Etude de la spore de Bacillus subtilis : caractérisation

des structures impliquées dans sa résistance

Pauline Loison

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Pauline Loison. Etude de la spore de Bacillus subtilis : caractérisation des structures im-
pliquées dans sa résistance. Biotechnologies. Université de Bourgogne, 2013. Français. <NNT
: 2013DIJOS078>. <tel-01124213>

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 Université de Bourgogne
Ecole Doctorale Environnement - Santé - STIC - N°490

Thèse présentée à
AgroSup - Dijon

Pour obtenir le titre de

Docteur de l’Université de Bourgogne
Discipline : Sciences de l’alimentation
Spécialité : Microbiologie

par Pauline Loison

Etude de la spore de Bacillus subtilis : caractérisation

des structures impliquées dans sa résistance

Soutenue le 10 Octobre 2013

Devant la commission d’examen :

Pr. N. ORANGE Université de Rouen Rapporteur

Dr. D. MARGUET CIML, Marseille Rapporteur
Pr. JM. PERRIER-CORNET AgroSup, Dijon Directeur de thèse
Pr. D. CHAMPION AgroSup, Dijon Co-directeur de thèse
Pr. P. GERVAIS AgroSup, Dijon Examinateur
Dr. F. WAHARTE Institut Curie, Paris Examinateur
 Remerciements

Ce travail de recherche a été réalisé à l’UMR Procédés Alimentaires et Microbiologiques, au

sein de l’équipe Procédés Microbiologiques et Biotechnologiques, sous la direction du
Professeur Jean-Marie Perrier-Cornet et du Professeur Dominique Champion.

Merci au Ministère de l’Education Nationale de la Recherche et de Technologie (MENRT)

pour le financement de cette thèse.

Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Nicole Orange et le Docteur Didier Marguet
d’avoir accepté la lourde tâche d’être mes rapporteurs de thèse. Je remercie également le
Professeur Patrick Gervais et le Docteur François Waharte d’avoir accepté de participer à mon
jury de thèse.

Je tiens aussi à remercier le Professeur Patrick Gervais, directeur de l’UMR PAM, de m’avoir
accueilli au sein de son laboratoire et de m’avoir permis d’effectuer cette thèse. Merci aussi
pour votre aide et vos conseils.

J’adresse également mes remerciements à mes encadrants de thèse. Merci au Professeur

Dominique Champion pour m’avoir encadré dans ce travail, pour sa disponibilité, sa
gentillesse, ses précieux conseils et pour m’avoir ouvert les portes du monde des Sciences des
matériaux. Je remercie aussi particulièrement le Professeur Jean-Marie Perrier-Cornet. Merci
d’avoir accepté d’encadrer mon travail, pour tes précieux conseils et pour toutes nos
discussions sur cette thèse. Merci également pour ta sympathie, ta disponibilité et ta
gentillesse.
Je remercie également tout particulièrement les Docteurs Marina K. Kuimova et Neveen A.
Hosny pour tous leurs conseils et leur gentillesse. Leur aide m’a été très précieuse, elles m’ont
ouvert les portes de l’imagerie en temps de vie et particulièrement des rotors moléculaires.
Merci de m’avoir permis de travaillé avec le Bodipy-C12.

Je remercie les membres de mon comité de thèse, Yvan Leguerinel et Marc Descamps, qui au
cours des réunions annuelles m’ont prodigué de précieux conseils.
Merci à mes stagiaires, Emilie, Kevin et Fabienne avec qui j’ai eu le plaisir de travailler. Cette
thèse est aussi leur travail et je les en remercie profondément.
Je tiens également à adresser un grand remerciement à tout le personnel de l’équipe PMB
comprenant l’ensemble des Maitres de conférences et Professeurs. En particulier, merci à
Eric, Rémy, Stéphane, Hélène et Mélanie. Laurent, je te remercie pour m’avoir initié au
monde de la recherche. Je remercie particulièrement Sylvie pour sa disponibilité et sa
gentillesse, merci d’être notre petite Maman du laboratoire ! Merci aussi au personnel
administratif pour leur efficacité et leur aide à gérer les problèmes administratifs et en
particulier Emmanuelle, Hélène, Karine et Florence. Merci également à Bernadette Rolin de
l’équipe PAPC pour son aide et sa gentillesse!

Un merci tout particulier à la « spore team », Hué, Alex et Julia. Le spore c’est la vie ! Merci
pour toutes nos discussions au travail mais surtout hors laboratoire! Mes remerciements vont
également à mes voisins de bureau, Seb et Gui, sans qui le bureau n’aurait pas été pareil !
Merci également à Yann et Cyril mais aussi à Romain, Charline, Célia, Samira et Florence de
la PPB. J’ai également une pensée particulière pour Mathieu. Merci à vous tous, c’est grâce à
vous que ces années passées au laboratoire furent de franches rigolades, sans vous ça n’aurait
pas été pareil!

Je tiens à remercier ma famille et tout particulièrement mes parents pour m’avoir

continuellement soutenu et m’avoir laissé le choix de faire ce qui me plaisait.

Enfin, mes remerciements vont bien entendu à Bruno qui m’a accompagné tout au long de
cette aventure. Merci d’avoir été là pour moi tout au long de cette thèse, pour ton soutien et ta
présence au quotidien. Merci particulièrement pour ton aide et tes petits plats de ces six
derniers mois, tu m’as aidé à tenir ! L’aventure continue maintenant…à Nancy !

En espérant n’avoir oublié personne.

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................................. 7
1. La spore bactérienne, sa structure et son cycle de vie ........................................................ 7
1.1. Structure et spécificité d’une spore « mature » ........................................................... 7
1.1.1. L’exosporium ....................................................................................................... 8
1.1.2. Le manteau (ou enveloppe) .................................................................................. 8
1.1.3. Le cortex ............................................................................................................... 9
1.1.4. Les membranes interne et externe ...................................................................... 10
1.1.5. Le protoplaste ou noyau ..................................................................................... 11
1.2. La sporulation ............................................................................................................ 13
1.2.1. Induction de la sporulation ................................................................................. 13
1.2.2. Formation d’une spore mature : la sporulation .................................................. 14
1.3. Le retour à l’état végétatif : la germination et le développement .............................. 17
1.3.1. L’activation : une étape facultative .................................................................... 17
1.3.2. La germination : un phénomène complexe et multifactoriel .............................. 18
1.3.3. Le développement (ou émergence) .................................................................... 21
1.4. Les spores bactériennes : impact pour l’alimentation humaine et la santé ................ 22
1.4.1. Pathogénicité ...................................................................................................... 22
1.4.2. Spores comme agents probiotiques et vecteurs « thérapeutiques ».................... 24
2. Résistance extrême de la spore aux stress environnementaux ......................................... 27
2.1. Comparaison entre cellules végétatives et spores ...................................................... 27
2.2. Propriétés du protoplaste impliquées dans la résistance extrême des spores ............ 28
2.2.1. Faible hydratation et mobilité réduite des composants du protoplaste .............. 28
2.2.2. Composition minérale du protoplaste ................................................................ 29
2.2.3. Les protéines SASPs .......................................................................................... 29
2.2.4. L’acide dipicolinique (DPA) .............................................................................. 30
2.2.5. Les systèmes de réparation de l’ADN ................................................................ 31
2.3. La membrane interne : structure impliquée dans la faible perméabilité de la spore . 32
2.3.1. Rôle du manteau et du cortex dans la perméabilité ............................................ 32
2.3.2. Composition de la membrane interne................................................................. 33
2.3.3. Propriétés spécifiques de la membrane interne .................................................. 36
2.3.4. Modulation des propriétés membranaires .......................................................... 38
3. Effets de perturbations environnementales sur les structures de la spore ........................ 40
3.1. Traitements physiques ............................................................................................... 40
3.1.1. Pression hydrostatique........................................................................................ 40
3.1.2. Température ....................................................................................................... 41
3.2. Traitements chimiques ............................................................................................... 42
3.2.1. Agents oxydants ................................................................................................. 43
3.2.2. Autres composés chimiques ............................................................................... 44
CONCLUSION ET PROBLEMATIQUE DE LA THESE ..................................................... 47
MATERIEL & METHODES ................................................................................................... 51
1. Matériel biologique .......................................................................................................... 51
1.1. Souches utilisées et techniques de culture ................................................................. 51
1.1.1. Souches bactériennes .......................................................................................... 51
1.1.2. Production de spores .......................................................................................... 51
1.1.3. Purification des productions de spores ............................................................... 53
1.1.4. Production de cellules végétatives ..................................................................... 53
1.2. Germination des spores ............................................................................................. 54
1.2.1. Conditions de germination ................................................................................. 54
1.2.2. Suivi de la germination ...................................................................................... 54
1.2.3. Obtention de fragments d’enveloppe après germination.................................... 55
1.3. Production de spores sans enveloppe (traitement chimique)..................................... 55
2. Caractérisation des structures de la spore par méthodes physicochimiques .................... 56
2.1. Etude de la mobilité par la résonance magnétique nucléaire (RMN) ........................ 56
2.1.1. Principe de la RMN ............................................................................................ 56
2.1.2. Préparation des spores déshydratées .................................................................. 57
2.1.3. Acquisition et traitement des signaux ................................................................ 57
2.2. Utilisation de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ............ 59
2.2.1. Principe de la spectroscopie infrarouge ............................................................. 59
2.2.2. Préparation des échantillons et acquisition du signal ......................................... 61
2.2.3. Suivi de la germination ...................................................................................... 62
3. Utilisation de la fluorescence pour étudier les structures de la spore .............................. 62
3.1. Spectrofluorimètrie .................................................................................................... 62
3.1.1. Principe............................................................................................................... 62
3.1.2. Mesure de l’anisotropie de fluorescence ............................................................ 63
3.1.3. Détermination du temps d’insertion de la sonde ................................................ 63
 3.1.4. Réalisation d’une rampe de température ............................................................ 64
3.2. Microscopie confocale ............................................................................................... 64
3.2.1. Mesure de la perméabilité des spores aux sondes fluorescentes ........................ 64
3.2.2. Acquisition d’image ........................................................................................... 66
3.3. Imagerie en temps de vie de fluorescence (FLIM) .................................................... 66
3.3.1. Principe............................................................................................................... 66
3.3.2. Détermination de la viscosité ............................................................................. 68
3.3.3. Intégration de la sonde ....................................................................................... 71
3.4. Cellules de visualisation ............................................................................................ 73
3.4.1. Fixation des spores ............................................................................................. 73
3.4.2. Germination ........................................................................................................ 73
3.4.3. Modification de la température .......................................................................... 73
4. Evaluation de l’effet d’un traitement éthanol sur les spores bactériennes ....................... 74
4.1. Barèmes des traitements utilisés ................................................................................ 74
4.2. Estimation de la viabilité ........................................................................................... 75
4.2.1. Pourcentage d’inactivation sur spores lavées ..................................................... 75
4.2.2. Pourcentage d’inactivation sur spores non lavées .............................................. 76
4.3. Estimation de la perméabilisation des spores ............................................................ 76
4.4. Evaluation de la viscosité des spores traitées ............................................................ 77
5. Traitement statistique des données ................................................................................... 77
RESULTATS ........................................................................................................................... 80
1. Caractérisation des structures de la spore impliquées dans sa faible perméabilité .......... 80
1.1. Approche non intrusive des structures et de la dynamique de la spore ..................... 81
1.1.1. RMN pulsée à bas champ ................................................................................... 81
1.1.2. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ............................... 84
1.2. Approche de la structure de la spore par la fluorescence .......................................... 86
1.2.1. Incorporation de sondes fluorescentes dans les spores ...................................... 87
1.2.2. Mesure de la mobilité des membranes et des structures hydrophobes d’une
population de spores par le DPH ...................................................................................... 89
1.2.3. Mesure de la viscosité des membranes et des structures hydrophobes de spores
individuelles par le Bodipy-C12 ........................................................................................ 90
2. Modification de la perméabilité de la spore et de la fluidité de ses membranes ............ 100
2.1. Modification « naturelle » des structures : la germination ...................................... 100
2.1.1. Libération de l’acide dipicolinique .................................................................. 100
 2.1.2. Modification de la membrane interne et de l’enveloppe .................................. 101
2.2. Effet de la température sur les structures de la spore .............................................. 107
2.2.1. Modification de la fluidité membranaire et autres structures hydrophobes d’une
population de spores ....................................................................................................... 107
2.2.2. Modélisation de l’état de rigidité de la membrane interne ............................... 108
2.2.3. Mesures individuelles de l’évolution de la viscosité de la membrane interne des
spores en fonction de la température .............................................................................. 109
2.3. Effet couplé de l’éthanol et de la température ......................................................... 111
2.3.1. Impact de l’éthanol sur l’inactivation des spores ............................................. 111
2.3.2. Modification des structures .............................................................................. 114
DISCUSSION GENERALE .................................................................................................. 125
Étude des propriétés de la membrane interne des spores bactériennes .............................. 125
Effet de la température sur les structures de la spore ......................................................... 133
Impact de l’éthanol sur les structures de la spore............................................................... 138
CONCLUSIONS – PERSPECTIVES .................................................................................... 145
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 151
Liste des symboles et abréviations

ADN Acide désoxyribonucléique

AED Analyse enthalpique différentielle
AGFK Asparagine, Glucose, Fructose et KCl
ANOVA Analyse de la variance
AO Acridine orange
ARN Acide ribonucléique
ATP Adénosine triphosphate
ATR Réflectance totale atténuée
aw Activité de l’eau
BCP Pourpre de bromocrésol
Bodipy-C12 Meso-phenyl-4,4′-difluoro-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene
Ca2+ Calcium
CL Cardiolipide
ClO2 Dioxyde de chlore
CPMG Carr-Purcell-Meiboom-Gill
DAPI 4',6'-diamidino-2-phénylindole
DCVJ 4-(Dicyanovinyl) Julolidine
dGDG Digalactosyldiacylglycérol
DMPC Dimyrystoylphosphatidylcholine
DMSO Diméthylsulfoxyde
DO Densité optique
DP2- Anion dipicolinate
DPA Acide pyridine-2,6-dicarboxylique ou Acide dipicolinique
DPH 1,6-Diphényl-1,3,5-Hexatriène
DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholine
Fi Intensité fractionnelle
FID Free Induction Decay
FLIM Imagerie par durée de vie de fluorescence
FRAP « Fluorescence recovery after photobleaching » – Redistribution de
fluorescence après photoblanchiement
FTIR Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourrier
FWHM « Full Width Half Maximum » – Largeur à mi-hauteur
GFP « Green Fluorescent Protein »
GP Polarisation généralisée
GUV Liposomes géants unilamellaires
H+ Hydrogène
H2O2 Peroxyde d’hydrogène
HCl Chlorure d'hydrogène
IP Iodure de propidium
IRF « Instrumental response function » – Réponse de l’instrument
K+ Ion potassium
KCl Chlorure de potassium
Laurdan 6-dodécanoyl-2-diméthylaminonaphthalène
LB Luria Broth
LE « Planar excited state » – Emission de fluorescence à partir de l’état
excité « plan »
l-PG Lysylphosphatidylglycérol
MAL Résidus δ-lactam muramiques
Mg2+ Ion manganèse divalent
Mn2+ Ion magnésium divalent
NAG N-acétyl-glucosamine
NAM N-acétyl-muramique
NaOH Hydroxyde de sodium
PBS Tampon phosphate salin
PE Phosphatidyléthanolamine
PG Phosphatidylglycérol
pH Potentiel hydrogène
PHB Acide poly-β-hydroxybutyrique
r Anisotropie de fluorescence
Rh 6G Rhodamine 6G
Rh B Rhodamine B
RMN Résonance magnétique nucléaire
RPE Résonance paramagnétique électronique
SASP « Small Acid Soluble Proteins » – Petites protéines solubles dans l’acide
SG Schaeffer’s-glucose
SNK Student-Newman-Keuls
SP Photo-produits
SPAD Single-photon avalanche diode
T2 Temps de relaxation spin-spin
TCSPC Time-Correlated Single Photon Counting
Tg Température de transition vitreuse
THF Tétrahydrofurane
TICT « Twisted intra-molecular charge transfer » – Relaxation non
fluorescente à partir de l’état de torsion
TTFC Fragment C de la toxine tétanique
UFC Unité formant colonie
UV Ultra-violet
ZnSe Séléniure de zinc
η Viscosité
ῆ Microviscosité apparente
χr2 Valeur du Chi 2 réduit
τ Temps de vie de fluorescence
INTRODUCTION
 Introduction

INTRODUCTION

De nombreux microorganismes procaryotes et eucaryotes peuvent produire des spores,

que ce soit pour leur reproduction ou pour leur protection face à des conditions
environnementales drastiques. Selon leur structure, leur mode de formation et leur origine, les
spores bactériennes sont classées en quatre catégories : les arthrospores ou conidies, produites
par les actinomycètes par exemple ; les kystes, produits par certaines bactéries Gram
négatives ; les exospores, observées chez certaines cyanobactéries et les endospores
(Sonenshein, 2000a). Dans le cadre de cette étude nous ne nous intéresserons qu’à cette
dernière catégorie de spores, dont la formation et la maturation ont lieu à l’intérieur de la
cellule mère. Cette catégorie concerne principalement des bactéries Gram positives,
appartenant notamment aux genres Bacillus et Clostridium (qui appartiennent à la branche
phylogénétique des Firmicutes) et qui sont largement répandues dans l’environnement
(Carlin, 2011). Le genre Bacillus correspond à des bactéries en forme de bâtonnets (1,2 à 10
µm de long), chimio-hétérotrophes, généralement mobiles (présence de flagelles péritriches),
habituellement présentes dans le sol. Ce sont des bactéries aérobies strictes ou facultatives. Le
genre Clostridium correspond également à des bactéries Gram-positives, mais qui sont
fermentaires, anaérobies et habituellement chimio-organotrophes. Les bacilles de ce genre
font environ 1,5 à 20 µm de long et se retrouvent généralement dans les sols ainsi que dans le
microbiote intestinal du tractus digestif (Cossart et al., 2004; Prescott et al., 2010). Dans ce
travail, nous nous intéresserons plus particulièrement à la bactérie Bacillus subtilis. B. subtilis
est « l’espèce type » du genre et la bactérie Gram-positive la plus étudiée. Son génome a ainsi
été l’un des premiers à être complètement séquencé (Kunst et al., 1997). En réponse à des
conditions défavorables, ces bactéries ont donc la capacité de former par enkystement des
endospores (appelées spores dans ce mémoire) métaboliquement inactives et qui peuvent
survivre sous cette forme plusieurs millions d’années (Nicholson et al., 2000).

