Pathologie Infectieuse
Pr. Mounirou CISS : Hydrologie
Pr. Amadou Papa DIOP : Biochimie

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

DEDICACES

Je dédie ce Travail:
A allah, le tout puissant, le clément et le miséricordieux par ta bonté et ta grâce,
tu m’as permis de mener à terme ce travail si long et pénible. J’implore la santé,
la foi et la longévité pour pouvoir réaliser davantage mes vœux.

A la mémoire de mon père feu El hadj ALZOUMA Younsa.

J’ai été touché par la confiance que tu m’as accordée dès les premiers pas de
ma vie.
Tu aurais aimé vivre cet instant mémorable qui voit l’aboutissement de tous les
sacrifices consentis. Tu n’as ménagé aucun effort pour mon éducation qui porte
aujourd’hui son premier fruit.
Cher père repose en paix dans la grâce de Dieu pour le repos éternel car tu n’as
pas vécu inutilement.

A ma mère Hadjia Halimatou Souleymane.

En souvenir des moments passés à tes cotés et de ton souci de faire de nous
des hommes préparés pour la vie. Tu as toujours été soucieuse de l’avenir de
toute la famille. Ce travail est un modeste témoignage de tous les sacrifices que
tu as consentis.
Que Dieu le tout puissant puisse te garder encore longtemps parmi nous.

A ma grande mère Hadjia Kadi Hamidou.

Tu n’as ménagé aucun effort pour la réussite de tes petits fils. Trouve en ce
travail le témoignage de ma reconnaissance.
En mémoire de mes grand parents Alzouma, Radi et Souleymane.
Sur tous les fronts vous avez toujours assisté, soutenu, chéri, conseillé et
encouragé. J’ai profondément ressenti votre disparition. Mes chers grands
parents, dormez en paix dans la grâce de l’ETERNEL.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

A mon mari AMOS David Daouda.

Tu as été toujours disponible pour moi sur tous les plans aux mauvais comme
aux bons moments. Tu es le mari le plus merveilleux. Je remercie le tout
puissant Allah de t’avoir mis sur mon chemin et je souhaite le poursuivre avec toi
le plus longtemps possible.

A mon fils AMOS Mohamed Nourdine.

Tu es le plus beau, le plus adorable et gentil des enfants. Que Dieu te bénisse et
t’accorde longue vie.

A mes frères et sœur Amadou ALZOUMA, Abdoul Kader ALZOUMA,

Mohamed Moctar ALZOUMA, Laila ALZOUMA, et Abdoul Rachid ALZOUMA.
Sources perpétuelles d’émotion, d’affection, d’inspiration et d’espoir. Que le
TOUT PUISSANT puisse raffermir chaque jour nos liens. Considérez ce modeste
travail comme une esquisse de chemin que je voudrais vous montrer afin de
susciter chez vous beaucoup de courage.

A la mémoire de mon tuteur Elhadj Amadoun Assoumane CISSE.

Sur tous les fronts tu m’as toujours assisté, soutenu, chéri, conseillé et
encouragé. J’ai profondément ressenti votre disparition. Mon cher tonton, dort en
paix dans la grâce de l’ETERNEL.

A tous mes oncles paternels et maternels.

Merci de vos efforts constants pour le renforcement des liens entre nos familles.
Trouvez ici l’expression de mon profond attachement aux valeurs que vous
cultivez.
Ce travail est le vôtre.

A mes tantes : Haoua, Safia, Rakia, Ramatou, Hadjara, Biba, Hassia,

Hamsa, Mariama

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Merci pour tout ce que vous avez fait pour moi et toute la famille.
Ce travail est le vôtre

A mes cousins et cousines plus jeunes que moi,

Considérez ce modeste travail comme une esquisse de chemin que je voudrais
vous montrer afin de susciter chez vous beaucoup de courage.

Au Dr Ousmane KOITA, Vous m’avez initié à cette nouvelle technique de

biologie moléculaire avec une disponibilité totale, un amour profond pour le
travail bien fait. Vos conseils et surtout votre patience ont contribué à améliorer
la qualité technique de ce travail. Mes remerciements pour l’enseignement reçu.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

REMERCIEMENTS
Mes remerciements s’adressent:

A mon oncle Tinni Tahirou, mes reconnaissances sincères pour la confiance que
tu m’as accordée. Ce travail est le tien.

A toute la famille Bidiga au Burkina Faso, Vous avez contribué de près ou de loin
à ma réussite, veuillez trouver ici l’expression de profond amour et de mon
sincère attachement. Merci de l’effort consenti pour les liens familiaux.

A la famille OUATTARA à Bamako, toute ma reconnaissance et mes sincères

remerciements.

A la famille Barké au Niger, toute ma reconnaissance et mes sincères

remerciements.

A toute la famille Cissé à Bamako et à Goundam, toute ma reconnaissance et

mes sincères remerciements.

A la famille Harouna Soumaïla à Bamako, mes sincères remerciements.

A toute la promotion 1997–2002 de la FMPOS.

Mes sincères remerciements en souvenir de la solidarité et le courage dont nous
avons fait preuve durant ces quelques années.

A mon amie Nafissa Hassane Kouka, toute ma reconnaissance et mes sincères

remerciements.

A mes amis Kader et sa femme, toute ma reconnaissance et mes sincères

remerciements.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

15
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

A mes compatriotes de promotion, trouvez ici l’expression de mon profond

attachement. Que DIEU le tout puissant fasse que nous continuions dans la voie
que nous nous sommes tracée.

A toute la colonie estudiantine Nigérienne à Bamako, merci pour votre

assistance.

A ma camarade de promotion du LBMA: Djènéba Comba Dabitaou, merci pour

ta bonne collaboration.

A mes cadets du LBMA: Ousmane Cissé, Moussa Cissé, Ousmane Maïga,

Penda Tcham, Hadiza Gao, Salimatou Samaké, Issoufou, Aïssata Cissé,
Ousmane Touré, Maïga, Ibrahima Zan Doumbia, Mahamadou Sangaré,
Benjamin Coulibaly, Cheick, Zibo, Karim, Salif Mangara, Mahamoudou Dicko.
Merci pour votre collaboration, bon courage et plein succès et surtout de la
patience.

A tous mes aînés DR Aliou Sissako, DR Aliou Coulibaly, Mahamadou Ibrah, DR

Bagayoko Mamadou, DR Salamatou Alzouma, DR Mariam N’Diaye, DR Lansana
Sangaré, DR Mamadou Mounkoro, Mariam N’Diaye,
C’est le lieu de vous réitérer toute ma reconnaissance et mon profond respect.
Encore merci pour tous les services rendus et surtout de vos soutiens et conseils
permanents. Recevez ici l’expression de ma reconnaissance.

Aux étudiants de DEA: Bintou, Rabi, Ousseini, Assan, Fanta. Merci pour votre
bonne collaboration.

A la secrétaire Kadiatou Bamba et les informaticiens Amadou et Ayouba. Merci

pour votre bonne collaboration.

A toute la population de Missira.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Merci pour votre bonne collaboration.

Aux manœuvres et gardiens de LBMA: Madou, Fofana, Sidi, René.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

AUX MEMBRES DU JURY

A notre président de jury.

Monsieur le Professeur Ousmane Doumbia
Maître de conférences agrégés
Professeur en Pharmacie chimique à la Faculté de Médecine de
Pharmacie et d’Odonto-Stomatologie.

Cher maître, vous nous faites l’honneur de présider ce jury malgré vos
multiples occupations. Vos qualités humaines, sociales, et scientifiques font
de vous un maître respectable et admiré. Nous avons très tôt compris
l’intérêt que vous portez à ce travail. Nous vous prions cher maître
d’accepter nos remerciements.

A notre maître et juge:

Monsieur le Docteur Seydou Doumbia,
DR en Médecine, Ph.D en Epidémiologie
Assistant de Santé Publique, FMPOS.
Chef de l’unité d’Epidémiologie et système d’information
Géographique au Malaria Research and Training Center,
FMPOS.
Nous sommes très honorés par votre présence dans ce jury de thèse. Vos
qualités humaines et surtout votre sens élevé de la responsabilité et de la
rigueur dans le travail ont beaucoup attiré notre attention. Vous avez apporté
un concours appréciable à la réalisation de ce travail. Veuillez recevoir nos
vifs remerciements.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

A notre maître et juge:

Monsieur le Docteur Madama Bouaré
Entomologiste
Chargé de cours de Biologie cellulaires et d’entomologie à la
Faculté des sciences et techniques.
Nous avons toujours admiré votre courtoisie et votre disponibilité au cours
de notre formation. Vos conseils et suggestions ont amélioré la qualité de ce
travail. Veillez croire cher maître l’expression de notre respectueuse
considération.

A notre maître et co-directeur de thèse.

Monsieur le Docteur Ousmane Koita
Pharmacien biologiste, PhD en Biologie Moléculaire.
Responsable du Laboratoire de Biologie Moléculaire Appliquée
à la faculté de Science et Techniques, Bamako, Mali.
Directeur adjoint du programme de recherche NIAD (NIH)
FMPOS sur le SIDA et la tuberculose.
Chargé de cours de biologie Moléculaire à la FAST, Bamako.
Chargé de cours de biologie animale à la Faculté de Médecine de
Pharmacie et d’Odonto-Stomatologie.

Cher maître, nous vous remercions de la confiance que vous nous avez faite
en nous proposant ce travail. Nous avons vite apprécié vos qualités
scientifiques, humaines et surtout votre amour pour le travail bien fait. Ces
qualités couplées à votre simplicité et votre générosité font de vous un
maître exemplaire. Homme de terrain, vous avez cultivé en nous l’esprit

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

d’équipe, le dévouement, l’endurance et la persévérance; des qualités sans

doute indispensables à la réalisation d’un travail scientifique et qui nous
aideront dans les combats futurs. Nous sommes très honorés d’être parmi
vos élèves. Soyez assuré cher maître de notre profonde gratitude et de nos
sincères remerciements.

A notre maître et directeur de thèse

Monsieur le Professeur Amadou Diallo
Professeur agrégé de Zoologie à la FMPOS
Professeur chargé de cours de Biologie animale et de Zoologie à
la Faculté de Médecine de Pharmacie et d’Odonto-Stomatologie.
Vice recteur de l’université de Bamako, Mali.
Nous avons beaucoup admiré vos qualités scientifiques et pédagogiques.
Tout au long de ce travail vous nous avez prodigué des conseils judicieux et
contribué à l’amélioration de sa qualité. Votre simplicité, votre disponibilité
et surtout votre souci constant pour notre formation, forcent l’admiration et
font de vous un maître de référence. Nous sommes honorés par votre
présence dans ce jury. Nous vous sommes très reconnaissants et vous
exprimons toute notre gratitude.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Sommaire

Page

I Introduction 1

II Objectifs 5
1- Objectif général 5
2- Objectifs spécifiques 5

III Généralités
1- Définition 6
2- Cycle biologique de Plasmodium falciparum 7
3- Epidémiologie du paludisme 9
4- Physiologie et Physiopathologie 10
4-1 Physiologie 10
4-2 Physiopathologie 13
5- Techniques de diagnostic biologique du Plasmodium 16
5-1 Techniques d’identification morphologique: Goutte Epaisse, Frottis mince 16
5-2 Techniques d’identification morphologique 19
5-3 Techniques de diagnostic immunologique 20
5-4 Techniques de diagnostic immunoenzymatique 20
5-5 L’amplification in vitro de l’ADN ou «Polymerase Chain Reaction» (PCR) 22
6- LDH 23

IV Méthodologie
1 Cadre et lieu de l’étude 27
2 Hydrographie 28
3 Structure actuelle de la population 28
4 Type de l’étude 31
5 Période de l’étude 31

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

6 Critères d’inclusion et de non inclusion 31

6-1 Critères d’inclusion 31
6-2 Critères de non inclusion 31
7 Echantillonnage 31
8 Gestions et exploitations statistiques des données 31
9 Considérations éthiques 32
10 Techniques d’analyse 32
10-1 Variables cliniques 32
10-2 Variables sociodémographiques 34
10-3 Variables biologiques 34
10-3-1 Goutte épaisse et frottis mince 34
10-3-1 Réalisation de la goutte épaisse 34
10-3-1-3 Préparation du giemsa 34
10-3-2 Dosage de l’hémoglobine par le test de l’hémocue 36
10-3-2-1 Matériels et réactifs 36
10-3-2-2 Protocole 37
10-3 -3 Le test optimal 37
10-3-3-1 Matériels et réactifs 37
10-3-3-2 Protocole 38
10-3-3-3 Interprétation des résultats 39
10-3-4 Techniques de PCR 39
10-3-4-1 Confection des confettis 39
10-3-4-2 Extraction de l’ADN plasmodial 40
10-3-4-3 Préparation des mélanges réactionnels 41
10-3-4-4 Protocole opératoire 43
10-3-4-5 Séquence de LDH 46
10-3-4-6 Préparation du gel à 2% 47
10-3-4-7 Révélation des produits amplifiés 47
10-3-4-8 Interprétation des résultats 47
10-3-5 séquençage de gène 48
10-3-5-1 Purification des amplicons 48

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

10-3-5-2 Cycle de séquençage 48

10-3-5-3 Préparation de plaques de Séphadex 49
10-3-5-4 Purification des produits de séquençage 49

V Résultats 50

VI Commentaire et Discussions 66
1 Méthodologie 66
2 Caractères sociodémographiques de la population 67
3 Prévalence de l’infection palustre chez les enfants 68
4 Distribution de la densité parasitaire 69
5 Etude comparative de la goutte épaisse et de l’Optimal-IT 70
6 Etude comparative de la goutte épaisse du test Optimal et de la PCR 72
7 Etude du polymorphisme nucléotidique du LDH 72

VII Conclusion 74

VIII Recommandations 75

IXRéférence bibliographiques 77

X Annexe 85

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

23
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Liste des figures

Page
1- Cycle biologique du Plasmodium 7
2- Cycle glycolytique d’Embden Meyerhoff 12
3- Pathogenèse du Paludisme grave 14
4- Réalisation de la goutte épaisse et frottis mince 19
5- Cycle de Krebs 24
6- Test Optimal 26
7- Cartographie de la région de Missira 30
8- Classification des splénomégalies selon Hackett 33
9- Confettis en spot 40
10- PCR nichée 45
11- Séquence du gène de PfLDH (AF 251291) 46
12-Résultat de la PCR à laquelle l’échantillon 3216 a été positif aux
amorces EBA-175. 58
13- Résultat de la PCR à laquelle l’échantillon 3162 a été positif aux amorces
RO33. 59
14- Résultat de la PCR à laquelle l’échantillon 3113 a été positif aux amorces
RO33. 60
15- Résultat de la PCR à laquelle les échantillons 412, 3162, 3216 ont été
positifs aux amorces RTLDH. 61

16- Alignement de la séquence nucléotidique de l’échantillon 3162 avec la

séquence PfLDH (AF251291). 62
17- Alignement de la séquence nucléotidique de l’échantillon 3216 avec la
séquence PfLDH (AF251291). 64

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

24
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Liste des Abréviations

ADN Acide Désoxyribonucléique

APAD Adénine pyridine Acétyl Dinucléotide
CHME Centre Hospitalier Mère Enfant, le Luxembourg
CHU Centre Hospitalier Universitaire
DDT Dichloro Diphényle Trichloracétique
ºC Degré Celsius
dNTP Dinucléotide Triphosphate
EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétique
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FAST Faculté des Sciences Techniques
FM Frottis mince
FMPOS Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’odontostomatologie
GE: Goutte épaisse
GPI: Glycosyl phosphatidyl inositol
HP/µl Hématie parasitée par microlitre
HRP-2 Histidine-Rich Protein-2
ICAM-1 Intercellular adhesion molecule-1
IFI Immunofluorescence Indirect
IGM Institut Géographique du Mali
IL-1, IL-6: Interleukine 1, 6
IL-1 : Interleukine Alpha
kDa Kilo Dalton
LBMA Laboratoire de Biologie Moléculaire Appliquée
LDH Lactate Déshydrogénase
ml millilitre
mM milli Mole
µl microlitre
mn minute
MgCl2 Chlorure de Magnésium

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25
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

MSP-1 Mérozoïte Surface Protein-1

MSP-2 Mérozoïte Surface Protein-2
NAD N-Acétyl Dinucléotide
nm nanomètre
OMS Organisation Mondiale de la Santé
PBS Phosphate Buffered Saline
PfEMP1 P. falciparum Erythrocyte Membrane Proteine 1.
Récepteurs potentiels pour le P. falciparum dans les phénomènes de
cytoadhérence.
pLDH Plasmodium Lactate déshydrogénase
PfLDH Plasmodium falciparum Lactate Déshydrogénase
PCR Polymerase Chain Reaction (réaction de polymérisation en
chaîne).
QBC Quantity Buffy Coat
TBE Tris Borate E DTA
TNF- Tumor Necrosis Factor Alpha
INF- Interféron Gamma
UNICEF The United Nations Children'
s Fund
VCAM Vascular cell adhesion molecule
VPN Valeur Prédictive Négative
VPP Valeur Prédictive Positive

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26
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Liste des tableaux

Page
Tableau I: répartition de l’échantillon en fonction du sexe et de l’âge
……………………………………………………………………………….. 50

Tableau II: taux de prévalence estimé par les deux tests (la goutte épaisse et le
test OptiMAL-IT).
……………………………………………………………………………….. 50
Tableau III: comparaison des résultats du test OptiMAL-IT par rapport à la
goutte épaisse.
……………………………………………………………………………….. 51

Tableau IV: résultats du test OptiMAL-IT en fonction des différentes classes de

la parasitémie.
……………………………………………………………………………….. 52
Tableau V : résultats de la parasitémie en fonction de l’âge
……………………………………………………………………………… 53
Tableau VI : étude comparative des résultats du test OptiMAL-IT et de la goutte
épaisse en fonction des espèces de plasmodies.
……………………………………………………………………………… 53
Tableau VII: sensibilité du test OptiMAL-IT sur les différents stades parasitaires
de Plasmodium falciparum.
……………………………………………………………………………… 54

Tableau VIII: répartition de l’indice plasmodique (goutte épaisse, test OptiMAL-

IT) en fonction de l’âge.
…………………………………………………………………………… 55
Tableau IX : relation entre la positivité à la goutte épaisse, au test OptiMAL-IT et
l’état fébrile des patients.
……………………………………………………………………………… 56
Tableau X: relation entre la positivité de la goutte épaisse et le taux
d’hémoglobine
……………………………………………………………………………… 56

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27
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Tableau XI : les échantillons concordants et discordants par la goutte épaisse et

le test OptiMAL-IT.

