Ingénieurs en Agro-Industrie – Agro-alimentaire (AGRO4)

BIOTECHNOLOGIES :
ENJEUX POUR
L'AGRICULTURE
ANNÉE UNIVERSITAIRE: 2022-2023

Pr. R. Ben Laouane

 Chapitre 3
Techniques et outils
d'amélioration des plantes
 Chapitre 3:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes

I. Croisements
II. Mutagénèse
III. Culture in vitro
IV. Transgénèse
V. Edition génomique
 Chapitre 3:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Croisements
1. Modes de reproduction des plantes
2. Biologie florale
3. Types de variétés
4. Inbreeding et Hétérosis
5. Techniques de sélection classiques
4. Exemple des plantes améliorés par croisement
5. Contraintes
 1. Croisements
Définitions:

▪ En botanique, le croisement génétique est un

programme d'amélioration qui consiste à croiser
différentes espèces afin d'obtenir des hybrides en
exploitant la variabilité génétique.

▪ Il s'agit de l’introduction du matériel génétique non

apparenté dans une lignée de reproduction.
▪ Il permet d'augmenter la diversité génétique, ce qui
réduit la probabilité qu'un individu soit sujet à des
maladies.
 1. Croisements

Si on dispose d’une variété intéressante,

mais elle lui manque un caractère :
• Sensible à la sècheresse
• Sensible à la salinité……..

Chercher une autre

Chercher chez
variété qui possède
une autre espèce
le caractère qu’on
veux améliorer

Hybridation intraspécifique Hybridation interspécifique

 Rappels de quelques notions de base de génétiques

➢ Génétique qualitative (Génétique mendélienne)

Hérédité monogénique :
Exemple 1: Croisement entre deux variété d’orge
➢ Un seul gène, croisement monohybride
➢ Le nombre de rangs est contrôlé par un seul gène (A),
présentant deux allèles différents A et a
➢ Orge à 2 rangs : AA
➢ Orge à 6 rangs : aa
➢ A est dominant sur a (A>a)
 Rappels de quelques notions de base de génétiques

Hérédité monogénique :
Exemple: Croisement entre deux variété d’orge
Si on croise deux parents, un homozygote pour A (AA) et l’autre
homozygote pour a (aa)
P1 : 2 rangs P2 : 6 rangs
AA x aa

Gamètes Parent VV
A A
Parent aa a Aa Aa
a Aa Aa
La F1 sera toute de génotype Aa et de phénotype A
F1 : Aa (2 rangs) 100%
 Rappels de quelques notions de base de génétiques

Hérédité monogénique :

La 1ere loi de Mendel : Loi d’uniformité de la premier génération

Ce résultat correspond à la première loi de Mendel : la

loi d’uniformité de la 1e génération.

→ Lorsque l’on croise 2 individus homozygotes mais

différents pour le caractère étudié, on obtient comme
résultat de ce croisement une 1e génération où tous les
individus ont le même génotype et le même phénotype :
ils expriment le caractère dominant.
 Rappels de quelques notions de base de génétiques

Hérédité monogénique :
Exemple: Croisement entre deux variété d’orge
Descendance de la F1 par autofécondation (F2) : Aa x Aa

les individus F1 vont donner 50% de gamètes A et 50% de gamètes a,

la F2 issue de l’autofécondation des individus de la F1 sera composée des

individus suivants

Gamètes Parent Aa
A a
Parent Aa A AA Aa
a Aa aa
 Rappels de quelques notions de base de génétiques
Hérédité monogénique :
F2 : 1/4 AA 1/2 Aa 1/4 aa → 3 génotypes
3/4 A- 1/4 aa → 2 phénotypes

ratios génotypiques : 1 : 2 : 1
ratios phénotypiques : 3 : 1
Ce ratio est typique pour un caractère contrôlé par un seul gène
avec dominance complète, c’est le croisement MONOHYBRIDE.

2émé loi de Mendel: ségrégation de type 3-1

La seconde loi ou loi de ségrégation, dite encore loi de pureté des gamètes, dit
qu’un seul caractère d’une paire d’allèle de caractères opposés peut être
représenté par son facteur – son gène- dans un gamète.
Dans le cas des hétérozygotes de F1 50% des gamètes sont A et 50% sont a. La
fusion aléatoire produira en F2 : 3/4 [A] et 1/4 [a].
 Rappels de quelques notions de base de génétiques
Exemple 2
➢ Le croisement d'une plante a fleurs rouges avec une plante à fleurs
blanches
 1. Croisements
Modes de reproduction des plantes

Le mode de reproduction des plantes est le premier facteur

qui conditionne le choix des méthodes d’amélioration et de
sélection applicables à une espèce.

Les plantes se reproduisent par :

* Voie asexuée : Multiplication végétative
* Voie sexuée : Autogame ou allogame
Plantes utilisent des parties de
plantes pour se multiplier.

C’est ce que l’on appelle la

multiplication végétative des
plantes
 1. Croisements
Modes de reproduction des plantes

Sexuée = MULTIPLICATION
Asexuée
amphimixie PLANTES
➢ Fleurs
➢ Pollinisation
Multiplication Végétative
➢ Fécondation Organes végétatifs
Par autofécondation : espèces autogames
Par fécondation croisée : espèces allogames
➢ Fruits et Graines
➢ Dissémination des Naturelle Artificielle
graines/Germination
➢ Plantule
 I. Croisements
Multiplication Végétative

Naturelle

Stolons Rhizomes Tubercules Bulbes Rejets

ex : fraisier ex : gingembre ex : pomme de ex : ail, oignon ex : palmier

terre dattier
• Example: Fraise
• Les stolons se développent horizontalement à la
surface du sol. Lorsque les noeuds touchent le
sol, des feuilles et racines se développent et
donnent naissance à une nouvelle plante
 Multiplication naturelle

Rhizomes

Un rhizome de gingembre Plante de gingembre

 Multiplication naturelle

Tubercules

Les pommes de terre peuvent germer à partir de « bourgeons » présents

sur leurs tubercules
 Multiplication naturelle

Bulbes

Bulbe d’oignon Germination Nouvelle plante

 Multiplication naturelle

Rejets

Palmier dattier Bananier

Multiplication Végétative

Artificielle

Culture in
Bouturage Marcottage Greffage
vitro

ex : l’Olivier ex : la Vigne ex : la Tomate

 Modes de reproduction des plantes

Sexuée = MULTIPLICATION
PLANTES Asexuée
amphimixie
➢ Fleurs
Multiplication Végétative
➢ Pollinisation
➢ Fécondation Organes végétatifs Apomixie
Par autofécondation : espèces autogames
Par fécondation croisée : espèces allogames
➢ Fruits et Graines
➢ Dissémination des Naturelle Artificielle
graines/Germination
➢ Plantule
 Modes de reproduction des plantes
Mode sexué
Anatomie d'une fleur
En général, la fleur est constituée de 4 organes :

➢ le pistil (♀) = stigmate + style + ovaire

➢ l'étamine (♂) = anthère + filet
➢ les pétales
➢ les sépales
 Modes de reproduction des plantes
Mode sexué

➢ Caractérisée par la fusion de 2 gamètes : mâle et femelle,

conduisant à la formation de l'embryon.

➢ Les descendants par croisement ne sont pas identiques à

leurs parents.

➢ Deux phénomènes biologiques fondamentaux caractérisent la

reproduction sexuée et sont responsables du brassage de
l’information génétique:

La méiose et la fécondation
 Modes de reproduction des plantes
Méiose
➢ La méiose assure la production de cellules reproductrices: gamètes.

➢ A l’issue de la méiose, les gamètes sont haploïdes (n) et ne possèdent pas tous
la même information génétique en raison des crossing-over et de la séparation
aléatoire des chromosomes homologues.

Fécondation
➢ La fécondation est l’union d’un gamète mâle
et d’un gamète femelle.

➢ réunie les deux noyaux haploïdes et donne

naissance à un œuf diploïde (l’œuf)

➢ Ce phénomène est responsable d’un

deuxième brassage des chromosomes, car la
fusion d’un pollen et d’un ovule se fait au
hasard
Fécondation
Union des gamètes mâles et femelles pour former l'embryon
et l'albumen.

➢ Après pollinisation, le grain de pollen s’hydrate et germe et

émet un tube pollinique (T.P).
➢ Le noyau végétatif se place à l'extrémité du T.P. et le
conduit le long du style jusqu'à l'ovule.
➢ Le noyau végétatif dégénère, et le T.P. déverse son
contenu dans le sac embryonnaire.
➢ 1 noyau spermatique fusionne avec l'oosphère pour donner le
zygote (diploïde) ; l'autre fusionne avec les 2 noyaux polaires
pour donner l'albumen (triploïde)

Double fécondation
 Modes de reproduction des plantes
Fécondation
 Le système de reproduction sexué:

• Autogamie = Autofécondation
Plantes autogames

• Allogamie = Fécondation croisée

Plantes autogames
 Autogamie

➢ La fécondation de la plante est réalisée par son propre pollen

➢ Les fleurs sont hermaphrodites
➢ La maturité des gamètes est simultanée
 Mécanismes assurant l'autofécondation
➢ l'autogamie peut être stricte chez les espèces
cleistogames où les fleurs ne s'ouvrent pas.