Les spores résistent efficacement à de nombreuses perturbations environnementales comme

des traitements thermiques à plus de 140 °C, à des pressions de plus de 4 GPa, à un manque
de nutriments, à la plupart des agents antimicrobiens mais également aux rayonnements UV et
γ. Elles sont en outre capables de germer même après de longues périodes de dormance
(Nicholson et al., 2000; Driks, 2002; Nicholson et al., 2002; Errington, 2003). En effet,
lorsque les conditions redeviennent favorables pour la croissance, la spore peut retourner à

1
 Introduction

son état végétatif (via la germination) et coloniser l’environnement par multiplication. Ces
spores représentent une préoccupation majeure des industries alimentaires, car elles sont
responsables de détérioration d’aliments et de toxi-infections alimentaires en raison de leur
haute résistance aux procédés de conservation des aliments. Les spores bactériennes sont
également connues pour être des agents infectieux animaux et humains. Elles sont
responsables de pathologies comme la gangrène gazeuse (Clostridium perfringens), le tétanos
(Clostridium tetani), le botulisme (Clostridum botulinum) ou encore la maladie du charbon
(Bacillus anthracis). Du fait de leur extrême résistance, notamment à la déshydratation, ces
spores sont des armes biologiques potentielles. Elles peuvent en effet être disséminées
rapidement à travers le monde. Ainsi, en 2001, des spores de B. anthracis ont été utilisées
comme arme biologique (Prescott et al., 2010). Il serait néanmoins intéressant d’utiliser cette
capacité à résister à des conditions environnementales drastiques pour protéger, conserver et
délivrer des molécules d’intérêt (Setlow, 2005).

Cette résistance des spores est due à leur structure particulière et compartimentée (Atrih and
Foster, 2002). En effet les spores sont formées de plusieurs couches superposées les unes aux
autres et caractérisées par des propriétés différentes : un manteau protéique, un cortex fait de
peptidoglycanes, deux membranes phospholipidiques et, enfin, le protoplaste contenant le
matériel génétique et possédant une faible teneur en eau. A ce jour, bien qu’il y ait eu des
avancées majeures dans la compréhension de la résistance extrême des spores bactériennes,
les points clés de cette résistance ne sont pas complètement élucidés. La spore est une
structure particulièrement peu perméable et possédant une faible mobilité de ses structures. La
membrane interne par exemple est particulièrement intéressante car elle est généralement
définie comme la principale barrière de perméabilité ; ses propriétés et sa structure sont
cependant encore mal connues (Cowan et al., 2004; Griffiths and Setlow, 2009). Cette
imperméabilité est d’ailleurs très utile à la spore car elle lui permet de maintenir l’état
déshydraté du protoplaste et donc son état de dormance. Le manque de données sur les
structures de la spore et notamment ses structures les plus internes provient notamment de sa
faible taille (~1 µm) et de sa compartimentation.

Dans ce contexte, l’objectif de cette étude est de mieux comprendre la formation et la

structure spécifique d’une spore bactérienne et de les relier à sa résistance. Cette meilleure
compréhension pourra permettre d’une part d’améliorer les procédés d’inactivation des spores
et d’autre part d’utiliser la spore bactérienne comme modèle pour l’encapsulation de

2
 Introduction

molécules d’intérêts qui seraient internalisées dans son protoplaste. Pour ce faire, il est
important de mettre au point de nouvelles méthodes d’investigation ou d’utiliser des
techniques de caractérisation issues d’autres domaines, comme les sciences des matériaux et
qui sont applicables à la spore bactérienne. Ces méthodes permettront d’analyser la faible
perméabilité et la faible mobilité des structures de la spore. Elles permettront également
d’observer l’effet de différentes perturbations, connues pour modifier ces propriétés, sur les
structures de la spore.

Ce mémoire de thèse est divisé en quatre chapitres. Il débute par une étude bibliographique
qui établit l’état des connaissances sur les spores bactériennes. Une description du cycle de
vie des spores (sporulation, germination) est ainsi présentée après avoir donné une brève
description de la structure de la spore. Ensuite, les spécificités de la structure sporale
impliquées dans la résistance sont présentées dans une seconde partie. Un détail de la
composition des différentes couches et leurs rôles dans les différentes résistances de la spore
est donné. Plus particulièrement, les connaissances sur la structure la plus impliquée dans la
faible perméabilité et rigidité de la spore, la membrane interne, sont détaillées. Enfin, la
troisième et dernière partie aborde certaines perturbations environnementales responsables de
modifications des structures et notamment permettant de moduler la perméabilité et la rigidité
de la spore.

Le second chapitre du mémoire rassemble les matériels et méthodes utilisés pour réaliser les
travaux de recherches et détaille notamment les techniques utilisées et développées pour
suivre l’évolution des structures internes de la spore. Une méthode innovante d’investigation
des membranes utilisant la fluorescence dans le temps est développée.

Le troisième chapitre présente l’ensemble des résultats obtenus au cours de ce travail de thèse.
La première partie concerne la mise en place et l’utilisation de méthodes de caractérisation
des structures afin d’étudier la faible perméabilité et la rigidité de la spore. Ces méthodes sont
issues d’une part des sciences des matériaux et d’autre part de l’utilisation de sondes
fluorescentes aux propriétés spécifiques. Dans une seconde partie, différentes perturbations
modulant les propriétés de la spore sont utilisées. Ainsi, la germination, méthode dite
« naturelle » est étudiée. L’effet de la température, notamment dans la gamme de température
permettant l’activation thermique de la germination, est également observé. Enfin, l’effet de
traitements combinant à la fois l’éthanol et la température, connus pour perméabiliser les

3
 Introduction

structures de la spore, est caractérisé. Les modifications structurales de la spore en relation

avec son inactivation sont ainsi abordées dans cette dernière partie.

Enfin, une discussion de l’ensemble des résultats présentés dans ce mémoire fera l’objet du
quatrième et dernier chapitre de ce mémoire.

4
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

5
6
 Etude Bibliographique

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1. La spore bactérienne, sa structure et son cycle de vie

1.1. Structure et spécificité d’une spore « mature »

Certaines bactéries, appartenant aux genres Bacillus, Clostridium (bâtonnets) ou

Sporosarcina (coques) sont capables dans des conditions défavorables, de produire une
structure de résistance particulière : l’endospore. La sporulation est le processus qui conduira
à la formation de cette forme cellulaire de résistance qui s’appuie sur une morphologie unique
et remarquable. En 1876, Robert Koch et Ferdinand Cohn publient la première description
morphologique des endospores de B. anthracis et B. subtilis (Eichenberger, 2007). La
Figure 1 présente ainsi une schématisation de cette structure de résistance.

Paroi de la cellule
germante

Membrane Manteau
externe
Cortex
Membrane Protoplaste
interne
Exosporium
(absent chez B.subtilis)

~ 1µm

Figure 1 : Schéma général de la structure de la spore bactérienne (l’échelle des différentes structures n’est
pas respectée) et photographie en Microscopie Electronique à Transmission d’une spore de Bacillus
subtilis (MET). Echelle : 100 nm.

Cette forme cellulaire est multicouche, chaque couche possédant des spécificités
notamment en termes de composition.

7
 Etude Bibliographique

1.1.1. L’exosporium

Cette structure principalement protéique n’est présente que chez certaines espèces de
Bacillus comme B. cereus, B. anthracis ou Bacillus thurengiensis mais est absente chez
B. subtilis. Il s’agit de la couche la plus externe de la spore. Cette structure est constituée
principalement de lipides, de polysaccharides et de protéines (Matz et al., 1970; Setlow and
Johnson, 2007). Ainsi, pour B. cereus, la fraction protéique représente 52% de l’exosporium.
Sa fonction reste cependant peu claire, mais l’exosporium pourrait conférer aux spores des
propriétés d’adhérence aux surfaces du fait de sa nature extrêmement hydrophobe. En outre,
l’exosporium est plus hydrophobe que le manteau (Koshikawa et al., 1989).

1.1.2. Le manteau (ou enveloppe)

Le manteau est constitué d’environ 30 à 80 protéines spécifiques différentes et est

organisé en deux parties : l’enveloppe interne et l’enveloppe externe (Setlow and Johnson,
2007; Leggett et al., 2012). Dans les spores dormantes, le manteau représente une grande
fraction du volume de la spore. En effet, son épaisseur est d’environ 77 nm pour un rayon
total de la spore d’environ 577 nm (Westphal et al., 2003). En approximant la spore à une
sphère, cela signifie que le volume de l’enveloppe représente environ 35 % du volume total de
la spore tandis que la fraction protéique de l’enveloppe représente 50 à 80% des protéines
totales de la spore (Leggett et al., 2012). Le manteau contient également des carbohydrates
(6%). L’enveloppe interne a une apparence lamellaire et est peu dense en microscopie
électronique, au contraire, l’enveloppe externe est plus épaisse et plus dense aux électrons.
Bien que la plupart des protéines n’aient pas de rôle connu, le manteau en lui-même assure un
rôle de protection du cortex contre les enzymes de dégradation du peptidoglycane. En effet,
sans l’enveloppe, ces enzymes, comme le lysozyme, ont accès au cortex et entraînent sa
dégradation. Ainsi, le manteau joue un rôle de protection physique face à des bactériovores.
Des auteurs ont montré, par exemple, que le manteau était essentiel à la résistance à la
prédation par le protozoaire Tetrahymena thermophila (Klobutcher et al., 2006) ou par le
nématode Caenorhabditis elegans (Laaberki and Dworkin, 2008), en empêchant l’accès des
enzymes muralytiques de l’hôte au cortex de la spore. Cette structure a également un rôle de
protection face à certains agents chimiques (glutaraldehyde, iode, agents oxydants,…). Ainsi,
des spores mutantes sans enveloppe sont très sensibles à l’hypochlorite de sodium (eau de
Javel) (Ghosh et al., 2008). Le mécanisme par lequel le manteau protège la spore face à ces

8
 Etude Bibliographique

agents n’est pas très clair : soit il joue un rôle de barrière de perméabilité (mais beaucoup de
composés semblent pouvoir traverser cette structure), soit cette structure sert à détoxiquer ces
composés chimiques avant qu’ils ne pénètrent dans les régions internes de la spore. A ce jour,
à l’exception de CotA laccase qui intervient dans la protection contre le peroxyde
d’hydrogène (H2O2) (Henriques and Moran, 2007), aucune protéine précise n’a cependant été
identifiée dans ce rôle (Setlow, 2006).

1.1.3. Le cortex

Le cortex est constitué d’une forme de peptidoglycane (hétéropolymère de deux

dérivés glucidiques, la N-acétyl-glucosamine (NAG) et l'acide N-acétyl-muramique (NAM) et
de différents acides aminés) qui est similaire, mais non identique, au peptidoglycane des
parois des cellules végétatives. Il s’en distingue par la présence de résidus δ-lactam
muramiques (MAL). Cette particularité est à l’origine d’un plus faible nombre de chaînes
latérales peptidiques et ainsi d’une réduction de la réticulation des brins glycanes (Popham,
2002). En effet seulement 3% environ des résidus NAM des spores de Bacillus subtilis
contiennent des chaines latérales peptidiques réticulées, c’est-à-dire environ 11 fois moins que
dans la paroi d’une cellule végétative (Atrih et al., 1996). Le cortex contient également des
enzymes sous forme inactive, SleB et CwlJ, qui permettent d’hydrolyser le cortex au cours de
la germination. Les résidus δ lactames sont nécessaires pour l’hydrolyse du cortex durant la
germination. En effet, ces résidus font partie des substrats reconnus par ces enzymes (Atrih
and Foster, 1999). CwlJ est synthétisée dans la cellule mère et localisée spécifiquement entre
le cortex et le manteau. SleB est également présente à cet endroit mais aussi au niveau de la
membrane interne (Chirakkal et al., 2002) (Figure 2).

E
Cx
SleB
Pa

ME P MI

Figure 2 : Schéma présentant la localisation des enzymes de germination dans la spore bactérienne.
Cx : cortex, E : enveloppe, MI : membrane interne, ME : membrane externe, P: protoplaste, Pa : paroi de
la cellule germante. D’après (Setlow, 2003).

Le cortex semble jouer un rôle déterminant dans la déshydratation et le maintien de l’état

déshydraté du protoplaste, paramètre important notamment dans la résistance des spores à la
chaleur humide. Cependant les mécanismes de déshydratation sont encore peu compris

9
 Etude Bibliographique

(Setlow, 2006). Ainsi, le faible degré de réticulation dans les spores a été identifié comme un
mécanisme possible responsable de l’obtention et du maintien d’un état déshydraté du
protoplaste. Cependant, certains auteurs ont montré qu’un plus fort degré de réticulation du
cortex n’affecte pas l’hydratation du protoplaste mais perturbe par contre la germination des
spores (Popham et al., 1996). Le cortex constitue une structure de résistance mécanique face à
la forte pression osmotique générée par la concentration importante des solutés dans le
protoplaste (Meador-Parton and Popham, 2000; Popham, 2002; Zhang et al., 2012). Le cortex
pourrait avoir un rôle dans la création et le maintien de l’état compressé de la membrane
interne pendant la sporulation et ce jusqu’à la germination (Cowan et al., 2004).
Entre le cortex et la membrane interne se situe la paroi de la cellule germante. La structure de
cette couche de peptidoglycane apparait identique à celle d’une cellule végétative. Celle-ci
deviendra la paroi de la future cellule végétative.

1.1.4. Les membranes interne et externe

1.1.4.1. La membrane externe

Cette membrane, localisée entre le cortex et le manteau, est peu connue et peu décrite dans
la littérature. Il s’agit d’une membrane fonctionnelle lors du développement de la préspore
mais qui pourrait ne plus l’être dans la spore dormante (Setlow and Johnson, 2007). Ainsi,
cette membrane semble ne plus être intègre dans la spore et ne serait pas une barrière de
perméabilité importante (Setlow, 2006). Il a été montré chez Bacillus megaterium que cette
membrane possède une composition lipidique différente de celle de la membrane interne
(Swerdlow and Setlow, 1984). Cette membrane ne semble pas avoir de rôle particulier dans la
résistance des spores aux radiations, à la chaleur ou à des agents chimiques (Nicholson et al.,
2000) .