……………………………………………………………………….. . 57
Tableau XII: répartition des échantillons traités par la technique de la PCR
nichée de MSP-1.
…………………………………………………………………………………….. 57
Tableau XIII : étude comparative du test OptiMAL-IT par rapport à la PCR de
MSP-1.…………………………………………………… 58
Tableau XIV: prévalence des allotypes de la MSP-1 des échantillons discordants
positifs à la PCR.
……………………………………………………………………… 59

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28
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

I. INTRODUCTION

En ce début de 3ème millénaire le paludisme reste encore l’endémie la plus grave

dans le monde et particulièrement dans les pays tropicaux (Molyneux, 1998).
Le paludisme est une érythrocytopathie fébrile et hémolysante dû à la présence
dans l’organisme d’un hématozoaire de genre Plasmodium. Il est transmis par
les piqûres des femelles infestées de moustiques appartenant au genre
Anophèles. Il existe quatre espèces de plasmodies inféodées à l’homme:
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium
ovale. Le plasmodium falciparum est l’espèce la plus répandue et la plus
redoutable. On lui attribue 85 à 95% de la formule parasitaire au Mali. Elle est
responsable de 13% de mortalité et 15,6% de morbidité chez les enfants au Mali
(Diani, 1985). Ces taux de mortalité et morbidité élevées ont un impact
considérable sur le développement socio-économique des populations en zone
d’endémie.
En Afrique, les régions au sud du Sahara sont les plus touchées. Dans cette
zone chaque enfant fait au moins un accès palustre par saison de transmission
qui coïncide généralement avec la période des travaux champêtres.
Selon les estimations de l’OMS les coûts directs et indirects en Afrique
subsaharienne dépasseraient les 2 milliards de dollars par an (OMS, 1998). Les
femmes enceintes et les enfants constituent la première cible de cette maladie.
En effet, au Mali 16 à 28% des enfants de 0 à 5 ans en meurent chaque année
et 42% des femmes enceintes présentent des signes d’anémies (DEAP, 1993).
Elles sont quelque fois exposées à des avortements spontanés, d’hypotrophie
fœtale (OMS, 2001). Vu l’impact de cette maladie sur l’économie, le Mali depuis
1993 dispose d’un programme national de lutte contre le paludisme (PNLP).
Dans le monde, la transmission du paludisme est assurée par plusieurs espèces
d’Anophèles. Les principaux sont: Anopheles gambiae S.l. (Gilles, 1902) et
Anopheles funestus (Giles, 1900). Les études effectuées par Touré et al. en
1979, 1983, 1984 ont montré que le complexe An. gambiae et An. funestus sont
les principaux vecteurs rencontrés au Mali. En plus, les études cytogénétiques

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29
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

effectuées à Banambani et à Sélinkényi ont montré que le complexe A. gambiae

est composé d’A. arabiensis et de trois formes chromosomiques d’A. gambiae
s.s dénommées: Bamako, Savane, et Mopti. Ces formes chromosomiques
contribuent toutes à la transmission du paludisme et la filariose de Bancroft
(Touré, 1989).
La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme glycolytique soluble exprimée
à concentration élevée au cours de la phase asexuée des parasites de
paludisme (Piper ,1999). Elle utilise le 3-acétyl pyridine adénine dinucléotide
NAD (APAD) comme coenzyme dans la principale réaction de formation de la
pyruvate à partir de la lactate (Makler and David J. Hinrihs, 1989, 1993). Cette
enzyme possède des orthologues chez les vertébrés et sont prédominants dans
plusieurs organes comme le muscle squelettique, les tissus aérobics, le sperme
des mammifères, des oiseaux et chez les poissons. L’activité de la LDH du
parasite (pLDH) est en corrélation avec la densité de parasites en culture in vitro
de Plasmodium et aussi dans le plasma des patients infectés déterminés par
microscopie (Makler, 1993; Makler & Hinrichs, 1993; Moody, 2000; Piper, 1996).
Hormis les techniques morpho parasitaires classiques qui sont la goutte épaisse
et le frottis mince, de nouveaux tests de diagnostic rapides sont actuellement
disponibles. Il s’agit notamment des tests immunochromatographiques telles que
l’OptiMAL-IT dont le principe est basé sur la détection de la pLDH et le
Parasight-F® qui permet la détection de l’Histidine Rich Protein II. Outre l’espèce
P. falciparum, le test OptiMAL-IT permet de distinguer le gène LDH des autres
espèces de Plasmodium (malariae, ovale et vivax). Cette capacité de mise en
évidence de toutes les espèces est particulièrement importante dans les pays où
les différentes espèces de Plasmodium coexistent (Ferro, 2002, Koita et al.,
2004). Ce test utilise des anticorps monoclonaux dirigés contre les métabolites
enzymatiques intracellulaires du pLDH présents et libérés par les érythrocytes
infectés (Ricci et al, 2000). La prise en charge des patients ayant le paludisme
passe par un diagnostic rapide et précis.
Plusieurs études (Jamshaid Iqbal et al, 2002; Moody, 2002) de part le monde ont
validé les paramètres diagnostics du test OptiMAL-IT par rapport à la goutte

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30
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

épaisse, ces études ont mis en évidence des faux négatifs, c'
est-à-dire des
échantillons positifs à la goutte épaisse et négatifs au tests Parasight-F® et
OptiMAL-IT (Limangeni Mankhambo et al, 2001). Le polymorphisme du gène
codant pour la pLDH n’a cependant pas été exploré dans les conditions de
terrain.

Le diagnostic du paludisme repose actuellement sur la mise en évidence du

parasite par la microscopie. Ainsi les techniques basées sur les éléments
morphologiques du parasite nécessitent un personnel qualifié, un microscope et
les colorants. Cela constitue un handicap dans les pays en voie de
développement où il y a peu de microscopistes qualifiés. L’arrivée sur le marché
des tests de diagnostic rapide a permis d’envisager l’utilisation de ces méthodes
de diagnostic rapide dans les centres de santé périphériques. La prise en charge
des cas de paludisme nécessite un diagnostic rapide. Ces tests
d’immunocapture tels que l’OptiMAL-IT, le Parasight-F® sont les tests indiqués à
cet effet. Ces tests sont basés sur des antigènes plasmodiaux dont les
séquences codantes sont connues. La grande diversité génomique de l’espèce
P. falciparum mérite que ces tests de diagnostic rapides fassent une étude
approfondie afin d’évaluer in vitro le polymorphisme du gène de l’espèce
plasmodiale utilisée dans le test. Une telle étude faite sur le gène HRP-II de P.
falciparum a montré que 2,5% des espèces plasmodiales présentes au Mali n'
ont
pas le gène HRP-II utilisé dans le test Parasight-F® (Koïta, 2000). Ceci se traduit
par un test à base d’HRP-II négatif alors que la goutte épaisse était positive.
Plusieurs mécanismes interviennent dans le polymorphisme génétique: le gène
HPR-II situé sur la partie subtélomérique du chromosome du parasite (Wellems
et al., 1987) se perd lors de la culture in vitro. Dans le cas de PfLDH, il
semblerait que des mutations ponctuelles peuvent se produire le long de ce
gène. La question à laquelle nous tentons de répondre est de savoir si des
mutations ponctuelles au niveau du gène de PfLDH entraîneraient une altération
antigénique empêchant le test OptiMAL-IT de détecter la présence du parasite.
Ainsi nous voulons vérifier cette hypothèse en testant les performances
diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT et voire la place de la biologie

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31
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

moléculaire dans l’évaluation du polymorphisme génétique de la lactate

déshydrogénase (LDH) de Plasmodium falciparum.

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32
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

II. OBJECTIFS
1-Objectif général.
Evaluer les paramètres diagnostiques du test OptiMAL-IT par rapport à la goutte
épaisse et évaluer le polymorphisme du gène codant pour la lactate
déshydrogénase (LDH) de Plasmodium falciparum dans le village de Missira.

2-Objectifs spécifiques.
- Estimer la diversité génétique de Plasmodium falciparum dans la zone d’étude
par la détermination de la séquence nucléotidique du gène PfLDH.
- Estimer la spécificité et la sensibilité du test OptiMAL-IT par rapport à la goutte
épaisse, au frottis mince et à la PCR.
- Déterminer la valeur prédictive négative (VPN), la valeur prédictive positive
(VPP) et la concordance Kappa du test OptiMAL-IT par rapport à la goutte
épaisse et à la PCR.

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33
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

III. GENERALITES
1- Définition
Le paludisme est une protozoose due à des hématozoaires du genre
Plasmodium transmis à l’homme par un moustique, l’anophèle femelle. Le
paludisme est très répandu dans le monde, et est la première endémie mondiale:
2 milliards de personnes sont exposées et 300 millions infectées (OMS, 2001). Il
s’agit de la première cause de mortalité infantile dans les pays en voie de
développement. Il y a 4 espèces qui sont inféodées à l’homme. La létalité est
due à l’espèce Plasmodium falciparum.
Selon l’UNICEF, le paludisme tue un enfant africain toutes les 30 secondes et
demeure l’une des plus graves menaces pour les femmes enceintes et leurs
nouveau-nés. Le paludisme est responsable de la mortalité périnatale, de faible
poids de naissance et d’anémie maternelle (OMS, 2001).
Quatre vingt-dix pour cent (90%) de décès dus au paludisme surviennent en
Afrique, au Sud du Sahara, principalement chez les enfants de 0 à 5 ans. De
nombreux enfants qui survivent à un accès du paludisme grave peuvent
présenter des séquelles qui ont un impact sur leur capacité cognitive (OMS,
2003).

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34
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

2- Cycle biologique de Plasmodium falciparum.

Le cycle de développement du parasite est assez complexe. Il comporte une
phase sexuée (sporogonie) qui se passe chez le moustique et une phase
asexuée (schizogonie) qui se déroule chez l’homme.

Figure 1: Schéma du cycle biologique du Plasmodium.

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35
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Chez l’homme.
Le cycle se caractérise par une phase tissulaire hépatique ou pré-érytrocytaire et
une phase intra-érythrocytaire.
- Schizogonie intra hépatique: Les sporozoïtes inoculés dans les capillaires de
l’homme par l’anophèle au cours du repas sanguin pénètrent les hépatocytes. Ils
se multiplient rapidement et leurs noyaux se divisent pour donner les schizontes
hépatocytaires ou corps bleus. L’hépatocyte éclate et libère les mérozoïtes de
première génération qui passent dans la circulation sanguine. Cette phase est
asymptomatique elle dure en moyenne de 7-9 jours chez Plasmodium falciparum.
Des formes dormantes appelées hypnozoïtes ont été observées chez P. ovale et
P. vivax.
- Schizogonie intra-érytrocytaire:
Après l’éclatement de l’hépatocyte, les mérozoïtes pénètrent rapidement dans
l’érythrocyte. Celui-ci augmente de taille et donne naissance au trophozoïte
jeune qui se nourrit de l’hémoglobine, se divise et donne le schizonte multi
nucléé. Le développement ultime du schizonte se termine par l’éclatement du
globule rouge et la libération des mérozoïtes de deuxième génération. Toutes les
36-48 heures les mérozoïtes vont réinfecter de nouvelles hématies. Ce cycle
intra-érytrocytaire est responsable de la pathologie liée au paludisme. Les tests
du ParaSight-F® et de l’OptiMAL-IT s’intéressent à cette partie du cycle
biologique du parasite lorsque les antigènes plasmodiaux sont libérés dans la
circulation sanguine.
Au bout de plusieurs cycles schizogoniques intra érythrocytaires apparaissent
dans le sang des gamétocytes. Ces derniers seront ingérés par l’anophèle
femelle lors d’un nouveau repas sanguin et amorceront la phase sexuée
sporogonique du cycle.
Chez l’anophèle femelle.
Le gamétocyte mâle se différencie en plusieurs gamètes mâles et le gamétocyte
femelle donne un seul gamète femelle.
La fusion d’un gamète mâle et femelle a lieu dans l’intestin moyen du moustique
(ou estomac). Il en résulte un oeuf mobile (ookinète) qui traverse la paroi

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36
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

gastrique et devient l’oocyste qui est la forme immobile. La division de l’oocyste

aboutit à la formation d’un grand nombre de sporozoïtes mobiles qui gagnent
activement les glandes salivaires du moustique pour être inoculés à l’homme lors
d’une piqûre.

3- Epidémiologie du paludisme.
Le paludisme pose un problème majeur de santé publique. Plus de 112 millions
de cas annuels de paludisme sont observés dans le monde dont 85% en Afrique
(OMS, 1992).
En Afrique 1 à 2 millions de décès par an sont attribués au paludisme (OMS,
1992). Le paludisme est une infection parasitaire qui sévit surtout dans les
régions tropicales: Sud-est de l’Asie, Moyen Orient, Amérique Latine et Afrique
au Sud du Sahara. La maladie est causée par 4 espèces de parasite qui sont P.
falciparum et P. malariae (observées sur tous les continents), P. ovale (Afrique,
est moins fréquente ailleurs) et P. vivax (Asie, Afrique et moins fréquente
ailleurs). L’indice du paludisme est fonction de l’intensité de la transmission. Le
programme de contrôle du paludisme de l’OMS entamé en 1993 a été une
réussite dans certaines zones. Cependant certains pays connaissent des
difficultés dans la lutte contre la maladie, surtout en Afrique. Ces difficultés sont
liées à l’apparition des parasites résistants à la chloroquine et à l’émergence des
moustiques résistants aux insecticides DDT. Ainsi des stratégies de contrôle ont
été préconisées par l’OMS. Elles sont basées sur:
- la prise en charge des cas de paludisme au niveau communautaire par le
traitement systématique de toute fièvre par un antipaludique (la chloroquine);
- la chimioprophylaxie chez les femmes enceintes et les sujets <<neufs>> (les
expatriés, sujets vivants en zone non impaludée);
- la réduction du contact homme vecteur par l’utilisation des supports imprégnés
d’insecticides (rideaux et moustiquaires);
- la surveillance épidémiologique et la prévention d’épidémie de paludisme;
- l’amélioration des capacités de recherches opérationnelles dans les pays
d’endémie.

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37
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Malgré les mesures de protection individuelle et collective et le traitement

systématique des cas préconisés par le programme national de lutte contre le
paludisme (PNLP), le paludisme reste une maladie endémique, et est la cause
de 16% de mortalité, 13% de morbidité (Doumbo et al., 1989). Les espèces
plasmodiales les plus répandues au Mali sont P. falciparum (80-90%), P.
malariae (10-15%). Les moins répandues sont P. ovale (1%) et P. vivax, un cas
retrouvé au Nord, (Koita, 1989). Ainsi le Mali est l’un des rares pays où se
trouvent les quatre espèces. Anophèle gambiae s.l et Anophèles funestus sont
les vecteurs majeurs de la transmission du paludisme (Touré et al, 1979).

4- Physiologie et Physiopathologie.
4-1 Physiologie.
Métabolisme du Plasmodium:
Les plasmodies ont besoin de beaucoup d’énergie pour assurer leur
développement au cours du cycle asexué intra érythrocytaire. Chez les
plasmodies aussi bien que chez les érythrocytes matures la glycolyse constitue
une source majeure d’énergie. La consommation de glucose par les érythrocytes
infectés de Plasmodium falciparum est de 25 à 50 fois supérieure à celle des
globules rouges non infectés (Tanabé., 1990). Le glucose est utilisé par la voie
d’Embden-Meyerhoff qui fait intervenir des enzymes parasitaires spécifiques à la
glycolyse (Roth et al., 1988). La lactate déshydrogénase joue un rôle important
dans ce métabolisme. Le stade ultime de cette voie est marqué par la
transformation du pyruvate en acide lactique par la LDH. Ce métabolisme
régénère le N-Acétyl Dinucléotide (NAD) qui est nécessaire à la production
d’Adénosine Triphosphate (ATP). L’acide lactique produit final du métabolisme
du glucose des espèces plasmodiales de mammifères est rapidement excrété
par les parasites vers le compartiment extracellulaire (Kanaani, 1991).
Les LDH de procaryotes et eucaryotes particulièrement celle du P. falciparum et
de l’homme ont sensiblement la même masse moléculaire de 35kDa (Vander &
Jagt, 1981; Simmons, 1985; Bzik, 1993). Cependant la séquence génomique de
la LDH plasmodiale présente des différences avec la LDH d’autres organismes.