➢ Dans de nombreux cas, la fleur ne s'épanouit qu'après la

fécondation (Blé, lin …).
 Modes de reproduction des plantes
Mécanismes assurant l'autofécondation
Cleistogamie:
Exemple: le petit pois et le riz pour lesquels les fleurs
ne s’épanouissent jamais entièrement obligeant
l’autofécondation

Fleur de petit pois

 Modes de reproduction des plantes
Mécanismes assurant l'autofécondation
➢ Pour certaines espèces (tomate), la fleur est épanouit, mais le
stigmate est protégé par un tube formé par les filets qui sont
soudés entre eux.

Au centre de la fleur, les étamines entourent et cachent le pistil

 Autogamie

Avantages évolutifs
➢ Pas de coût des mâles, ni de la sélection sexuelle.
➢ Reproduction plus rapide (pas de recherche des
partenaires).
➢ 100 % des gènes des descendants sont présents chez
le parent.

Inconvénients évolutifs

➢ Diminution inévitable de la diversité génétique.

Le système de reproduction sexué:

• Allogamie = Fécondation croisée

Plantes autogames
Mécanismes assurant la fécondation croisée :
1. Séparation des sexes dans l'espace :
➢ Plantes monoïques : les inflorescences mâles et femelles sont
séparées, mais situées sur la même plante.
Ex : maïs, melon, concombre, …

➢ Plantes dioïques : les sexes sont séparées sur des plantes mâles et
des plantes femelles.
➢ Ex : palmier dattier et l’ortie
Mécanismes assurant la fécondation croisée :

2. Séparation des sexes dans le temps

Les organes sexuels n'arrivent pas à maturité en

même temps,la dichogamie

➢ Protandrie : maturité plus précoce de la partie

mâle avant la partie femelle.

➢ Protogynie : maturité plus précoce de la partie

femelle avant libération des grains de pollen.
Mécanismes assurant la fécondation croisée :

4. Auto-incompatibilité (Self-incompatibility)
➢ Absence d'aptitude pour une plante à donner les
semences lorsqu'elle est autofécondée, bien qu'elle
puisse donner des semences normales par la
fécondation croisée; son pollen est actif sur une autre
plante.
➢ Incapacité d’une plante hermaphrodite à produire
des zygotes après autopollinisation
Mécanismes assurant la fécondation croisée :
Avantage de l’auto-incompatibilité:

L’auto-incompatibilité permet des réaliser des croisements

entre plantes sans castration préalable.

Exemple : Trèfle, choux, …

Modes de reproduction des plantes
Mécanismes assurant la fécondation croisée :
4. Auto-incompatibilité (Self-incompatibility)
Inconvénients de l’auto-incompatibilité:

✓ L’autostérilité est un obstacle à la création de lignées

homozygotes.

✓ L’autostérilité est parfois désavantageuse en agriculture et en

horticulture :

Un verger composé d’une seule variété est formé d’un clone génétiquement
uniforme; si cette variété est auto-incompatible tous les individus possèdent les
mêmes allèles S et ils ne peuvent fructifier sans un apport de pollen étranger:
c’est surtout le cas des pruniers et cerisiers.
Mécanismes assurant la fécondation croisée :
5. Stérilité male
✓ C’est l’incapacité d’une plante à produire des anthères ou du
pollen fonctionnel, alors que les gamètes femelles
fonctionnent normalement.
✓ Incapacité à produire ou à libérer un pollen viable ou
fonctionnel en raison de l'échec de la formation ou du
développement d'étamines, de microspores ou de gamètes
fonctionnels.
Fertile Stérile
✓ La raison principale est la mutation.

Ce type de stérilité mâle se retrouve

chez l'oignon, le colza, le maïs, le
sorgho, la betterave sucrière, la
carotte, le chou, etc
Intérêts de la stérilité mâle

✓ Réduction du coût de production des semences hybrides.

✓ Production à grande échelle de semences F1.

✓ Évitement des énormes travaux manuels d'émasculation

et de pollinisation.

✓ Accélération du programme d'hybridation.

✓ Exploitation commerciale de la vigueur des hybrides..

 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

I. Croisements
1. Modes de reproduction des plantes
2. Biologie florale
3. Types de variétés
4. Inbreeding et Hétérosis
5. Techniques de sélection classiques
4. Exemple des plantes améliorés par croisement
5. Contraintes
Biologie florale

La connaissance de la biologie florale est un préalable essentiel à

l’établissement de tout schéma d’amélioration. Il est nécessaire de
connaître :

* Mode de reproduction : asexuée, autogame ou allogame.

* Quand se fait la déhiscence des anthères.
* Durée de réceptivité des stigmates.
* Durée de vie du pollen.
• Le temps nécessaire à la fécondation.

Ces connaissances sont indispensables pour déterminer les

méthodes de castration et d’isolement à prévoir afin d’éviter les
autofécondations et les croisements non contrôlés.
 Mode de pollinisation

Pollinisation : transfert des grains de pollen des

anthères aux stigmates. Fait appel à
plusieurs vecteurs :

➢ Pollinisation anémophile vent

➢ Pollinisation entomophile insectes
➢ Pollinisation hydrophile eau
➢ Pollinisation ornitophile oiseaux
 Mode de pollinisation
Chez la majorité des plantes allogames:
La pollinisation est assurée par le vent ou les insectes.

Les plantes anémophiles et entomophiles peuvent être identifiées

par des adaptations particulières.
Les Anémophiles:

* Produisent une grande quantité du pollen.

* Les grains de pollen sont légers.
* Bien séparés les uns des autres.
* Sont disséminés par des anthères mobiles (graminées).
* Les grains de pollen sont généralement collants.
 Mode de pollinisation
Les Entomophiles:

* Le pollen peut être moins abondant.

* Souvent collant.
* Les fleurs possèdent diverses adaptations qui facilitent leur
reconnaissance par les insectes ou les attirent :
- Elles produisent des nectaires ou émettent des parfums.
- les enveloppes florales sont grandes et visibles de loin
 Transport du Pollen
Lorsque le mode de pollinisation est connu, il est nécessaire de
déterminer son efficacité en fonction de la distance,

Cas des espèces anémophiles :

Des lames de microscope enduites de vaseline sont placées en divers

endroits pour recueillir des échantillons de pollen : l’examen au
microscope de ces lames permet de retrouver les grains de pollen de
l’espèce étudiée.
 Transport du Pollen

✓ Cas des espèces entomophiles :

il faut capturer les insectes qui visitent les fleurs et de les
examiner pour y retrouver éventuellement du pollen, parce que, il
y a des insectes qui ne jouent aucun rôle dans la pollinisation
parce que leur taille, leur morphologie et leurs déplacement dans
la fleur ne sont pas adaptés à la taille et à la position des organes
floraux.

Remarque : Les abeilles sont pour la plupart des plantes, les

agents les plus efficaces de pollinisation croisée, en raison de leurs
nombres, leur taille, leur distribution cosmopolite et leurs
adaptations pour la récolte du pollen.
 Spécialisation des pollinisateurs
Dans la nature, il existe de nombreux exemple d’adaptation très
précise entre un insecte et une espèce d’angiosperme.
Exemple de pollinisation du figuier (ficus carica)

Relation symbiotique
Blastophaga psenes
➢ Le figuier ne peut être pollinisé que par le blastophage
➢ le blastophage ne peut se reproduire en dehors des fructifications du figuier :
aucun des deux n’existerait sans l’autre
 Spécialisation des pollinisateurs
D’un point de vue botanique, la figue n’est donc pas une fleur mais d’abord une
inflorescence (appelée sycone) qui se transforme après fécondation en une
infrutescence à l’intérieur de laquelle se trouvent les vrais fruits, des akènes
 Spécialisation des pollinisateurs
✓ Les insectes mâles et
femelles vont se
reproduire dans le fruit.

✓ Puis la femelle va quitter

le fruit.

✓ en sortant, elle va se
frotter aux fleurs mâles qui
se trouvent sur le haut du
fruit et elle va ainsi se
couvrir de pollen.

✓ La femelle blastophage va
s'envoler pour
parasiter d'autres figuiers
 Contrôle de la pollinisation

✓ Isolement

✓ Emasculation mécanique

✓ Emasculation chimique

✓ Emasculation physique

✓ Stérilité mâle
 Contrôle de la pollinisation
✓ Isolement
➢ Il est nécessaire de protéger les fleurs après l’émasculation, pour s’assurer que
la fécondation est réalisée par le pollen qui a été déposé sur le stigmate.

➢ La méthode la plus efficace consiste à envelopper les fleurs ou les

inflorescences dans des sacs spéciaux après l’enlèvement des anthères, ou
l’ensemble d’une inflorescence unisexuée (Maïs) ou une plante.