1.1.4.2. La membrane interne

Les propriétés de la membrane interne seront détaillées succinctement dans cette partie, la
membrane interne faisant l’objet d’une partie ultérieure (cf 2.3). Cette membrane correspond
à la membrane de la future cellule végétative. Sa composition lipidique apparait très similaire
à celle de la cellule végétative (Griffiths and Setlow, 2009) avec cependant une proportion
plus élevée de cardiolipides pour les spores. La composition protéique est quant à elle très

10
 Etude Bibliographique

différente. En effet, bien que la membrane des cellules végétatives contienne de nombreuses
protéines, la membrane interne possède, en plus des protéines membranaires classiques,
d’autres protéines très spécifiques. Ces protéines vont être des transporteurs, mais surtout des
récepteurs de germination (Paidhungat and Setlow, 2001). Cette membrane possède de plus
des propriétés uniques. Il s’agit d’une importante barrière de perméabilité, ralentissant l’entrée
de la plupart des molécules, aussi petite que la méthylamine, dans le protoplaste de la spore
(Black and Gerhardt, 1962; Cortezzo et al., 2004). Ceci permet une protection face aux agents
chimiques pouvant altérer l’ADN. Elle possède de plus une très faible dynamique, des auteurs
ayant montré que les lipides de cette membrane sont très peu mobiles (Cowan et al., 2004).

1.1.5. Le protoplaste ou noyau

Il s’agit de la structure centrale de la spore, contenant le matériel génétique, la plupart

des enzymes synthétisées ainsi qu’une molécule en quantité très abondante et spécifique à la
spore : l’acide pyridine-2,6-dicarboxylique ou acide dipicolinique (DPA).
L’hydratation du protoplaste est considérée comme faible, l’eau ne représente que 27 à 50%
du poids humide du protoplaste de spores, la variation étant liée aux espèces et aux conditions
de sporulation (Storz and Hengge, 2011). Ainsi les cellules végétatives contiennent environ
4 g d’eau / g de poids sec comparées au cytoplasme des spores qui ne contient que 0,4 à 1 g
d’eau / g de poids sec, soit environ 10 fois moins (Setlow and Johnson, 2007). Cette faible
teneur en eau est notamment liée à la présence dans le protoplasme du DPA complexé en
majorité aux ions calcium à un ratio 1 : 1 (Ca-DPA). Ainsi, des spores mutantes sans DPA
présentent une plus faible densité du protoplaste et donc une teneur en eau plus importante
(Paidhungat et al., 2000). En effet, Lindsay et al., ont corrélé la mesure de la densité du
protoplaste avec sa teneur en eau selon l’ Équation 1 (Lindsay et al., 1985).

= −.  + .   Équation 1

Avec y, densité du protoplaste et x, teneur en eau du protoplaste.

Le DPA représente environ 5 à 15% du poids sec total des spores. Cette concentration est telle
que le DPA est au-dessus de sa limite de solubilité (Huang et al., 2007). Cependant, il semble
que la faible teneur en eau du protoplaste n’empêche pas une mobilité importante de l’eau,
celle-ci ne serait que 30 fois inférieure à « de l’eau libre» et comparable à un système
eau/protéine de 0,6 g eau / g protéine (Sunde et al., 2009). Par contre, la mobilité des

11
 Etude Bibliographique

protéines et des ions à l’intérieur du protoplaste est quant à elle quasi nulle (Cowan et al.,
2003). Une autre caractéristique du protoplaste est la valeur de son pH, celui-ci diminuant de
1 à 1,5 unités durant la sporulation pour atteindre une valeur proche de 6. Cette valeur est plus
faible que celle mesurée dans les cellules végétatives (classiquement autour de 7,5-8) (Setlow
and Setlow, 1980; Magill et al., 1994). Ces changements de pH pourraient entraîner des
changements dans le métabolisme et la synthèse de macromolécules. Ainsi, la faible
hydratation et le pH jouent un rôle essentiel dans la modulation de la mobilité et de l’activité
enzymatique du protoplaste.
Une dernière caractéristique du protoplaste est la présence de petites protéines solubles dans
l’acide ou « Small Acid Soluble Proteins » (SASP), représentant 5 à 10% des protéines totales
des spores de Bacillus ou Clostridium, les plus répandus étant les SASP α et β. Ces protéines,
spécifiques des spores, forment un complexe avec l’ADN et le sature, lui conférant une forme
compressée particulière, une structure « ring like » comme le montre la Figure 3 (Ragkousi et
al., 2000).

a b

Figure 3: Observation en microscopie de fluorescence de spores de Bacillus megaterium marquées après 2

min de germination. a) marquage de l'ADN au DAPI b) immunomarquage des SASPs α/β. D’après
(Ragkousi et al., 2000).

Cet assemblage permet de protéger l’ADN contre de nombreuses altérations (Setlow et al.,
1991; Setlow, 2007). Ces protéines sont synthétisées tardivement dans la sporulation et
rapidement dégradées pendant la phase de germination (Setlow, 2007). Le rôle du DPA et des
SASPs sera détaillé dans la partie 2.2.

12
 Etude Bibliographique

1.2. La sporulation

La structure compartimentée de la spore résulte d’un cycle de formation unique qui

conduit la cellule bactérienne à former une endospore. Ce processus est appelé sporulation.
Les caractéristiques et la résistance exceptionnelle de la spore sont fortement liées au bon
déroulement des différentes étapes de cette sporulation. Celles-ci seront détaillées dans la
partie suivante.

1.2.1. Induction de la sporulation

L’entrée des cellules en sporulation dépend de plusieurs facteurs, le principal stimulus

de ce processus étant la limitation en nutriments. En général, une limitation en source de
carbone, d’azote ou plus rarement de phosphore peut induire une entrée en sporulation
(Nicholson and Setlow, 1990; Sonenshein, 2000b). Dans leur environnement naturel (le sol
généralement), ces bactéries sont souvent confrontées à un manque de nutriments et disposent
alors de plusieurs stratégies de survie. Lorsque la densité cellulaire augmente, des peptides
spécifiques sont sécrétés et s’accumulent dans le milieu extracellulaire. Quand ces peptides
atteignent une concentration critique, reflétant une forte concentration cellulaire, ils sont
« détectés » par des récepteurs à la surface des cellules et peuvent entraîner une
phosphorylation d’une protéine clé de la sporulation : Spo0A (Hoch, 1976; Strauch et al.,
1990). Le facteur de transcription Spo0A et notamment son degré de phosphorylation
gouverne la décision de l’entrée en sporulation mais également d’autres stratégies de survie.
En effet, un faible degré de phosphorylation conduira plutôt à la formation de biofilms ou à du
cannibalisme alors qu’un degré élevé entraînera la sporulation (López et al., 2009). Ces
phosphorylations sont sous le contrôle de kinases (Errington, 2003; Higgins and Dworkin,
2012). Le cannibalisme a ainsi été observé chez B. subtilis. La lyse de cellules qui ne sont pas
encore entrées en sporulation, via différentes enzymes, permet de libérer des nutriments. Ceci
va permettre aux cellules ayant initié la sporulation de continuer à croître plutôt que de
terminer la sporogénese ou de réaliser une sporulation « efficace » au moment opportun.
Ainsi, le cannibalisme, permettrait de retarder le recours à la sporulation (Gonzalez-Pastor et
al., 2003). La sporulation semble être l’ultime recours, puisqu’il s’agit d’un processus long et
couteux en énergie (Errington, 2003). L'entrée en sporulation nécessite un autre facteur de
transcription, le facteur σH. Celui-ci, en partenariat avec Spo0A, serait impliqué dans la
division cellulaire asymétrique qui conduirait à la sporulation (Hilbert and Piggot, 2004;

13
 Etude Bibliographique

Piggot and Hilbert, 2004). Les facteurs sigma sont des sous-unités protéiques qui s’associent
transitoirement avec l’ARN polymérase. Une fois associés, ces facteurs sigma déterminent
ainsi la spécificité de liaison de l’ARN polymérase avec des régions promotrices de l’ADN,
augmentant la transcription de sous-ensembles de gènes impliqués dans des processus
spécifiques(Gruber and Gross, 2003; Prescott et al., 2010), ici la sporulation.
Spo0A agit aussi en activant d’autres gènes spécifiques clés de la sporulation, notamment
ceux impliqués dans l’activation de facteurs sigma spécifiques à la sporulation (McKenney et
al., 2013).

1.2.2. Formation d’une spore mature : la sporulation

Face aux conditions extrêmes de son environnement la cellule va, en dernier recours,
initier la sporulation. Il s’agit d’un processus complexe, divisé généralement en 7 étapes,
contrôlé par 4 facteurs sigma distincts en plus de σH (Piggot and Hilbert, 2004). Ces facteurs
sigma sont spécifiques de la sporulation et contrôlent l’expression de gènes de la préspore et
de la cellule mère en début de sporulation (σF et σE, respectivement) et plus tardivement dans
la sporulation (σG et σK respectivement) (Hilbert and Piggot, 2004; De Hoon et al., 2010).
La cellule végétative mère est considérée comme l’étape 0-I. La Figure 4 schématise les
étapes conduisant à une spore mature.
Etape II Etape III
σF σF

σE
σE
σH Spo0A

σG

σK
σG
Etape I

Etape IV-V

σK

Etape VI-VII

Figure 4 : Schéma simplifié des étapes du cycle de sporulation et de germination chez Bacillus subtilis.
D’après (McKenney et al., 2013).

14
 Etude Bibliographique

Elle débute par une division cellulaire asymétrique près de l’un des pôles de la cellule, cette
étape est contrôlée par Spo0A et σH. Le septum de division pendant la sporulation est
similaire mais non identique à un septum de division cellulaire classique, et contient une fine
couche de peptidoglycane séparant les deux compartiments (Higgins and Dworkin, 2012).
Ceci correspond à l’étape II de la sporulation. Pendant cette étape, la cellule mère synthétise
un certain nombre d’enzymes (principalement extracellulaires), incluant des α-amylases,
protéases et nucléases ainsi qu’une variété d’antibiotiques extracellulaires. En conséquence
de cette division asymétrique, deux compartiments sont formés : un plus petit, la préspore et
un plus grand, la cellule mère.
Chaque compartiment s’engage dans une voie de différenciation via différents facteurs
sigma, σF dans la préspore et σE dans la cellule mère (Parker et al., 1996; Piggot and Hilbert,
2004; Leggett et al., 2012). σF entraînera l’activation de gènes impliqués dans la synthèse de
récepteurs de germination, le développement des constituants du cortex de la future spore, la
réparation de l'ADN et la communication avec le compartiment de la cellule mère (Wang et
al., 2006). Le septum commence ensuite à s’incurver et finalement, la préspore devient
complètement intégrée à l’intérieur de la cellule mère. Il s’agit de l’invagination, considérée
comme l’étape III. La préspore est englobée par la cellule mère, dans un processus
ressemblant à une phagocytose (Higgins and Dworkin, 2012; McKenney et al., 2013). Après
l'achèvement de l'invagination, la préspore est alors libre dans la cellule mère et entièrement
entourée par deux membranes, interne et externe. C’est à partir de ce stade que l’on parle de
« commitment », c'est-à-dire que l’engagement dans la voie de la sporulation devient
irréversible (Parker et al., 1996; Higgins and Dworkin, 2012).
Durant l’étape IV, deux couches de peptidoglycane sont synthétisées entre les deux
membranes : une couche épaisse correspondant au cortex et la paroi de la future cellule.
Cette synthèse résulte de l’action de gènes exprimés dans la cellule mère notamment sous le
contrôle de σE, mais aussi de σK (Errington, 1993; Vasudevan et al., 2007). Cette étape est
suivie par l’étape V qui voit la synthèse de l’enveloppe à l’extérieur de la spore en
développement. Il a cependant été décrit que l’assemblage du manteau commence juste après
l’invagination et continue tout au long de la sporulation. Celui-ci est composé d’au moins 70
protéines individuelles qui sont produites par la cellule mère et commencent à se localiser à
la surface de la spore pendant l’invagination. Les précurseurs du peptidoglycane sont
également synthétisés dans la cellule mère et sont acheminés à travers la membrane externe
de la préspore (Vasudevan et al., 2007; McKenney and Eichenberger, 2012). En même temps
que la formation du cortex, la préspore perd de l'eau et des ions comme le potassium (K+),

15
 Etude Bibliographique

suscitant une forte diminution en volume et une baisse simultanée du pH d'environ une unité.
La diminution du contenu en eau de la spore s’accompagne de l'absorption de cations (Ca2 +,
Mg2 + ou Mn2 +) et du DPA qui est synthétisé dans la cellule mère pendant les étapes IV et V.
La dernière période de développement des spores, la maturation appelée étape VI, se produit
avec peu de changements morphologiques manifestes (le matériau de l’enveloppe devient
plus dense en apparence) mais au cours de cette période, les propriétés caractéristiques de
résistance à la chaleur, de dormance et de germination apparaissent successivement. La
cellule mère se lyse ensuite pour libérer la spore mature, il s’agit du dernier stade, l’étape VII
(Nicholson and Setlow, 1990; Errington, 1993; Leggett et al., 2012). Cette spore libérée,
métaboliquement inactive, est ainsi résistante à de nombreux stress environnementaux
extrêmes (hautes températures, radiations, détergents, solvants chimiques,…) et peut rester à
l’état de dormance sur une très longue période de temps (Errington, 2003).
Les deux termes « matures » et « métaboliquement inactive » doivent être pris avec
précaution lorsqu’on parle de spores qui viennent d’être libérées de la cellule mère. En effet,
des auteurs ont montré, que des spores récoltées directement après leur libération, sont moins
résistantes à la chaleur que celles récoltées au moins 24 h plus tard. Ceci serait lié à une
maturation supplémentaire de l’enveloppe, elle-même reliée à une activité enzymatique
(Sanchez-Salas et al., 2011). De plus, il semble que ces « jeunes » spores possèdent une
dynamique de transcription (période adaptative), et n’entreraient en réalité en dormance que
quelques jours après la fin de la sporulation (Segev et al., 2012).

Dans les cultures de laboratoire, la sporulation commence au début de la phase stationnaire

lorsque les nutriments sont épuisés (Nicholson and Setlow, 1990; McKenney and
Eichenberger, 2012). La Figure 5 présente ainsi un résumé des étapes de la sporulation en
fonction de la densité optique chez B. subtilis à 37 °C. Du point de vue d’une spore
individuelle, la sporulation dure environ 8 à 10 h (De Hoon et al., 2010).

16
 Etude Bibliographique

-2 0 2 4 6

Figure 5: Courbe de temps idéalisée de la sporulation chez Bacillus subtilis à 37 °C avec les différentes
synthèses caractéristiques et l’apparition de différentes résistances. (D’après Nicholson et Setlow, 1990).

1.3. Le retour à l’état végétatif : la germination et le

développement

Les spores sont formées lorsque les conditions environnementales de la bactérie sont
défavorables. Inversement, lorsque ces mêmes conditions redeviennent viables pour le
microorganisme, la spore va entamer son retour à l’état végétatif via la germination. La
germination est une série d’événements entraînant la perte de propriétés spécifiques des
spores et est déclenchée par des solutés spécifiques (germinants), par la variation de certaines
grandeurs physiques ou parfois spontanément (Foster and Johnstone, 1990).
Cette transition de l’état de spore à celui de cellule végétative implique 3 étapes : l’activation,
la germination et le développement.

1.3.1. L’activation : une étape facultative

L’activation prépare la spore à lever son état de dormance. Elle permet souvent à une
population de spores de germer plus rapidement et efficacement. Ainsi, Yi et Setlow, ont
montré une diminution du temps d’entrée en germination et de la libération du DPA après une
activation thermique (Yi and Setlow, 2010). Il s’agit cependant d’un phénomène réversible,

17
 Etude Bibliographique

c'est-à-dire qu’en absence de déclencheurs (de germinants), la germination n’aura pas lieu et
la spore restera en état de dormance (Keynan et al., 1964; Zhang et al., 2009). Les spores
activées gardent ainsi la plupart des propriétés des spores dormantes. Un certain nombre
d’agents sont responsables de l’activation bien qu’une exposition à un traitement thermique
sublétal (70 °C / 30 min par exemple) soit la plus utilisée. Celle-ci peut aussi être déclenchée
par un faible pH (< à 4,5) ou bien une exposition chimique (mercaptoethanol) (Keynan et al.,
1964),. Les mécanismes correspondants à l’activation sont encore peu connus cependant, la
modification de la conformation d’une ou de plusieurs protéines semble être impliquée. Ainsi,
Keynan et al., suggèrent que la chaleur modifie la structure tertiaire d’une protéine
responsable de la maintenance de l’état dormant en réduisant les ponts disulfures qui stabilise
cette protéine dans une configuration particulière (Keynan et al., 1964). La dénaturation
partielle de cette protéine serait réversible par réoxydation des ponts disulfures réduits. Zhang
et al., ont observé par spectroscopie Raman, des modifications dans les ratios d’intensité des
bandes caractéristiques du DPA, suggérant une modification de l’environnement de ce
composé à l’intérieur du noyau, à des températures correspondant à l’activation (Zhang et al.,
2009). Une dénaturation protéique a également été observée (Keynan et al., 1964; Zhang et
al., 2009). Yi et Setlow, en comparant l’augmentation du niveau d’expression de récepteurs
par spore (utilisation de mutants) à l’activation thermique, suggèrent que cette dernière
pourrait également être à l’origine d’une amélioration de l’accessibilité ou de la réponse de
ces récepteurs, dans un mécanisme qui reste peu clair (Yi and Setlow, 2010). L’activation
thermique pourrait aussi être associée à un événement thermique (relaxation enthalpique et/ou
transition vitreuse) observé aux alentours de cette température par plusieurs auteurs, et qui est
réversible après plusieurs jours, bien que la structure concernée ne soit pas bien élucidée
(Ablett et al., 1999; Leuschner and Lillford, 2003).

