BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
biologie moléculaire: étude et manipulation de l'ensemble nucléique
Le terme biologie moléculaire est utilisé pour la première fois en 1938 par WARREN WEAVER qui fait
partie de la Fondation Rockefeller.
La biologie moléculaire moderne née en 1953: détermination de la structure de l’ADN, cliché de
diffraction aux rayons X de [Link] et Gosling et règle d’appariement des bases par Watson et Crick
les fondamentaux:
➔ structure biochimique de la molécule d’ADN
➔ propriétés fondamentales de la molécule d’ADN:
double hélice droite constitué de deux brins d’ADN
les deux brins d’ADN s’associent par leur bases selon la règle
chaque brin possède une extrémité 5’ phosphate et 3’ hydroxyle
➔ orientation antiparallèle de deux brins d’ADN
- permet l’appariement des bases et la formation de liaison H
- Chaque brin est constitué d’une séquence de bases
différentes
- chaque brin comporte une information différente de l’autre
- les deux brins sont complémentaires => possibilité de
réplication
représentation symbolique:
convention d'écriture
➔ les séquence ADN et ARN s’écrivent toujours dans le sens 5’ vers 3’
- peuvent s’écrire sous forme de simple ou double brin complémentaire
- l’écriture des amorces ADN pour effectuer des PCR respecte cette convention d’écriture
- exemple de séquence ARN
Pourquoi privilégier le sens 5’-3’ ?
la séquence des gènes est lue dans le sens 5’-3’
les ARN et ADN polymérases ont des activités polymérases 5’-3’
apport de la biologie moléculaire: exemple
➔ connaissance de l’évolution des espèces
- phylogénétique: techniques de séquençage des génomes pour comparaison entre
espèces
➔ développement d’outils ayant un impact direct en santé humain:
- clonage de gènes pour production de protéines recombinantes
- diagnostic de maladie génétique
- identification de virus par RT-PCR ou test antigéniques
- amélioration des plantes
une séquence d’ADN d'intérêt peut être cloné
clonage moléculaire: isolement et amplification à l’identique d’une séquence d'intérêt
une séquence peut donc être cloné afin de produire une protéine recombinante
ex: importance dans le traitement du diabète => importance en santé humaine
➔ l’insuline et sa maturation
L'insuline est produite/stockée (sous forme d’hexamère) par des cellules β des îlots de Langerhans La
forme monomérique de l’insuline est la forme active
Comment produire une forme active afin de pallier au diabète de type I ?
➔ la production de l’insuline synthétique est réalisé par clonage
moléculaire
Deux vecteurs expriment séparément les chaînes A et B.
Les chaînes A et B sont isolées et purifiées.
Les ponts disulfures sont re-créés entre les chaînes.
D'autres méthode existent
les acteur du clonage moléculaire
séquence d'intérêt à cloner va s’insérer dans la séquence d’ADN vectrice donnant le système
amplificateur
I. séquence d'intérêt à cloner (l’insert)
Quelle peut être la nature des inserts?
A) les types d'insert:
a. fragment de restriction:
fragment de restriction: séquence ADN obtenu en utilisant des enzymes de restriction
gel d'agarose: trie en fonction de la taille: les plus petiute en bas et les plus grande en haut
les enzymes de restriction: sont des endonucléases qui clive la liaison phosphodiester à l'intérieur de la
chaîne d'acides nucléiques
les enzymes de restriction de classe II: nomenclature
les enzymes de restriction de classe II peuvent être
Homodimériques ou homotétramérique
Elles ont besoin de Mg comme co-facteur permettent la
reconnaissance d’une séquence ADN spécifique ( site
de restriction) =site de type palindromique
Les trois types d’extrémités générées:
- eco R1: 5’ sortant
- Pst 1: 3’ sortant
- SmaI: bout franc
Notion d'extrémité compatible:
Il existe deux types d’enzyme de restriction distinctes qui reconnaissent des sites de restrictions
différents mais génère la même extrémité
exemple:
BamH1-BrIII = enzyme non orienté =les extrémité compatibles peuvent se religuer
exemple avec un ADN double brin: clonage
clonage non orienté = molécule peut faire un
rotation de 180°
b. la séquence d'intérêt
séquence ADN obtenue par PCR ou RT PCR:
L’ADN est amplifié par PCR classique cependant pour l’ARN il faut d’abord qu’il soit reverse transcrit
puis amplifié par PCR.