➢ L’isolement doit être installé avant le début de la floraison et être maintenu

aussi longtemps que les stigmates sont réceptifs.
 Contrôle de la pollinisation

✓ Emasculation mécanique
➢ Chez la plupart des plantes à fleurs hermaphrodites, les
croisements artificiels doivent être précédés par une
castration qui peut se faire par enlèvement des anthères.
➢ Cette opération n’est inutile que si l’espèce est strictement
autostérile et si l’autopollinisation est impossible
(protandrie, protogynie).
➢ Le plus souvent, l’émasculation est faite à la main, avant
l’ouverture des fleurs : on coupe ou on enlève les pétales et
les anthères sont extraites à l’aide de pinces fines ou
d’aiguilles montées.
 Contrôle de la pollinisation

✓ Emasculation chimique

Méthode basée sur la différence de sensibilité du pollen et du gynécée à

divers agents chimiques

▪ Hybrex : Hormone végétale (de synthèse), substance efficace pour la

production du blé hybride.

▪ L’éthrel et le FW450 : sont des substances qui ont été testées sur
plusieurs espèces, par arrosage ou en pulvérisation pour la
production commerciale de semence hybride :

Ces substances tuent le pollen, sans altération notable de la viabilité de

la plante et du Gynécée.
 Contrôle de la pollinisation

✓ Emasculation physique

➢ Méthode basée sur la différence de sensibilité du pollen et du gynécée à

divers agents physiques

➢ La température est comprise entre 42 et 52°C pendant 10 min.

➢ Le traitement par la chaleur est assez souvent utilisé chez les graminées:

Il consiste à immerger les inflorescences dans de l’eau qui est maintenue à

une température constante ou dans de l’air chauffé par l’eau.

Exemple : Pour le riz, un séjour de 10 min de la panicule dans l’air à 45°C tue
le pollen alors que l’ovule et les stigmates restent fonctionnels.
 Contrôle de la pollinisation

✓ Stérilité pollinique

L’utilisation de lignées mâles–stériles est le moyen le plus économique et

parfois le seul possible pour produire commercialement des semences
hybrides entre lignées sélectionnées.

Exemple: la majorité des hybrides de Maïs, Sorgho et betterave sucrière sont

produits à partir de lignées mâles-stériles pollinisées spontanément par des
lignées fertiles plantées à proximité.
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

I. Croisements
1. Modes de reproduction des plantes
2. Biologie florale
3. Types de variétés
4. Inbreeding et Hétérosis
5. Techniques de sélection classiques
4. Exemple des plantes améliorés par croisement
5. Contraintes
Variété lignée pure:

➢ Ensemble d’individus possédant tous un caractère commun fixé et

pouvant le transmettre indéfiniment de génération en génération
➢ Une lignée pure est la descendance d'un individu homozygote se
reproduisant par autogamie. Cette descendance est constituée
d'individus identiques entre eux à l'intérieur d'une génération
(homogénéité) et identiques entre eux d'une génération à l'autre
(stabilité).
➢ Le génotype est fixé chez la variété lignée et la plante est
autogame (ex : blé, orges, colza…)
La variété population :
Une variété population = variété de pays = variété de ferme = variété
cultivée traditionnelle, hétérogène

➢ constitué d'un ensemble d'individus aux génotypes variés, mais

répondant à des caractéristiques morphologiques communes
(phénotype similaire)

➢ Ces variétés sont sélectionnées principalement par les agriculteurs

eux-mêmes, dans leurs champs.

➢ Ce ne sont pas des variétés (cultivars) au sens juridique du terme car

il est nécessaire de respecter l'inscription d'une variété dans un
catalogue officiel,

➢ Les variétés populations existent depuis les débuts de l'agriculture.

Variété clone :

➢ Lorsque la reproduction végétative est disponible et utilisable

industriellement (cas de nombreux fruitiers : poires, pommes,
abricots, amandes…),
➢ les variétés sont vendues sous forme de clones.
➢ La variété clone est très homogène, tous les individus
appartenant à un même clone sont identiques.
La variété hybride F1 :

➢ Ce que l'on appelle « Hybride F1 de lignées pures » est

le résultat de la fécondation de deux lignées pures.
➢ Comme le prédit la première loi de Mendel cet hybride
F1 est homogène.
➢ Chaque plante est identique génétiquement quel que
soit le nombre de descendants du croisement.

➢ Le concept de variété hybride F1 a été inventé par Shull

en 1908.
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

I. Croisements
1. Modes de reproduction des plantes
2. Biologie florale
3. Types de variétés
4. Techniques de sélection classiques
5. Inbreeding et Hétérosis
4. Exemple des plantes améliorés par croisement
5. Contraintes
 Sélection dans des population hétérogènes
Sélection massale
Les individus avec des caractères désirables sont choisis de la
population de plantes, les individus sélectionnés sont récoltés en
vrac.

Caractéristiques:

➢ Basée sur le phénotype

➢ Les caractères à sélectionner doivent être identifiables
visuellement.
➢ Efficacité dépend de la capacité du phénotype à refléter le
génotype
➢ Efficace pour les caractères à héritabilité élevée
➢ Peu efficace pour les caractères très influencés par
l'environnement.
Schéma de sélection massale
Sélection dans des population hétérogènes
Sélection massale
Avantages :
simple, facile, rapide, non coûteuse

Inconvénients :

➢ Impossible de distinguer les effets de l'environnement des

effets génotypiques,

➢ Non efficace quand l'héritabilité est faible.

Sélection dans des population hétérogènes
Sélection généalogique ou sélection de lignées pures
C’est une forme de sélection massale plus rigoureuse où les lignées pures issues
des individus sélectionnés sont cultivées séparément et testées pour vérifier
leur valeur:
➢ Les individus avec des caractères désirables sont choisis de la population de
plantes,
➢ les individus sélectionnés sont récolté séparément.

➢ Chaque plante sélectionnée est semée en ligne la saison suivante.

➢ Une lignée pure est obtenue par la multiplication de la descendance

résultant de l'autofécondation d'une seule plante homozygote.
Cette méthode présente les mêmes caractéristiques que la sélection massale.
Rappels
Evolution de la fréquence des homozygotes et des hétérozygotes

Après chaque génération d’autofécondation, l’hétérozygotie est réduite de moitié.

Schéma de sélection généalogique

- Population de base :
sélection des meilleurs
plantes
- Semis en épi-ligne :
chaque ligne représente une
famille
-On rejette les familles dont la
moyenne Xi est faible

- Sélection des meilleurs familles,

puis des meilleurs individus au sein
des familles sélectionnées

- On répète la même procédure

Comparaison entre la sélection massale et la sélection généalogique :

-Une variété développée par la sélection généalogique est plus homogène qu’une
variété développée par une sélection massale.

-La sélection massale est relativement plus simple et moins coûteuse que la
sélection généalogique.

-La sélection massale est souvent utilisée par les agriculteurs alors que la sélection
généalogique n’est généralement utilisée que par les sélectionneurs.

Les deux méthodes ne vont pas créer des génotypes nouveaux et se limitent
seulement à l’isolement de certains génotypes déjà existant dans la population
d’origine.
Sélection après hybridation
Méthode de sélection Pedigree
➢ L'objectif principal: - Combiner les caractères désirables de deux ou
plusieurs génotypes en un seul génotype ou variété.

- Rétablir l'homozygotie
➢ L’hybridation combinée à la sélection est un des moteurs de
l’évolution des espèces.
➢ L’hybridation est une technique consiste à croiser deux parents et à
créer de la diversité génétique
➢ L’hybridation est utilisée au niveau inter et intra-spécifique.
.
Sélection après hybridation
Méthode de sélection Pedigree

Procédure :
Sélection des parents : étape très importante, détermine le
potentiel de la méthode de sélection.
En général, l'un des parents doit être bien adapté et à
performance acceptable ; l'autre parent doit complémenter les
faiblesses du premier.

Croisement des parents sélectionnés .

La taille de la F1 doit être suffisante pour donner une

génération F2 assez large (500-2000).
Méthode de sélection Back-Cross ou Rétro-croisement

introgression génétique d'un ou quelques gènes à l'intérieur

d'une espèce,
méthode utilisée pour améliorer des lignées pures de bonne
performance mais présentant un ou quelques caractères
indésirables à déterminisme simple.

Principe:
✓ Eliminer (vider) progressivement tous les gènes d'un géniteur donné
comme un géniteur de résistance (parent donneur), sauf celui qui
confère la résistance à une maladie déterminée.
✓ Ceci est réalisé par des recroisements successifs de celui ci avec une
variété de bonne valeur agronomique (= parent récurrent = parent
receveur).
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

I. Croisements
1. Modes de reproduction des plantes
2. Biologie florale
3. Types de variétés
4. Techniques de sélection classiques
5. Inbreeding et Hétérosis
4. Exemple des plantes améliorés par croisement
5. Contraintes
Hétérosis (vigueur hybride)
Définitions :

➢ Augmentation de la vigueur liée à l’état hétérozygote

➢ Supériorité de l’hybride F1 par rapport à la moyenne des
parents

L’hétérosis peut se manifester par une

augmentation de la hauteur, du volume
racinaire, de la taille des feuilles et de
l’épi, du nombre et de la taille des
graines, de la résistance aux maladies,
de la précocité, etc..
Explication de l’Hétérosis

➢ Théorie de la dominance
Explication de l’Hétérosis

➢ Théorie de la dominance

Cette théorie suppose la dominance complète.

L'accumulation des gènes dominants dans la F1 peut fournir
une explication de l'hétérosis.
Explication de l’Hétérosis
Exemple:
P1 (AABBccdd) x P 2 (aabbCCDD)

Hybride (AaBbCcDd)
Si pour le P1 :
- AA (Gène de résistance à un parasité 1).
- BB (Gène de résistance à un parasité 2).