1.3.2. La germination : un phénomène complexe et multifactoriel

Contrairement à la sporulation, la germination est un événement irréversible. La

période précise correspondant à la germination possède plusieurs définitions suivant les
auteurs. On considère en général qu’elle correspond aux événements qui ont lieu après
l’induction et qui ne nécessitent pas d’énergie métabolique (pour la différencier du
« développement») (Setlow and Johnson, 2007). La germination peut avoir lieu en réponse à
de nombreux stimuli comme certains acides aminés spécifiques, des nucléosides, des sucres
mais aussi des germinants non métabolisables comme des surfactants cationiques, des ions, le

18
 Etude Bibliographique

DPA, mais aussi des traitements physiques comme les hautes pressions (Gould and Sale,
1970; Setlow, 2003). Ces germinants peuvent alors activer la germination via l’activation de
récepteurs de germination (localisés dans la membrane interne) ou via une action sur des
voies avales. La Figure 6 présente ainsi les différents stimuli (en rouge) et voies d’entrée en
germination (en mauve).
Nutriments

Pression de 100-200 MPa (Protéines GerP ?)

Récepteurs à la
germination
(homologues de GerA) Pression de 500-600 MPa

Alkylamines Libération des ions et du Ca2+ -

DPA (protéines SpoVA?)

Ca2+ - DPA traverse le

Réhydrataion partielle du
cortex et l’enveloppe
protoplaste et déformation
Ca2+ - DPA exogène
du cortex ?

Activation de
Activation de CwlJ
SleB
Hydrolyse du cortex et Traitement au lysozyme
hydratation complète du de spores sans
protoplaste enveloppe

Achèvement de la
germination

Figure 6: Différents facteurs inducteurs de la germination. D’après (Setlow, 2003).

Le DPA et les alkylamines sont des germinants plutôt universels au contraire des
nutriments qui sont souvent spécifiques à une espèce (Setlow and Johnson, 2007). Il a
récemment été montré que des petits fragments de peptidoglycanes (muropeptides) peuvent
être à l’origine d’une germination, ces fragments se liant à une protéine kinase de la
membrane interne (Shah et al., 2008). Les muropeptides sont produits lors de la dégradation
du peptidoglycane, il s’agit d’une caractéristique normale lors de la croissance. Ainsi un haut
niveau de ces composés dans l’environnement peut signifier une croissance abondante de
bactéries (Gram positives) et donc un environnement favorable à la vie (Setlow, 2008).
La germination est une série d’événements se déroulant, normalement, dans un ordre
particulier. Ainsi, initialement, la mise en contact avec un (ou plusieurs) des germinants cités
précédemment entraîne une série de réactions déclenchant l’entrée en germination, même si le

19
 Etude Bibliographique

germinant est enlevé. Setlow décrit ainsi la germination en 2 étapes constituées de plusieurs
stades (Setlow, 2003). Les étapes I et II sont ainsi schématisées sur la Figure 7.

Etape I
Germinants 1. Sortie d’ions et DPA
2. Hydratation partielle du
protoplaste
Activation (pH, 3. Perte de la résistance thermique
T°,…)

Etape II
Paroi de la cellule 1. Hydrolyse du cortex
germante 2. Hydratation supplémentaire du
Enveloppes protoplaste
Développement: 3. Expansion du protoplaste
1. Métabolisme 4. Perte de toute résistance
2. Dégradation des SASPs 5. Perte de la dormance
3. Synthèse de macromolécules
4. Sortie de l’enveloppe

Résidus d’enveloppes

Figure 7 : Déroulement du processus de germination d’une spore bactérienne D’après (Santo and Doi,
1974; Setlow, 2003).

Le premier stade serait une libération de cations monovalents (K+, Na+) issus probablement du
protoplaste de la spore. La germination se poursuit par la libération d’une grande quantité de
DPA et d’ions Ca2+, initialement présents dans le protoplaste des spores sous forme de
complexe Ca-DPA. Cette reprise des flux peut être reliée à une modification de la membrane
interne lors de la germination. En effet, la fluidité de la membrane interne augmente et sa
perméabilité augmente de plus de cent fois en début de germination (Swerdlow et al., 1981;
Cowan et al., 2004; Setlow et al., 2008). Le DPA est ensuite remplacé par de l'eau contribuant
à augmenter l'hydratation du protoplaste. Ceci serait à l’origine d’une première perte de
résistance de la spore, la résistance à la chaleur humide. Par contre cette étape a peu d’effets
sur la résistance à d’autres agents et ne permet pas la reprise d’activité enzymatique ou
l’augmentation de la mobilité des protéines (Cowan et al., 2003; Setlow, 2003). Le cortex est
ensuite dégradé. En effet, la sortie de DPA active elle-même, pour les spores de Bacillus,
l’hydrolyse du cortex via l’activation d’une des 2 enzymes de dégradation : CwlJ ou SleB.
Ces deux enzymes reconnaissent les résidus δ-lactam muramiques (MAL) et sont localisées
de manière adjacente à la surface externe et interne du cortex (Paredes-Sabja et al., 2011).
CwlJ est probablement activée directement par une forte concentration en DPA mais le
mécanisme d’activation de SleB est encore méconnu. Une faible concentration en DPA
semble pouvoir activer cette enzyme pour compléter la germination. Il a également été

20
 Etude Bibliographique

suggéré que SleB pourrait être activée par la variation de la pression exercée sur le cortex
alors que la plupart du DPA est libéré (Magge et al., 2008; Paredes-Sabja et al., 2011).
Par la suite, l’hydrolyse du cortex va permettre à son tour au noyau de s’expanser et de
s’hydrater complètement via une absorption d’eau supplémentaire. Le volume de la spore va
ainsi être multiplié par 2 à 3 (Setlow and Johnson, 2007). Cette hydratation va permettre
l'activation d'enzymes et l'initiation du métabolisme dans le noyau de spores (Yi and Setlow,
2010) et correspond au 5ème et dernier stade. Cette étape s’accompagne également d’une perte
supplémentaire de la résistance extrême des spores. Tous ces mécanismes et événements se
déroulent sans activité métabolique énergétique détectable (Setlow, 2003). De plus, à l’échelle
d’une spore individuelle, la germination peut être très rapide, de 30 secondes à 2 minutes.
Cependant à l’échelle de la population le temps peut être bien plus long car les spores
déclenchent l’entrée en germination après des temps de latence très différents.
Les spores possèdent des propriétés particulières de réfringence, ainsi une spore dormante et
mature est dite « phase bright » et apparait comme une structure brillante en microscopie à
contraste de phase. La germination s’accompagne de la perte de la réfringence et les spores
deviennent « phase dark ». Kong et al., en combinant microscopie à contraste de phase,
fluorescence et spectroscopie Raman, ont observé que une perte de réfringence très rapide (au
niveau d’une spore individuelle) et concomitante avec la libération de la majeure partie du
DPA, suivi d'une nouvelle baisse plus lente de la réfringence (~ 30% ) due à l’hydrolyse du
cortex (Kong et al., 2010).
Ainsi, nous avons pu voir qu’il existe deux types de constituants nécessaire à la germination
des spores, les récepteurs à la germination ainsi que les enzymes de lyse du cortex. Ces deux
constituants peuvent ainsi être les cibles de traitements provoquant l’inactivation des spores
en inhibant leur germination (Setlow et al., 2002).

1.3.3. Le développement (ou émergence)

Il s’agit de la dernière étape de la germination. Le développement est défini comme

l’ensemble des événements ayant lieu après la germination incluant l’initiation du
métabolisme, la synthèse de macromolécules, l’émergence ainsi que la croissance de la
nouvelle cellule (cf. Figure 7). A la suite de l’étape II, l’hydratation du protoplaste correspond
à celle d’une cellule végétative et la mobilité des protéines est restaurée. En conséquence, il y
a reprise d’activité enzymatique dans le noyau des spores (génération d’ATP, dégradation des
SASPs, catabolisme de certains acides aminés issus de cette dégradation,…) (Setlow, 2003).

21
 Etude Bibliographique

Dès les premières minutes de l’émergence, l’ARN est synthétisé à partir de nucléotides
stockés dans la spore ou provenant de la dégradation d’anciens ARN (Nicholson and Setlow,
1990; Setlow and Johnson, 2007). En ce qui concerne les protéines, leur synthèse arrive peu
de temps après celle de l’ARN et utilise en grande partie des acides aminés provenant de la
dégradation des SASPs dans les 20 à 30 premières minutes de l’émergence. La synthèse
d’ADN arrive plus tard dans le processus, après environ 45 minutes (Santo and Doi, 1974).
Bien que les spores utilisent des réserves endogènes, l’achèvement du développement, qui
peut prendre à peine 90 minutes, nécessite des nutriments exogènes (Setlow and Johnson,
2007). Ce processus voit le volume de la spore germante continuer à augmenter, nécessitant
ainsi la synthèse de membrane et de composés pariétaux. Au niveau structural, après environ
50 minutes, il est possible de voir l’émergence d’une cellule qui sera suivie après
environ1 heure par son élongation. Au bout d’environ 90 minutes, deux corps nucléaires sont
observés suivis par une division cellulaire. Il est alors possible de visualiser les fragments de
l’enveloppe aux pôles opposés de la cellule en division (Santo and Doi, 1974).
En effet, l’enveloppe est également altérée lors de ce processus. Elle se dégrade et se fissure
partiellement durant la germination, mais le mécanisme par lequel cette dégradation est initiée
n'est pas encore élucidé (Moir, 2006).
Après avoir décrit la structure de la spore, nous nous intéressons dans la partie suivante à
l’impact de son cycle de vie sur la santé humaine.

1.4. Les spores bactériennes : impact pour l’alimentation

humaine et la santé

1.4.1. Pathogénicité

La germination est une partie du cycle de la spore qui peut, dans le cas d’espèces
pathogènes, être à l’origine de maladies et/ou d’intoxications alimentaires. Elles peuvent
également provoquer la détérioration des aliments, notamment des aliments en conserve
(apparition de flaveurs de type rance ou aigre) (Setlow, 2005; Setlow and Johnson, 2007). B.
cereus est un exemple de bactérie responsable d’infections alimentaires. Ces bactéries sous
forme de spores peuvent contaminer des aliments comme le riz, les pommes de terre ou la
viande. Elles peuvent alors résister à la cuisson ou au réchauffage. Leur forme végétative peut
produire des entérotoxines dans l’aliment ou dans l’intestin de l’homme qui sont responsables

22
 Etude Bibliographique

de forts vomissements et diarrhées. Les bactéries du genre Clostridium peuvent aussi

provoquer des intoxications aigües. Ainsi, la forme végétative de Clostridium botulinum
produit une toxine thermolabile responsable du botulisme, Clostridium perfringens peut quant
à elle provoquer des intoxications via la contamination d’aliments. La sporulation dans
l’intestin, suite à l’ingestion, provoquera la synthèse d’entérotoxines.(Cossart et al., 2004;
Prescott et al., 2010).
En plus des intoxications, les bactéries sporulantes peuvent également provoquer d’autres
maladies. Ainsi, C. perfringens est également responsable de gangrènes gazeuses post-
traumatique, suite à une contamination de tissus blessés par des spores. C’est la germination
de C. perfringens qui est responsable de la production de la toxine impliquée (toxine α).
Bacillus anthracis (ou anthrax), une bactérie du sol, est l'agent pathogène de la maladie du
charbon, qui est une maladie animale hautement infectieuse pouvant être transmise aux
humains par contact avec des animaux infectés. La bactérie produit en effet des toxines
« charbonneuses ». Les spores sont ingérées par les herbivores, les animaux deviennent
infectés à leur tour, et les bactéries prolifèrent dans les vaisseaux lymphatiques exprimant
alors les exotoxines, ce qui conduit finalement à la mort de l'animal (Figure 8).

Ingestion

Germination et
SPORES
prolifération dans les
vaisseaux lymphatiques.
Libération massive des
formes végétatives dans
le sang avant la mort de Sporulation
l’animal.

FORMES VEGETATIVES
Dispersées à la mort de l’animal

Figure 8 : Illustration du cycle d’infection des animaux par Bacillus anthracis. D’après (Jensen et al.,
2003).

La contamination chez l’homme se fera principalement de manière directe via des coupures
ou plus rarement de manière indirecte par inhalation de spores. L’anthrax peut également
provoquer des infections intestinales (Jensen et al., 2003; Setlow, 2005; Prescott et al., 2010).

23
 Etude Bibliographique

1.4.2. Spores comme agents probiotiques et vecteurs « thérapeutiques »

Lorsqu’elles retournent à l’état végétatif, les spores peuvent être responsables d’un
certain nombre de maladies. Pourtant, la formation et la structure de la spore présentent
également des intérêts pour l’alimentation ou la santé.
Ainsi, les spores bactériennes sont utilisées comme probiotiques depuis au moins 50 ans, bien
que l’utilisation des Bacillus comme bactérie sporulante a gagné en intérêt depuis les 15
dernières années (Cutting, 2011). Les probiotiques sont définis comme des microorganismes
vivants, qui lorsqu’ils sont administrés en quantité adéquate confère un effet bénéfique à
l’hôte (WHO/FAO). La résistance extrême des spores semble leur permettre de passer les
stress drastiques que représente le système gastro-intestinal. En effet, plusieurs travaux ont
montré la sensibilité in vitro de cellules végétatives de Bacillus de différentes espèces à un
fluide gastrique simulé ou aux sels biliaires. Au contraire, des études menées sur des spores de
B. subtilis ont montré une très bonne résistance des spores aux fluides gastriques ou aux sels
biliaires bien qu’il semble que la germination soit partiellement inhibée par ces sels (Hong et
al., 2005). L’intérêt d’utiliser les spores comme probiotique provient également de la
possibilité de conserver le produit à température ambiante sous une forme déshydratée, sans
aucun effet délétère sur la viabilité (Cutting, 2011). Plusieurs études ont cherché à savoir
comment fonctionnait l’effet probiotique obtenu par les spores et/ou les cellules végétatives.
Bien que le genre Bacillus concerne des bactéries aérobies facultatives, il semble qu’elles
puissent, sous conditions appropriées, se développer sous conditions anaérobies comme celles
retrouvées dans le système gastro-intestinal (Hong et al., 2005). Il semble ainsi qu’un certain
pourcentage d’inoculum de spores de Bacillus (> 10%) peut germer dans le petit intestin, se
multiplier (de manière peu importante) puis resporuler (Casula and Cutting, 2002; Tam et al.,
2006; Leser et al., 2008). La capacité des microorganismes à subir ce cycle semble cependant
dépendre des souches, Tam et al., ayant observé une meilleure capacité pour des souches de
B. subtilis isolées d’un milieu naturel que pour des souches de laboratoire. Ils ont ainsi montré
un temps de séjour dans l’intestin de souris plus long pour ces souches (Tam et al., 2006). La
Figure 9 représente ce cycle.

24
 Etude Bibliographique

Ingestion des spores

probiotiques

Estomac : pH acide (pH<2), enzymes

stomacales, nutriments en transit

Résistance de la forme sporale
Duodénum : sécrétions
pancréatiques et biliaires

Résistance de la forme sporale

Jéjunum
pH 7-8, présence de
nutriments

Germination Iléon
Côlon descendant : Anoxie, diminution de
la quantité de nutriments, enzymes
bactériennes

Sporulation

Figure 9 : Schéma du cycle des spores bactériennes dans le système gastro-intestinal.