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38
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Au plan fonctionnel, la LDH plasmodiale est capable d’utiliser 3 fois plus de

molécules de NAD que ne peut utiliser la LDH humaine (Makler, 1993).

Figure2: cycle glycolytique: d’Emden Meryerhoff, stade a: stade primordial,

stade b: stade de division, stade c, stade d’oxydoreduction-phosphorylation.

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39
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

4-2 Physiopathologie.
L’infection palustre produit toute une série de symptômes cliniques différents en
fonction de la nature et du stade parasitaire et de facteurs liés à l’hôte. En effet,
l’expression clinique peut aller de la forme simple (surtout en zone d’endémie) à
des formes sévères, graves pouvant être mortelles. Au niveau du parasite il
semblerait que certaines souches de P. falciparum sont plus virulentes que
d’autres.
Rôles des cytokines.
L’éclatement des hématies parasitées entraîne la production par les
macrophages de cytokines telles le TNF-α et l’IL-1 responsable de la fièvre et
des frissons observés en phase d’état (Schofied et al, 1993; Kwiatkowski et al,
1993). Le GPI serait l’un des facteurs parasitaires responsable de cette
stimulation. Le TNF-α et l’IL-1 seraient également responsables de l’anémie
palustre par le dysfonctionnement de l’érythropoïèse (Burgmann et al, 1996;
Selvam et al, 1996/). La cytoadhérence des hématies parasitées via les var
gènes (PfEMP1) ferait intervenir plusieurs cytokines qui sont : TNF-α, l’IL-1α,
INF-γ et l’IL-6 et des récepteurs endothéliaux (ICAM-1, VCAM, etc) cérébraux et
au niveau des autres organes profonds où se passe la schizogonie lors de
l’infection à P. falciparum.

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40
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Invasion des globules rouges

Anneau Merozoïte
Anémie

Trophozoïte Rupture des

Schizontes

GPI

Effet physique Knobs Cytoadhérence Obstruction des

du parasite Perte de la deformabilité microvaisseaux TNF
Sur les hématies

Effet métabolique Consommation du glucose Hypoxie tissulaire Fièvre

du parasite Hypoglycémie Acidose et hypoglycémie
Hypoglycemie
lactique

atteinte Cérébrale, rénale

Pulmonaire et autres
Complications
Selon Krogstad D J, 1995

Figure 3: Pathogenèse du paludisme grave.

L’accès simple.
Les signes qui conduisent au diagnostic de l’accès palustre simple ne sont pas
spécifiques. C’est pourquoi en zone d’endémie palustre, il faut devant tout
patient, quelque soit son âge, penser à un accès palustre simple s’il présente
depuis moins d’une semaine, l’un ou plusieurs des signes suivants: fièvre,
frisson, sueur, céphalées, troubles digestifs, asthénie, splénomégalie,

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41
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

hépatomégalie et anémie, plus une parasitémie sanguine. Lorsque le diagnostic

n’est pas fait précocement ou si le traitement n’est pas fait ou incorrectement fait,
l’accès simple peut évoluer vers un paludisme grave.
Le paludisme grave
Le paludisme grave est une urgence diagnostique et thérapeutique, car
menaçant le pronostic vital du patient. Selon l’OMS (2000), il existe 15 critères
majeurs qui, lorsqu’ils sont associés à la forme asexuée du P. falciparum
permettent de définir le paludisme grave. Dans cette définition il n’est point
besoin de réunir tous les critères. La présence d’au moins deux critères suffisent.
Ci-dessous les 15 critères majeurs de l’OMS.
1- prostration,
2- troubles de conscience (score de Glasgow < 10)
3- détresse respiratoire,
4- convulsions répétées,
5- état de choc (pression artérielle systolique < 80 mmHg en présence de signes
périphériques d’insuffisance circulatoire),

6- Œdème pulmonaire (radiologique), anomalies radiologiques précisées chez

l’enfant,

7- Saignement anormal,

8- Ictère Clinique ou bilirubine > 50 µmol/L,

9- Hémoglobinurie (Urines rouges foncées ou noires, hémoglobinurie ou

myoglobinurie à la bandelette, absence d’hématurie microscopique),

10- Anémie profonde (Hématocrite < 15% ou hémoglobine < 5g/dL, en présence
d’une parasitémie de plus de 10 000/µL. Si l’anémie est microcytaire, exclure une
carence martiale ou une hémoglobinopathie),

11- Hypoglycémie (Glycémie < 2.2 mmol/L (< 40 mg/dL)),

12- Acidose (PH < 7.35 ou bicarbonates < 15 mmol/L)

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42
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

13- Hyperlactatémie (Lactates plasmatiques > 5 mmol/L),

14- Hyperparasitémie (Parasitémie > 4% chez le non immun),

15- Insuffisance rénale (Débit urinaire < 400mL /24 h (adulte) ou < 12mL/24 h
(enfant) ne s’améliorant pas après réhydratation et une créatininémie supérieure
à 265µmol/L (>3.0 mg/dL).

Paludisme viscéral évolutif.

L'
apparition de la chloroquinorésistance, l'
inobservance fréquente de la
prophylaxie et l'
automédication en zone d'
endémie sont responsables de
l'
apparition du paludisme viscéral évolutif. Les signes cliniques sont
généralement frustres et la gravité tient au retard diagnostique. Les symptômes
sont limités à une anémie, une asthénie et une splénomégalie inexpliquée. Pour
les cas où le diagnostic est rapide, le traitement permet une sédation des
symptômes et une normalisation des paramètres biologiques sans séquelles.
Rarement, le paludisme viscéral évolutif peut être responsable d'
une situation
clinique plus précaire où la notion de terrain préalablement débilité revêt une
importance toute particulière.

5- Techniques de diagnostic biologique du Plasmodium.

5-1 Techniques d’identification morphologique: Goutte
Epaisse et Frottis mince.
Principe
Les étalements sanguins colorés et observés au microscope permettent de
distinguer sur le plan morphologique les différentes espèces de Plasmodium et
leur stade d’évolution chez l’hôte humain.
La technique de la goutte épaisse : elle est effectuée pour la mise en évidence
morphologique du parasite. Une ou 2 gouttes de sang sont disposées au milieu
d’une lame-porte objet, ces gouttes sont défibrinées par des mouvements
circulaires du bout d’une autre lame. L’étalement est ainsi séché et ensuite
coloré par le colorant Giemsa pour la lecture au microscope.

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43
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Avantages: la goutte épaisse, plus sensible, est l'

examen de référence. Elle
permet de détecter une très faible parasitémie (50 parasites/correspondant à
0,001% parasites). C’est la raison pour laquelle, la goutte épaisse est mieux
indiquée dans les enquêtes épidémiologiques.
Inconvénient: L’inconvénient majeur de la goutte épaisse est la destruction des
hématies au moment de la coloration rendant l’identification des espèces difficile.
La technique de frottis mince.
Une goutte de sang est étalée sur une lame porte-objet soigneusement
ème
dégraissée. Placer le petit côté de la 2 lame, bien tenue entre le pouce et
l'
index au contact de la goutte de sang au centre de la première lame. Attendre
que le sang fuse sur le bord. Incliner cette 2ème lame à 45ºC par rapport à la 1ère
et la pousser vers le bord libre avec un geste rapide, sans discontinuité jusqu'
à
épuisement de sang pour avoir un étalement très fin.
Une fois séché, cet étalement est fixé au méthanol absolu, puis coloré par une
solution de Giemsa. Le temps de réalisation est de 30 à 40 min, la qualité du
frottis et celle de la coloration sont deux éléments essentiels pour permettre une
lecture correcte au microscope. Un étalement de mauvaise qualité, non
monocellulaire, est « illisible ». Un étalement mal coloré (trop clair, trop foncé ou
avec des dépôts de colorants) est difficile à « lire » et peut être à l'
origine de
résultats erronés.
Avantages
Le frottis mince permet une meilleure identification de l’espèce plasmodiale et
son stade de développement (Moody, 2002), l’étude de la densité plasmodiale et
des signes hématologiques associés. Il permet également le diagnostic d’autres
agents pathogènes sanguicoles. Il est adapté à l’urgence. Le séchage ne prend
que quelques secondes, et est très bien indiqué en milieu hospitalier ou une
prise en charge rapide s’impose.
Inconvénient
Une manque de sensibilité par rapport à la goutte épaisse

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44
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Estimation quantitative des parasites sur la lame.

Afin d’apprécier correctement le degré d’infestation du patient par le
Plasmodium, il est important de connaître la parasitémie (nombre de parasites
par microlitre). Il est indispensable d’avoir ces informations pour prévenir des cas
sévères du paludisme et d’adopter un mode de traitement efficace chez le
patient, identifier son stade de développement, la présence ou l’absence de
l’hémozoïne.
- Avantages des étalements sanguins
Ces techniques permettent de déterminer les stades et les espèces de
Plasmodium d’une part, et de déterminer la charge parasitaire d’autre part. La
microscopie permet également d’établir l’indice plasmodique et l’indice
gamétocytique, deux indices épidémiologiques importants.
L’examen de la goutte épaisse doit constituer la première étape, car elle
présente l’avantage de concentrer 20 fois plus de parasites qu’un frottis mince
bien que les parasites puissent paraître déformés, rendant leur identification
difficile. Si la présence de parasites est détectée, l’espèce devra alors être
identifiée par l’examen du frottis mince. L’idéal est de prélever du sang quand la
température corporelle est élevée. La goutte est indiquée dans les enquêtes
épidémiologiques.
- Inconvénients des étalements sanguins:
Ces techniques demandent un microscopiste bien expérimenté et une source de
lumière. Il est à signaler aussi la lenteur d’exécution de ces techniques (au moins
1 heure pour le résultat d’une goutte épaisse et 15 à 20 mn pour celui d’un frottis
mince). Elles ne permettent pas la mise en évidence de la parasitémie
systémique (séquestration des hématies parasitées dans les capillaires
profonds). Les hématies séquestrées sont celles qui contiennent des schizontes
mûrs, seuls les globules rouges parasités par de jeunes trophozoïtes ou de
gamétocytes de Plasmodium falciparum peuvent circuler dans le sang
périphérique.
.

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45
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Figure4: Réalisation de la goutte épaisse et du frottis mince

(D’après Sbergal et al.,1986).

5-2 Techniques d’identification morphologique.

QBC:Quantitative Buffy Coat.
- Principe:
Il consiste à rechercher à l’aide d’un microscope à fluorescence les parasites
dans un prélèvement de sang contenu dans un tube capillaire et coloré à
l’acridine orange (AO) qui est le marqueur fluorescent.
-Avantages
Le seuil de détection est bas (1 hématie par microlitre), sa réalisation est simple
et rapide. Le diagnostic des autres agents sanguicoles (filaire) est possible.
- Inconvénients
La technique nécessite un microscope à fluorescence qui est onéreux. Le QBC
manque aussi de spécificité. Le test ne permet pas le diagnostic de l’espèce, ni
de quantifier la densité plasmodiale, ni les signes hématologiques associés.

5-3 Techniques de diagnostic immunologique.

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46
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Elisa et IFI (Immunofluorescence indirecte).

Principe
Le test ELISA est une réaction à double sandwich utilisant des anticorps
monoclonaux et polyclonaux capables de reconnaître les antigènes
plasmodiaux.
Le test d’immunofluorescence indirecte (IFI) sur étalement de sang ou la culture
in vitro de Plasmodium falciparum est une technique chère et compliquée.
Les limites d’utilisation du diagnostic indirect sont:
- contre indication suite à un traitement préalable;
- surveillance post thérapeutique;
- transfusion sanguine;
- enquêtes épidémiologiques.

5-4 Techniques de diagnostic immunoenzymatique.

Ces tests à double sandwich utilisent des anticorps monoclonaux capables de
reconnaître spécifiquement les anticorps parasitaires contenus dans le sang.
Ces tests de migration comportent plusieurs étapes:
- dans la phase de migration une réaction entre antigènes parasitaires et
conjugués;
- migration du complexe ainsi formé à travers la membrane cellulosique;
- réaction du complexe avec les anticorps monoclonaux fixés sur la membrane
cellulosique.

Le test Parasight-F® et le test malaquick (Becton Dickinson Tropical Diseases

USA).
Le Parasight-F® est un test manuel sur bandelette. C’est un test
immunochromatographique qui détecte le Plasmodium falciparum histidine-rich
protéine-2 (PfHRP-2) (Beatle, 1994 et Singhn, 1997). Le Plasmodium falciparum
histidine-rich protéine-2 est un antigène soluble dans l’eau, produit par les
trophozoïtes du P. falciparum et par les gamétocytes immatures (Rock, 1987).
Elle est exprimée sur la surface de la membrane des globules rouges immatures.

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47
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Ce test ne peut en aucun cas détecter les infections causées par P. vivax, P.
ovalae et P. malariae. Le Parasight-F® utilise pour le marquage un antigène
monoclonal anti HRP-2 conjugué à la Rhodamine qui colore les endroits de la
bandelette où il a pu détecter la présence de l’antigène en question. Ce test
utilise deux anticorps monoclonaux spécifiques pour l’antigène pHRP. Le test est
performant suivant les instructions du pratiquant.
Les études faites par Humar et al. (1997) et Pieroni et al. (1998) ont évoqué la
sensibilité et la spécificité du Parasight-F® de P. falciparum comparées à la
PCR. Ils ont démontré que la spécificité et la sensibilité du test Parasight-F® sont
de 88 et 97% respectivement. La sensibilité réduite est indicative de haute
compétence de la PCR pour la détection des faibles niveaux de parasitémie.
Le test malaquick (immunochromatographique diagnostics Sydney, Australie,
distribué en France par les laboratoires Fumeze) possède l’avantage d’une
utilisation simplifiée d’immunochromatographique. Cette technique peut être
recommandée tant en situation de précarité qu’en pratique hospitalière. Ce test
utilise deux anticorps anti HRP-2. Un des anticorps marqués à l’or colloïdal,
visible par sa coloration voilette, imprègne une petite zone de la bandelette. Au
dessus de cette zone se trouve l’autre anticorps, fixé sous forme d’un trait
transversal.
Le test de recherche de HRP-2 est simple, rapide, et commode. En zone
d’endémie du paludisme, la recherche de l‘HRP-2 de l’OMS caractérise un test
de diagnostic de P. falciparum adapté aux structures de soins périphériques ne
disposant pas d’un microscope. Cependant ce test est spécifique aux formes
asexuées du P. falciparum seules capables de produire le HRP-2.
Ces tests (Parasight-F® et Malaquick) détectent environ 20 parasites par l. Un
inconvénient est la persistance de l’antigène dans le sang après un traitement.
Les parasites disparaissent laissant une quantité non négligeable de métabolites,
dont la HRP-2. Le test reste donc positif plusieurs jours après la guérison.

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48
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

5-5 L’Amplification in vitro de l’ADN ou «Polymerase Chain Reaction»

(PCR).
Principe
Elle consiste à amplifier in vitro en plusieurs copies un fragment de gène codant
pour une protéine du Plasmodium en utilisant deux amorces spécifiques. Cette
amplification consiste à utiliser de courtes séquences d’ADN (oligonucléotides)
comme amorces et une enzyme (la Taq polymérase) pour répliquer en copies
multiples une portion d’ADN dont les séquences aux extrémités 3’ et 5’ sont
connues. Les 2 oligonucléotides doivent avoir une séquence complémentaire
des extrémités de chacun des deux brins d’ADN. La synthèse à partir des deux
amorces a lieu simultanément et aboutit à la duplication de la séquence matrice
initiale.
Cycle de la réaction de la PCR.
Une réaction de PCR correspond à une multiplication exponentielle (2 ) cycle
comprenant chacun trois étapes: la dénaturation, l’hybridation et l’élongation.
Tous les réactifs nécessaires à la synthèse sont soumis aux différentes
températures correspondant à chaque étape.
- la dénaturation :
Elle permet de séparer la molécule d’ADN se trouvant sous forme de double
brin en deux simples brins à une température de 94ºC;
- l’hybridation:
Elle permet d’apparier des amorces aux séquences nucléotidiques
complémentaires sur les deux brins d’ADN séparés lors de la dénaturation.
Le temps d’appariement étant environ 30 secondes à une minute ne permet
pas aux deux brins d’ADN de s’apparier favorisant ainsi la formation du
complexe ADN Amorce. La température d’appariement (Th) qui varie entre 40
à 60ºC, est fonction de la température de ramollissement (Tm) ou de Tm
=16,6 log {[Na] +0,41(%G-C) = 81,5[Na]}.
%G-C = % en dGTP et Dctp.
- l’élongation: Elle permet la synthèse de la nouvelle copie qui est
complémentaire à la séquence de la matrice. Cette synthèse commence par

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49
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

l’amorce déjà appariée. Cette synthèse est produite par l’enzyme Taq
polymérase (thermostable) qui insère les nucléotides G, A, T, et C selon
l’ordre dans la séquence cible (matrice). La température est de 72ºC, ce qui
permet à la Taq polymérase d’ajouter les amorces hybrides dans le sens
5’vers 3’.