Si pour le P2 :
- CC (Gène de résistance à un parasité 3).
- DD (Gène de résistance à un parasité 4).

L’hybride est résistant donc à 4 parasites.

Inbreeding ( consanguinité)
Définition: l’une des différentes formes de croisements permettant
l'augmentation du pourcentage des homozygotes dans une population
hétérozygote.
L'autofécondation est la forme la plus poussée d'inbreeding dans la mesure où
elle permet d'atteindre rapidement l'homozygotie totale
Inbreeding
Après chaque autofécondation, l'hétérozygotie est réduite de
moitié
% Homo % Hétéro
Parents AA aa 100 0
F1 Aa 0 100

F2 1/4 AA 1/2 Aa 1/4 aa 50 50

F3 3/8 AA 1/4 Aa 3/8 aa 75 25

F4 7/16AA 1/8 Aa 7/16aa 87,5 12,5

etc..
Inbreeding =
▪ Baisse de vigueur et de fertilité liée à
l’homozygotie résultant de la consanguinité Dépression de
▪ Expression de gènes récessifs délétères consanguinité
Inbreeding
➢ Ce phénomène est surtout marqué chez les plantes
allogames (sauf pour quelques cas tels que la citrouille,
le concombre, la courge, la pastèque et le ricin).
➢ Pour les plantes autogames telles que le blé, l'orge, le
riz, le soja et la tomate, l'effet d'inbreeding n'est pas
apparent et ces plantes peuvent être maintenues à
l'état homozygote sans perte de vigueur

Autogames peu d’effet d’inbreeding

Allogames fort effet d’inbreeding

 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

I. Croisements
1. Modes de reproduction des plantes
2. Biologie florale
3. Types de variétés
4. Inbreeding et Hétérosis
5. Techniques de sélection classiques
4. Exemple des plantes améliorés par croisement
5. Contraintes
 Croisement (Olea europaea)

• Les programmes de croisements ont été mis au point depuis

1960 dans différent pays (Lavee 1990 ; Ozdemir et al., 2016,
Boulouha, 2001)
• visant l’obtention des variétés pour l’huile d’olive et
seulement quelques unes pour les olives de table ou les deux
avec un rendement élevé et une adaptabilité aux nouveaux
systèmesde plantation (récolte mécanique) (Rallo, 2014a).
 Croisement (Olea europaea)

• Plus récemment, des

programmes de croisement sont
établis pour la résistance à la
Verticilliose (Arias-Calderon et
al., 2015a ; Trapero et al.,
2015 ; Sikaoui, 2012 en cours).
 Croisement (Olea europaea)
• Le programme marocain de croisements entre les clones et
variétés sélectionnées locales (Menara & Haouzia) et les
variétés étrangères performantes (Manzanille, Picholine de
Languedoc, Leccino et Arbequine), a permis l’obtention de
1890 génotypes entre 1995 et 1998 (Boulouha, 2001,
Sikaoui, 2019).

•A ce jour, les programmes de diversification variétale du

verger National à l’INRA, ont abouti à la création de cinq
nouvelles variétés Agdal, Mechkate, Tassaoute, Dalia et
Baraka sont inscrites et en cours de diffusion (Sikaoui, 2019).
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

I. Croisements
1. Modes de reproduction des plantes
2. Biologie florale
3. Types de variétés
4. Inbreeding et Hétérosis
5. Techniques de sélection classiques
4. Exemple des plantes améliorés par croisement
5. Contraintes
 Contraintes
Durée et coût des programmes de sélection végétale

➢ Environ 7 à 30 ans pour mener à bien un programme de sélection pour les

cultivars annuels tels que le maïs, le blé et le soja.

➢ Beaucoup plus long pour les cultures arboricoles.

➢ L'utilisation de techniques moléculaires pour faciliter le processus de

sélection peut réduire le temps nécessaire à la sélection des plantes dans
certains cas.

➢ L'utilisation de la culture de tissus peut réduire la durée des programmes de

sélection des espèces pérennes.
 Contraintes
Durée et coût des programmes de sélection végétale par
croisement

➢ Néanmoins, le développement de nouveaux cultivars peut coûter

des centaines de milliers, voire des millions de dollars.

➢ Le coût du développement de cultivars peut être beaucoup plus

élevé s'il s'agit de matériel breveté.
 Contraintes
Durée et coût des programmes de sélection végétale
➢ Le coût de la sélection dépend également de l'endroit et de la personne qui
mène l'activité :

▪ Pays développés : En raison des frais généraux élevés, des produits similaires
fabriqués par des sélectionneurs dans des économies développés sont
produits à un coût beaucoup plus élevé.

▪ Pays en développement : La main-d'œuvre peu coûteuse dans les pays en

développement peut permettre aux sélectionneurs de produire des hybrides
de certaines espèces autopollinisées à moindre coût, car ils peuvent se
permettre de payer la pollinisation manuelle (par exemple, le coton en Inde).
 2) Croisement (Tournesol)
• Les espèces sauvages de tournesol constituent un bon réservoir de
source de résistances aux pathogènes.
• On a donc recours à des croisements entre tournesols cultivés et
sauvages. Ces croisements sont souvent limités par des phénomènes
d’avortement desembryons.

Lesvariétés de tournesol résistant

au mildiou et au Sclerotinia, deux
pathogènes majeurs de cette
[Link]
qui necessite l’application
d’autre technique
d’amélioration
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

I. Croisements
II. Mutagénèse
III. Culture in vitro
IV. Transgénèse
V. Edition génomique
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

II. Mutagénèse
1. Définition et types de mutation
2. Les différents types de mutations géniques
3. Mutation et amélioration des plantes
 Du gène a la protéine

gène

La transcription

La traduction

Rmq : Certains gènes codent seulement des ARN

fonctionnels qui ne sont pas traduits en protéines (comme
l’ARNr et l’ARNt)
Définition et types de mutations

Mutation = Modification rare et soudaine du matériel génétique

Al’echelle Chromosomique : Al’echelle Génique: Mutations

Microlésions
Macrolésions géniques
ou
• Variations au niveau du gène
ponctuelle
• Variations de grande taille s ou
• Non visible au microscope
alléliques
• Visible au microscope •Techniques de la biologie
moléculaire (séquençage)

cours Pr. Samia Rkha. FSSM . 2020-2021

 Mutation germinale / mutation somatique

Les mutations peuvent affecter :

•Soit les cellules germinales : prézygotiques et héréditaires

→ Mutations germinales

•Soit les cellules somatiques : postzygotiques et non héréditaires

→ Mutations somatiques
 Lignée somatique / Lignée germinale
Gamète mâle Gamète femelle

Cellule œuf = zygote

mitoses

Développement
cellulaire
Lignée Lignée somatique
germinale =
= Feuilles, racines, tiges…
gamètes

cours Pr. Samia Rkha. FSSM . 2020-2021

 Mutation somatique

Gamète mâle Gamète femelle

Cellule œuf = zygote

mitoses

mutation

peau
Lignée
germinale
= Lignée
gamètes somatique
Mutation somatique

Clone cellulaire
Ensemble des cellules mutées
ayant le même génotype

Individu mosaïque
Individu composé de 2 ou plusieurs
lignées cellulaires
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

II. Mutations
1. Du gène a la protéine
2. Définition et types de mutation
3. Les différents types de mutations
4. Mutation et amélioration des plantes
Mutations géniques
La substitution
Substitution = remplacement d’une paire de bases de l’ADN
par un autre paire de bases de l’ADN

Purines : A G
Transition :
Transversion :
Pyrimidines : T C

La transition = le remplacement d’une base purine par une base purine ou

d’une base pyrimidine par une base pyrimidine.

La transversion = le remplacement d’une base purine par une base pyrimidine

ou le remplacement d’une base pyrimidine par une base purine
Exemple

Site de la mutation
GAT Transition GGT
CTA CCA

Transversion GCT
CGA

Transversion GTT
CAA

Purines : A G
Transition :
Transversion :
Pyrimidines : T C
 Mutations chromosomique
Translocations
La translocation réciproque implique l’échange de fragments entre
deux chromosomes non homologues
Inversions
Une inversion correspond au renversement d’une portion de
chromosome, possiblement par recombinaison autour d’une boucle
a) Inversion péricentrique : Le centromère est situé dans la région
inversée.
b) Inversion paracentrique : le centromère en dehors du segment
inversé.
Variations dans le nombre de segments d’un chromosome:
 Chapitre III:
Techniques et outils biotechnologiques

II. Mutations
1. Du gène a la protéine
2. Définition et types de mutation
3. Les différents types de mutations géniques

4. Mutation et amélioration des plantes

 Les mutations spontanées

➢ Les mutations spontanées sont rares (10-6, 10-7 par gène et par
génération) mais néanmoins significatives.

➢ La plupart sont neutres (n’influencent pas la valeur sélective), les

moins favorables sont éliminées par la sélection naturelle.

➢ Les agriculteurs et les sélectionneurs qui ont choisi depuis des

siècles de façon plus ou moins empirique les plantes les plus
intéressantes ont souvent choisi en fait des plantes mutantes.
La mutagénèse :

➢ Processus naturel qui s’inscrit sur le long terme : les organismes

vivants sont soumis dans la nature à des rayons UV ou à de la

radioactivité, ce qui provoque des mutations aléatoires.