L’effet probiotique dû aux bactéries sporulantes et notamment aux espèces de Bacillus,

semble être relié aux spores germantes. Celles-ci susciteraient des réponses immunitaires dans
le tractus gastro-intestinal (observées notamment sur des modèles murins) cause d’un effet
probiotique (Cutting, 2011). Un autre des mécanismes considérés comme important est la
production de molécules antimicrobiennes par ces bactéries (Hong et al., 2005).
Plus récemment, l’utilisation des spores bactériennes, notamment de B. subtilis, a été
envisagée comme « véhicule » de vaccins. L’idée est d’utiliser le potentiel de l’enveloppe
pour l’affichage d’antigènes hétérologues, en utilisant notamment les protéines CotB ou CotC
de l’enveloppe comme le montre la Figure 10 (Ricca and Cutting, 2003).

Enveloppe externe
Cortex
Protéine de l’enveloppe
(protéine vectrice)

Protoplaste

Protéine hétérologue
(protéine passagère)
Enveloppe interne

Figure 10 : Illustration de l’affichage de protéines hétérologues à la surface des spores bactériennes.

D’après (Ricca and Cutting, 2003).

25
 Etude Bibliographique

Ainsi, des spores de B. subtilis affichant l’antigène du fragment C de la toxine tétanique

(TTFC) ont été utilisées pour la vaccination orale et nasale et ont montré la génération de
réponses muqueuses et systémiques chez un modèle murin (Duc et al., 2003). De même, la
production de spores exprimant un antigène ciblé contre un parasite a été réalisée. Ce modèle
a été utilisé pour une vaccination orale chez le rat et a montré une réponse de la muqueuse
chez ces animaux. Il semble que cet antigène exprimé sur les spores de B. subtilis provoque
bien une réponse immunogène et peut fournir une éventuelle protection contre le parasite
(Zhou et al., 2008).

Ainsi, la spore bactérienne est une structure cellulaire multicouche dormante issue d’un
processus appelé sporulation qui intervient lorsque certaines bactéries sont placées dans
un environnement défavorable. Lorsque des conditions favorables reviennent, ces spores
sont réactivables et peuvent revenir à un état végétatif via la germination. Ces bactéries
pathogènes peuvent sous la forme de spore résister à une grande variété de traitements
drastiques naturels (tractus digestif, déshydratation) ou mise en place par l’homme
(pasteurisation, séchage, congélation) et ainsi contaminer l’homme en provoquant des
intoxications alimentaires et/ou maladies. En effet, les nombreuses spécificités dans leur
composition et leur structure unique sont à l’origine d’une extrême résistance des spores
à une grande variété de contraintes physiques telles que la chaleur sèche et humide, les
radiations UV et γ ou encore les agents oxydants. La composition particulière de la
spore, a un rôle important dans sa résistance extrême aux stress environnementaux. Un
autre facteur important dans cette résistance est sa faible perméabilité, due notamment
à sa membrane interne mais également à d’autres structures plus externe comme
l’enveloppe. Ces deux paramètres feront l’objet de la partie suivante.

26
 Etude Bibliographique

2. Résistance extrême de la spore aux stress

environnementaux

2.1. Comparaison entre cellules végétatives et spores

Les procédés classiques de décontamination, comme la pasteurisation ou la
stérilisation utilisent la chaleur humide pour détruire les microorganismes. Les barèmes de
pasteurisation sont connus pour ne pas être efficace sur les spores bactériennes, au contraire
de la stérilisation dont le barème a été initialement établi pour détruire la totalité des formes
sporulées (120 °C / 20 min). Les spores sont en effet généralement résistantes à des
températures 40 °C plus élevée que les cellules végétatives en chaleur humide (Setlow, 2006)
(Tableau 1).

Tableau 1 : Différences observées entre spores et cellules végétatives de Bacillus subtilis : structure et
résistance face à différents traitements. D’après (Setlow et al., 2002; Setlow, 2005; Setlow and Johnson,
2007)
Cellules végétatives Spores dormantes

Caractéristiques structurales

Surface Gram positive (majorité). Paroi cellulaire Enveloppes. Epais cortex

Apparence microscopique Non réfringente Réfringente

Contenu en Calcium Faible Elevé

DPA Absent Présent

Contenu en eau Élevé, 80-90% Faible, 25-50% (protoplaste)

SASPs Absente Présente

Métabolisme Présent Très faible ou absent

Résistance (en % de survivants à moins d’une autre indication)

-4
Chaleur humide-85°C 30min < 10 79

Valeur de D à 65°C < 15 sec 105 h

-5
Chaleur sèche-120°C 30min < 10 14

Lyophilisation et réhydratation 2 > 90

2 -6
Radiation UV à 254 nm – 315 J/m < 10 10
-6
0.5 M HCl-24°C 30 min < 10 65
-2
Ethanol 70% 65 °C < 10 (1 min) 59 (1 h)

27
 Etude Bibliographique

Les différences observées entre cellules végétatives et spores sont à la fois constitutives, c’est-
à-dire au niveau de leur structure et composition, mais aussi dans leur résistance à différents
procédés. Ainsi, la spore possède des composés spécifiques comme le DPA ou les protéines
SASPs. Cette différence dans leur constitution est notamment responsable de la meilleure
résistance des spores à divers traitements. Tous les stress existants ne sont pas répertoriés, il
est ainsi également connu que les spores sont plus résistantes que les cellules végétatives aux
radiations γ ou aux hautes pressions (Nicholson et al., 2000).

2.2. Propriétés du protoplaste impliquées dans la résistance

extrême des spores

2.2.1. Faible hydratation et mobilité réduite des composants du protoplaste

Comme indiqué précédemment, le protoplaste des spores contient une faible teneur en
eau, de l’ordre de 25 à 50% du poids humide. Cette caractéristique va intervenir dans la
résistance des spores notamment à la chaleur en milieu liquide. En effet, il existe une relation
bien établie entre la teneur en eau du protoplaste et la résistance à la chaleur humide : plus le
protoplaste est hydraté et plus la résistance diminue (Popham et al., 1995). Ceci a été constaté
de différentes façons. Des espèces, voire des souches différentes du genre Bacillus, ont une
résistance différente à la chaleur, corrélée à la teneur en eau de leur protoplaste. Pour une
même espèce, les spores formées à une température plus élevée ont généralement une teneur
en eau plus faible et sont alors plus résistantes. Par exemple, les spores de B. subtilis produites
à 50 °C ont une teneur en eau de 33,5% comparées à 50% pour les spores produites à 37 °C.
Leurs valeurs de D100, c'est-à-dire le temps (en minutes) nécessaire pour réduire la population
par 10 à une température de 100 °C, sont alors de 45,1 et 8,84 min respectivement (Beaman
and Gerhardt, 1986). Ceci a également été observé pour les spores mutantes ne possédant pas
de DPA, qui ont un protoplaste plus hydraté et qui sont alors moins résistantes (Paidhungat et
al., 2000). De même, la modification de la composition lipidique de la membrane interne des
spores conduit à une plus faible survie des spores à ce traitement, les auteurs suggérant un
effet indirect de l’altération de la composition lipidique sur le niveau d’hydratation (Griffiths
and Setlow, 2009).
Il semble que la faible teneur en eau du protoplaste ait également un rôle dans la résistance
aux radiations γ (réduisant probablement la possibilité de ces radiations à créer des radicaux

28
 Etude Bibliographique

hydroxyles néfastes) et UV (la faible hydratation du protoplaste pouvant avoir un rôle dans la
formation de « spores photoproducts » (SP) qui se sont accumulés dans la spore suite à
l’exposition à ces radiations) (Setlow, 2006). Selon plusieurs auteurs, la mobilité des
substances contenues dans le protoplaste des spores est très réduite. Ainsi, une faible mobilité
des protéines a été mesurée dans le protoplaste (Leuschner and Lillford, 2000; Cowan et al.,
2003). La dénaturation des protéines par la chaleur va être minimisée si ces dernières sont
faiblement hydratées (Coleman et al., 2007). Cette faible mobilité est également un paramètre
important dans le maintien de l’état de dormance (et éventuellement la résistance) des spores.

2.2.2. Composition minérale du protoplaste

Le degré de minéralisation du protoplaste est également un facteur intervenant dans la

résistance à la chaleur humide et à la chaleur sèche ; une augmentation de la teneur en
minéraux permettant une meilleure survie. Ainsi, des spores de Bacillus stearothermophilus
présentent une plus faible résistance à la chaleur sèche lorsqu’elles sont déminéralisées
(Nicholson et al., 2000). En ce qui concerne la chaleur humide, une augmentation de la teneur
en eau suite à la déminéralisation peut expliquer en partie la diminution de la résistance. La
composition semble également jouer un rôle puisque, par exemple, les spores possédant une
plus grande proportion en Ca2+ sont plus à même de résister que les spores possédant une
grande quantité de Mg2+ ou Mn2+. De même, des spores enrichies en Ca2+ ont une résistance
similaire aux spores natives, alors que des spores enrichies en cations monovalents H+ sont
elles moins résistantes (Beaman and Gerhardt, 1986; Setlow, 2006).
La quantité et la composition en ions du protoplaste ont également un rôle dans la résistance à
la pression hydrostatique. Ainsi, des spores déminéralisées sont plus résistantes alors que si
elles sont reminéralisées avec du Ca2+ ou du Mg2+ la résistance de ces spores est diminuée, ces
deux derniers ions pouvant avoir un rôle dans l’activation des enzymes de germination (Igura
et al., 2003).

2.2.3. Les protéines SASPs

Ces protéines sont localisées dans le protoplaste des spores et saturent l’ADN. Elles
constituent un des paramètres majeurs de protection de l’ADN contre de nombreux
traitements comme la chaleur ou l’H2O2. L’utilisation de spores mutantes ne possédant pas de
SASPs α et β a permis de corréler la présence de ces protéines à la résistance à de nombreux

29
 Etude Bibliographique

stress. Les spores sauvages présentent une bien meilleure résistance à la chaleur sèche que les
spores mutantes (90% de survie après 60 min à 90 °C contre 2,1% de survie après 5 min à
90 °C pour les spores ne possédant pas de SASPs α et β) (Popham et al., 1995; Setlow and
Setlow, 1995). De même les spores déficientes en SASPs sont décrites comme étant beaucoup
plus sensibles aux radiations UV (Mason and Setlow, 1986), à l’H2O2 (Setlow and Setlow,
1993) ou à d’autres agents chimiques comme le glutaraldehyde (Tennen et al., 2000). Popham
et al., ont montré que l’exposition des spores à la chaleur humide n’entraîne pas de
dégradation de l’ADN (les spores survivantes ne présentent pas plus de mutations), suggérant
qu’il existe un mécanisme de protection, probablement par la saturation de l’ADN par les
SASP α et β (Popham et al., 1995).
La diminution de la quantité en protéines α et β entraîne également une diminution de la
résistance des spores de C. perfringens à la chaleur humide ou aux radiations UV (Setlow,
2007). Il existe d’autres SASPs dans la spore, les SASPs γ et d’autres dites mineures, dont le
rôle n’est pas connu.

2.2.4. L’acide dipicolinique (DPA)

Le protoplaste de la spore contient une grande quantité de DPA (5 à 15 % du poids sec de

la spore), bien que le contenu puisse varier selon l’espèce ou la souche et les conditions de
sporulation (Huang et al., 2007). Cette molécule (Figure 11) n’est synthétisée que dans la
cellule mère et diffuse dans la spore dans les dernières étapes de la sporulation sous forme
chélatée (1 : 1) avec des cations divalents, notamment le Ca2+ (Setlow, 2005). Il semble de
plus que cette molécule soit sous sa forme basique à l’intérieur de la spore, l’anion
dipicolinate, avec 3 molécules d’eau (CaDP.3H2O) (Johnson et al., 2010).

Figure 11 : Structure chimique de l’acide dipicolinique (DPA) et de l’anion dipicolinate (DP2-)

L’utilisation de spores déficientes en DPA a permis de clarifier le rôle de cette molécule

dans la résistance des spores. Ainsi, ces spores mutantes sont plus sensibles à la chaleur
humide, à l’H2O2, ceci étant en grande partie relié à une plus importante quantité d’eau dans

30
 Etude Bibliographique

le protoplaste (Paidhungat et al., 2000; Setlow et al., 2006). Le DPA aurait donc un rôle dans
le maintien de l’état déshydraté du protoplaste. Coleman et al., ont également montré que lors
d’un traitement thermique en milieu liquide, une augmentation en eau du protoplaste apparaît
dans les spores dans lesquelles le DPA a été libéré (Coleman et al., 2007). Cette molécule a
également un rôle dans le maintien de l’état de dormance. En effet, les spores sans DPA ont
tendance à germer de manière spontanée (Paidhungat et al., 2000; Setlow et al., 2006), bien
que ce comportement ne soit pas bien compris. Les spores sans DPA sont plus sensibles à la
dessiccation (observation de mutations chez les survivantes). Un effet similaire est observé
face à des traitements par la chaleur humide ou sèche en absence de SASPs (Setlow et al.,
2006). Il semble que ce composé joue également un rôle de protection de l’ADN. Le DPA est
aussi connu pour être un photo-sensibilisant des spores, augmentant le nombre de photo-
produits (« spore photoproduct » = SP) (Nicholson et al., 2000).

2.2.5. Les systèmes de réparation de l’ADN

La spore possède des mécanismes de réparation de l’ADN lors du retour à l’état végétatif.
Cette réparation va se faire pendant la phase de germination et peut avoir lieu bien avant la
réplication de l’ADN (Setlow and Johnson, 2007). Ce système de réparation est mis en place à
la suite de différents traitements provoquant des dégradations de l’ADN. Ainsi, Setlow et
Setlow ont montré que l’expression de gènes impliqués dans la réparation de l’ADN (comme
recA) est induite de manière importante durant la germination suite à une exposition à la
chaleur sèche ou aux UV (Setlow and Setlow, 1996). L’utilisation de mutants inactifs sur ces
gènes a également montré l’importance de ce système de réparation. Il faut environ neuf fois
moins de temps pour détruire 90% de ces spores comparées aux spores sauvages (2 min
contre 18 min à 120 °C), et ces spores sont environ 2 fois plus sensibles aux UV. Les spores
ne possédant pas RecA et/ou les protéines de réparations sont également beaucoup plus
sensibles à certains composés chimiques (Setlow and Setlow, 1996; Salas-Pacheco et al.,
2005; Ibarra et al., 2008). Ce gène est impliqué dans des procédés de réparation par
recombinaison ou excision qui peuvent aussi nécessiter certaines protéines spécifiques de
réparation (Leggett et al., 2012). Il existe un autre système de réparation, qui est la lyase de
photoproduits (lyase photoproduct), une enzyme spécifique aux SP générés suite à
l’exposition aux UV.

31
 Etude Bibliographique

2.3. La membrane interne : structure impliquée dans la faible

perméabilité de la spore

2.3.1. Rôle du manteau et du cortex dans la perméabilité

L’ensemble « Enveloppe-Cortex » ne semble pas représenter une barrière de perméabilité

importante à l’eau. Ainsi des travaux réalisés sur les spores de Bacillus thuringiensis à l’état
sec ont montré que ces dernières sont sensibles à un changement en humidité relative du
milieu. Ces spores ont tendance à se contracter lorsque l’humidité est diminuée et à regonfler
lorsque l’humidité est augmentée. Ceci est corrélé à une diffusion rapide de l’eau à travers
l’ensemble « Enveloppe-Cortex » (une première étape dans le regonflement étant rapide,
environ 50 secondes) au contraire de la diffusion jusqu’au protoplaste (Westphal et al., 2003).
De manière similaire, en utilisant la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), il a été montré
une diffusion rapide de l’eau à travers l’enveloppe, diffusion plus rapide à l’état hydraté qu’à
l’état sec (Sunde et al., 2009). L’enveloppe peut être vue comme un « tamis », c'est-à-dire
qu’elle constitue une barrière par rapport à certaines molécules, notamment par rapport à leur
taille. Ainsi, cette structure constitue une barrière pour des molécules comme le lysozyme,
mais laisserait passer des molécules allant de 2 à 8 kDa selon les espèces, ici pour B.
megaterium et B. cereus respectivement (Driks, 1999; Nicholson et al., 2000). Ceci
permettrait d’éviter que des enzymes de dégradation du cortex n’arrivent jusqu’à cette
structure. La relative porosité de l’enveloppe est cependant nécessaire. En effet, de
nombreuses molécules, notamment des germinants, peuvent passer au travers de l’enveloppe
et du cortex et atteindre des couches plus profondes telles que la membrane interne qui
contient les récepteurs (Driks, 1999). Il semble cependant que cette structure ait un rôle
critique dans la résistance à de nombreux composés chimiques (peroxyde d’hydrogène, le
peroxynitrite, l’hypochlorite…) responsables de l’inactivation rapide des spores en absence
d’enveloppe (Ghosh et al., 2008; Leggett et al., 2012). En étudiant, l’effet de traitements
chimiques sur les spores de B. cereus, Cronin et Wilkinson ont également montré par
cytométrie en flux que l’enveloppe serait, paradoxalement, la principale barrière à des
composés fluorescents comme l’Iodure de Propidium (IP) et le Hoechst 33342 (Cronin and
Wilkinson, 2008). Des molécules de faible taille comme l’éthanol, le NaOH ou le HCl,
peuvent passer la relative barrière que représente l’enveloppe comme le montre le peu de
différence de sensibilité de spores sans enveloppe à ces agents (Setlow et al., 2002).