6-LDH
Rôle
La lactate déshydrogénase est une enzyme que possède le Plasmodium. Elle a
une habileté d’utiliser le 3-acétyl pyridine adénine dinucléotide NAD (APAD)
comme coenzyme dans la formation du pyruvate à partir de la lactate. La LDH
utilise aussi le APAD pour l’oxydation de la lactate (Matcler et al., 1993). La
mesure du parasite LDH (pLDH) conduit à la détection de la présence de P.
falciparum. Le parasite de la LDH est une enzyme glycolytique soluble qui
exprimé au cours des étapes asexués des parasites de paludisme.

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50
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Figure 5: Cycle de Krebs.

Distribution chez les vertébrés.

Chez la plupart des vertébrés, on peut, en principe, après extraction de la
fraction LDH, séparer 5 molécules à mobilité électrophorétique différente mais
qui ont chacune l’activité lactico-déshydrogénase. Ce sont des isoenzymes dont

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

les molécules, synthétisées dans un même organisme, ne diffèrent sur le plan

fonctionnel que par leur affinité pour le pyruvate ou la lactate. Pour la mise en
évidence d’urée (dénaturant), le mélange des 5 isoenzymes ne fournit plus que 2
constituants séparables par électrophorèse, ce sont les monomères des
molécules tétramériques des isoenzymes. Les 5 molécules d’isoenzymes sont
donc constituées à partir de 2 sous-unités: la chaîne M (= A) et la chaîne H (= B).
La synthèse relative de ces chaînes est plus ou moins importante suivant les
organes. La molécule LDH-M4, abondante dans le muscle à une forte affinité
pour le pyruvate, elle est donc très efficace pour la fermentation lactique alors
que la molécule LDH-H4, abondante dans le cœur a une forte affinité pour la
lactate. Le cœur, bien oxygéné, utilise moins la fermentation que les autres
muscles. Une autre sous-unité, la chaîne C (=X) a été identifiée, sa répartition
dans les organes chez les vertébrés est variable et elle n’est synthétisée que
dans le testicule chez les mammifères.
Chromosome portant le gène.
Le gène Plasmodium falciparum LDH ne contient pas d’introns et est présent en
une seule copie sur le chromosome 13.
Détection du plasmodium déshydrogénase (pLDH).
L’activité du pLDH est proportionnelle à la parasitémie (Moody, 2002). Le pLDH
est une enzyme glycolytique synthétisée par toutes les formes plasmodiales et à
tous les stades de leur développement (Moody, 2000).
Le test OptiMAL-IT.
Il s’agit d’une technique rapide immunochromatographique basée sur la
détection du Plasmodium lactate déshydrogénase (pLDH). Ce test a pour but
d’utiliser des anticorps monoclonaux dirigés contre le métabolisme enzymatique
intracellulaire du Plasmodium lactate déshydrogénase (pLDH) présent et libéré
par les érythrocytes infectées (2000, Evaluation of OptiMAL-IT assay). Il a la
capacité de distinguer le Plasmodium falciparum des trois autres espèces de
Plasmodium. Cette capacité est particulièrement importante dans les pays où les
différentes espèces coexistent (Ferro, B 2002, performance of OptiMAL-IT®).

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Des études faites par le groupe (Moody, 2002) ont montré que la sensibilité de
l’OptiMAL-IT pour Plasmodium vivax et Plasmodium falciparum sont
respectivement 88 et 94% et la spécificité 99 et 100%. L’OptiMAL-IT est
incapable d’identifier les infections mixtes, bien que sa sensibilité et sa spécificité
soient similaires à celles de l’observation microscopique de [Link] quand on
compare avec la PCR (Moody, 2002).

Figure 9: test OptiMAL-IT de DiaMed

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53
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

IV. METHODOLOGIE

1 Cadre et lieu de l’étude.

Présentation de la zone d’étude.
L’aire dans laquelle l’essentiel de notre étude a été réalisé (zone de Missira) fait
partie de l’Arrondissement Central du Cercle de Kolokani. Elle se situe sur la rive
droite de la rivière Baoulé qui marque la limite entre les cercles de Kolokani et de
Kita. En fait la zone de Missira est comprise dans l’entité géographique nommée
« Boucle du Baoulé ».

Situation géographique.
La Boucle du Baoulé comprend les parties Ouest du cercle de Kolokani, Est du
cercle de Kita, Sud du cercle de Diéma et Nord-ouest du cercle de Kati. Elle se
situe entre les méridiens 8 20’W et 9 40’W et les parallèles 13 20’N et 14 39’N.
La zone de Missira est contiguë au Parc National et à la forêt classée de Fina
desquels elle n’est séparée que par le cours du Baoulé.

Climat, végétation et faune.

Le climat est de type soudanien avec une nette tendance sahélienne vers le
nord. Les deux saisons principales sont : la saison des pluies en relation avec
des vents soufflant du Sud-ouest (mousson) et la saison sèche durant laquelle
l’harmattan, ce vent chaud et sec est orienté Nord-est/Sud-ouest est
prédominant. La saison sèche qui s’étale de Novembre à Mai comprend deux
périodes bien distinctes: une saison fraîche (Novembre - Février) avec des
températures mensuelles de 23 à 29˚C (moyennes sur 40 ans: 1930-1970), des
humidités relatives moyennes de 22 à 51% et une évaporation moyenne
mensuelle variant de 76 à 317 mm (moyennes sur 19 ans: 1951-1970). Une
saison sèche chaude pendant laquelle les températures moyennes mensuelles
(29-35˚C) et les humidités relatives moyennes de 27 à 69% sont plus élevées.
L’évaporation atmosphérique en moyenne de 304 à 422 mm/mois est également
très intense. La saison de pluies couvre la période de Juin à Octobre et la valeur

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54
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

annuelle des précipitations diminue progressivement du Sud vers le Nord. Des

moyennes établies sur une période de 40 ans note un maximum de 1150,9 mm
et un minimum de 630,4 mm.

La végétation est de type savane arborée avec un tapis herbacé. L’arbre le plus
fréquent est le karité (Vitellaria paradoxa). Le paysage typique de la zone
consiste en une surface d’érosion plane ancienne (pédiment) où s’élèvent des
reliefs gréseux aux pentes abruptes entourés d’éboulis et protégés dans leur
partie supérieure par un couvert de grès résistant ou une cuirasse latéritique. La
faune est constituée par des nombreux insectes d’importance médicale dont le
groupe des Culidae (les Anophèles, Culex et Aèdes). Parmi les vertébrés, on
rencontre des reptiles et plusieurs espèces d’oiseaux et de mammifères.

2 Hydrographie.

Le réseau hydrographique de la Boucle du Baoulé est formé par le Baoulé et ses

affluents. Le Baoulé (842 km) prend sa source dans les monts Mandingues, à
700 m d’altitude avec la confluence des rivières Simanko et Kéniébaoulé. Il se
jette dans le Bakoy au Nord de Toukoto. Les plus importants des affluents du
Baoulé sont de la source vers l’embouchure: le Bafing (rive gauche), le kénié
(rive gauche), le Dla (rive droite), le kéniébako (rive gauche), le Bading-ko (rive
gauche). Le Dla qui marque la limite sud de la zone de Missira représente le
déversoir du lac Wénia. Ce cours d’eau constitue des gîtes larvaires pour les
simulies (vecteur de l’Onchocerca Volvulus) et des gîtes permanents pour le
développement des anophèles.

3 Structure actuelle de la population.

La population est compte 1300 habitants constitués de sédentaires et de

nomades et comprend différentes ethnies (recensement LBMA, 2004). Les
sédentaires sont représentés par les Malinkés et les khassonkés à l’ouest et au
Sud, les Sarakolé, les bambara et les Kakoloh au Nord et à l’Est. Les nomades
sont des peulhs et des Maures. Les premiers conduisent généralement

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55
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

d’importants troupeaux de bovins et les seconds sont plutôt spécialisés dans

l’élevage des ovins et caprins.

Les caractéristiques du peuplement humain auxquelles nous allons faire allusion

dans la suite de ce paragraphe concernent essentiellement la population de la
zone de Missira. Ce village est composé en majorité des Kakoloh qui sont pour
la plupart des cultivateurs. Leur habitat, le modèle le plus répandu est la case en
terrasse entièrement construite en banco (biliso). Le village est dirigé par un chef
(dougoutigi) assisté de quelques conseillers (dougoutigi-séré). Le rôle du chef du
village se résume essentiellement à servir d’intermédiaire entre les autorités
administratives et la population villageoise. Le village se compose d’un certain
nombre de familles, les membres d’une même famille exploitent en général un
champ collectif et possèdent souvent un bétail en commun.

L’activité économique majeure des sédentaires de la zone de Missira est

l’agriculture. La principale culture commerciale est l’arachide. Le mil (Pennisetum
typhoides = sagnon) et le sorgho (Sorghum sp) sont les principales cultures
vivrières, le haricot (Phaseolus lunatus = cho) et le maïs (Zea mais = kaba)
viennent en second plan. La noix de karité (Vitellaria paradoxa) et les fruits de
néré (Parkia biglobosa) constituent les produits de cueillette les plus communs.

La pratique religieuse la plus répandue reste l’animisme. On note actuellement

une influence croissante de l’islam. Les chrétiens sont peu nombreux.

Ce village a fait l’objet d’une thèse de doctorat sur l’onchocercose. Il n y a aucun

poste de santé dans le village. Le centre le plus proche est à 8 kilomètres, il
s’agit du Centre de Santé Communautaire de Sébékoro vers lequel sont
acheminés les malades. La prévalence du paludisme dans le village de Missira
est de 52% de la population générale (Ousmane KOITA, 2001).

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56
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Figure 5: cartographie de la région de Missira (Sources IGM).

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57
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

4 Type de l’étude.

Il s’agit d’une étude transversale qui s’est déroulée sur une période de deux
mois.

5 Période de l’étude.

Notre étude s’est déroulée du 27 Avril au 1 Juin 2004, période de transmission

moins intense du paludisme à l’entrée de la saison des pluies.

6 Critères d’inclusion et de non inclusion.

6-1 Critères d’inclusion.

Avoir un âge compris entre 1 et 9 ans et faisant partie des sujets recensés.

Avoir l’assentiment des parents ou tuteurs en charge de l’enfant.

6-2 Critères de non inclusion.

Il s’agissait de tous les enfants qui ont un âge inférieur à 1 an et ceux qui ont
plus de 9 ans. Ainsi que tous les sujets qui ont refusé de participer à l’étude
d’une manière directe ou indirecte.

7 Echantillonnage.

Notre échantillon a été exhaustif, incluant tous les enfants âgés de 1 à 9 ans
vivant dans le village de Missira. Au total, 304 enfants âgés de 1 à 9 ans
recensés pendant la période d’étude.

8 Gestions et exploitations statistiques des données.

Les formulaires d’enquête étaient vérifiés systématiquement sur le terrain à la fin

de la journée. Ils ont été stockés dans des cantines métalliques et transportées
vers le Laboratoire de Biologie Moléculaire Appliquée (L.B.M.A) où ils ont fait
l’objet d’une vérification rigoureuse. Toutes les lames de goutte épaisse ont été
relues au L.B.M.A par des lecteurs expérimentés, les confettis ont été mis dans

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58
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

des enveloppes, classés et gardés. Les données ont été saisies sur le logiciel
Excel (Microsoft office 2003). Les analyses statistiques ont été faites à partir du
logiciel SPSS (version 11.0 pour Windows). Les tests statistiques utilisés sont:

le chi carré et le test de probabilité exact de Fisher pour la comparaison

des proportions. L’obtention d’une probabilité p inférieure ou égale à 0,05 était
en faveur de l’existence d’un lien statistique entre les variables comparées.
9 Considérations éthiques.
Le protocole de recherche a été examiné et validé par le comité éthique
médicale de la Faculté de Medecine, de Pharmacie et d’odonto stomatologie
(FMPOS) dans le cadre de la phase II de l’essai clinique de la molécule
d’AQ13.
Après cette approbation, nous avons pris contact avec le médecin-chef et le
préfet de Kolokani. Il s’agissait au cours de ces rencontres de leur expliquer les
objectifs de l’étude, mais également de recueillir leur point de vue et
d’appréhender leur niveau d’adhésion.
Puis, nous avons rencontré le maire de la commune rurale de Sébékoro dont
fait partie le village de Missira et les responsables du village de Missira. Après
l’accord du chef du village, du conseil du village et du maire de la commune
rurale de Sébékoro, un formulaire de consentement fut élaboré en détaillant
toutes les modalités de la participation à l’étude. La participation à l’étude était
volontaire. Durant toute la période de l’étude, toute la population (participant à
l’étude ou non participant) a bénéficié de nos prestations (prises en charges
des affections courantes, références sur des structures de santé compétentes
et/ou hospitalisation sur place).

10 Techniques d’analyse.
10-1 Variables cliniques.
10-1-1 Température.

Nous avons utilisé la mesure de la température axillaire. Cette mesure était faite
en plaçant le thermomètre dans le creux axillaire pendant une durée fixe. Etait

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59
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

considéré comme fébrile tout enfant ayant une température supérieure ou égale
à 37,5º C.

10-1-2 La palpation de la Rate.

La rate a été classée selon la méthode de Hackett :

Rate 0: rate normale, non palpable même en inspiration forcée.
Rate 1: rate palpable à la respiration normale.
Rate 2: rate palpable sur la ligne mamalonnaire gauche, ne dépassant pas une
ligne horizontale passant à égale distance entre le rebord costale et l’ombilic.
Rate 3: rate dépassant cette ligne sans franchir l’ombilic.
Rate 4: rate dépassant l’ombilic sans franchir l’horizontale passant à égale
distance entre l’ombilic et la symphyse pubienne.
Rate 5: rate dépassant cette ligne horizontale.

Figure 6: classification des splénomégalies selon la molécule de Hackett.

10-1-3 La mesure de la tension artérielle

10-1-4 Le poids
10-1-5 La taille
10-1-6 Appréciation des conjonctives
10-1-7 La détresse respiratoire
10-1-8 La recherche de signes neurologiques (obnubilation, convulsion, coma)

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60
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

10-2 Variables sociodémographiques

- âge,
- sexe,
- origine,
- la classification ethnique sur la base du nom de famille de l’enfant.

10-3 Variables biologiques.

10-3-1 Goutte épaisse et frottis mince.

Chaque échantillon a servi à confectionner sur des lames différentes un frottis
mince et une goutte épaisse.

10-3-2 Réalisation de la goutte épaisse.

La lame porte objet (Fisher) était numérotée et le sang obtenu par ponction
digitale était déposé au centre. A l’aide d’une seconde lame, on procède à la
défibrination mécanique par des mouvements circulaires de sorte à avoir un
diamètre d’environ 1 cm. Les lames étaient ensuite séchées dans les boîtes de
collection OMS puis colorées et acheminées au laboratoire.

10-3-3 Préparation du giemsa.

Dans un tube en plastique de 50 ml: ajouter 5 ml de giemsa (Sigma, St Louis,
USA) pour 45 ml d’eau distillée tamponnée. Agiter le mélange très doucement.
Cette quantité de 50 ml permet de colorer un nombre important de lames.
Coloration des lames.
Les lames étaient colorées suivant la technique à un temps au Giemsa (Sigma,
St Louis, USA) à 5% dans de l’eau tamponnée à pH 7,2. Cette technique permet
en même temps la déshémoglobinisation et la coloration des éléments du sang.
Après séchage, les frottis sanguins sont au préalable fixés au méthanol (2
minutes) avant la coloration.
- Après séchage, plonger verticalement la lame de goutte épaisse dans le bac
contenant le giemsa dilué à 5% pendant 30 minutes;
- rincer à la pissette avec de l’eau de robinet et sécher sur le râtelier à l’abri des
mouches.

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61
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Le rinçage de la goutte épaisse se fait délicatement à la pissette pour ne pas

décoller la goutte.
Nous avons également utilisé la technique de Field pour la coloration de grandes
quantités d’échantillons. Elle est composée de bleu de méthylène polychrome
(A) et de l’éosine (B). Les solutions sont conservées dans des cuves de
coloration couvertes.
1- tremper l’étalement sec mais non fixé dans la solution A pendant 1ou 2
secondes;
Plonger le film dans la solution B pour 1 ou 2 secondes;
2- le retirer de la solution A et rincer immédiatement à l’aide d’eau propre (vase à
bec plein d’une eau qui coule lentement conviendrait en la circonstance);
3- plonger le film dans la solution B pour 1 à 2 secondes;
4- le rincer à l’eau propre pour quelques secondes;
5- le sécher dans une position verticale.
Si les étalements sont vieux ou très épais, les hématies risquent de ne pas
s’étaler dans le court laps de temps dévoué à la coloration. Si cela est à prévoir,
tremper l’étalement dans de l’eau propre pendant quelques secondes (ou jusqu’à
ce que l’hémoglobine soit dispersée avant la coloration).
Lecture de la goutte épaisse.
la lecture des gouttes a été effectuée au laboratoire de biologie moléculaire
appliquée à l’aide d’un microscope optique (Nikon Eclipse E400, Japon ;
Olympus Optical co, Japon) en immersion ( Stephens Scientific- riverdale, USA)
à l’objectif 100. La parasitémie a été quantifiée suivant la méthode quantitative
leucocytaire. Les parasites étaient comptés en même temps que les leucocytes
sur la lame. Lorsque le nombre de 300 leucocytes était atteint, le compte est
arrêté. La parasitémie était obtenue par la formule suivante (Payne, 1989): P =
(X / Y) 7500 parasites par mm3de sang où X est le nombre de parasites comptés
au microscope et Y le nombre de leucocytes comptés (300 leucocytes) et 7500
la moyenne leucocytaire par mm3 de sang chez l’homme.