➢ Pour accélérer les choses, les plantes sont exposées à des taux
extrêmement importants d’agents chimiques ou physiques

➢ Le but : provoquer des centaines de mutations, puis repérer les

plus bénéfiques – résistance à un herbicide, croissance plus rapide
etc. – afin de les exploiter, y compris pour l'agriculture
 Les mutations induites

Elles peuvent être provoquées par des traitements physiques (UV,

rayons X…) ou chimiques (divers agents alkylants…) qui
augmentent significativement le taux de mutation (plus de 500
fois)

Exemple, chez Arabidopsis par l’ethyl methane sulfonate – EMS).

La probabilité de produire ou modifier un caractère intéressant
pour le sélectionneur est alors ainsi fortement augmentée.
Le plus grand gamma field du monde, situé au sein de l’Institute of
Radiation Breeding de Kamimurata au Japon.
➢ Technologie nucléaire sur des organismes végétaux depuis
1962.

➢ un champ circulaire de 100 mètres de diamètre soumis à des

taux de radiation jusqu’à 300 000 fois supérieurs à ceux
présents dans la nature.

➢ Les plantes de ce champ reçoivent en un

jour l’équivalent de 1 000 ans de radiation.

➢ Muter favorablement ou mourir, voilà le

destin de ces plantes : les taux de mortalité
en laboratoire peuvent en effet atteindre
les 80%,
➢ Les premières recherches remontent aux années 1930
et les premières utilisations commerciales aux années
1950.

➢ Plus de 3 000 variétés mutantes sont créé en utilisant ce

processus:
Gold Nijisseiki : une variété de poire prisée Japonaise très sensible à
la black spot disease, une maladie qui touche feuilles et fruits des arbres.

En 1981, Les chercheurs japonais ont soumis des plants de poiriers à des
radiations nucléaires, sous la forme de rayons gamma. les plants ont
muté en devenant résistants à la maladie.
 OGM ou NON…?

La communauté
scientifique est
divisée sur ce sujet

NON !? OUI !?
➢ la mutagenèse est simplement une
accélération du processus naturel ➢ La fréquence des mutations
de mutation spontanée qui se spontanées dans la nature est
produit dans les plantes. extrêmement faible
➢ la mutagenèse provoque des
mutations pour accélérer le ➢ Il est impossible de trouver des
processus dans un programme de niveaux aussi élevés de mutagènes
sélection des plantes dans la nature.
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Croisements
II. Mutagenèse
III. Culture in vitro
IV. Transgénèse
V. Edition des gènes
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Culture in vitro
1. Introduction aux bases de la culture in vitro

2. Potentialités de la cellule végétale ( totipotence

et dédifférenciation )

3. Etapes de la multiplication in vitro

4. Principales techniques de culture in vitro

5. Contrainte de la culture in vitro

La cultures in vitro des tissus végétaux:
Définition:
Cultures in vitro= vitriculture
cultures d’organe ou de fragments d’organes
isolés, sur un milieu synthétique, dans des
conditions aseptiques et contrôlées.

4
La culture in vitro est une technique qui permet la régénération d'une
plante entière à partir de la culture d'une partie de la plante mère sur
un milieu nutritif et en conditions axéniques
Objectifs:
➢ Reproduire de façon identique, une espèce et la
multiplier en grande quantité, et à moindre coût pour
la mettre sur le marché dans les plus courts délais. On
parle d’une micropropagation rapide ;

➢ Préserver des espèces anciennes et menacées, pour

conserver la biodiversité ;

➢ Elaborer de nouvelles variétés de plantes plus

rapidement ;

➢ Assainir des plantes virosées et conserver des plantes

saines.
Le terme in vitro comprend le fait que des explants
prélevés sur des plantes élites sont cultivés dans des
milieux synthétiques, en conditions d’asepsie
rigoureuses, dans un environnement contrôlé et dans un
espace réduit
 Explants

➢ Choix est en fonction de la

technique

➢ Peuvent être des parties

d'organes ou des organes
entiers, (tige, feuille, racine,
fleurs, etc.), des tissus, des
pièces florales, des graines ou
des embryons, des bourgeons ou
des apex ou des méristèmes, des
cellules somatiques ou sexuelles,
des protoplastes.
 Explants

En général il existe 2 types d’explants:

a: Explants à structure organisée :

- bourgeons végétatifs, bourgeons floraux.
Ce sont les explants les plus réactifs du
fait de l’existence de cellules
méristématiques qui reprennent leur
activité dans des milieux appropriés
 Explants
b: Explants constitués de tissus
différenciés:
Fragments: d’Entre Noeuds, fragments de
racines, de feuilles ou de pièces florales :
nécessitent de provoquer un retour à un
état dédifférencié avant de retrouver un
pouvoir organogène.

➢ Il existe un comportement très différent

selon les espèces:
Herbacées:

régénération possible à partir de plusieurs organes: fragments

de feuilles, de Pétioles, noueds, tissus floraux

ex pour le saintpaulia capable de régénérer par toutes les

parties de la plante: pétiole, limbe, racine, pétales, …)

Fig 2: Saint Paulia

Ligneux:

régénération limitée à certains explants

ex du palmier dattier adulte régénéré soit à partir:

*Bourgeons apicaux et bourgeons axillaires

(rejets)
*Fragments de jeunes inflorescences:
*Aucun résultat à partir des racines ou des feuilles
d’arbres adultes.
 Milieu synthétique
Milieu synthétique: adapté à la technique

➢ Eau, de macro et de micro-éléments,

➢ Substances de croissance:
phytohormones et vitamines, de sucre
et d’un agent gélifiant
➢ Le pH entre 5 et 6.
➢ Modification de milieu au cours des
différentes étapes de production,
➢ Milieu neuf toutes les 3 ou 4 semaines
en général.
 Milieu synthétique
Les premiers milieux de culture utilisés en culture in vitro sont le milieu
MS de Murashige et Skoog (1962) et le milieu de Miller (1963).
Les milieux de culture de base contiennent :
- Les macroéléments (0.1% or % per Poids sec) : N, P, K, S, Ca, Mg, O, H,..
- Les microéléments (ppm/poids sec): Na, Cl, Zn, Fe, Cu, Mn, Bore, ….
- Les sucres.
- Les vitamines.
- Les hormones.
- Les acides aminés.
- Avec un pH allant de 5,4 à 6.
La composition et la concentration des ingrédients de base des premiers
milieux de culture se sont modifiées au fil des années.
➢ Les sucres

Utilisé comme source de carbone et régulateur de pression

osmotique, le saccharose et le sucre le plus employé. Chez la
plupart des espèces végétale, une concentration de 30 g/L est
favorable dans un milieu d’induction.

➢ Les vitamines

Les vitamines les plus employés sont :

- le méso-inositol, Glycine, Thiamine Hcl, Pyridoxine Hcl, Acide
nicotinique.

Remarque : La nature et la concentration des vitamines utilisées

dans un milieu de culture varient avec les espèces et les variétés.
Support de culture

Les milieux de culture les plus utilisés en culture in

vitro sont des milieux solides.
Les agents gélifiants les plus couramment utilisés sont
l’Agar (environ 7 g/l).
 PHYTOHORMON ES
◼ ONDISTINGUE DIFFERENTS
TYPES :

◼ LES AUXINES .
◼ LES CYTOKININES .

◼ LES GIBBERRELLINES .

◼ L’ACIDE ABSCISSIQUE .

◼ L’ETHYLENE .
Les substances (régulateurs) de croissances
Les substances de croissance les plus utilisées sont les auxines et
Les cytokinines :

- Les auxines les plus utilisées sont : 2,4-D, ANA et AIA.

- Les cytokinines les plus utilisées sont : Kinétine, Zéatine et 6
BAP.

Remarque : La nature et la concentration des hormones utilisées

dans un milieu de culture varient avec les espèces et les variétés.
Le 2,4-D, auxine de synthèse, semble être plus utilisé que les
autres hormones.
 Balance hormonale
➢ Le développement d’un explant en culture in vitro est lié aux
concentrations en auxine et cytokinine (la balance
hormonale).
➢ Si les concentrations d’auxine sont plus élevées que celles de
la cytokinine, cela va favoriser la rhizogénèse (racines).
➢ En revanche, si les concentrations d’auxine sont moins élevées
que celle de la cytokinine, l’explant va évoluer vers une
fonction caulogène
➢ Enfin, si les concentrations en auxine et en cytokinine sont
équivalentes, l’explant a un comportement calogène
Balance hormonale
 Conditions d’asepsie

➢ Obtenues par une désinfection des explants, une

stérilisation du milieu de culture et des flacons ou tubes de
culture.