32
 Etude Bibliographique

En ce qui concerne le cortex, son éventuel rôle comme barrière de perméabilité n’est que peu
décrit dans la littérature. Plomp et al., en observant la germination des spores de Bacillus
atropheus en microscopie à force atomique ont révélé une structure en nid d’abeille du cortex
dont la taille des pores varie de 5 à 100 nm (Figure 12) (Plomp et al., 2007).

Figure 12 : Germination d’une spore de Bacillus atrophaeus observée par microscopie à force atomique.
(a) 3h40, (b) 5h45, (c) 7h05, (d) 7h30, (e) 7h45, (f) 7h15, (g) 7h50, (h) surface d’une cellule végétative de B.
atrophaeus. Echelle : 500 nm (a-e), 100 nm (f-h) et 1 µm (h encadré). D’après (Plomp et al., 2007).

Le cortex ne représente ainsi pas une structure imperméable à l’eau bien qu’un de ses rôles
majeurs semble être la mise en place et/ou le maintien d’un état déshydraté du protoplaste ;
cette fonction est assurée en association avec la membrane interne. Son rôle mécanistique
peut être vu via la germination. En effet, sa dégradation est essentielle pour permettre la
germination et ainsi le retour à la perméabilité et la « fluidité » d’une cellule végétative
(Setlow, 2003; Setlow et al., 2009).

2.3.2. Composition de la membrane interne

2.3.2.1. Composition phospholipidique

Un certain nombre d’études se sont intéressées aux caractéristiques de la membrane

interne et notamment à sa composition phospholipique. Ainsi, le Tableau 2 donne la
composition lipidique ou phospholipidique mesurée par différents auteurs dans les cellules
végétatives de certaines souches de B. subtilis comparées à celle des spores (notamment la
membrane interne).

33
 Etude Bibliographique

Tableau 2 : Composition lipidique (excepté mention contraire) (en %) des membranes plasmiques de
cellules végétatives et de la membrane interne des spores de Bacillus subtilis. PG : phosphatidylglycérol,
PE : phosphatidyléthanolamine, CL : cardiolipide, l-PG : lysyl-phosphatidylglycérol, dGDG :
digalactosyldiacylglycérol

PE PG CL l-PG dGDG
Publication
(%) (%) (%) (%) (%)
Cellules végétatives phase
(Op den Kamp
stationnaire (composition 30 36 12 22 -
et al., 1969)
phospholipidique)
Cellules végétatives phase (Kawai et al.,
24,4 39,4 1,4 15,6 9,4
exponentielle 2004)
(Kawai et al.,
T2h après le début de sporulation 26,5 47,1 2 16,7 6,3
2004)
T4h après le début de la (Kawai et al.,
22,9 47 5,4 2,7 8
sporulation 2004)
Cellules végétatives phase (Kawai et al.,
33,3 50,2 1,2 2 9,8
exponentielle 2006)
(Kawai et al.,
Spores 168 9,6 45,7 24,3 1,4 1,4
2006)
Cellules végétatives en phase (Griffiths and
14 23 46 Nd 17
stationnaire Setlow, 2009)
(Griffiths and
Spores CU1065 12 35 50 Nd 3
Setlow, 2009)

On constate des compositions légèrement différentes selon les souches utilisées ainsi que
le stade de croissance. L’utilisation de milieux de croissance différents peut aussi expliquer
ces différences. Dans les cellules végétatives en phase stationnaire, les phospholipides
principaux sont le phosphatidylglycérol (PG), la phosphatidyléthanolamine (PE) ainsi que le
cardiolipide (CL) (Op den Kamp et al., 1969; Griffiths and Setlow, 2009) ; les PG et CL étant
des phospholipides anioniques (Kawai et al.,2004; Nishibori et al.,2005) au contraire du PE
qui est un phospholipide neutre.
Selon, le Tableau 2, des cellules en phase exponentielle auraient cependant une plus faible
proportion en CL et une plus forte proportion en lysyl-phosphatdylglycérol (l-PG). Il semble
qu’au cours de l’entrée en sporulation et dans les premières heures, la proportion en
cardiolipides augmente, ce qui est cohérent avec l’augmentation de la transcription de gènes
impliqués dans sa synthèse (Kawai et al., 2004). On atteint alors dans les spores, et
notamment dans la membrane interne, une plus forte proportion en phospholipides PG et CL
et une plus faible proportion en PE que dans les cellules végétatives (Kawai et al., 2006;
Griffiths and Setlow, 2009). Les cardiolipides en présence de certains cations divalents ainsi
que de PE ont la possibilité de former des structures qui ne sont pas en bicouches (Matsumoto

34
 Etude Bibliographique

et al., 2006). Ceci permet, en entraînant des discontinuités dans la membrane, des fonctions de
dynamique membranaire comme l’intégration et la stabilisation de protéines dans la
membrane (Dowhan, 1997). Kawai et al,. ont ainsi montré la présence de domaines riches en
CL dans la membrane des cellules de B. subtilis (Kawai et al., 2004). Ces domaines auraient
un rôle dans la sporulation, jouant à la fois un rôle dans la formation du septum et dans le
processus d’invagination. Ils permettraient également une activité optimale de certaines
protéines spécifiques à la sporulation qui nécessiteraient une localisation et/ou un maintien
dépendant des CL. Griffith et Setlow, affirment cependant que les lipides majeurs retrouvés
dans les membranes, excepté le PG, ne sont pas indispensables à la sporulation, bien que
l’efficacité de la sporulation soit dépendante d’un « ensemble » de lipides (Griffiths and
Setlow, 2009).
La grande quantité de CL retrouvée dans les spores a été reliée à une implication de ces
phospholipides dans le fonctionnement de certains récepteurs de germination (L-alanine et
AGFK (Asparagine, Glucose, Fructose et KCl). Ce phospholipide serait nécessaire pour
donner la conformation appropriée à ces récepteurs (Kawai et al., 2006). Kawai et al.,
semblent montrer que, bien que ce phospholipide anionique puisse être remplacé pour des
fonctions indispensables pendant la croissance des cellules végétatives, il est par contre
indispensable à la germination des spores (Kawai et al., 2006). Ce résultat est à nuancer,
d’autres auteurs ayant observé que des mutants déficients en CL germaient assez bien en
présence de L-alanine et un peu moins bien avec le mix AGFK, avec tout de même une
efficacité moindre que des spores sauvages. Il semble qu’une germination optimale avec
nutriments nécessite un environnement lipidique membranaire approprié (Griffiths and
Setlow, 2009). Une modification de la composition lipidique de la membrane ne semble pas
perturber de manière drastique l'intégrité de la membrane interne des spores (contenu en DPA
inchangé) (Griffiths and Setlow, 2009). Cependant, cette modification aurait un impact
indirect sur la résistance à la chaleur humide puisque l’hydratation du protoplaste et donc la
résistance seraient modifiées (cf. 2.2).

2.3.2.2. Composition protéique

En plus des phospholipides, de nombreuses protéines spécifiques de la spore sont

localisées dans la membrane interne. La distribution des protéines à l’intérieur de la
membrane interne pourrait être répartie de façon hétérogène comme observée pour les spores
de B. megaterium (Swerdlow and Setlow, 1984). En effet, selon cette étude, la membrane

35
 Etude Bibliographique

serait composée de deux fractions, l’une ayant un ratio phospholipides/protéines de

4,3 mg/mg comparée à 0,47 mg/mg pour l’autre fraction. Les auteurs suggèrent également
une différence dans la teneur en protéines particulières. Cette membrane abriterait un certain
nombre de protéines impliquées dans la germination et la sporulation. Ainsi, le transport du
DPA (accumulation) à travers la membrane interne serait relié à la présence de protéines
SpoVA lors de la sporulation (Errington, 1993) mais également lors de la germination
(Vepachedu and Setlow, 2005). Vepachedu et Setlow, ont ainsi montré la présence de la
protéine transmembranaire SpoVAD dans la membrane interne, suggérant que les protéines
SpoVA sont localisées dans cette membrane (~15000 SpoVAD par spores). Cette grande
quantité peut faciliter le mouvement du DPA qui doit traverser la membrane interne dans les
premières minutes de la germination (Kong et al., 2010). La présence de nombreux récepteurs
de germination à l’intérieur de cette membrane, comme la protéine transmembranaire GerBA
ou d’autres protéines impliquées comme GerD, a également été montrée (Paidhungat and
Setlow, 2001). Toutes ces protéines seraient localisées dans des « domaines » ou clusters, ce
qui faciliterait une réponse rapide et coopérative en présence de nutriments. D’autres
protéines (récepteurs inconnus, agents de transduction du signal, agents de formation des
clusters,...) pourraient également être localisées dans ces domaines (Griffiths et al., 2011).

2.3.3. Propriétés spécifiques de la membrane interne

Plusieurs études ont montré la faible perméabilité de la membrane interne des spores.
Ainsi, la spore dormante est très imperméable, même à des petites molécules comme la
méthylamine (~31,1 g/mol) ; l’eau ne pénètre elle-même que très lentement dans la spore
(Swerdlow et al., 1981; Cortezzo and Setlow, 2005). La perméabilité de cette membrane à
l’eau serait en effet au moins 100 fois moins importante que celle d’une membrane modèle
(Sunde et al., 2009). Ceci permettrait d’assurer le maintien de l’état déshydraté du protoplaste
et a également un rôle dans la résistance des spores aux composés délétères de l’ADN
(Setlow, 2007). Cette membrane subit un retour à une perméabilité classique au cours de la
germination (Swerdlow et al., 1981). Ainsi, le SYTO-16, une molécule fluorescente reconnue
comme perméable vis-à-vis des membranes cellulaires, et ayant des affinités pour l’ADN ou
l’ARN, ne marque pas les spores dormantes mais pénètre très rapidement à partir du moment
où la spore a libéré tout son DPA (environ 8 min) (Kong et al., 2010). La membrane interne
constituerait la barrière majeure de perméabilité de la spore. Cette caractéristique de la
membrane interne a conduit à l’hypothèse que la membrane interne des spores était différente

36
 Etude Bibliographique

de la membrane d’une cellule végétative. Cependant, comme mentionné dans la partie

précédente, la composition lipidique de ces membranes est assez proche, et la différence en
protéines présentes ne semble pas être un paramètre expliquant cette faible perméabilité. De
plus, la composition en acides gras de la membrane interne des spores est généralement
semblable à celle des cellules cultivées à la même température (avec cependant quelques
différences) et ne semble pas non plus responsable de cette faible perméabilité (Cortezzo and
Setlow, 2005).

Une autre spécificité de cette membrane est sa faible fluidité et la faible mobilité lipidique.
Dans les années 80, des études ont été réalisées sur la fluidité de la membrane interne et son
évolution lors de la germination par résonance paramagnétique électronique (RPE). Ces
auteurs ont ainsi montré que les lipides étaient très peu mobiles et que cette mobilité
augmentait lors de la germination. Cependant, il est apparu que ces résultats étaient en réalité
en grande partie dus aux protéines du manteau (Stewart et al., 1980; Elmes et al., 1983). De
manière similaire, une étude utilisant comme marqueur le 1,6-Diphényl-1,3,5-Hexatriène
(DPH) en spectrofluorimétrie de polarisation a montré une plus faible mobilité de la sonde
dans les spores de B. subtilis que dans les cellules végétatives (Ishihara et al., 1999).
Cependant la localisation du DPH n’est pas certaine, c'est-à-dire qu’il ne s’agit pas forcément
d’un marquage exclusivement membranaire et notamment de la seule membrane interne.
Cowan et al., ont montré par technique FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching),
sur des spores marquées avec les sondes di-4-ANEPPS et FM 4-64 au cours de la sporulation,
une faible mobilité lipidique de la membrane interne, celle-ci étant environ 2,5 fois plus faible
que dans des spores germées (Cowan et al., 2004). Une étude récente portant sur l’utilisation
de la sonde Laurdan (6-dodecanoyl-2-diméthylaminonaphthalène) dans les spores de
Clostridium sporogenes a également montré une plus faible mobilité de cette membrane
comparée à celle des cellules végétatives (Hofstetter et al., 2012). L’hypothèse généralement
admise est que la membrane interne est dans un état très compacté. Le volume qu’elle englobe
(le protoplaste) est divisé par 2 en fin de sporulation et elle doit suivre l’augmentation de ce
même volume (environ multiplié par 2) durant la germination, sans synthèse de membrane
supplémentaire (Cowan et al., 2004). Cet état compacté pourrait expliquer la faible mobilité
ainsi que la faible perméabilité de cette structure.
Peu de données bibliographiques concernent l’état biophysique de la membrane interne ainsi
que son évolution durant la germination. Cowan et al., ont soulevé l’hypothèse selon laquelle
le feuillet interne de la membrane interne pourrait être dans un état gel (Cowan et al., 2004) ce

37
 Etude Bibliographique

qui est cohérent avec la faible perméabilité mesurée dans cette membrane. Sunde et al.,
suggèrent que cette faible mobilité des lipides serait liée à une compression de la membrane
(et peut être à un état gel), plutôt qu’a des interactions des têtes polaires avec un protoplaste à
l’état vitreux (correspondant à un liquide figé) (Sunde et al., 2009). Enfin, les travaux réalisés
sur les spores de Clostridium avec le Laurdan, suggère là encore par rapport aux valeurs de
polarisation généralisée (GP), un haut degré d’ordre des lipides de cette membrane et une
exclusion de l’eau (Hofstetter et al., 2012).
Dans le cadre de l’étude de la membrane interne, une méthode d’investigation intéressante
basée sur l’imagerie en temps de vie de fluorescence (FLIM) est ressortie de la bibliographie.
Cette méthode utilise des sondes fluorescentes particulières, les rotors moléculaires dont les
caractéristiques de fluorescence, notamment le temps de vie de fluorescence, sont
dépendantes de la viscosité (Haidekker et al., 2001; Kuimova et al., 2008). Cette technique a
déjà été utilisée pour mesurer les microviscosités dans une variété de systèmes y compris des
cellules vivantes, des sols-gels et des mono et bicouches lipidiques (Haidekker et al., 2001;
Kuimova et al., 2008; Hungerford et al., 2009; Levitt et al., 2009). Ces sondes n’ont jamais
été utilisées sur les spores, elles présentent cependant un potentiel intéressant dans l’idée de
cartographier la fluidité des structures spores (et donc de visualiser à quelle structure
correspond quelle viscosité). L’utilisation du FLIM permet de plus de s’affranchir de
problèmes de concentration en sonde.

2.3.4. Modulation des propriétés membranaires

Les conditions de sporulation lorsqu’elles sont modifiées, peuvent jouer entre autre sur
les propriétés membranaires. Ainsi, la culture des spores sur milieu solide ou liquide peut
entraîner une modification de leur composition membranaire (Rose et al., 2007). Ce travail a
également montré qu’il était plus facile d’extraire les protéines de l’enveloppe de spores
produites en milieu liquide, suggérant un degré de réticulation plus faible. Cependant peu
d’autres modifications de l’enveloppe sont à noter. Concernant la membrane, ces auteurs ont
observé que les spores préparées en milieu solide avaient un ratio d’acides gras anteiso- / iso-
plus élevé que les spores préparées en milieu liquide. Ceci indiquerait une fluidité
membranaire plus importante. Les phospholipides avec des acides gras à chaines ramifiées
anteiso- ont des points de fusion inférieurs à ceux dont les acides gras ont des ramifications
iso- (Mansilla et al., 2004). De manière similaire, lorsque les spores sont produites à une
température plus faible (23 °C), la membrane des cellules végétatives ou des spores ont un

38
 Etude Bibliographique

ratio anteiso-/iso- plus important ainsi qu’une quantité d’acide gras insaturés plus importante
(Cortezzo and Setlow, 2005). Ces spores sont alors plus sensibles à la chaleur humide. Une
étude réalisée par Nguyen et al, au laboratoire GPMA, a également mis en évidence une
relation entre l’augmentation de la sensibilité des spores à la chaleur humide et la
fluidification de la membrane des cellules végétatives mères (Nguyen Thi Minh et al., 2011).
On peut alors supposer qu’une augmentation de la fluidité de la membrane des cellules
végétatives aura également un impact sur la membrane interne. Ainsi, différentes conditions
de sporulation peuvent jouer sur la fluidité (Nguyen Thi Minh et al., 2011) :
• l’activité de l’eau du milieu de sporulation (0,95 avec du NaCl ou glycérol) ;
• la température ;
• le pH (un pH alcalin par exemple).