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62
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

10-3-2 Le taux d’hémoglobine: mesuré à l’aide de l’hémocue selon les

instructions de fabricant (Mathie Ickeringill)
C’est un appareil portable (Angelholm, Suède) fonctionnant avec pile ou courant
électrique. Il permet de déterminer le taux d’hémoglobine d’une quantité de sang
calibrée introduite dans une microcuvette par une méthode
spectrophotométrique. Il est peu encombrant et peut fonctionner sur groupe
électrogène. Le taux d’hémoglobine peut être rapidement évalué (quelques
secondes) à l’admission du patient.
10-3-2-1 Matériels et réactifs.
- Gants;
- Microcuvettes à usage unique contenant des réactifs (chimiques) sous
forme déshydratée;
- Photomètre portable (instrument mesurant la lumière) fonctionnant avec
le courant électrique à l’aide d’un adaptateur ou cinq piles de 1,5 volts.
Chaque microcuvette a un volume de 10 l et un petit orifice pour la lumière de
0,13 nm entre les parois parallèles de la fenêtre optique. La microcuvette
contient trois réactifs sous forme déshydratée qui convertissent l’hémoglobine en
hémoglobinazide (HiN3):
le désoxychlolate de sodium hémolyse les cellules sanguines ;
le nitrite de sodium convertit l’hémoglobine (fer ferreux) en méthémoglobine (fer
ferrique),
l’azide de sodium convertit la méthémoglobine en méthémoglobinazide (HiN3)

10-3-2-2 Protocole.
Après ponction du bout du doigt, la quatrième goutte de sang au niveau de la
ponction est placée dans la microcuvette par action capillaire. Cette microcuvette
est insérée dans le photomètre de l’hémocue. La lumière passe à travers
l’échantillon et l’absorption de la méthémoglobinazide est mesurée à deux
longueurs d’ondes (570 nm et 880 nm) pour compenser de façon automatique la
turbidité (due à la lipidémie et la leucocytose). Les résultats sont fournis après 45
à 60 secondes en g/l sur la fenêtre numérique.

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63
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Après mesure le photomètre refait son O automatiquement et vérifie l’intensité de

la source lumineuse et le fonctionnement de la cellule lumineuse. Une micro
cuvette de contrôle est fournie avec chaque photomètre pour permettre la
vérification de la calibration de celui-ci.
Le test doit être effectué dans les 10 minutes suivant le remplissage de la
microcuvette.
Alors que l’utilisation de l’hémocue est très simple, il faut être rigoureux dans
son utilisation et l’apprentissage est utile. On recommande la supervision du
laboratoire d’hématologie local pour qu’il vérifie les bonnes pratiques.
De nombreuses études suggèrent que les échantillons capillaires sont sujets à
plus d’erreurs que les échantillons veineux ou artériels. En pratique, il convient
d’analyser deux prélèvements. Le résultat est acceptable si les deux chiffres sont
proches. On peut utiliser des échantillons de sang veineux ou artériel mélangés
et insérés immédiatement dans la microcuvette.
10-3-3 Le test OptiMAL-IT.
C’est un test immunochromatographique qui permet de détecter le LDH des
différents plasmodies. Ce test utilise des anticorps monoclonaux dirigés contre
les antigènes des plasmodies.
10-3-3-1 Matériels et réactifs.
- un dispositif composé d’un puits de réaction (contenant le conjugué) et
d’un puits de lavage et des bandelettes réactives démontables avec anticorps
monoclonaux dirigés contre les antigènes des plasmodies;
- une solution de lyse et de lavage (Buffer);
- une lancette;
- une fermeture pour puits;
- un tampon désinfectant;
- une micropipette à usage unique de 10 l;

10-3-3-2 Protocole
ouvrir la trousse d’aluminium, placer le dispositif contenant les deux puits
(un puits de réaction contenant des anticorps monoclonaux et un puits de

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64
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

lavage) horizontalement sur une surface plane, écrire la date et le nom du patient
dans la zone réservée à cet effet.
Décapuchonner l’ampoule du buffer, mettre 1 goutte (environ 10 µl) du
tampon dans le puits de réaction et 4 (40 µl) dans le puits de lavage. Attendre 1
minute.
Désinfecter le bout du doigt du patient avec le tampon désinfectant, laisser
sécher, piquer la partie latérale du doigt à l’aide de la lancette stérile. Recueillir le
sang à l’aide de la micropipette (environ 8 à 12 µl) à usage unique. Le sang
veineux peut être utilisé en aspirant avec la pipette de la même manière.
Transférer le volume total de sang prélevé avec la micropipette dans le
puits de réaction tout en remuant légèrement. Attendre 1 mn.
Placer le dipstick dans le puits de réaction. Attendre 10 mn ou bout
desquelles il y aura migration de la totalité du mélange de sang et du réactif du
puit le long de la partie réactive de la bandelette.
Placer ensuite la bandelette dans le puits de lavage pendant 10 mn.
Sortir la bandelette du puits de lavage et replacer la dans le support en
plastique. Fermer les deux puits avec le couvercle en plastique. Casser les pose
pieds et les jeter dans la poubelle.
Lire la réaction et interpréter les résultats. Conserver la bandelette testée en cas
de besoin.

10-3-3-3 Interprétation des résultats.

La présence ou l’absence des bandes permet d’interpréter les résultats. On
distingue 3 bandes de réaction:
- une bande de contrôle (bande C);
- une bande commune aux trois espèces du parasite (bande P) sans le
Plasmodium falciparum;
- une bande spécifique à Plasmodium falciparum (bande Pf).Le résultat est
valide lorsque la bande de contrôle est bien visible et la partie réactive de la
bandelette est exempte de sang. Le test est ininterprétable lorsque la bande de
contrôle et la bande Pf seules sont visibles.

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65
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Le test est négatif lorsque seule la bande C est visible.

Le test est positif à Plasmodium ovale; Plasmodium malariae; Plasmodium vivax
lorsque la bande de contrôle C et la bande P sont visibles.
Le test est positif à P. falciparum lorsque les 3 bandes(C, P et Pf) sont visibles.

10-3-4 Techniques de PCR.

10-3-4-1 Confection des confettis.
A l’aide du vaccinostyle une ponction capillaire était effectuée sur le troisième
doigt, après désinfection à l’alcool. La première goutte était éliminée à l’aide d’un
morceau de coton sec. Une à trois gouttes de sang étaient ensuite déposées sur
les deux cercles du papier filtre (Scheilcher & Schuell- Keene, USA). Le papier
filtre était ensuite numéroté en fonction de l’identité du patient et mis à sécher à
l’abri des mouches et de la poussière.
Après séchage, les confettis sont enveloppés et acheminés dans un carton au
laboratoire

Name : ---------------------------------------------

Date : -----------------------------------------------

Figure 10: Confettis en spot.

Le protocole comprend trois étapes qui sont: l’extraction de l’ADN plasmodiale,
l’amplification génique in vitro, et la révélation du produit amplifié.

10-3-4-2 Extraction de l’ADN plasmodial.

L’extraction a été effectuée selon le protocole décrit par Wooden et al., (1992).
Les spots de confettis imbibés de sang sont découpés à l’aide de ciseaux et
introduits dans des tubes Eppendorff de 1,5 ml (Robbins Scientific - Sunnyvale,

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66
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

CA). 1 ml de saponine (Sigma - St Louis, MO) à 1% dans de l’eau distillée était

ajouté et incubé pendant une nuit à 4ºC. La saponine dissout la double couche
phospholipidique du globule rouge. Cette altération détruit la membrane de
l’hématie et libère le parasite. L’incubation à 4°C à pour effet l’inhibition des
enzymes libérées par la lyse des hématies. Le papier filtre était ensuite lavé à
l’aide du PBS 1X (Sigma - St Louis, MO) 3 fois ou jusqu’à ce que la solution
devienne claire. Le PBS est un détergent qui enlève l’hémoglobine et le reste de
la saponine présents dans la solution. Une fois la dernière solution de lavage
éliminée, 200 µl de Chelex-100 (Bio Rad - Hercules, CA) à 5% dans de l’eau
distillée sont ajoutés et chauffés à 56°C pendant 15 mn dans un bain marie.
L’ADN se trouve normalement lié aux ions Mg2+ et Ca2+ qui sont des cofacteurs.
Le Chelex-100 permet la chélation de ces cations polyvalents et libère l’ADN. Sa
capacité de chélation est de 0,6 méq/g de métaux lourds. Le papier filtre est
ensuite trituré à l’aide d’embout de pipette et le tube centrifugé à 12000g pendant
3 mn dans une centrifugeuse Eppendorff (Robbins Scientific).
L’échantillon est porté à ébullition à 100°C pendant 8 mn. Après avoir trituré une
dernière fois le papier filtre est rejeté. L’ébullition à 100°C permet d’achever la
libération de l’ADN. La centrifugation à 12000 g pendant 3 mn permet le dépôt du
Chelex-100 au fond du tube tandis que le surnageant qui contient l’ADN est
recueilli et conservé à 20°C.
Préparation des mélanges réactionnels
Mélange 1 ou Mix 1 : Il était composé de: 19,5µl d’eau distillée (GIBCO-Grand
Island, NY), auxquels étaient ajoutés 3 µl de la solution tampon à la
concentration 10X puis 1,5 µl de solution de MgCl2 à 50 mM. Ensuite 1 µl de
chacun des 4 dNTPs à 10 mM suivi de 1µl de chaque oligonucléotide à 50 µM.
Mélange 2 ou Mix 2 était constitué en ajoutant à 12 µl d’eau distillée, 2 µl de la
solution tampon à la concentration 10X et 0,5 µl de solution de Taq polymérase
(Gibco, Grand Island, NY) à 5 unités par µl.
Les tableaux I et II donnent la composition des Mix 1 et Mix 2.

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67
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Tableau I: composition du mélange réactionnel 1 (Mix 1)

Concentration des réactifs Réactifs volume concentration finale

Eau stérile 9,5 l ---

10x Tampon 3 l 1x
50mM Mgcl2 2 l 2 mM
10mM Dinucléotide phosphate 4 l 0,2mM
50 Amorce 5’ 1 l 1mM
50 M Amorce3’ 1 l 1 mM

30,5 l
Le volume de ce mélange est de 30,5 l dans chaque tube, auquel sera ajouté
un grain de wax. Le grain de wax a pour rôle de séparer les amorces, la Taq
polymérase et l’ADN afin d’empêcher les amplifications non spécifiques, et aussi
d’éviter l’évaporation du volume réactionnel au cours de l’amplification.

Tableau II: composition du mélange réactionnel 2 (Mix2).

Concentration des réactifs Réactifs volume concentration finale

Eau stérile 12 l ----

10x Tampon PCR 2 l 1x
5u Taq polymerase 0,5 l 0,05u
14,5 l

10-3-4-4 Protocole opératoire.

L’ensemble de la réaction était réalisée dans un tube à PCR de 0,2 ml (Robbins
Scientific - Sunnyvale, CA) et le volume réactionnel total était de 50 µl. Dans le
tube de 0,2 ml étaient disposés 30,5 µl du Mix 1 auquel est ajouté un grain du
Wax (Perkin Elmer). Le tube était ensuite porté à 73°C pendant 3 mn pour
inactiver les enzymes. Après refroidissement, 14,5 µl du Mix 2 étaient ajoutés
suivis de 5 µl de la solution contenant l’ADN à amplifier. Le tube ainsi prêt était

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68
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

placé dans le thermocycleur GENE AMP* PCR system 2700 (Applied Biosystem)
et le programme d’amplification était enfin appliqué.

Programme
Pour la PCR simple du gène LDH, la dénaturation initiale est effectuée à 95°C
pendant 2 mn; suivent 35 cycles d’amplification avec dénaturation à 94°C
pendant 30 secondes, hybridation à 58°C pendant 1 minute et extension à 72°C
pendant 1 minute et un cycle d’extension finale 72ºC pendant 10 minutes.
Pour la nested PCR (augmentation de la sensibilité de l’amplification) avec les
amorces du gène LDH, la première amplification comporte une dénaturation
initiale à 95°C pendant 2 mn suivie de 35 cycles d’amplification avec
dénaturation proprement dite à 94°C pendant 30 secondes, hybridation à 58°C
pendant 1 minute, extension à 72°C pendant 1 minute et l’extension finale 72ºC
pendant 10 minutes. Au moment de la deuxième amplification, 2 µl de produit de
la première amplification sont utilisés comme matrice d’ADN. Les conditions
d’amplification sont les mêmes que celles de la PCR simple.
Pour la PCR simple du gène de MSP-1, la température de dénaturation initiale
est de 95ºC pendant 5 minutes, suivent 35 cycles d’amplification avec
dénaturation de 94ºC pendant 30 secondes, hybridation à 55ºC pendant 30
secondes, l’extension à 72ºC pendant 2 minutes.
L’amplification du bloc 2 (utilisation des amorces spécifiques K1, MAD20, RO33)
a été faite par nested PCR (PCR nichée). Elle consiste à amplifier le produit
obtenu durant la première amplification par les amorces spécifiques K1, MAD20
et RO33. Ainsi 2 l de la première amplification (MSP-1) sont ajoutés au
mélange réactionnel final (Mix1 et Mix2).
Une dénaturation initiale de 5 minutes à 95ºC suivie de 35 cycles de:
- dénaturation pendant 30 secondes à 94ºC,
- appariement pendant 30 secondes à 57ºC,
- extension pendant 1 minute à 72ºC.

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69
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

PCR nichée 1ère amplification par les

MSP-1 amorces du boc 1

2 ème amplification
par les amorces
spécifiques du boc 2

K1 Mad20 Ro33 Mad-Ro

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70
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

10-3-4-5 Séquence de LDH

ATG GCA CCA AAA GCA AAA ATC GTT TTA GTT 30
GGC TCA GGT ATG ATT GGA GGA GTA ATG GCT 60
ACC TTA ATT GTT CAG AAA AAT TTA GGA GAT 90
GTA GTT TTG TTC GAT ATT GTA AAG AAC ATG 120
CCA CAT GGA AAA GCT TTA GAT ACA TCT CAT 150
ACT AAT GTT ATG GCA TAT TCA AAT TGC AAA 180
GTA AGT GGT TCA AAC ACT TAT GAC GAT TTG 210
GCT GGA GCA GAT GTA GTA ATA GTA ACA GCT 240
GGA TTT ACC AAG GCC CCA GGA AAG AGT GAC 270
AAA GAA TGG AAT AGA GAT GAT TTA TTA CCA 300
TTA AAC AAC AAG ATT ATG ATT GAA ATT GGT 330
GGT CAT ATT AAG AAG AAT TGT CCA AAT GCT 360
TTT ATT ATT GTT GTA ACA AAC CCA GTA GAT 390
G T TA TGG TAC AAT TAT TAC ATC AAC ATT CAG 420
GTG TTC CTA AAA ACA AGA TTA TTG GTT TAG 450
GTG GTG TAT TAG ATA CAT CAA GAT TGA AGT 480
ATT ACA TAT CTC AGA AAT TAA ATG TAT GCC 510
CAA GAG ATG TAA ATG CAC ACA TTG TAG GTG 540
CTC ATG GAA ATA AAA TGG TTC TTT TAA AAA 570
GAT ACA TTA CTG TAG GTG GTA TCC CTT TAC 600
AAG AAT TTA TTA ATA ACA AGT TAA TTT CTG 630
ATG CTG AAT TAG AAG CTA TAT TTG ATA GAA 660
CTG TTA ATA CTG CAT TAG AAA TTG TAA ACT 690
TAC ATG CAT CAC CAT ATG TTG CAC CAG CTG 720
CTG CTA TTA TCG AAA TGG CTG AAT CCT ACT 750
TAA AAG ATT TGA AAA AAG TAT TAA TTT GCT 780
CAA CCT TGT TAG AAG GAC AAT ATG GAC ACT 810
CCG ATA TAT TCG GTG GTA CAC CTG TTG TTT 840
TAG GTG CTA ATG GTG TTG AAC AAG TTA TCG 870
AAT TAC AAT TAA ATA GTG AGG AAA AAG CTA 900
AAT TTG ATG AAG CCA TAG CTG AAA CTA AGA 930
GAA TGA AGG CAT TAG CTT AA 950

Figure 10: Séquence du gène de PfLDH de GenBank (gi/ 10180805/ gb/ AF

251291.1/ AF 251291)

Légende : La séquence de l’amorce PfLDH 5’ est soulignée en jaune : A GGT

ATG ATT GGA GGA GTA ATG GCT

La séquence de l’amorce PfLDH 3’ est soulignée en violet: T TTG ATG AAG

CCA TAG CTG AAA CTA AGA GA

La séquence de l’amorce RTLDH 5’est soulignée en bleu:

TTGCGTAAGTGGTTCA AACAC

La séquence de l’amorce RTLDH 3’est soulignée en vert: AACCCA

GTAGATGT

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71
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

10-3-4-6 Préparation du gel à 2%.