➢ Les différentes opérations de mise en culture sont réalisées

dans un environnement stérile obtenu par une hotte à flux
laminaire horizontal.
 Conditions d’asepsie: Désinfection des explants

Elimination des contaminants microbiens

Les agents désinfectants

Concentration of Time
Agent Active Ingredient Phytotoxicity (min)

Na hypochlorite 0.25-1% Moderate 5-20

Ca hypochlorite 9-10% Moderate 5-20

H2O2 3-10% High 5-20

Alcool
Ethanol or
isopropanol 70% High <30 sec
Conditions d’asepsie: stérilisation du milieu de
culture et des flacons ou tubes de culture.
➢ Maintenir l’aseptie
durant l’excision et la
culture
➢ Tout se fait sous une
hotte à flux laminaire
avec capuchon à
pression positive (filtres
de type HEPA 0.3 µm)
 Environnement contrôlé

1. Température – Dépend de génotype

Absolu - 22-28°C

2. Illumination

Qualité - racines – lumière rouge and tige - UV lumière bleue

Intensité - faible, 1000 lux ou 20 E m-1s-2
Photopériode - 16 h/8 h

3. Humidité
Très élevée - contamination,
Très faible – déshydratation du milieu

.
➢ L'espace est réduit

L'espace est réduit car les plantes sont miniaturisées,

cultivées dans des récipients posés sur des étagères
éclairées, ce qui permet d'avoir la possibilité de
replanter des hectares de terrain à
partir de plants cultivés sur quelques mètres carrés
La CIV a complètement bouleversé la reproduction végétale. Désormais,
on peut à partir d’un fragment de la plante, voire d’une cellule, propager
la plante en des milliers d’exemplaires.
Explant mis en culture

plantules enracinées
(vitroplants)
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Culture in vitro
1. Introduction aux bases de la culture in vitro

2. Potentialités de la cellule végétale ( totipotence

et dédifférenciation )

3. Etapes de la multiplication in vitro

4. Principales techniques de culture in vitro

5. Contrainte de la culture in vitro

 Différenciation
➢ Les cellules d’un organisme proviennent toutes d’une
même cellule-oeuf ou zygote.
➢ Au cours de l’ontogenèse (Développement de l'individu, depuis la
fécondation jusqu'à l'état adulte ) la mise en place des différents
tissus implique la différenciation des cellules.
➢ Cette différenciation fait apparaitre une diversité qui se
situe à plusieurs niveaux :
➢ niveau cytologique des structures et infrastructures
cellulaires,
➢ niveau biochimique,
➢ niveau physiologique du fonctionnement
La différenciation cellulaire est le processus qui conduit à la
spécialisation des cellules qui acquièrent de nouvelles structures et
des fonctions spécialisées.
Chez les végétaux, ce processus s'exprime dans les cellules des zones
de croissance, cellules nommées cellules méristématiques.
➢ Dédifférenciation = rajeunissement cellulaire qui se traduisant par
la perte de sa spécialisation antérieure.
➢ Elle se manifeste globalement par un retour plus ou moins
profond de la cellule à l'état méristématique originel
➢ A l’inverse, des tissus déjà différenciés peuvent se dédifférencier
c'est-à-dire recouvrer les caractéristiques cytologique et les
potentialités des cellules embryonnaires.
 Différenciation
Lignée somatique / Lignée germinale
Gamète mâle Gamète femelle

Cellule œuf = zygote

mitoses

Développement

Dédifférenciation
Différenciation
cellulaire
Lignée Lignée somatique
germinale =
= Feuilles, racines, tiges…
gamètes

cours Pr. Samia Rkha. FSSM . 2020-2021

 Rappel: Comparaison d’une cellule différenciée
et une cellule non différenciée:

Cellule différenciée Cellule non différenciée

Petit noyau Grand noyau
Grande Vacuole Petite vacuole
Rapport nucléo-plasmique Rapport nucléo-plasmique
faible (taille du noyau/taille élevé
de la cellule)

Pas de division cellulaire Activité de division

cellulaire importante
 Totipotence

Formation d’une plante de carotte à partir d’une culture de cellules

 Totipotence
= la possibilité de régénérer une plante entière à partir de
n'importe quelle cellule d'une plante donneuse .

= Toute cellule végétale vivante est capable de donner une plante

entière semblable à la plante mère dont elle provient Haberlandt
(1902): donc elle possède toute l’information génétique
nécessaire.

= la faculté qu’a la cellule végétale spécialisée (différencié) à

perdre cette spécialisation, à se multiplier sous forme d’un tissu
indifférencié, puis à retrouver sa spécialisation, voire une autre
différenciation.
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Culture in vitro
1. Introduction aux bases de la culture in vitro

2. Potentialités de la cellule végétale ( totipotence

et dédifférenciation )

3. Etapes de la multiplication in vitro

4. Principales techniques de culture in vitro

5. Contrainte de la culture in vitro

Cinque étapes principales sont nécessaires pour établir une espèce,
un cultivar, une variété in vitro:

Une première étape d'initiation de la culture est nécessaire : c'est la

phase la plus sensible qui consiste à désinfecter les boutures (racine,
bourgeon, etc.) ou les graines afin de les rendre stériles, avant de les
placer sur un milieu de culture approprié.
Viennent ensuite les étapes de multiplication, d'enracinement et
enfin de sevrage ou acclimatation.
Le sevrage est le passage des conditions de laboratoire aux
conditions de serre. Cette phase s'avère souvent critique, car les
plantes en tubes ont perpétuellement leurs stomates ouverts, même
les plantes succulentes peuvent sécher si le changement
d'environnement se fait trop brusquement.
 Etapes de culture
1: Phase d’initiation: formation des bourgeons
2: Phase de multiplication:
3: Phase d’enracinement: formation des racines
4: Phase d’acclimatation: conditions d’acclimatation: conditions en serre
5: Transfert dans le champs
 Phase de multiplication

L’organogénèse = Initiation des organes: bourgeons

(caulogènese), Feuilles (phyllogenèse) & des racines
(rhizogénèse).
Mais en pratique de l’in vitro : La multiplication par
organogénèse concerne surtout la multiplication par
Bourgeonnement.
-Organogenèse directe:
reprise de l’activité des cellules méristématiques
préexistantes: bourgeonnement direct
(ça peut être démontré par des études
microscopiques des étapes de développement)

-Organogenèse indirecte:
Passage par une phase de callogénèse:
ensuite néoformations de bourgeons

Cal= amas de cellules non organisées

 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Culture in vitro
1. Introduction aux bases de la culture in vitro

2. Potentialités de la cellule végétale ( totipotence

et dédifférenciation )

3. Etapes de la multiplication in vitro

4. Principales techniques de culture in vitro

5. Contrainte de la culture in vitro

La culture in vitro d’explants permet différentes applications :
Principales techniques de culture in vitro, permettant:

➢ d'exploiter la diversité
➢ de faciliter les croisements interspécifiques,
➢ de diminuer la durée de création des variétés,
➢ d'obtenir du matériel végétal sain.
 Principales techniques de culture in vitro:
1. La micro-propagation
Elle permet de reproduire un individu et le multiplier en très grand nombre, à partir
de cellules ou d’un fragment d’organe ( bourgeon..).

Dans le cas de la pomme de terre, un seul bourgeon permet de produire jusqu’à

100.000 plantes en six mois
Chronologie de la méthode :
1)mise en culture de l'explant.
2)formation d'un cal ( = amas de cellules
dédifférenciées en division),
3)multiplication avec apparition de bourgeon.
4) chaque bourgeon est repiqué sur
un milieu de
propagation.
5)les bourgeons redonnent des plantes.
Cette méthode présente les avantages suivant :

➢ Taux de multiplication très élevé,

➢ Possibilité de propagation de plantes réfractaires
au bouturage
➢ multiplication durant toute l'année,

Quelques limites sont à signaler :

➢ Risque de mutation au stade de formation du cal,

➢ Difficulté ou impossibilité de mettre au point un milieu
de culture adapté aux plantes à multiplier.
La micropropagation connaît beaucoup d'applications :

➢ production à grande échelle de plante pour les

fleuristes (Saint Paulia, Phylodendron, rosier nain,
➢ Chrysenthème),
➢ culture d'arbres précieux (noyer, merisier) ou de
reboisement (pin),
➢ culture de plantes ayant des propriétés
pharmacologiques (production de médicaments).
 Principales techniques de culture in vitro :
2. La culture de méristèmes

➢ Les méristèmes = cellules non différenciées,

➢ Origine de tous les tissus de la plante.
➢ Présentes dans les bourgeons à l’extrémité des tiges et des racines et
qui peuvent, en se multipliant, donner naissance à tous les tissus de la
plante.
➢ Leur culture permet d'obtenir une plante identique à la plante initiale.
Principales techniques de culture in vitro :
2. La culture de méristèmes
 Principales techniques de culture in vitro :
2. La culture de méristèmes

➢ L’intérêt des méristèmes réside dans le fait que ce sont des structures
indemnes de virus.
➢ Leur culture va permettre de régénérer des plantes saines.
 Principales techniques de culture in vitro :
3. L’obtention d’embryons somatiques
➢ C’est le phénomène par lequel des cellules initient un
programme aboutissant à la formation d’un embryon:
▪ sans la participation des gamètes
▪ à partir de cellules non germinales (cellules
somatiques) soumises à un traitement
hormonal.