Ainsi, la composition de la spore bactérienne en fait une structure de résistance extrême.

Sa faible perméabilité à des composés autres que l’eau ou des germinants est également
impliquée dans sa résistance. Différentes structures interviennent dans cette
imperméabilité, la membrane interne étant la plus impliquée. La composition
phospholipidique de cette membrane est peu différente de celle de la membrane de
cellule végétative, ainsi les raisons de sa faible mobilité et imperméabilité sont encore
peu comprises. L’état biophysique de cette membrane est de plus peu décrit.
L’utilisation de nouvelles méthodes d’investigation, comme le FLIM et les rotors
moléculaires, pourrait permettre d’obtenir des informations supplémentaires.
La modulation de ses propriétés via la germination ou d’autres stress environnementaux
pourrait permettre de mieux comprendre son état de compaction extrême. Nous allons
donc nous intéresser dans la partie suivante aux perturbations permettant de modifier
ces structures.

39
 Etude Bibliographique

3. Effets de perturbations environnementales sur les

structures de la spore

3.1. Traitements physiques

3.1.1. Pression hydrostatique

Il existe deux niveaux de pression qui peuvent jouer sur la modification des structures de
la spore bactérienne : entre 50 et 400 MPa (basses pressions) et à des niveaux de pressions
plus élevés : de 400 à 700 MPa (hautes pressions) (Vepachedu et al., 2007). En ce qui
concerne les basses pressions, la modification de la perméabilité des spores à ce traitement va
en fait correspondre à une activation de la germination via les récepteurs aux nutriments
(Figure 6) (Paidhungat et al., 2002; Nguyen Thi Minh et al., 2010a). Cette activation de la
germination pourrait se faire soit par une modification directe des récepteurs entrainant leur
activation, soit par une modification des propriétés membranaires (Paidhungat et al., 2002).
Pour que ce procédé fonctionne, les spores doivent être à un pH et une température optimale
(Gould and Sale, 1970). Ainsi, suite à une pression modérée, on observe les modifications
classiques suite à une germination c'est-à-dire une dégradation du cortex suivie des autres
étapes. Les basses pressions ne semblent pas avoir d’effet direct sur les barrières de
perméabilité. Cependant, il semble que des cycles répétés de compression/décompression
(notamment une pression de 400 MPa à 35 / 45 ou 55 °C) entraînent, suite à une activation de
la germination, des perturbations et ruptures des structures des spores conduisant à leur
inactivation (Furukawa et al., 2003).
Les hautes pressions semblent agir de manière différente sur les structures de la spore
bactérienne. Ces hautes pressions peuvent également être à l’origine d’une entrée en
germination, mais cette entrée se fait par des mécanismes différents de ceux rencontrés pour
les basses pressions. Il semblerait que cette activation se fasse de manière indirecte via une
libération de DPA (Figure 6) (Paidhungat et al., 2002; Black et al., 2007). Cependant, les
mécanismes conduisant à la libération du DPA restent hypothétiques :
- une activation des canaux DPA via une action directe sur la membrane interne ou une de ses
protéines ;

40
 Etude Bibliographique

- une libération reliée à une augmentation de la perméabilité de la membrane interne (pores),

du cortex ou bien de l’enveloppe, Black et al., suggérant plutôt une action sur une protéine de
la membrane interne (Margosch et al., 2004; Black et al., 2007).

Il semble que la pression ait également une action directe sur les barrières de perméabilité de
la spore. Ainsi, Wuytack et Michiels suggèrent que la pression (mais également les hautes
températures) affaiblisse les barrières de perméabilité de la spore, favorisant les échanges
d’ions et de protons (Wuytack and Michiels, 2001). Mathys et al., en combinant hautes
pressions et températures (600 MPa / 77 °C) ont montré par cytométrie en flux une
inactivation des spores en plusieurs étapes, commençant par la germination et terminant par
une déstructuration de la membrane interne, les spores pouvant être marquées à l’IP (Mathys
et al., 2007). Cependant, il n’est pas sûr que cette déstructuration soit liée seulement à
l’application de la pression.
Ainsi, les modifications sur les structures créées par les hautes pressions sont surtout reliées à
une entrée en germination, bien qu’il puisse y avoir une action directe de ces pressions,
notamment sur la membrane interne.

3.1.2. Température

La résistance des spores à la chaleur humide est notamment corrélée au niveau

d’hydratation du protoplaste (cf. 2.2). Bien que les mécanismes ne soient pas encore bien
compris, il semble qu’une des cibles des traitements à la chaleur humide soit la membrane
interne. Ce traitement est également accompagné d’une inactivation des enzymes du
protoplaste (Setlow, 2006). Ainsi, en 1976, Flowers et Adams suggéraient déjà que la
membrane des spores de C. perfringens pouvait être le lieu de perturbations suite à ce
traitement (Flowers and Adams, 1976). Cependant, plus récemment, Coleman et al., ont
proposé un modèle expliquant la destruction des spores par la chaleur. Selon ces auteurs, la
membrane interne serait une cible « tardive » de la destruction des spores. L’inactivation des
spores surviendrait suite à la perturbation d’un nombre important de protéines. Par la suite,
ces spores toujours exposées au traitement, subiraient une rupture de la membrane interne
conduisant à une libération rapide du DPA et d’autres molécules (Coleman et al., 2007).
Concernant les autres barrières de perméabilité, c'est à dire l'enveloppe et le cortex, peu de
descriptions existent dans la littérature quant à l'effet de la température sur ces structures.
Cependant, quelques études réalisées en AED (Analyse Enthalpique Différentielle) peuvent

41
 Etude Bibliographique

apporter des informations. Ainsi, Ablett et al., ont étudié des spores de B. subtilis hydratées
par AED et ont constaté une transition réversible aux alentours de 60 °C (Ablett et al., 1999).
Ces auteurs ont alors suggéré qu'une partie de la spore pouvait être dans un état vitreux,
notamment le protoplaste. Cette conclusion a depuis été remis en question (Ablett et al., 1999;
Sunde et al., 2009). Cependant, cette transition a également été observée par Lillford et
Leuschner sur des spores à l'état sec à une température un peu plus faible (Leuschner and
Lillford, 2003). Ces auteurs suggèrent que cette transition obtenue pour des spores entières
soit reliée à l'enveloppe. Ils ont en effet observé des transitions à des températures proches
pour des systèmes protéiques hydratés. Enfin, plus récemment, des expériences menées au
laboratoire, ont montré une transition entre 58 et 70 °C sur des spores à différents degrés
d'hydratation (Nguyen Thi Minh et al., 2010b). Au contraire de Leuschner et Lillford, cette
transition a également été observée sur des spores sans enveloppe, suggérant ainsi que cette
transition serait plutôt relié au cortex qui serait sous sa température de transition vitreuse (Tg)
lorsque les spores sont à un état d'hydratation faible. Bien que des doutes subsistent sur la
nature du compartiment sporal impliqué et du type de transition, il semble néanmoins que
pour des températures comprises entre 50 et 70 °C, le cortex (et/ou l’enveloppe) subissent une
modification permettant une augmentation de la mobilité. Le passage de cette transition
thermique permet en effet d’augmenter la perméabilité. Comme suggéré par Ablett, la
température de transition est proche de celle utilisée pour l’activation thermique de la
germination (cf. 1.3.1) (Ablett et al., 1999). Beaman et al., avaient déjà suggéré que des
spores de B. stearothermophilus totalement activées étaient « perméabilisées », observant une
libération de DPA (Beaman et al., 1988). Cependant, cette perméabilisation durant
l’activation dépend du traitement appliqué d’une part et de l’espèce de Bacillus impliqué
d’autre part (Kort et al., 2005).

3.2. Traitements chimiques

Les spores sont résistantes à un grand nombre de composés chimiques létaux pour des
cellules végétatives. En combinant des barèmes drastiques, il est cependant possible
d’inactiver les spores par un nombre réduit de ces produits. Pour certains agents chimiques, la
destruction des spores se fait via des dommages à l’ADN (acide nitrique, formaldehyde,...).
Cependant pour un grand nombre de composés chimiques, elle se fait via d’autres voies,
notamment la perturbation de couches externes de la spore (Setlow, 2006).

42
 Etude Bibliographique

3.2.1. Agents oxydants

Les agents oxydants sont connus pour entraîner des perturbations « physiques » sur les
structures de la spore, notamment sur la membrane interne. La présence de l’enveloppe de la
spore est importante dans la résistance des spores à ces composés comme le montre la plus
grande sensibilité des spores sans enveloppe à ces traitements (traitées chimiquement ou
spores mutantes) (Young and Setlow, 2003; Ghosh et al., 2008). Des composés comme
l’hypochlorite de sodium (eau de Javel), le dioxyde de chlore (ClO2), l’H2O2 et d’autres
décontaminants commerciaux, sont responsables de modifications irréversibles au niveau de
la membrane interne (Melly et al., 2002; Young and Setlow, 2003; Young and Setlow,
2004a). Contrairement à l’hypochlorite, les spores traitées au ClO2 peuvent entamer les
premières étapes de la germination. Cependant, celle-ci serait incomplète suite aux
perturbations subies par la membrane interne. Ces composés semblent donc avoir un effet
possible sur l’appareil de germination mais pas seulement puisque ces spores, même germées
artificiellement (lysozyme), ne peuvent se développer (Setlow, 2006). Bien que le lysozyme
ne permette pas aux spores d’être revivifiées, il entraîne une perte de réfringence des spores et
un certain pourcentage de spores germées, indiquant qu’il peut dégrader le cortex (Foegeding
and Busta, 1983; Young and Setlow, 2003). Ceci signifie que le manteau est en partie
perméabilisé, ou que sa structure a été modifiée et permet le passage du lyzozyme. Ainsi, des
spores de B. megaterium traitées à l’H2O2 (combiné à la température) montrent une
dégradation importante des couches externes de la spore (manteau et cortex) (Shin et al.,
1994). Il ne semble pas que la structure sporale soit cependant totalement perméabilisée
puisque les spores traitées avec ces agents ne peuvent pas être marquées au DAPI (Melly et
al., 2002; Young and Setlow, 2003; Young and Setlow, 2004a). Cronin et Wilkinson ont
cependant observé un marquage modéré pour des spores traitées au H2O2 contrairement à
Melly et al., (Melly et al., 2002; Cronin and Wilkinson, 2008). La nature précise des
modifications de la membrane interne, causées par ces agents, n’est pas connue. Il semble, en
tout cas, que ce ne soit pas relié à une oxydation d’acides gras insaturés (Setlow, 2006).
L’ozone aqueux est un autre agent qui cause l’inactivation des spores via des perturbations
similaires aux agents oxydants (Young and Setlow, 2004b).

43
 Etude Bibliographique

3.2.2. Autres composés chimiques

Les acides et les bases fortes (HCl et NaOH), ainsi que l’éthanol sont d’autres
composés chimiques décrits comme perturbateurs
perturba des structures de la spore bactérienne.
bactérienne En
ce qui concerne les bases fortes, elles semblent avoir un effet essentiellement sur
l’inactivation des enzymes dégradant le cortex. En effet, ces spores ne peuvent être marquées
par des sondes se liant à l’ADN et peuvent être complètement germées par le lysozyme
(Setlow et al., 2002).. Au contraire, l’inactivation des spores par les acides forts est reliée
directement à une déstructuration très importante de ces spores. La membrane interne,
in mais
également les structures plus externes comme l’enveloppe ou le cortex, sont touchées de
manière importante (Figure 13).
13

Figure 13 : Image en Microscopie Electronique à Balayage (MEB) de spores de B. subtilis traitées dans
une solution 1 M de HCl. (a) spores traitées (b) spores non
no traitées. Echelle= 0,5µm (Setlow et al., 2002).

L’éthanol joue également sur les barrières de perméabilité mais de manière différente. Pour
entraîner une inactivation des spores, l’éthanol
l’éthanol doit être couplé à la température (Russell,
1990; Setlow et al.,, 2002; Cronin and Wilkinson, 2008).
2008). Ainsi, un traitement de 2 h à 70%
sans chauffage d’éthanol n’entraine pas d’inactivation, alors qu’à 65 °C, environ 2 log (99%)
sont détruits. De même, le suivi
s de la survie des spores à des contacts prolongés avec
l’éthanol a révélé
vélé une tolérance prolongée (>12
(> mois) à différents niveaux d’alcool,
d’al sauf à
90% où aucune survie n’aa été observée au-delà
au de 2-12 mois (selon les espèces) (Thomas,
2012). Bien que l’éthanol chauffé modifie les barrières de perméabilité, il le fait de manière
man
différente des agents oxydants puisque dans
dans ce cas, les spores peuvent être marquées par un
colorant des acides nucléiques (Setlow et al.,, 2002; Cronin and Wilkinson, 2008).
2008) De plus une
libération du DPA et une hydratation du protoplaste sont observées (Figure
Figure 14).

44
 Etude Bibliographique

Figure 14 : Images de microscopie de fluorescence montrant le marquage

marquage de spores traitées à l’éthanol
l’é
par le DAPI. (a) spores non traitées
raitées (b) spore traitées à l’éthanol
l’é 70% 2 h à 65 °C (Setlow et al., 2002).

Ainsi, les spores traitées montrent une accessibilité augmentée au SYTO 9 et à l’IP mais plus
faible au Hoechst 33342,, indiquant peut être que bien que l’éthanol perturbe une ou plusieurs
barrière de perméabilité, les « brèches » sont relativement mineures (Cronin and Wilkinson,
2008). Les spores sans DPA sont très sensibles au traitement
trai éthanol. Setlow et al., suggèrent
ainsi que la destruction des spores par l’éthanol serait liée à un premier mécanisme de
libération du DPA suivi de la mort des spores par l’effet de la chaleur (cf. 2.2) et/ou de
l’éthanol.. Bien que les spores traitées à l’éthanol aient des aspects de spores germées, ces
ce
spores ne perdent pas leur réfringence,
réfringence ne sont pas capables de germer même avec le
lysozyme et ne montrent pas d’initiation du métabolisme (Setlow et al.,, 2002; Cronin and
Wilkinson, 2008). L’alcool est très rapidement létal pour des bactéries non sporulantes
sporulante à
concentration appropriée. L’éthanol à 70% est recommandé
reco comme étant la meilleure
concentration comme désinfectant bactérien puisqu’il tue les cellules bactériennes par des
perturbations de la membrane et des dénaturations protéiques (Thomas, 2012).
2012) Ce dernier
auteur suggère que l’éthanol
ol à 90% serait plus efficace sur les spores.
D’autres agents chimiques comme des aldéhydes (glutaraldéhyde) peuvent détruire les spores,
mais par des mécanismes qui restent hypothétiques. Il est par contre connu qu’ils ne
provoquent pas d’altération de l’ADN
l (Setlow, 2006).

45
 Etude Bibliographique

Différents paramètres environnementaux, qu’ils soient physiques ou chimiques,

permettent de moduler les propriétés structurales des spores bactériennes. Ils peuvent
notamment être responsables de modifications des barrières de perméabilité de la spore.
L’éthanol couplé à la température est une perturbation intéressante à étudier. En effet,
ce stress entraine une perméabilisation de la structure, suffisante pour laisser entrer des
sondes spécifiques de l’ADN, mais la spore semble conserver son intégrité au contraire
d’un traitement à l’acide par exemple. Ce stress peut ainsi s’avérer intéressant dans une
optique d’utilisation de la structure de la spore bactérienne comme microcapsule
biologique. Les propriétés de résistance de la spore sont en effet déjà exploitées dans
l’alimentation. Cependant, l’effet de cette perturbation sur les structures, et notamment
la ou les couches cibles, est encore mal compris. L’utilisation de différentes méthodes,
globales ou plus ciblée, est ainsi envisagé afin d’en étudier l’impact sur les structures de
la spore.