Deux grammes d’agarose ultra pure (GIBCO, Life Technologies) sont pesés puis
versés dans un erlenmeyer de 1000 ml. Ensuite 100 ml de TBE 0,5X (GIBCO,
Life Technologie) étaient ajoutés et le mélange est porté à 100°C pendant 1 min
30s. Après chauffage, 30 µl de Bromure d’Ethydium (0,3 mg/ml -Sigma) sont
ajoutés. La préparation ainsi obtenue est coulée dans un support de gel avec un
peigne à 10, 15 ou 20 dents suivant le nombre d’échantillons. La polymérisation
du gel a lieu en 25 minutes.

10-3-4-7 Révélation des produits amplifiés.

Douze microlitres du produit d’amplification mélangés à 2 µl de «dye» (Quality
Biological Inc, Gaithersbug, MD) étaient chargés dans un gel d’agarose à 2%
placé dans un bac de migration contenant 700 ml de Tris Borate EDTA 0,5X
(GIBCO, Life Sciences) et de 210 µl de Bromure d’Ethydium (GIBCO, Life
Sciences). Une tension de 100 V (200 mA) était appliquée pendant 45mn. Au
niveau de la première colonne de migration étaient déposés 12 µl de marqueur
de poids moléculaire (Boerhinger Mannheim, Indianapolis IND). Le gel était
rendu fluorescent par le Bromure d’Ethydium (Sigma, St Louis, Mo). Après l’arrêt
de la migration le gel était photographié sous UV (Transilluminateur, Fisher) à
l’aide d’une caméra photo (KODAK ). L’image visualisée est interprétée et les
bandes identifiées pour chaque paire d’amorces étaient ensuite enregistrées
dans le tableau sur windows 2000.

10-3-4-8 Interprétation des résultats.

Sur la photographie les produits amplifiés apparaissent sous forme de bandes.
La taille des produits amplifiés est exprimée en nombre de paires de base en
référence au standard à l’aide du programme, «Kodak EDAS290». Les
standards utilisés sont pBR322/Hae III, pBR328/Bg/ I et pBR328/Hinf I
(Molecular Markers V et VI - Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN).

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72
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

10-3-5 séquençage de gène

Nous avons utilisé le séquenceur automatique de nucléotide CEQTM 2000 XL de
Beckman Coulter (Fullerton, Ca) utilisant le système capillaire.
10-3-5-1 Purification des amplicons
Procédure
Vingt microlitres des amplifiats (produits amplifiés par PCR) sont transfèrés dans
des plaques de lavage de 96 puits à fond plat (Millipore, France) avec 150µl
d’eau stérile et le mélange est aspiré par une pompe à vide montée sur un
compresseur; cette opération est répétée 2 fois. Ensuite, 40 µl d’eau stérile est
ajoutée dans chaque puits et la plaque est soumise à une agitation pendant 5 à
10 minutes; Le contenu de la plaque est transfèré dans une autre plaque de 96
puits (Corning, NY) avant de procéder au cycle de séquençage (conserver à –
30ºC avant usage).

10-3-5-2 Cycle de séquençage

Mélange
Trois µl d’amplifiats lavés sont ajoutés à 1 µl d’amorce (allée ou retour) et 4 µl de
DUTCS (Quick Start Master Mix contenant le tampon, les DNTPS, les colorants
de charge des nucléotides, l’ADN polymérase (Invitrogen, CA) pour séquençage,
le volume réactionnel de 10 µl est obtenu avec un ajout de 2 µl d’eau. Les
plaques sont ensuite scellées avec une feuille plastique.

Conditions d’amplification pour le séquençage

Stade1 : 75º pendant 2 mn
Stade 2 : 94º pendant 2 mn
Stade 3 : 96º pendant 20 s
Stade 4 : 50º pendant 10s
Stade 5: 60º pendant 4 mn
Stade 6: retour 30 fois au stade 2
Stade 7 : 4º jusqu’à l’infini

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73
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

10-3-5-3 Préparation de plaques de Séphadex

Matériels
Plaques de Séphadex-50
Poudre de Séphadex Tm G-50 (Amersham Biosciences AB)
Moule de Séphadex-50 plaques

Procédure
Remplir le moule avec la poudre Séphadex;
Ajuster le niveau de la poudre dans le moule;
Bien placer la plaque dans le moule en inversant le système;
Transférer toute la poudre dans la plaque;
Additionner 300 µl (150 µl deux fois) d’eau et conserver à 4º avant usage.

10-3-5-4 Purification des produits de séquençage.

Centrifuger la plaque Séphadex-50 pendant 5 mn à 2500 rpm pour enlever l’eau;
Additionner 10 µl du produit séquencé dans la plaque Séphadex;
Superposer la plaque Séphadex sur une plaque en maintenant soigneusement
les plaques en utilisant un adaptateur ;
Centrifuger pendant 5mn à 2500 rpm, récupérer l’éluant et procéder au séchage
avec le speedvac pendant 20 mn et placer le formamide à la température
ambiante;
Après séchage, additionner 25 µl de formamide plus une goutte d’huile minérale
dans chaque puits;
Procéder au séquençage.
Additionner 150 µl d’eau dans la plaque Séphadex si on ne l’utilise pas et la
conserver à 4ºC.

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74
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

V. RESULTATS

5-1 Caractéristiques socio-démographiques

Tableau I: répartition de l’échantillon en fonction du sexe et de l’âge.

Classes Sexe
d’âge
Masculin % Féminin % Total %
1- 5 ans
100 64,1 83 56,1 183 60,2

6- 9 ans 56 35,9 65 43,9 121 39,8

Total 156 100 148 100 304 100

Les sujets de sexe masculin 51,3% (156/304) étaient plus représentés que ceux
de sexe féminin 48,7 (148/304) dans notre échantillonnage. Le sexe ratio est de
1, 05 en faveur du sexe masculin.

5-2 Comparaison des résultats de la goutte épaisse et du test OptiMAL-IT

5-2-1 Prévalence globale
Tableau II: taux de prévalence estimé par les deux tests (la goutte épaisse et le
test OptiMAL-IT).

Effectif Total Effectif Positif Pourcentage

Goutte épaisse
304 122 40,1

Test OptiMAL 304 123 40,5

La prévalence de l’infection palustre par l’observation de la goutte épaisse était

de 40,1% dans notre population d’étude soit 122 / 304 et celle du test OptiMAL-
IT était de 40,5% soit 121/304.

5-2-2 Valeurs diagnostiques

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75
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Tableau III: comparaison des résultats du test OptiMAL-IT par rapport à la goutte
épaisse.

Goutte épaisse
Test
Total
OptiMAL-IT Positive % Négative %

Positif 114 93,4 9 4,9 123 40,5

Négatif 8 6,6 173 95,1 181 59,5

Total 122 100 182 100 304 100

Test OptiMAL-IT Pourcentages

Sensibilité 93,4% (114/122)

Spécificité 95,1% (173/182)

Valeur prédictive négative 95,6% (173/181)

Valeur prédictive positive 92,7% (114/123)

Concordance Kappa 0,88

Nous avons observé 9 faux positifs par la technique de l’OptiMAL-IT par rapport
à la goutte épaisse. C’est à dire négatifs à la goutte épaisse mais positifs au test
OptiMAL-IT. De même 8 échantillons négatifs par la technique de l’OptiMAL-IT
s’étaient avérés positifs à la goutte épaisse.

Nous avons obtenu une bonne concordance Kappa= 0,88.

Un cas d’association de P. malariae et de P. ovale a été identifié à la fois par le

test OptiMAL-IT et par la goutte épaisse.

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76
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

5-2-3 Charge parasitaire

Tableau IV: résultats du test OptiMAL-IT en fonction des différentes classes de

la parasitémie.

Test OptiMAL-IT
Parasitémie
(Tf / mm3) Effectif total Fréquence Pourcentage positif
positive

17 16 94,1
25-50
75-500 71 65 91,5

525-1000 15 15 100
>1000 19 18 94,7
Totale 122 114

La moyenne géométrique de la densité parasitaire positive était de 261,26±

995,51. La densité minimale était de 25 trophozoïtes par mm3 de sang et la
maximale de 6375 trophozoïtes par mm3 de sang. Les sujets les plus nombreux
sont ceux ayant une parasitémie comprise entre 75-500, soit 58,2% (71/ 122)
suivi des patients ayant une parasitémie supérieure à 1000 trophozoïtes par mm3
de sang (15,6%).

L’analyse de ce tableau nous indique que le test OptiMAL-IT a pu mettre en

évidence des parasites dans toutes les classes de densité parasitaire. La
concordance dans la classe de parasitémie moyenne (525-1000 trophozoïtes par
mm3 de sang) a été de 100%.

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77
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Tableau V : résultats de la parasitémie en fonction de l’âge.

Parasitémie Total
Classes
d’âge 25-50 % 75-500 % 525-1000 >1000

1-5 ans 8 47,1 49 69 10 66,7 16 84,21 83 68

6-9 ans 9 52,9 22 31 5 33,3 3 15,79 39 32

Total 17 100 71 100 15 100 19 100 122 100

Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les classes d’âge
par rapport aux classes de parasitémie. (χ2= 5,77 et p= 0,12).

Les densités parasitaires inférieures à 75 p/µl augmentaient avec l’âge, tandis

que celles supérieures ou égales 75 p/µl diminuaient avec l’âge.

5-2-4 Espèces

Tableau VI: étude comparative des résultats du test OptiMAL-IT et de la goutte

épaisse en fonction des espèces de plasmodies.

Espèce Pf Pm Po

GE P N P N P N

OptiMAL-IT
Positif 111 12 5 118 3 120

Négatif 8 173 1 180 0 181

Total 119 185 6 298 3 301

L’analyse de ce tableau nous montre que le test OptiMAL-IT nous a permis de
poser le diagnostic d’espèce dans la grande majorité des cas. Aucun cas de
Plasmodium vivax n’a été retrouvé.
L’échantillon 3179 est négatif au test OptiMAL-IT et positif à la goutte épaisse.

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78
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Tableau VII: sensibilité du test OptiMAL-IT sur les différents stades parasitaires
de Plasmodium falciparum.

Test Plasmodium falciparum

OptiMAL
-IT Tf % Gam Tf + Gam Tf + Sch

Positif 111 93,3 2 5 2

Négatif 8 6,7 0 0 0

Total 119 100 2 5 2

NB Tf: Trophozoïte de P. falciparum, Sch: Schizonte de P. falciparum, Gam:

gamétocyte de P. falciparum.

Le test OptiMAL-IT a permis l’identification des différents stades parasitaires de

P. falciparum avec une concordance de 100% avec la goutte épaisse. Nous
n’avions pas obtenu de Schizonte seule mais plutôt en association.

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79
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

5-2-5 Distribution de la fréquence de l’infection plasmodiale par groupe d’âge

Tableau VIII: répartition de l’indice plasmodique (goutte épaisse, test OptiMAL-

IT) en fonction de l’âge.

Goutte épaisse Positive Test OptiMAL-IT

Classes d’âge
Effectif Fréq positive Effectif Fréq Positive

1-5 ans 183 83 183 83

6- 9 ans 121 39 121 40

Total 304 122 304 123

Fréq : Fréquence

Il y avait une différence statistiquement significative entre les classes d’âge par
rapport aux résultats de la goutte épaisse. (χ2= 5,22 et p= 0,02). Ainsi qu’ entre
les classes d’âge du point de vue résultat du test OptiMAL-IT. (χ2= 4,57 et p=
0,04).

Les enfants de 1 à 5 ans étaient les plus infectés par les plasmodies avec une
fréquence de 45,36% (83 / 183) contre 32,23% (39/121) pour la goutte épaisse
et 45,36% (83 / 183) contre 33,06 (40/121) pour le test OptiMAL-IT.

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80
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

5-2-6 Distribution de la fréquence de l’infection selon le statut la fièvre

Tableau IX: relation entre la positivité à la goutte épaisse, au test OptiMAL-IT et

l’état fébrile des patients.

Goutte épaisse Test OptiMAL-IT

Température
Positive % Positive %

72 59,02 73 59,35
< 37,5ºC
50 40,98 50 40,65
37,5ºC
122 100 123 100
Total

Nous pouvons dire que l’état fébrile des patients n’est pas lié à la positivité de la
goutte épaisse (χ2 = 0,29 ; p= 0,63). De même qu’au test OptiMAL-IT (χ2 = 0,12 ;
p = 0,72).

5-2-7 Distribution de la fréquence de l’infection selon le statut de l’hémoglobine

Tableau X: relation entre la positivité de la goutte épaisse et le taux

d’hémoglobine.

Goutte épaisse Positive Pourcentage

Hémoglobine %
51 41,8
< 10
10 71 58,2

Total 122 100

Il ressort de ce tableau qu’il n’existe pas de relation statistiquement significative

entre la positivité de la goutte épaisse et le taux d’hémoglobine (χ2 = 2,8; p =
0,1).

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81
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

5-3 Résultats moléculaires

5-3-1 Polymerase chain reaction

Tableau XI: les échantillons concordants et discordants par la goutte épaisse et

le test OptiMAL-IT.

GE - OptiMAL-IT Effectif Pourcentage

Concordants 287 94,41

Discordants 17 5,59

Total 304 100

La PCR a été faite sur 17 échantillons non concordants qui constituent les faux
positifs et les faux négatifs du test OptiMAL-IT par rapport à la goutte épaisse.

Tableau XII: répartition des échantillons traités par la technique de la PCR

nichée de MSP-1.

Allotypes Effectifs positifs Pourcentage

PCR – 14 82.35
PCR + 3 17,65
Total 17 100

Sur les 17 échantillons discordants traités, seul 17,65% (3/17) se sont avérés
être positifs par la PCR. Parmis les trois échantillons positifs à la PCR, deux
échantillons étaient positifs à la goutte épaisse et un positif au test OptiMAL-IT.

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82
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Gel 1

Bande

Figure 11 : résultat de la PCR à laquelle l’échantillon 3216 (positif à la goutte

épaisse, négatif au test OptiMAL-IT et négatif à la PCR nichée) a été positif aux
amorces EBA-175 (Erythrocyte Binding Antigen-175).
Sur cette photo le marqueur VI est en position 3 et l’échantillon 3216 en position
7 sur le gel.

Tableau XIII: étude comparative du test OptiMAL-IT par rapport à la PCR de

MSP-1.

Test PCR(MSP-1)
Total %
OptiMAL-IT Positive % Négative %

Positive 1 33,3 6 42,9 7 41,2

Négative 2 66,7 8 57,1 10 58,8

Total 3 100 14 100 17 100

Ce tableau nous montre qu’il n’y a pas une concordance entre ces deux tests.
Nous avions observé 6 faux positifs et 2 faux négatifs par le test OptiMAL-IT
comparé à la PCR.
Tableau XIV: prévalence des allotypes de la MSP-1 des échantillons discordants
positifs à la PCR.

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83
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Echantillons/Allotypes K1 MAD20 RO33 Total

3113 0 0 1 1
3118 0 1 0 1
3162 0 0 1 1
Total 0 1 2 3
Fréquence 0 33,33 66,67 100
L’allotype RO33 a été majoritaire avec 66,67%. Nous n’avons pas retrouvé
l’allotype K1 au cours de notre amplification. Nous n’avons pas observé de
polymorphisme intra-allélique chez un même patient au cours de notre étude.

Gel 2

Figure 12 : résultat de la PCR à laquelle l’échantillon 3162 (négatif à la goutte

épaisse, positif au test OptiMAL-IT) a été positif aux amorces RO33 par la PCR
nichée.
Sur cette figure, le puits 1 représente le marqueur VI, les 6 puits suivants
l’amplification des échantillons 2803 et 3101 avec les marqueurs K1, MAD20 et
RO33 n’ont donné aucune amplification. L’échantillon 1201qui est un contrôle
positif amplifié avec les amorces K1, MAD20 et RO33 dans les puits 11,12,13 a
révélé une bande avec le marqueur K1 et RO33.
Gel 3

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84
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Figure 13 : résultat de la PCR à laquelle l’échantillon 3113 (positif à la goutte

épaisse et négatif au test OptiMAL-IT) a été positif aux amorces RO33 par la
PCR nichée.

A part l’échantillon 3113 qui était positif avec le marqueur RO33, les autres
échantillons se sont révélés négatifs à la PCR de MSP-1 avec les marqueurs K1,
MAD20 et RO33. La bande dans le puits 14 était le contrôle positif.
Nous avons utilisé une paire d’amorces permettant d’amplifier le fragment d’ADN
de PfLDH de 222 paires de bases entre l’échantillon 3162 et 3216. Les produits
ainsi obtenus étaient ainsi séquences.