➢ L’obtention de cellules dites embryogènes nécessite un passage

de dédifférenciation préalable induite par des stimuli externes
 Principales techniques de culture in vitro :
3. L’obtention d’embryons somatiques
(A) cellules somatiques différenciées
(B) cellules indifférenciées
embryogènes,
(C) proembryon,
(D) embryon au stade globulaire,
(E) embryon au stade cordiforme,
(F) embryon stade torpille,
(G) plantule à deux semaines
(H) plantule à quatre semaines.
(I) Les plantules sont ensuite
transplantées en terreau et
acclimatées en serre
 Principales techniques de culture in vitro :
4. Culture d’embryons immatures
➢ Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être
prélevés, mis en culture in vitro et donner un nouvel individu.

Soit pour accélérer les Soit parce qu’il ne pourrait

cycles végétatifs = pas se développer dans
accélérer les procédures les tissus maternels, par
classiques de sélection... exemple lorsqu’il résulte
d’un croisement
interspécifique =
sauvetage des embryons
Principales techniques de culture in vitro :
Accélération des cycles végétatifs,
 Principales techniques de culture in vitro :
Accélération des cycles végétatifs,

➢ La technique de culture d'embryons immatures permet d'éviter la phase de

maturation de la graine et d’accélérer les procédures classiques de sélection.
➢ Les embryons sont prélevés quelques jours après la fécondation et non à maturité
de la graine et cela permet ainsi de réaliser plusieurs générations par an.
➢ On peut réaliser en une année plusieurs cycles d'autofécondations ou de
rétrocroisements successifs nécessaires pour la fixation et la conversion de lignées.

Cette technique est très utilisée chez le tournesol et dans une moindre mesure chez
le maïs. Chez le tournesol où les phénomènes de dormance des graines sont
particulièrement forts, elle est particulièrement facile à mettre en oeuvre, et permet
d'obtenir 4 à 5 générations successives par an, au lieu d'une seule en culture normale,
car le cycle végétatif est ramené à 80 jours.
Principales techniques de culture in vitro :
Sauvetage des embryons
Cas des croisements interspécifiques
Principales techniques de culture in vitro :
Sauvetage des embryons
➢ Ces embryons ne peuvent pas
poursuivre un développement
normal in vivo, car les tissus de
l’albumen dégénèrent quelques
jours après sa formation.
➢ L’embryon avorte alors le plus
souvent entre 10 et 14 jours après
pollinisation.
➢ Le transfert de ces embryons sur
milieu synthétique permet leur
survie et leur développement en
plantules.
 Principales techniques de culture in vitro :
5. L’haplodiploïdisation
➢ Consiste à obtenir des individus haploïdes doublés à partir de cellules
reproductrices
➢ Ces cellules germinales contiennent une seule copie du génome (cellules
haploïdes) au lieu des deux présentes dans les cellules somatiques (cellules
diploïdes)
➢ Au cours de la régénération de la plante, on obtient le doublement à l’identique
du génome haploïde par application d’un composé chimique, la colchicine.
 Principales techniques de culture in vitro :
5. L’haplodiploïdisation
Traitement à la colchicine
La colchicine bloque la mitose après la duplication des
chromosomes et les cellules deviennent diploïdes.
Principales techniques de culture in vitro
Intérêt de l’haplodiploïdisation
➢ La technique d’haplo-diploïdisation permet d'obtenir des
lignées pures..

➢ Dans une lignée pure, les plantes sont "homozygotes"

pour tous les caractères, c’est-à-dire que les deux lots de
chromosomes homologues sont identiques.

➢ La création de lignées pures est une étape nécessaire

dans les programmes d'amélioration des plantes.

➢ Elle permet de stabiliser les combinaisons génétiques

favorables obtenues par sélection
 Principales techniques de culture in vitro :
6. L’obtention de protoplastes
Définition
➢ Les protoplastes sont des cellules débarrassées de la paroi
pectocellulosique par hydrolyse enzymatique.
➢ Ils peuvent être obtenus à partir de différents tissus d’une plante,
de préférence des limbes de jeunes feuilles.
Culture de protoplaste

➢ Un protoplaste est par définition une cellule

végétale ayant perdu sa paroi et donc de
forme sphérique.
➢ La culture de protoplastes permet
d'introduire facilement de nouveaux gènes
dans le génome de la plante.
➢ On obtient des plantes transformées.
 Principales techniques de culture in vitro :
6. L’obtention de protoplastes
➢ les protoplastes peuvent fusionner ce qui permet de créer de
nouvelles variétés, d’introduire des caractères à hérédité
cytoplasmique.

➢ La fusion de protoplastes permet le croisement entre deux

espèces éloignées...

➢ La culture de protoplastes permet d'introduire facilement de

nouveaux gènes dans le génome de la plante. On obtient des
plantes transformées.
➢ Hérédité cytoplasmique = l'héritage de l'ADN d'organite des parents.
➢ Diffère de la génétique nucléaire "ancienne" car elle ne suit pas les lois de l'héritage
génétique qui stipulent que la moitié des gènes proviendront du génome de chaque
parent
 Principales techniques de culture in vitro :
6. L’obtention de protoplastes

Ces cellules peuvent non seulement fusionner entre elles mais encore
régénérer des plantes entières.
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Croisements
II. Mutations
III. Culture in vitro
IV. Transgénèse
V. Edition génomique
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes

IV. Transgénèse
1. Différentes stratégies de transgénèse
2. Etapes de la transgénèse
3. Création des plantes transgénèses
Génie génétique
➢ Le génie génétique désigne l'ensemble des techniques
utilisées pour introduire et exprimer dans un organisme
vivant un ou plusieurs gènes provenant de tout autre
organisme.

➢ Les organismes ainsi obtenus sont appelés organismes

génétiquement modifiés (OGM).

➢ On distingue les techniques de biologie moléculaire qui

permettent de préparer les séquences d'ADN qui seront
introduites, appelées construction génétique, et les
techniques de transgénèse qui permettent le transfert
du gène.
Les deux principales caractéristiques du génie génétique en
comparaison de la sélection classique basée sur la reproduction
sexuée sont :

- Une source de gènes étendue. On peut franchir la barrière des

espèces, des genres et des règnes. Ainsi, il est possible
d'introduire des caractères qu'il ne serait pas possible
d'introduire par sélection classique.

- Le transfert d'un gène précis. Elle permet de transférer le seul

gène désiré et non de transférer plusieurs gènes comme lors de
la reproduction sexuée.
 Transgénèse
Définitions:

➢ Technique de transfert et d'intégration d'un ou

plusieurs gènes à l'intérieur du patrimoine génétique
d'un organisme vivant.

➢ Transfert par des moyens artificiels d'un gène dans le

génome d'un organisme;

➢ Touche toutes les cellules de l'organisme, y compris

les cellules reproductrices.
 Transgénèse

Définitions:

➢La transgénèse est un outil du génie génétique, qui

complète les méthodes traditionnelles d’amélioration des
plantes quand ces dernières se heurtent à des impossibilités.

➢Pour le sélectionneur, il s’agit d’un moyen de créer un

caractère qui n’existe pas dans l’espèce considérée ni dans ses
apparentées
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes

IV. Transgénèse
1. Différentes stratégies de transgénèse
2. Etapes De La Transgénèse
3. Création des plantes transgénèses
 Les différentes stratégie de transgénèse

Les transformations induites par les techniques de

transgénèse peuvent :

- Apporter une fonction nouvelle (résistance à un

ravageur, tolérance à un herbicide etc.) ;

- Inactiver une fonction déjà existante (réduire ou

supprimer une protéine naturellement présente dans une
plante.
 Les différentes stratégie de transgénèse

1-Introduire un nouveau caractère

C'est un cas où le transfert de gènes s'accompagne d'un transfert

de caractère. Une copie du gène d'intérêt est introduite dans la
plante. Son expression, par l'intermédiaire d'un ARN messager,
entraîne la production d'une protéine, responsable du nouveau
caractère.

Les exemples dans ce domaine sont nombreux : introduction

d'un gène de résistance à des insectes, à des pathogènes, à des
herbicides, modification de la composition des graines,
production de molécules d'intérêt industriel ou pharmaceutique.
2-Inactiver un caractère

Dans ce cas, il n'y a plus à proprement parler de transfert

de gènes, on agit sur l'expression d'un gène déjà présent
dans la plante.
La stratégie antisens est la voie la plus couramment utilisée.
Elle consiste à bloquer l'expression d'un gène cible. Une copie «
inversée » de ce gène est introduite, d'où le nom de la technique.
Les ARN messagers (ARNm) produits par la copie originelle du
gène et par celle introduite sont complémentaires. Ils s'hybrident
donc et forment une molécule d'ARN double brin. Cette molécule
aberrante est dégradée. Ainsi l'expression du gène est bloquée
et le caractère ne s'exprime plus. Cette technique a permis
d'obtenir des espèces végétales à teneur en lignine réduite, des
tomates et des melons à maturation retardée, ou des pommes
de terre contenant moins d'am
Les tomates sont des fruits climactériques

Comment peut-on obtenir des plantes a maturité retardé?