La PCR peut s'effectuer avec:
- un couple d’amorce classique = amplifier tel quel
- un couple d’amorces à queues flottantes = où l’on rajoute des amorces aux 2 extrémités
La technique de la PCR: À partir d’une copie, on peut en avoir plusieurs centaines de milliers
Pour cela on utilise une ADN polymérase ADN dépendante pour recopier de l’ADN. Elle est utile en
recherche fondamentale, clinique et criminologique
les composants de la réaction PCR:
- la matrice ADN: ⚠ lors d’une PCR: matrice = tjrs ADN (simple ou double brin) => qualité et
quantité dont primordiale pour une PCR efficace
- la Taq polymérase: issue de la bactérie thermophile: thermus aquaticus: c’est une ADN
polymérase ADN dépendante qui ne possède pas d’activité de correction d’erreur. Elle possède
un activité polymérase 5’→3’ et est thermorésistante
- une paire d'amorces *: s’hybrident de part et d’autre de la séquence à amplifier. Elles délimitent
donc la séquence qui va être amplifiée. Elles fournissent un 3’OH à la TAQ polymérase
- des dNTPs
- H20
- tampon avec Mg2+ : le pH de la Taq polymérase est légèrement basique, ainsi le cation bivalent
(Mg2+) et monovalent (NH4+, K+) permet de neutraliser les charges négatives des phosphates
de l’ADN et donc de stabiliser les amorces
* Les amorces:
● design des amorces: nécessité de connaître la séquence à amplifier. Les amorces ont une
longueur de 18 à 30 nucléotides de long. Elles doivent avoir un ™ comparable (hybridation
comparable). les amorces commerciales ont un extrémité 5’OH
● faut éviter les amorces qui sont complémentaire entre elles (dimère d’amorces) et qui
présentent des séquences répétées inversées (tiges boucles)
Calcul de températures d’hybridation des amorces à la matrice
nécessité de connaître la séquence d’amorce. On calcule ensuite Tm des amorces.
pour les amorces <= 30 nucléotides on applique la formule la formule suivante:
Si on se trouve avec plusieur amorce qui n’ont pas la même température d’hybridation: on choisi le Tm
de l’amorce qui est le plus faible et on enlève 5°
les amorces à queue flottantes
Ajoutent des séquences en plus aux extrémités du produit PCR = au début pas hybridé à la séquence
d'intérêt
ex: des sites de restrictions pour un clonage orienté:
Au départ les queues flottantes ne sont pas hybridées à la séquence d'intérêt. Obtention d’un produit
PCR avec ces nouvelles extrémités après le troisième cycle
la PCR se déroulent en 3 étape:
Le produit PCR à taille attendue est obtenu à partir du cycle 3:
La PCR s’effectue grâce à un thermocycleur (bloque chauffant programmable): monte et redescend
très vite en température
II) séquence d’ADN vectrice (vecteur)
vecteurs: molécule d’ADN susceptible de recevoir un fragment d’ADN
étranger, dont elle facilite l’introduction, la multiplication et/ou l’expression dans une cellule.