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85
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Gel 4

Figure 14: résultat de la PCR à laquelle les échantillons 412 (positif à goutte
épaisse et au test OptiMAL-IT), 3118 (positif à la goutte épaisse et négatif au test
OptiMAL-IT), 3162 (positif au test OptiMAL-IT et négatif à la goutte épaisse),
3216 (positif à la goutte épaisse, négatif au test OptiMAL-IT, négatif à la PCR
nichée et positif aux amorces EBA-175 (Erythrocyte Binding Antigen-175) ont été
positifs aux amorces PfLDH.

Cette photo de gel d’agarose montre les produits d’amplification obtenus avec
les amorces de PfLDH avec les échantillons 412, 3118, 3162 et 3116. Ces
amplifiats présentent le même profil migratoire, reflétant une stabilité de la partie
conservée du gène.

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86
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Les Résultats de séquençage. Les produits de PCR obtenus (figure 13) ont été
séquencés. Leur séquence a été comparée à la séquence du gène de
Plasmodium falciparum (PfLDH) avec le numéro d’accès au GenBank est
AF251291.
Pfldh ATG GCA CCA AAA GCA AAA ATC GTT TTA GTT 30
Pfldhmal4 -- - --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh GGC TCA GGT ATG ATT GGA GGA GTA ATG GCT 60
Pfldhmal4 --- --- -- - --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh ACC TTA ATT GTT CAG AAA AAT TTA GGA GAT 90
Pfldhmal4 --- --- --- --- --- --- --- --- --- - - -

Pfldh GTA GTT TTG TTC GAT ATT GTA AAG AAC ATG 120
Pfldhmal4 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh CCA CAT GGA AAA GCT TTA GAT ACA TCT CAT 150
Pfldhmal4 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh ACT AAT GTT ATG GCA TAT TCA AAT TGC AAA 180
Pfldhmal4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -T TGC AAA 10

Pfldh GTA AGT GGT TCA AAC ACT TAT GAC GAT TTG 210
Pfldhmal4 GTA AGT GGT TCA AAC ACT TAT GAC GAT TTG 40

Pfldh GCT GGA GCA GAT GTA GTA ATA GTA ACA GCT 240
Pfldhmal4 GCT GGA GCA GAT GTA GTA ATA GTA ACA GCT 70

Pfldh GGA TTT ACC AAG GCC CCA GGA AAG AGT GAC 270
Pfldhmal4 GGA TTT ACC AAG GCC CCA GGA AAG AGT GAC 100

Pfldh AAA GAA TGG AAT AGA GAT GAT TTA TTA CCA 300
Pfldhmal4 AAA GAA TGG AAT AGA GAT GAT TTA TTA CCA 130

Pfldh TTA AAC AAC AAG ATT ATG ATT GAA ATT GGT 330
Pfldhmal4 TTA AAC AAC AAG ATT ATG ATT GAA ATT GGT 160

Pfldh GGT CAT ATT AAG AAG AAT TGT CCA AAT GCT 360
Pfldhmal4 GGT CAT ATT AAG AAG AAT TGT CCA AAT GCT 190

Pfldh TTT ATT ATT GTT GTA ACA AAC CCA GTA GAT 390
Pfldhmal4 TTT ATT ATT GTT GTA ACA AAC CCA GTA GAT 220

Pfldh GTT A TGG TAC AAT TAT TAC ATC AAC ATT CAG 420
Pfldhmal4 GT - -- 222

Figure 15: Alignement de la séquence nucléotidique de l’échantillon 3162 (GE négative,

OptiMAL-IT positif) avec la séquence PfLDH du GenBank.

La séquence utilisée comme amorce allée pour amplifier le fragment est

soulignée et est similaire à la séquence du GenBank. La séquence utilisée

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87
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

comme amorce retour soulignée est identique à celle de la séquence du

GenBank.
L’échantillon 3162 a été positif au test d’OptiMAL-IT mais négatif à la goutte
épaisse. Le fait que la PCR soit positive atteste que la goutte épaisse a donné un
faux négatif. Les fragments des 2 séquences sont totalement identiques et
aucune mutation nucléotidique n’est observée le long du fragment de 222
nucléotides amplifiés par la technique de PCR et révélés par le séquençage.

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88
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Alignement de l’amorce retour de l’échantillon 3216

Pfldh ATG GCA CCA AAA GCA AAA ATC GTT TTA GTT 30
Pfldhmal5 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh GGC TCA GGT ATG ATT GGA GGA GTA ATG GCT 60
Pfldhmal5 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh ACC TTA ATT GTT CAG AAA AAT TTA GGA GAT 90
Pfldhmal5 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh GTA GTT TTG TTC GAT ATT GTA AAG AAC ATG 120
Pfldhmal5 --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

Pfldh CCA CAT GGA AAA GCT TTA GAT ACA TCT CAT 150
Pfldhmal5 --- --- --- --- --- --- --- - -- --- ---

Pfldh ACT AAT GTT ATG GCA TAT TCA AAT TGC AAA 180
Pfldhmal5 --- --- --- - -- --- --- --- -- - --- ---

Pfldh GTA AGT GGT TCA AAC ACT TAT GAC GAT TTG 210
Pfldhmal5 - - - - - - GGT TCA AAC ACT TAT GAC GAT TTG 24

Pfldh GCT GGA GCA GAT GTA GTA ATA GTA ACA GCT 240
Pfldhmal5 GCT GGA GCA GAT GTA GTA ATA GTA ACA GCT 54

Pfldh GGA TTT ACC AAG GCC CCA GGA AAG AGT GAC 270
Pfldhmal5 GGA TTT ACC AAG GCC CCA GGA AAG AGT GAC 84

Pfldh AAA GAA TGG AAT AGA GAT GAT TTA TTA CCA 300
Pfldhmal5 AAA GAA TGG AAT AGA GAT GAT TTA TTA CCA 114

Pfldh TTA AAC AAC AAG ATT ATG ATT GAA ATT GGT 330
Pfldhmal5 TTA AAC AAC AAG ATT ATG ATT GAA ATT GGT 137

Pfldh GGT CAT ATT AAG AAG AAT TGT CCA AAT GCT 360
Pfldhmal5 GGT CAT ATT AAG AAG AAT TGT CCA AAT GCT 167

Pfldh TTT ATT ATT GTT GTA ACA AAC CCA GTA GAT 390
Pfldhmal5 TTT ATT ATT GTT GTA ACAAAC CCA GTA GAT 197

Pfldh G T TA TGG TAC AAT TAT TAC ATC AAC ATT CAG 420
Pfldhmal5 GT-- --- - 199

Figure 16: Alignement de la séquence nucléotidique de l’échantillon 3216 (GE

positive, OptiMAL-IT négatif) avec la séquence PfLDH (gi/ 10180805/gb/
AF251291.1/ AF251291).

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89
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

La séquence utilisée comme amorce aller pour amplifier le fragment est

soulignée et est similaire à la séquence du GenBank. La séquence utilisée
comme amorce retour soulignée est identique à celle de la séquence du
GenBank.
L’échantillon 3216 a été négatif au test d’OptiMAL-IT mais positif à la goutte
épaisse. Ce résultat indique que le parasite était présent dans le sang
(parasitémie de 1025 parasites/µl) mais que les antigènes plasmodiaux de LDH
n’étaient reconnaissables par les anticorps monoclonaux sur la bandelette
réactive du test OptiMAL-IT. Le fait que la PCR est positive réconforte que
l’OptiMAL-IT a donné un faux négatif. Les fragments des 2 séquences sont
totalement identiques et aucune mutation nucléotidique n’est observée le long du
fragment de 199 nucléotides amplifiés par la technique de PCR et révélés par le
séquençage.

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90
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

VI. COMMENTAIRE ET DISCUSSIONS

Cette étude nous a permis de déterminer les valeurs diagnostiques de

l’OptiMAL-IT par rapport à la goutte épaisse classique et de déterminer le
polymorphisme génétique du gène codant pour la lactate déshydrogénase
(LDH) de Plasmodium falciparum dans le village de Missira (cercle de Kolokani).

1 Méthodologie
Notre étude a été réalisée pendant la saison sèche entre Avril et Juin 2004.
L’année est caractérisée par une période de saison sèche de Novembre à Mai et
une période hivernale qui commence au mois de Juin et finit en Octobre.
La raison du choix du village de Missira comme lieu d’étude se justifie par son
accessibilité en toute saison (situé à 50 Km à l’Est de Kolokani) et par la bonne
collaboration qui existe entre la population du village et notre centre de
recherche. Le village de Missira est par ailleurs une zone d’endémie palustre qui
a servi de lieu d’étude pour l’essai thérapeutique de l’ivermectine dans le
traitement de l’onchocercose (Bissan, 1985). La présence sur place d’une
structure de santé facilite nos conditions de collecte des données et de suivi
clinique des patients.
Le choix de la période d’étude (début de saison de pluie) a dû cependant
influencer nos indices plasmodiques eu égard au faible taux d’inoculation
entomologique. Les données obtenues en période de forte transmission
(octobre) n’ont cependant pas montré de différence statistiquement significative.
Cela montre que la transmission du paludisme dans le village de Missira s’étale
sur presque toute l’année. Koita et al., 2000 ont montré une distribution similaire
de l’infection palustre dans le village de Bancoumana situé à 60 Km au sud-
ouest de Bamako.
Les enfants de 1 à 9 ans ont constitué notre population d’étude du fait du suivi
aisé de cette tranche de la population. Ceux-ci étant déjà recensés, ils se
présentaient à l’inclusion suivant l’ordre de présentation au centre de santé.

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91
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Nous avons au cours de notre étude collecté les échantillons de sang sur papier
confetti selon la technique des spots afin d’éviter l’utilisation d’une chaîne de
froid pour la conservation, de minimiser les contaminations et de prélever des
quantités identiques de sang chez chaque enfant. Cette technique à l’avantage
d’éviter l’utilisation d’anticoagulant qui pourrait inhiber la réaction d’amplification
génique ultérieure.
Notre échantillonnage a été exhaustif pendant la période d’étude. Il est
comparable à celui utilisé par Oduola et al au Nigeria.
L’ADN a été extrait selon la technique du Chelex-100. Les réactifs utilisés au
cours de cette technique sont stables à la température ambiante et ne présentent
pas de danger pour le manipulateur à l’inverse de la technique du phénol /
chloroforme qui est toxique et celle au méthanol qui est très contaminant.
Nous avons utilisé la technique de la PCR nichée (nested PCR) pour
l’amplification de la séquence désirée. Cette technique a l’avantage de permettre
l’amplification de très petites parasitémies. Koita et al., Doumbo et al. ont
procédé de façon similaire au cours des études effectuées à Bancoumana et à
Ménaka. Les amorces utilisées sont celles s’hybridant aux séquences
nucléotidiques conservées des blocs 1 et 3 du gène de la MSP-1 et permettant
l’amplification du bloc 2 qui est variable. Ces amorces nous ont ainsi permis le
typage des allotypes K1, MAD20, RO33 tel que décrit par Tanabé et al et Certa
et al.
Nous avons utilisé des méthodes de dépistage de l’infection palustre qui
s’appuient sur des caractères parasitaires différents, la goutte épaisse qui
explore les caractéristiques morphologiques du parasite, les tests rapides qui
s’adressent aux antigènes libérés au cours du cycle du parasite, la PCR explore
l’empreinte génétique au niveau de l’ADN parasitaire et en fin le séquençage
pour confirmer nos résultats.

2 Caractères sociodémographiques de la population

L’analyse de la distribution de notre population d’étude selon l’âge a montré une
prédominance des enfants dont la tranche d’âge était comprise entre 1 et 5 ans

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

92
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

avec une fréquence de 60,2%. Les enfants âgés de 6 à 9 ans étaient les moins
représentés avec 39,8%. Parmi les 304 enfants étudiés, 156 (51,3%) sont de
sexe masculin et 148 (48,8%) de sexe féminin avec un sexe ratio de 1,05 en
faveur du sexe masculin (Tableau I).
Des résultats similaires ont été obtenus par Bagayogo et al. en 2003 au centre
hospitalier de Luxembourg ont obtenu au cours de leur étude, 50,09% des
enfants de 5 à 12 ans de sexe masculin et 49,91 de patients de sexe féminin.
Une étude faite par Keita M.M en milieu hospitalier à Bamako en pédiatrie en
2000 a aboutit au même résultat. Toutes ces études se sont déroulées chez les
enfants.

3 Prévalence de l’infection palustre chez les enfants

La prévalence de l’infection palustre dans notre population d’étude était de
40,1% par la goutte épaisse tandis qu’elle était de 52% en fin d’hivernage à
Missira (Koita et al. 2001). Cette variabilité de la prévalence de l’infection à
Plasmodium falciparum d’une zone à une autre, et d’année en année aurait 2
raisons essentielles. D’une part cela pourrait s’expliquer par les variations de la
pluviométrie (très faible dans le septentrion malien avec un écosystème très
différent de la steppe soudanienne) et d’autre part par l’augmentation de la
couverture socio sanitaire et de la sensibilisation de la population pour les
mesures préventives.
Il est possible que la prévalence obtenue au cours de notre étude augmente
durant la saison de pluie nous permettant de faire une comparaison avec
d’autres faciès durant la même période d’étude. Plasmodium falciparum a été
l’espèce plasmodiale la plus rencontrée au cours de notre étude avec 111 sujets
infectés, soit 93,3%. Il a été retrouvé en 2004 au village de Missira une formule
parasitaire composée de 84,9% de Plasmodium falciparum (Ly, 2005). Ceci
confirme les résultats de l’étude faite par Gaye et al au Sénégal en 1989 qui
rapportent que cette espèce est la plus fréquente en Afrique de l’Ouest.
La différence de prévalence des espèces plasmodiales selon Burkot et al serait
due à une meilleure efficacité de la transmission des sporozoïtes de l’espèce P.

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93
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

falciparum et aussi du fait que la seule espèce qui attaque toutes les hématies.
L’analyse de la distribution des classes d’âge en fonction de la positivité de la
goutte épaisse nous a montré que c’est surtout la classe d’âge de 1 à 5 ans qui
était la plus infectée avec 68% (83/122). Une étude faite en 2001 par Koïta et al
dans la même zone montrait que la classe d’âge de 0 à 9 ans était la plus
infectée avec 51% contre 15% des sujets de plus de 20 ans. Ceci pourrait
s’expliquer par la mise en place graduelle de l’immunité anti-palustre dans cette
tranche de la population.

4 Distribution de la densité parasitaire

La distribution de la densité parasitaire positive a été très variable. Cette
densité a une moyenne géométrique de 261,26 plus ou moins 995,51, une
minimale de 25 et une maximale de 6375. Les sujets ayant une parasitémie
comprise entre 75 et 500 parasites par/ µl étaient les plus représentés (58,2%)
suivis des patients ayant une parasitémie supérieure à 1000 (15,6%) (Tableau
IV). Ces résultats sont comparables à ceux obtenus en 2004 par Bougouma au
Burkina Faso avec 40% des sujets ayant une densité parasitaire inférieure à
1000 parasites par microlitre. L’analyse de la charge parasitaire supérieure à 75
parasites par microlitre montre une nette régression de la parasitémie avec l’âge.
La fréquence des enfants de la classe d’âge de 1 à 5 ans ayant une parasitémie
supérieure 1000 trophozoïtes/µl a été de 84,21% comparée à 15,79% chez les
enfants de la classe d’age de 5 à 9 ans.
Pour les parasitémies inférieures à 75 trophozoïtes par microlitre la fréquence
des enfants infectés augmente avec l’âge. Celle-ci a été de 47,1% chez les
enfants de la classe d’age de 1 à 5 ans et de 52,9% pour la classe de 5 à 9 ans
(tableau V). Une étude effectuée par Bougouma en 2004 au Burkina Faso
montrait que le portage de charges parasitaires supérieures à 10000 p/µl de
sang régressait avec l’âge. Cette charge a été de 17,2% chez l’enfant contre
4,3% chez l’adulte. La fréquence des charges parasitaires inférieures à 1000
trophozoïtes/µl augmentait cependant avec une fréquence de 31% chez les
enfants et 82% chez l’adulte. La diminution de la parasitémie chez les enfants

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94
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

âgés (de plus de 10 ans) s’expliquerait par l’augmentation de l’exposition due

aux piqûres infestantes des moustiques avec acquisition d’une immunité
graduelle antiplasmodiale. Les enfants de moins de 5 ans n’ayant pas été en
contact avec plusieurs souches n’ont pas encore acquis cette immunité d’où les
parasitémies élevées.
Nos observations vont de paire avec celles faites par Cox et al en 1994 en
Guinée et Rogier et al, au Sénégal, 2001. Ces auteurs ont expliqué la baisse de
la densité parasitaire par acquisition de l’immunité. Les enfants de moins de 1
an n’étant pas concernés car protégés par les anticorps maternels. Trape et al.
ont abordé dans le même sens en 1994 au Sénégal en précisant que la densité
parasitaire atteint son maximum durant la deuxième année de vie et commence
à décroître après l’âge de 15 à 19 ans.