Différentes stratégies de transgénèse

Cette technique a permis

d'obtenir des espèces
végétales à teneur en
lignine réduite, ou des
pommes de terre
contenant moins d’amidon
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes

IV. Transgénèse
1. Différentes stratégies de transgénèse
2. Etapes de la transgénèse
3. Création des plantes transgénèses
 Etapes de la transgénèse
Etape 1 : Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène d’intérêt
Etape 2 : Transférer le gène
Etape 3 : Régénérer et évaluer les plantes transformées
Etape 4 : Incorporer dans une variété commerciale
 Les étapes de la transgénèse
Etape 1 : Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène d'intérêt

➢ Le gène d'intérêt peut provenir de tout organisme vivant, puisque

le code génétique est universel.
➢ Il est intégré dans une construction génétique associant souvent
un gène marqueur.
➢ Ce gène marqueur permet de sélectionner les cellules qui ont
intégré le gène d'intérêt.
.
Etape 1 : Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène d'intérêt

La construction est ensuite multipliée (clonée) afin de disposer d'une quantité suffisante
d'ADN pour son introduction dans les cellules végétales que l'on veut transformer.
 Etape 2 : Transférer le gène
Il y a plusieurs méthodes pour introduire un gène dans une cellule :

Le transfert direct
Cette technique fait intervenir :

•soit une projection d'ADN dans les cellules de la plante par

l'utilisation d'un canon à particules qui projette dans les cellules des
microparticules enrobées d'ADN (biolistique),

•soit l'introduction d'ADN dans des protoplastes, par action d'un

agent chimique ou d'un champ électrique (électroporation).

La transformation biologique
C'est la technique la plus couramment utilisée.
Etape 3 : Régénérer et évaluer les plantes transformées

Les plantes régénérées in vitro sont ensuite analysées pour

confirmer l'insertion de la construction génétique dans leur
génome.
Des analyses moléculaires sont conduites dans ce sens. Des études
sur l'expression du gène ont lieu à plusieurs stades, ce qui permet de
caractériser le niveau d'expression et le comportement de la plante
exprimant le nouveau caractère.
Etape 4 : Incorporer dans une variété commerciale

Les plantes transformées obtenues sont soumises à des croisements

contrôlés pour étudier les modalités de transmission du nouveau
caractère à la descendance.

La transformation et la régénération étant des opérations délicates, le

génotype de la plante choisie est celui facilitant ces étapes. C'est
pourquoi les plantes retenues sont ensuite soumises à une succession
de rétrocroisements afin d'introduire le gène dans le matériel élite et
d'obtenir de nouvelles variétés commerciales exprimant ce caractère.
 Utilisation d'agrobacterium
Les bactéries du sol :
Agrobacterium tumefaciens la galle du collet
Agrobacterium rhizogenes chevelu racinaire

A. tumefaciens est la bactérie la plus employée.

➢ Transfert de l’ADN-T dans les chromosomes de la plante.
➢ ADN-T contient des gènes qui confèrent à la plante des propriétés tumorales,
➢ ADN-T contient des gènes qui entraînent la synthèse d’opines par les cellules
végétales transformées qui favorisent la multiplication des souches pathogènes en
détournant une partie de l’activité photosynthétique de la plante au profit des
bactéries.
➢ La région de virulence est indispensable au transfert et à l’intégration de l’ADN-T
Utilisation d'agrobacterium
Le principe est de modifier son plasmide Ti afin qu’il n’y ait pas de
formation de la galle du collet, mais que le transfert et l’intégration
des gènes désirés dans le génome des plantes se fasse.
 Transformation Biologique

1. prétraitement de l’explant pour provoquer des

blessures à sa surface
2. Co-culture et transformation génique
3. Sélection des cellules transformées
on apporte dans la culture des explants un agent sélectif approprié : herbicide,
antibiotique… Seules les cellules végétales transformées, possédant et exprimant
le gène de sélection : résistance à un herbicide ou à un antibiotique, pourront se
développer sur ce milieu.
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes

IV. Transgénèse
1. Différentes stratégies de transgénèse
2. Etapes De La Transgénèse
3. Création des plantes transgénèses
 Création des plantes transgénèses

La pyrale du maïs, Ostrinia nubilalis, est un papillon redouté par les

agriculteurs : ses larves se développent dans les plants de maïs,
provoquant une chute des rendements lorsque l'infestation est massive.
Pour contrer ce ravageur, un maïs Bt résistant aux attaques de la pyrale
a été mis sur le marché en 1996.
Création des plantes transgénèses
 Transgénèse:

Buts :
➢d’introduire le trait de la résistance aux herbicides dans une
gamme plus étendue de variétés de maïs, de soja et de canola et
également de cultures telles que le blé;
➢d’élargir la gamme d’herbicides utilisables en association avec les
cultures transgéniques porteuses du trait résistant aux herbicides,
par exemple de les rendre tolérantes à des herbicides tels que le
bromoxynil, l’oxynil et la sulfonylurée;
➢d’introduire de nouveaux gènes de résistance aux insectes dans
les végétaux, par ex. sous la forme de nouveaux variants Bt
contenant d’autres toxines.
Transgénèse: Résistance aux virus

➢ La résistance aux virus pourrait se révéler d’une importance capitale

pour l’amélioration de la productivité agricole (Thompson 2003).

➢ On procède actuellement dans différentes régions du monde à des essais

de plein champ sur la résistance aux virus des cultures suivantes: patate
douce (virus spumeux de la tache de la patate douce); maïs (virus de la
striure du maïs) et manioc (virus de la mosaïque du manioc africain).

➢ Ces cultures pourraient être commercialisées d’ici 3 à 5 ans. Les travaux

sur le blé résistant au virus de la jaunisse nanisante de l’orge ont peu
progressé en raison de la complexité de son génome et les recherches en
laboratoire se poursuivent. On a également obtenu une pomme de
terre transgénique qui résiste aux nématodes(versdesracines).
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
I. Croisements
II. Mutations
III. Culture in vitro
IV. Transgénèse
V. Edition génomique
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
V. Edition génomique
Introduction
Système de Cripser
Technologie de Crisper-cas9
Perspectives et limites de CRISPR-Cas
Introduction
➢ CRISPR-Cas9 est une technique récente et révolutionnaire de génie
génétique, développée depuis 2012 par Jennifer Doudna et
Emmanuelle Charpentier

➢ Prix Nobel de Chimie 2020

➢ permet de modifier le génome de n'importe quel organisme. Elle

utilise un mécanisme naturel de protection des bactéries contre
les virus pour rechercher et couper une séquence dans un génome
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
V. Edition génomique
Introduction
Système de Cripser
Technologie de Crisper-cas9
Promesses et les limites de CRISPR-Cas9
 Système de Cripser

Système de défense bactérien découvert dans

les années 1980 par le biologiste japonais Atsuo
Nakata
CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats,
= Courtes répétitions en palindrome regroupées et
régulièrement espacées

➢ Des répétitions trouvées dans le génome bactérien

Cycle lytique
Système de Cripser
Système de Cripser
Système de Cripser
Système de Cripser
Système de Cripser
Système de Cripser
Système de Cripser
 Chapitre III:
Techniques et outils d'amélioration des
plantes
V. Edition génomique
Introduction
Système de CRISPR
Technique de CRISPR-Cas9
Promesses et les limites de CRISPR-Cas9
Technique de CRISPR-Cas9
Technique de CRISPR-Cas9
Technique de CRISPR-Cas9
Technique de CRISPR-Cas9
 Technique de CRISPR-Cas9

Les modifications possibles :

➢ Une coupure – simple – sans réparation induit une mutation qui

rend généralement le gène non fonctionnel.

➢ Une réparation avec un « modèle » (une séquence homologue

modifiée) induit une modification du gène et de sa fonction.
Ex: Il est testé par exemple pour lutter contre un potyvirus de la
tomate.
 Perspectives et limites de CRISPR-Cas

Perspectives de CRISPR-Cas
➢CRISPR-Cas peut être utilisé pour une large gamme de
traits:
sachant que les traits sous dominance d’un seul gène (de
type résistance aux maladies) sont plus accessibles que les
traits polygéniques (comme la tolérance à la sécheresse).
 Perspectives et limites de CRISPR-Cas

Perspectives de CRISPR-Cas

➢CRISPR-Cas est plus précis et plus rapide que la

sélection de mutations spontanées ou induites,

car il reconnaît une séquence prédéterminée. On peut

agir simultanément sur deux ou plusieurs gènes, sur un
ou plusieurs sites d’un gène, impliqués dans un trait à
améliorer. Il induit peu ou pas de modifications ailleurs
dans le génome chez les plantes.
 Perspectives et limites de CRISPR-Cas

Perspectives de CRISPR-Cas
➢ CRISPR-Cas peut permettre une domestication accélérée en
introduisant les gènes majeurs qui ont influencé la domestication
d’une espèce.

(par exemple les 5 gènes majeurs pour la téosinte qui est l’ancêtre du
maïs).

➢ CRISPR-Cas peut permettre de réintroduire un état ancestral (pour

rechercher de la vigueur perdue ou des gènes de tolérance à des
stress). CRISPR-Cas peut donc créer de la variabilité originale pour
les sélectionneurs.
 Perspectives et limites de CRISPR-Cas

Limites de CRISPR-Cas

➢ CRISPR-Cas est une combinaison unique pour chaque

transformation souhaitée. L’aspect réglementaire de son
utilisation n’est pas encore clairement défini.

➢ L’utilisation de CRISPR-Cas reste difficile pour de nombreuses

plantes et la probabilité de modification varie suivant les
objectifs d’amélioration