Les différents types de vecteurs sont utilisés:
- les plasmides
- les bactériophages
- les cosmides
- les chromosomes artificiels de bactéries
- les chromosomes artificiels de levures
les vecteurs:
choix du vecteur en fonction de la taille de l’insert
les plasmides: molécules bicaténaires circulaire présentes chez les bactéries : non essentielle mais
procurent un avantage
comprendre les représentation:
5’ phosphate se met contre le 3’ OH = forme
un cercle
fleche orientation des gene, origine de
réplication …
les caractéristiques des plasmides:
- gène de résistance à un antibio (permet de sélectionner les bactéries transformées)
- une origine de réplication (permet la réplication autonome du plasmide)
- un site de clonage multiple (permet l’ouverture du plasmide pour y cloner un insert)
Le clonage:
les principales étapes:
- préparation de l’insert du vecteur
- ligation vecteur/insert
- transformation de bactérie compétente,
- étalement sur boîte
- piquage de colonies + miniculture
- Minipréparation d’ADN plasmidique (TP biomol): permet de caractériser les clones dit
recombinants
préparation de l’insert:
● l'insert est un fragment de restriction: on peut génère un fragment de restriction avec:
- des bords francs ( Eco RV). Si on a des bord franc => le plasmide aussi à des bord
franc= clonage non orienté = on peut le mettre dans le sens que l’on veut => donc 5’=
phosphate
Les extrémités 5’ ont un phosphate et les 3’ un groupement OH
- a bord cohésif non compatible (BamH1 + EcoR1) = pas de possibilité de rotation de 180 =
clonage orienté = 1 seule intertion possible = digestion par enzyme de restriction= 5’ phosphate
Les extrémité 5’ ont un phosphate et les 3’ un groupement OH
- à bord cohésifs compatibles: une seule enzyme de restriction: fragment peut faire une rotation
de 180° donc non orienté = 5’ phosphate
Les extrémités 5’ ont un phosphate et les 3’ ont un groupement OH
2eme cas: 2 enzymes de restriction compatibles: clonage non orienté car l’insert pourra s’insérer selon
deux orientation possibles
Les extrémité 5’ ont un phosphate et les 3’ un groupement OH
l'insert est un produit PCR:
● obtenu en utilisant des amorces classiques:
Les amorces commerciales de par leur synthèse ont une extrémité 5’OH.
Nécessité de phosphoryler les 5’: T4 Polynucléotide Kinase +ATP
Le clonage direct du produit PCR est possible
● obtenu en utilisant des amorces à queues flottantes
Après digestion, les extrémités 5’ ont un phospahte et les 3’ un groupement OH
Pas besoin de phosphoryler les 5’
préparation du plasmide:
● pour le clonage direct d’un produit PCR:
Le vecteur est digéré par une enzyme générant des bords francs (ex: EcoRV)
Le vecteur doit être phosphorylé pour ne pas se religuer sur lui même
● pour le clonage d’un insert à extrémités cohésives:
Le vecteur doit avoir les mêmes extrémités cohésives. Il doit être digéré avec les mêmes enzymes de
restriction. Si le vecteur est digéré par un enzyme ou deux enzymes compatibles, il doit être
déphosphorylé pour ne pas religuer sur lui-même.
ex: clonage orienté BAMH1/EcoRI
ligation insert vecteur: exemple de clonage orienté bam H1/ecoR1= seule orientation
transformation des bactéries compétentes:
● la membrane des bactéries est traité pour les rendre perméables (par traitement chimique et par
choc électrique)
● les produits de ligation sont mis en présence de bactéries (sur glace)
● on réalise un choc thermique à 42° (ou électrique) : favorise l’entrée des plasmides dans les
bactéries
● incubation des bactéries dans du milieu de culture sans antibiotique: permet l’expression
phénotypique de la résistance
● etalement des bactéries sur boite de pétri+milieu de culture gélifié: ce milieu de culture contient
l’antibiotique, permet de sélectionner les bactéries transformées
● les bactéries transformées par le plasmide: poussent car elles contiennent le gène de résistance
à l’antibiotique. Les bactéries non transformées meurent
resumé:
un antibio permet de sélectionner une bactérie transformé par un insert mais on se sait pas lequel
clonage de long fragment d’ADN:
principe de la technique d’assemblage Gibson
Au lieu de cloner un très grand fragment, on génère des fragments chevauchants
les 2 produits PCR seront chevauchant et auront les 2 portions de chaque bout
exemple avec 2 inserts et un plasmide:
orienté, capable de connaître de très très long fragment d’ADN
minipréparation d’ADN plasmidique: purification alternative de l’ADN plasmidique + caractérisation
des plasmides recombinants
