Coloration de Ziehl Neelson
Coloration pour la mise en évidence des "Bacilles Acido-Alcoolo résistants" (BAAR) ou
mycobactéries : Mycobacterium (tuberculose), Mycobacterium leprae (lèpre).
Cette coloration permet également de mettre en évidence des bactéries
comme Nocardia (faible coloration au Ziehl)
Matériel :
-pince en métal
-marqueur
-anse métallique
-bec de bunsen
-lame
-microscope, huile à immersion
-grille porte lame placée sur l’évier
-coton
-minuterie
Réactifs et colorants :
-Acide alcool à 3%: 100 ml acide chlorhydrique pure+500ml alcool éthylique à 95°
-fuchsine phéniquée de Ziehl (Flacon 1)
-bleu de méthylène phéniqué (Flacon 2)
Attention à filtrer les colorants au moindre doute de précipité.
Mode opératoire :
-Prélever par une anse métallique préalablement flambée et refroidie, une
parcelle purulente ou hémorragique de crachat, étalement sur une surface
rectangulaire de 2 cm sur 1cm
-Les lames sont placées sur une grille porte lame
COLORATION
-Recouvrir la lame en totalité de Fushine.
-Chauffer doucement 2 à 3 fois, au moyen d’un goupillon imbibé d’alcool à
brûler, jusqu’à émission de vapeur. Eviter l’ébullition et le desséchement du
colorant (modification de la morphologie du bacille tuberculeuxfaux négatif)
Laisser agir 5 min
-Rincer délicatement à l’eau de robinet autant que possible à l’aide d’un flacon
et non sous le jet du robinet qui risque de décrocher le frottis de la lame.
-Incliner les lames une à une pour égoutter l’eau, puis le recouvrir avec le
mélange acide-alcool. Laisser agir 3min
-Rincer abondamment à l’eau, le frottis est alors incolore ou légèrement teinté en rose
-Incliner les lames une à une pour égoutter l’eau.
-Si les lames restent toujours roses, rajouter du décolorant pendant 1 à 3 min.
CONTRE COLORATION :
-Couvrir la lame par la solution de bleu de méthylène. Laisser agir 1 min.
-Rincer à l’eau de robinet et incliner les lames une à une pour les faire égoutter.
-Les laisser sécher sur une porte lame à l’air avant l’examen microscopique.
-Si nécessaire, nettoyer le verso de la lame avec une serviette en papier imbibé.
Lecture et interprétation du frottis colorés :
La lecture microscopique à immersion objectif 100 x et avec des oculaires de
10. C'est-à-dire grossissement final de 1000. Il faut examiner au moins 300
champs (100 champs correspondent à une longueur), ce qui requiert environ
15 minutes avant de déclarer une lame négative.
Pour les frottis présentant < 3 BAAR/frottis, d’autres échantillons doivent être
observés ou bien la culture doit être envisagée.
Les Bacilles Acido-Alcoolo Résistants (B.A.A.R.) apparaissent rose sur fond
bleu. Ils sont droits ou légèrement incurvés de 2 à 4 μm sur 0.3 à 0.5 μm de
large. Ils sont souvent granuleux et groupés en amas.
La réponse doit toujours être faite en termes de présence ou absence de
B.A.A.R et non en termes de bacilles tuberculeux, de bacilles lépreux, ou de
toute autre espèce mycobactérienne
Méthode Ziehl Résultat
0 BAAR/300 champs Recherche de BAAR négative
< 3 BAAR/300 champs Résultat douteux, à refaire
1-10 BAAR/100 champs Positive +
1-10 BAAR/10 champs Positive ++
1-10 BAAR/champs Positive +++
>10 BAAR/champs Positive ++++
Contrôle de qualité des colorants :
Pour chaque nouveau lot et à chaque série de coloration, des contrôles positif
(frottis réalisé à partir d’une culture positive ou d’un échantillon connu positif) et négatif
(frottis réalisé à partir d’une culture bactérienne Gram positif ou Gram négatif) doivent être
inclus dans la série