5 Etude comparative de la goutte épaisse et de l’OptiMAL-IT

Nous avons comparé 2 méthodes qui n’explorent pas la même caractéristique du
parasite, l’une s’adressant aux caractéristiques morphologiques du parasite et
l’autre aux antigènes. C’est ainsi que nous avons soumis 304 échantillons à la
fois à la technique de goutte épaisse et le test OptiMAL-IT. Nous avons obtenu
122 (40,1%) enfants positifs à la goutte épaisse et 123 au test OptiMAL-IT
(40,5%). Les données obtenues par les 2 techniques sont presque identiques
avec une concordance de 0,88. Néanmoins, nous avons obtenu des faux
négatifs (6,6%) et des faux positifs (4.9%) par la technique de l’OptiMAL-IT
lorsque la goutte épaisse a été considérée comme la technique de référence. Le
test a une bonne sensibilité (93,4%), une bonne spécificité (95,1%), est simple à
utiliser, mais ne permet pas une quantification de la parasitémie et ne précise
pas le stade de développement du parasite. Les autres paramètres diagnostics
telles la valeur prédictive négative et valeur prédictive positive ont été
respectivement de 95,6% et de 92,7%. Le test OptiMAL-IT a une bonne
concordance Kappa qui a été de 0,88. Nos résultats sont similaires à ceux
obtenus par Rénion Saye en 2004 au village de Faladiè, une sensibilité de

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95
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

97,2%, une spécificité de 95,4%, une valeur prédictive positive de 96,7%, une
valeur prédictive négative de 96,1% et une bonne concordance Kappa de 0, 93.
Palmer et al. (1998), après examen microscopique d’échantillons sanguins, ont
trouvé pour le test OptiMAL-IT, une sensibilité de 88% et une spécificité de 99%
pour Plasmodium falciparum. John et al. (1998) ont de même obtenu des
résultats comparables avec 94% de sensibilité lors d’un essai au sud de l’Inde.
Hunt- Cook et al en Gambie ont trouvé une sensibilité de 91,3% et une spécificité
de 94% lors d’une étude en Gambie en utilisant le même test.
Le test OptiMAL-IT nous a donc permis d’identifier P. falciparum seul ou associé
à une autre espèce. L’espèce P. malariae associé à P. ovale a été identifiée à la
fois par le test OptiMAL-IT et par la goutte épaisse.

La présence de faux négatifs s’expliquerait par les faibles parasitémies. Le

fabricant a dans le cas de l’OptiMAL-IT a prévu un seuil de détection de 50-100
parasites par mm3 de sang. Durant notre période d’étude qui correspondait à la
saison sèche, les faibles parasitémies sont les plus fréquentes se traduisant par
les faux négatifs observés. Nous avons des faux négatifs avec des parasitémies
assez élevées, ceci était très surprenant, car la parasitémie était élevée par
rapport au seuil de non détection (50-100/ l) et faible par rapport à des
parasitémies très élevées à partir desquelles des effets de masque au niveau
des anticorps monoclonaux des bandelettes réactives du test sont observées.
Notre hypothèse est que des mutations ponctuelles se produiraient au gène de
LDH correspondant à l’épitope de la partie antigénique et ferait en sorte que
l’anticorps monoclonal ne puisse le reconnaître. Il a été observé qu’un
changement d’un seul acide aminé entraînerait une altération d’un antigène
(Imamichi et al., Shulman et al., 2001).
En ce qui concerne les faux positifs, aucune hypothèse explicative ne semble
supporter cet état de fait et nécessite donc une analyse plus poussée.

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96
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

6 Etude comparative de la goutte épaisse du test OptiMAL-IT et de la PCR de

MSP-1
Afin de partager les résultats discordants des 2 tests, nous avons eu recours à la
technique d’amplification par la PCR en utilisant les marqueurs polymorphiques
du bloc II de MSP-1 (Koita, 2000). Nous avons utilisé la PCR nichée pour
augmenter la sensibilité de la technique. Nous avons réalisé la PCR sur 17
échantillons dont les résultats de la goutte épaisse et du test OptiMAL-IT ne
concordaient pas. Ce procédé nous permettait de lever toute ambiguïté. Sur les
8 échantillons qui étaient des faux négatifs par le test OptiMAL-IT, nous avons
identifié deux échantillons qui s’étaient avérés positifs après amplification par les
marqueurs de PCR. Un échantillon sur 9 des faux positifs à l’OptiMAL-IT s’était
révélé positif à la PCR de MSP-1.
La fréquence des faux positifs de l’OptiMAL-IT par rapport à la PCR a été de
42,9% et celle des faux négatifs de 66,7%. Ces résultats étaient attendus
puisque les marqueurs polymorphiques ne sont pas appropries pour être des
tests de diagnostic, en effet les gènes de MSP-1 peuvent subir des variations de
telle sorte que les amorces n’arrivent plus à s’apparier, la formation des parasites
hybrides de MSP-1 en est une illustration (Koita et al. 2005).

7 Etude du polymorphisme
L’utilisation du gène de la MSP-1 permet d’évaluer l’impact de l’infection
polyclonale au niveau des échantillons dont les résultats étaient discordants.
Ainsi aucun des sujets avec un résultat discordant n’avait plus d’un allotype
(infection monoclonale) dans le sang au moment des tests. Ce résultat a été
retrouvé avec le test ParaSight-F® lors que des faux négatifs ont été identifiés en
comparaison avec la goutte épaisse et la PCR (Koita et al. 2005)
L’amplification du gène de la MSP1 nous a permis d’identifier les 3 allèles décrits
de par le monde. L’allèle le plus fréquent a été RO33 avec 66,67% de l’ensemble
des allèles. Cette observation est identique à celle faite par Koita et al en 1996,
Ouattara et al en 1997 et N’Toumi en al au Sénégal. Ces auteurs décrivaient une
fréquence élevée de RO33 au cours de la saison de pluie avec une

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97
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

recrudescence de l’allèle K1 et des cas de paludisme grave en fin de saison de

transmission. Mercereau et al au Sénégal ont également observé une distribution
similaire des allèles en utilisant des échantillons collectés de par le pays.
Nous avons confirmé les échantillons amplifiés par la PCR de MSP-1 avec des
marqueurs moléculaires plus conservés notamment ceux du PfLDH. Ainsi, nous
avons amplifié l’ échantillon 3113 qui était positif à la goutte épaisse mais négatif
au test OptiMAL-IT, l’échantillon 3118 positif à la goutte épaisse mais négatif au
test OptiMAL-IT, l’échantillon 3162 négatif à la goutte épaisse mais positif au test
OptiMAL-IT par la PCR de PfLDH. Ces résultats suggèrent que la technique de
PCR reste le test le plus sensible et doit être réservée qu’aux centres de
référence de diagnostic (à cause de sa technicité et de son coût) pour le contrôle
de qualité de nos laboratoires. Le cas particulier de l’échantillon 3216 confirme
encore de l’utilité des marqueurs conservés pour le diagnostic. En effet, il a été
négatif à la PCR avec les marqueurs polymorphiques de MSP-1, son test
OptiMAL-IT était négatif malgré une parasitémie élevée (1025p/ l), nous avons
observé une bande de PCR lors de l’amplification avec la paire d’amorce
provenant du gène de l’Erythrocyte Binding Antigen-175 (EBA-175). En effet,
PfEBA-175 et PfLDH sont des gènes essentiels à la biologie du parasite, l’un
pour son entrée à l’intérieur de l’érythrocyte et l’autre pour son besoin
énergétique. Ainsi les marqueurs obtenus des gènes conservés sont les plus
indiqués pour leur inclusion dans les tests de diagnostic, ces résultats de PCR
avec PfLDH ont été confirmés avec la technique de séquençage où les
séquences nucléotidiques (Figures 15 et 16) présentent une parfaite homologie
avec celle séquencée par Shan et al., (2001) se trouvant dans la base de
données de GenBank ([Link] ) sous le numéro d’accès
AF251291.

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98
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

VII. CONCLUSION

Notre étude a montré que le test rapide OptiMAL-IT de DiaMed a les mêmes
valeurs diagnostiques que la technique d’identification morphologique de la
goutte épaisse. Nous avons décelé des faux négatifs probablement dus à des
faibles parasitémies mais aussi des faux négatifs lorsque les parasitémies
étaient de loin supérieures au seuil de détection établi par le fabricant.
L’étude a suggéré que les marqueurs moléculaires obtenus des gènes dont
les séquences nucléotidiques sont conservées sont souhaitables pour être
insérées dans les tests rapides de diagnostic au lieu des marqueurs
moléculaires des gènes polymorphiques adaptés aux études de génétique de
population.

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99
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

VIII. RECOMMANDATIONS

Au terme de notre étude nous formulons les recommandations suivantes:

Aux autorités sanitaires nationales:

- permettre l’accessibilité aux antimalariques surtout dans les régions les

plus éloignées,
- appuyer les études de recherches éventuelles sur le paludisme.
- la mise en place d’un laboratoire de référence au niveau régional pour le
contrôle de qualité des tests rapides de diagnostic parasitaire,
- la formation des techniciens de santé à la technique d’identification des
espèces (goutte épaisse et frottis mince) par la microscopie,
- mettre à la disposition des centres de santé de nouveaux tests de
dépistage du paludisme tels OptiMAL-IT, CoreTM
- le maintien et le renforcement des cantines scolaires pour que les enfants
se portent bien sur le plan nutritionnel.

Aux autorités sanitaires locales de Kolokani et le CSCOM de

Toumanibougou

- IEC (Information, éducation et communication) sur le mécanisme de

transmission du paludisme,

- IEC (Information, éducation et communication) sur les différentes

méthodes de prévention,

- IEC (Information, éducation et communication) sur l’imprégnation des

supports et former les populations à sa pratique,

- Former le personnel en mettant en place une infrastructure adaptée à

leurs besoins,

- Effectuer un dépistage rapide par les tests d’immunocapture et une prise

en charge précoce des cas de paludisme simple et grave,

- Formation de personnels sanitaires par rapport à l’évacuation des

malades atteints de formes graves.

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100
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

A la population de Missira:

- Former les mères, à la prise en charge des cas de fièvre suivant un

organigramme à élaborer par le programme régional de lutte contre le
paludisme et l’identification correcte des cas présentés,

- Lutter contre les vecteurs en éliminant les gîtes larvaires et les

anophèles de manière naturelle ou artificielle par les insecticides,

- Fermer les portes et les fenêtres dès le crépuscule jusqu’à l’aube,

faire porter par les enfants des vêtements longs et éviter leur
exposition dehors,

- Conduire l’enfant au centre de santé dès la survenue de la maladie

afin d’éviter les formes graves du paludisme,

- Eloigner les champs de maïs des concessions afin d’éviter une trop
grande agressivité des moustiques.

Au fabricant du test OptiMAL-IT (DiaMed)

- Augmenter la sensibilité du test OptiMAL-IT,

- Adapter la température de conservation du test en fonction du lieu
d’étude.
- Diminuer le coût du test OptiMAL-IT

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

101
Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

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Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

X. FICHE SIGNALÉTIQUE

Nom : ALZOUMA Younsa

Prénom : Fatoumata
Date de soutenance :21 Mai 2005
Ville de soutenance : Bamako
Pays d’origine : Niger

Titre de la thèse: Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT. Place

de la biologie moléculaire dans l’évaluation du polymorphisme génétique de la
lactate déshydrogénase (LDH) de Plasmodium falciparum.

Lieu de dépôt : Bibliothèque de la faculté de médecine, de pharmacie et

d’odontostomatologie.

Secteur d’intérêt : Recherche au Laboratoire de biologie moléculaire appliquée

Résumé
Le but de notre étude était d’évaluer le polymorphisme génétique de la lactate
déshydrogénase (LDH) de Plasmodium falciparum et d’estimer les paramètres
diagnostiques du test OptiMAL-IT par rapport aux techniques de PCR et de la
goutte épaisse (GE). Notre étude s’était déroulée dans le village de Missira
Cercle de Kolokani en période sèche (Avril - mai). Notre échantillon comptait 304
enfants âgés de 1 à 9 ans. Au cours de cette étude nous avons obtenu les
mêmes valeurs diagnostiques entre le test optimal et la technique d’identification
morphologique de la goutte épaisse.
La fréquence des enfants positifs au test OptiMAL-IT au cours de cette étude
était de 40,5 % soit 123/304. La prévalence de l’infection palustre par
l’observation de la goutte épaisse était de 40, 1 % (122/304). Le test OptiMAL-IT
a donné une bonne sensibilité de 93,4%, une spécificité de 95,1 %, une VPN de
95,6 % et une VPP de 92,7% par rapport à la goutte épaisse. Le test de kappa
de Cohen (0,88 %) réalisés sur l’ensemble des résultats a montré qu’il existe une
très bonne concordance entre les résultats du test OptiMAL-IT et la goutte

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

épaisse. Nous avons observé 8 faux négatifs (6,6%) probablement dus à des
faibles parasitémies, mais aussi des faux négatifs malgré des parasitémies
supérieures aux seuil de détections établis par le fabricant qui (50-100 parasites /
µl de sang). Neuf faux positifs (4,9%) ont été aussi décelés dont une analyse
plus poussée pourrait nous donner plus d’information.
Afin de départager les résultats discordants (17) des 2 tests nous avons utilisé la
technique d’amplification par la PCR en utilisant des marqueurs polymorphiques
du bloc 2 de MSP1. Nous n’avons pas obtenu des résultats satisfaisants entre la
PCR et les 2 tests. Cet état de fait était attendu puisque les marqueurs
polymorphiques ne sont pas appropriés pour être des tests de diagnostic.
L’utilisation des marqueurs moléculaires plus conservés notamment ceux de
PfLDH pour confirmer les échantillons amplifiés par la PCR de MSP1 nous a
permis d’obtenir des bons résultats et de connaître l’utilité de ces marqueurs.
Ces résultats de PCR avec PfLDH ont été confirmés avec la technique de
séquençage où les séquences nucléotidiques (figure 15 et 16) présentent une
parfaite homologie avec celle séquencée par Shan et al 2001, se trouvant sur la
base de données de GenBank sous le numéro d’accès AF251291.

Mots clés: Plasmodium falciparum, PfLDH, test OptiMAL-IT, PCR, Mali.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

Name: ALZOUMA Younsa

Surname: Fatoumata
Defence date: 21 Mai 2005
Defence country: Bamako
Title: Performances diagnosis of rapid test OptiMAL-IT. Place of biologie
molecular in evaluation of genetic polymorphism of the lactate dehydrogenase
(LDH) of Plasmodium falciparum.
In reserve at: Medical, Pharmacial and dentistry library of faculty of Mali
Subject interest: seek at the laboratory of Molecular Biologie, malaria.

Abstract
The goal of our study was to evaluate the genetic polymorphism of the lactate
dehydrogenase (LDH) of Plasmodium falciparum and to consider the parameters
diagnosis of the OptiMAL-IT test compared to the techniques of PCR and of the
thick blood smear. We carried out a cross-sectional study within 304 children
from 1 to 9 years old during the dry season (April-May) in the village of Missira in
Kolokani areas (Mali). During this study we obtained the same diagnostic values
between the OptiMAL-IT test and the morphological technique of identification of
the blood smear. The frequency of the positive children to the OptiMAL-IT test
during this study was 40,5 % is 123/304. The prevalence of the malaria infection
by the microscopic observation of the blood smear was 40, 1 % (122/304). The
OptiMAL-IT test gave a good sensitivity of 93,4%, a specificity of 95,1 %, the
Negative Predictive Value (NPV) was 95,6% and the Positive Predictive Value
(PPV) was 92,7% compared to the blood smear. The kappa test of Cohen
(0,88%) showed a good agreement between the OptiMAL-IT test and the thick
blood smear. We observed 8 cases of false negatives (6,6%) in spite of some
with higher parasitemia than the threshold of detections establish by the
manufacturer (50-100 parasites/µl of blood). Nine false positive (4,9%) were also
detected of which a more thorough analysis could give us more information. In
order to decide between the unmatched results (17) of the 2 tests we used the
technique of amplification by the PCR by using polymorphic markers of block 2 of

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

MSP1. We did not obtain a suitable result between the PCR and the 2 tests. This
established fact was expected since the polymorphic markers are not adapted to
be diagnostic tests. The use of more conserved molecular markers in particular
those of PfLDH to confirm the samples amplified by the PCR of MSP1 enabled
us to obtain good results and to know the utility of these markers. These results
of PfLDH PCR were confirmed by gene sequencing and the nucleotidic
sequences (figure 15 and 16) have a perfect homology with those sequenced by
Shan et al. 2001, being on the basis of data of GenBank under the number of
access AF251291.

Key words: Plasmodium falciparum, PfLDH, OptiMAL-IT test, PCR, Mali.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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Performances diagnostiques du test rapide OptiMAL-IT

SERMENT DE GALIEN

Je jure, en présence des maîtres de la faculté, des conseillers de l’ordre des

pharmaciens et des condisciples :

- d’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de mon art et de leur
témoigner ma reconnaissance en restant fidèle à leur enseignement ;

- d’exercer dans l’intérêt de la Santé Publique, ma profession avec

conscience et de respecter non seulement la législation en vigueur, mais
aussi les règles de l’honneur, de la probité et du désintéressement ;

- de ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le malade et

sa dignité humaine ;

En aucun cas, je ne consentirai à utiliser mes connaissances et mon état

pour corrompre les mœurs et favoriser les actes criminels.

Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses.

Que je sois couverte d’opprobre et méprisée de mes confrères si j’y manque.

Mme AMOS Fatoumata ALZOUMA Younsa LBMA/ FMPOS

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