46
CONCLUSION ET PROBLEMATIQUE DE LA THESE

La spore bactérienne est une structure cellulaire multicouche issue d’un processus
appelé sporulation. Lorsque des conditions favorables reviennent, ces spores sont réactivables
et peuvent sortir de leur état de dormance via la germination. Ces deux processus sont très
bien décrits dans la littérature, cependant certains points, comme l’activation thermique de la
germination, sont encore mal compris. Des hypothèses sont néanmoins avancées puisque de
précédents résultats obtenus au laboratoire ont relié une modification du cortex à une
relaxation enthalpique aux alentours de la température d’activation de la germination.

Cette étude bibliographique montre également que les nombreuses spécificités dans la
composition des spores bactériennes sont à l’origine d’une extrême résistance à de multiples
stress environnementaux. Ainsi, la forte minéralisation et la faible hydratation du protoplaste
sont particulièrement importantes dans sa résistance. De même, le DPA, un composé
spécifique des spores est également impliqué. Ce dernier peut avoir un rôle dans la faible
mobilité de certains constituants de la spore.

L’étude bibliographique a également permis de mettre en évidence que les

caractéristiques structurales de la spore, notamment sa faible perméabilité à des composés
autres que l’eau ou les germinants, sont également impliquées dans sa résistance. La
membrane interne a ainsi été identifiée comme un point clé de l’imperméabilité des spores.
Cependant, peu de différences existent dans sa composition par rapport à la membrane de
cellules végétatives. Il est ainsi difficile d’expliquer la faible mobilité de ses constituants et
son état biophysique est encore mal connu.

Enfin, ce travail bibliographique nous a permis de mettre en évidence certains

paramètres environnementaux, qu’ils soient physiques ou chimiques, permettant de moduler
les propriétés structurales des spores bactériennes. Des températures non létales semblent
ainsi être responsables d’une augmentation de la mobilité de certains constituants ou de
certaines structures de la spore. Des agents chimiques, comme l’éthanol couplé à la
température ou les acides forts, provoquent également des modifications de l’intégrité des
structures de la spore en relation avec leur inactivation. L’éthanol permet notamment une
perméabilisation différente des spores puisque des sondes fluorescentes peuvent pénétrer

47
jusque dans le protoplaste. Cette perturbation semble particulièrement intéressante dans une
éventuelle utilisation de la spore comme capsule biologique. Cependant, même si l’hypothèse
de « rupture » d’une des couches de la spore est soulevée, la ou les structures cibles ne sont
pas encore totalement identifiées.

La problématique de ce travail peut s’énoncer ainsi :

« Est-il possible de contrôler la perméabilité de la spore afin d’utiliser cette structure comme
une microcapsule biologique ? »

Afin de répondre à cette question, différents axes de recherche ont été menés :

 Mise en place de techniques d’études permettant de rendre compte de la perméabilité et

de l’état des barrières de perméabilité de la spore et notamment de sa membrane interne.
 Evaluation de l’effet de perturbations connues (germination, température) au moyen des
méthodes mises en place.
 Etude de l’impact de procédés de perméabilisation des spores sans modification drastique
des structures, notamment par l’utilisation du couplage éthanol/température.

48
MATERIEL & METHODES

49
 Matériel & Méthodes

50
 Matériel & Méthodes

MATERIEL & METHODES

1. Matériel biologique

1.1. Souches utilisées et techniques de culture

1.1.1. Souches bactériennes

Les souches de B.subtilis utilisées dans ce travail sont la souche sauvage 168 (Bacillus
Genetic Stock Center, Département de biochimie, Ohio State University, Columbus, OH
43010, USA) et la souche sauvage PS533. La souche sans enveloppe PS4150 dans laquelle la
plupart des séquences codantes pout les gènes cotE et gerE sont supprimés a également été
utilisée. Ces spores ne possèdent plus la plupart des protéines qui peuvent être extraites de
l’enveloppe et la microscopie électronique à transmission montre que cette structure est très
faiblement présente (Ghosh et al., 2008). PS533 et PS4150 sont des dérivés de la souche
isogénique PS832, un dérivé prototrophe de la souche 168. Ces souches ont généreusement
été fournies par Barbara Setlow (Department of Molecular, Microbial and Structural Biology,
University of Connecticut Health Center, USA). La souche PS533 porte un plasmide pUB110
codant pour la résistance à la kanamycine (Setlow and Setlow, 1996). La souche PS4150
porte une résistance à la tétracycline (qui remplace la séquence codante cotE) et une
résistance à la spectinomycine (qui remplace la séquence codante gerE). Dans le texte, les
souches 168 et PS533 seront appelées « souche sauvage » et la souche PS4150, « souche
mutante » ou « cotE gerE ».

1.1.2. Production de spores

Les spores de B. subtilis ont été produites selon la méthode de Nicholson et Setlow
(Nicholson and Setlow, 1990). Pour s’assurer des souches utilisées, les isolements des
souches PS533 et PS4150 sont réalisés sur des boites de gélose contenant un antibiotique
adéquat (kanamycine pour PS533 et spectinomycine pour PS4150).
Une pré-culture est obtenue par l’inoculation d’une colonie fraiche à 50 ml de milieu de
sporulation 2x Schaeffer’s-glucose (2xSG) à 37 °C contenu dans une fiole bafflée de 250 ml.
La composition du milieu de sporulation est donnée dans le Tableau 3.

51
 Matériel & Méthodes

Tableau 3 : Composition du milieu de sporulation 2x Schaeffer’s-glucose (2xSG) pour 1L

Méthodes
Eléments Quantités de
stérilisation
Difco nutrient broth
(Becton Dickinson, 16,0 g
Detroit, USA ) Autoclavage
KCl 2,0 g
MgSO4, 7H2O 0,5 g
Ca(NO3)2, 4H2O (1M) 1,0 mL
FeSO4, 7H2O (0,1M) 1,0 mL
Filtration
MnCl2 (1 mM) 1,0 mL
D-Glucose (50% w/v) 2,0 mL

Le pH est ajusté à 7 avant autoclavage avec du NaOH 1 M puis les autres composés filtrés
sont ajoutés après refroidissement à 50 °C. Sauf précision, les différents constituants
proviennent de Sigma Aldrich, France.

La préparation a été mise sous agitation à 37 ºC jusqu’à obtention d’une DO600 nm comprise
entre 0,4 et 0,6. Puis 90 ml de milieu de sporulation 2xSG à 37 ºC contenus dans une fiole
bafflée de 500 ml sont inoculés par 10 ml de pré-culture. La préparation est mise à l’étuve
pendant 48 à 72 h sous agitation (200 rpm) à 37 ºC jusqu’à l’obtention d’une sporulation
suffisante (supérieur à 90%). Le niveau de sporulation est vérifié à l’aide d’un microscope
droit à contraste de phase (Primostar, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany). En effet, les
spores matures, appelées spores dormantes, apparaissent très réfringentes et il est donc
possible de les distinguer des cellules végétatives ou des spores germées (Figure 15).

a b

Figure 15 : Observation au microscope à contraste de phase de spores à différents stades. (a) spores
dormantes. (b) spores germées pendant 45 min avec de la L-alanine.

52
 Matériel & Méthodes

Les spores sont ensuite récoltées par centrifugation pendant 15 min à 4500 g à 4 ºC, puis
lavées trois fois avec de l’eau distillée froide. Elles sont ensuite stockées à 4 °C.

1.1.3. Purification des productions de spores

Les spores sont ensuite lavées à l’eau déminéralisée froide stérile tous les deux jours
pendant au moins une semaine afin d’éliminer les débris cellulaires, les cellules restantes et
les contaminants éventuels. Le matériel biologique est ensuite conservé dans de l’eau
déminéralisée à 4 ºC et sa pureté est vérifiée par la détermination du pourcentage de spores
réfringentes « phase bright » (au minimum 95% de spores pour un maximum de pureté). Les
spores sont ensuite utilisées au moins 7 jours après la récolte. Certaines production de spores,
notamment les spores mutantes cotE gerE, nécessitent une purification supplémentaire. Pour
cela, après centrifugation les culots de spores sont repris dans 100 à 200 µl de Nycodenz
(Histodenz® Sigma Aldrich, France) à 20% (m/v) et déposés sur 1 à 2 ml de Nycodenz à 50%
(m/v). Les tubes sont ensuite centrifugés pendant 45 min à 14000 g à 25 °C (Ghosh and
Setlow, 2010). Les culots de centrifugation obtenus contiennent exclusivement des spores
dormantes et sont lavés abondamment (au moins 5 lavages) pour enlever tout les résidus de
Nycodenz. Les spores sont ensuite stockées à 4 °C.

1.1.4. Production de cellules végétatives

La production de cellules végétatives débute par une pré-culture réalisée de la même manière
que pour la production de spores. 10 mL de pré-culture sont alors ajoutés à 90 mL de milieu
2xSG dans une fiole bafflée. La culture est placée à 37 °C sous agitation (200 rpm) pendant
environ 100 min. Les cellules sont alors en milieu de phase exponentielle, ce qui permet
d’éviter la présence de spores dans les échantillons. La culture est suivie par la densité optique
à 600 nm (DO600nm) (Figure 16).

53
 Matériel & Méthodes

5 T0 sporulation

4.5

3.5

DO (600nm)
2.5

1.5

0.5

0
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Temps (min)

Figure 16 : Evolution de la densité optique à 600 nm (DO600nm) au cours de la culture de cellules de

Bacillus subtilis en milieu 2xSG

L’arrêt de la croissance est réalisé par centrifugation à 3500 g pendant 15 min à 4 °C. Le culot
est ensuite lavé trois fois dans 100 ml d’eau physiologique pour se débarrasser du milieu
résiduel.

1.2. Germination des spores

1.2.1. Conditions de germination

Préalablement à la germination, les spores de B. subtilis sont activées thermiquement.

Pour cela, elles sont suspendues à une concentration cellulaire d’environ ~1,5.108 spores/ml
(DO600 nm = 1) pendant 30 minutes dans un bain d'eau à 70 °C, puis immédiatement refroidies
dans la glace. Ceci permet de synchroniser et d’améliorer la germination (Keynan et al., 1964;
Zhang et al., 2009). Pour la germination, les spores sont remises en suspension à une DO600 nm
proche de 1 dans un milieu riche Luria Broth (LB, Sigma Aldrich, France) ou dans un tampon
Tris-HCl 25 mM contenant 10 mM de L-alanine (Sigma Aldrich, France) à 37 °C. Les spores
sont ensuite récoltées par centrifugation 15 min à 4500 g à 4 ºC, lavées au moins deux fois
avec de l'eau distillée à 4 °C puis sont utilisées.

1.2.2. Suivi de la germination

La germination peut être suivie ou vérifiée par différentes méthodes. La microscopie à

contraste de phase permet ainsi de distinguer les spores dormantes et réfringentes (« phase
bright ») des spores germées qui deviennent « phase dark » (Figure 15). Le suivi de la densité

54
 Matériel & Méthodes

optique à 580 nm (DO580 nm) permet également de suivre la germination au cours du temps. En
effet, suite à l’ajout d’un germinant, une chute de la DO580 nm est observée au cours du temps
et ce jusqu’à atteindre environ 40 à 50% de la densité optique initiale, comme le montre la
Figure 17.
120

% DO580 nm initiale 100

80

60

40

20

0
0 10 20 30 40 50
temps (min)

Figure 17 : Suivi de la chute de la DO580 nm de spores sauvages de Bacillus subtilis en présence de L-alanine
10 mM.

1.2.3. Obtention de fragments d’enveloppe après germination

Les fragments d’enveloppes sont obtenus en laissant les spores sauvages germer
pendant environ 90 min et sont alors identifiés par microscopie. En effet, des résidus
d’enveloppe et/ou de cortex sont souvent observables attachés aux cellules ou dans le milieu
de germination (Keijser et al., 2007; Ceragioli et al., 2009).

1.3. Production de spores sans enveloppe (traitement chimique)

Ces spores ont été préparées selon la procédure décrite par Paidhungat et Setlow
(Paidhungat and Setlow, 2001). Dans le but d'extraire les protéines de l’enveloppe, les spores
sont suspendues à une DO600 nm d’environ 10-15 pendant 30 minutes à 70 °C dans la solution
suivante : 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,1 M de NaOH, 0,1 M de NaCl et 0,1 M
de dithiothréitol (DTT). Ces spores sont ensuite lavées abondamment avec de l'eau distillée
(environ 8 fois) et conservés à 4 °C dans du tampon phosphate salin (PBS). L'efficacité du
traitement a été vérifiée par le suivi de la diminution de la DO580 nm en présence de 0,5 mg /
ml de lysozyme. En effet, les spores sans enveloppe sont sensibles au lysozyme. Cette enzyme

55
 Matériel & Méthodes

va provoquer la germination de ces spores en dégradant le cortex, ce qui pourra être suivi,
comme décrit précédemment, par la chute de DO580nm.

2. Caractérisation des structures de la spore par

méthodes physicochimiques

2.1. Etude de la mobilité par la résonance magnétique nucléaire

(RMN)

2.1.1. Principe de la RMN

Le noyau d’un atome peut être considéré comme une sphère chargée tournant sur elle-
même. Cette rotation induit un petit champ magnétique appelé moment magnétique nucléaire
de spin et noté µ. Lorsque l’échantillon est plongé dans un champ magnétique externe intense
(B0), les moments magnétiques nucléaires s’orientent dans la direction de ce champ. Le
nombre de noyaux parallèles est légèrement supérieur à celui des noyaux antiparallèles, la
somme vectorielle de tous les moments magnétiques nucléaires, l’aimantation M, est alors
non-nulle et dirigée dans la direction du champ B0 (Figure 18a).

a b
z z
Bo Bo
B1 B1

ω0 x y x y
BO
Sans champ magnétique Avec champ magnétique Résonance Relaxation

Figure 18 : Principe de la résonance magnétique nucléaire (RMN).

Le moment magnétique est également animé d’un mouvement de précession analogue au

mouvement de l’axe d’une toupie. Pour un champ magnétique B0 donné, on a alors :
ω0 = γ.B0 (relation de Larmor)
avec ω0 : la fréquence de précession (Hz), γ : rapport gyromagnétique du noyau (MHz/T) et
B0: force du champ magnétique appliqué (T).
Si un second champ magnétique B1 de radiofréquence ω1 = ω0 est appliqué
perpendiculairement à B0, il va y a avoir absorption d’énergie, les noyaux précessent sous

56
 Matériel & Méthodes

l’influence de B1, c’est la résonance. A l’arrêt de B1, l’aimantation va progressivement

retourner à sa position d’équilibre, parallèle à B0, c’est la relaxation (Figure 18b). La
relaxation est alors caractérisée par des temps de relaxation :
T1, temps de relaxation spin-réseau, correspond à la relaxation longitudinale. Dans ce cas
l'énergie est transférée à l’environnement moléculaire (le réseau) par vibration ou translation.
Pour l’atome 1H par exemple, plus T1 est court, plus les protons sont mobiles.
T2, temps de relaxation spin-spin, correspond à la relaxation transversale. Dans ce cas
l’énergie est transférée au noyau voisin. Plus T2 est long, plus les protons sont mobiles.

2.1.2. Préparation des spores déshydratées

Les suspensions de spores sont atomisées à 135 °C, avec un débit d’air de 473 L/h
(Mini spray dryer B-290, Buchi, France), la concentration des spores est alors d’environ
1011 spores/g. Environ 100-150 mg de spores sont ensuite placées dans un tube RMN de 8
mm de diamètre. Ces tubes sont par la suite placés dans des boites hermétiques contenant
différentes solutions de sel saturés pour équilibrer l’activité de l’eau (aw). Avant chaque
mesure, les tubes sont sortis des boites et immédiatement fermés à l’aide de parafilm. Les
différents aw utilisées dans ce travail ainsi que les sels utilisés (Sigma Aldrich, France) pour
les atteindre sont donnés en Tableau 4.

Tableau 4 : Solutions saturées de sels et aw correspondantes à 25 °C

aw Sels utilisés
0,113 LiCl
0,328 MgCl2
0,528 Mg(NO3)2
0,754 NaCl
0,843 KCl

Chaque tube est laissé au moins 10 jours à équilibrer pour chaque aw. Les aw sont vérifiées à
l’aide d’un osmomètre Decagon-AQUALAB CX-2 (Pullman, USA).

2.1.3. Acquisition et traitement des signaux

L'étude des temps de relaxation des protons a été réalisée sur un spectromètre RMN
basse résolution MARAN Ultra (Resonance Instrument, Oxford, UK) dont la fréquence de
résonance est de 23 MHz. Le système RMN est équipé d'un régulateur de température

57
 Matériel & Méthodes

permettant des acquisitions comprises entre 25 et 100 °C. Les temps de relaxation spin-spin
(T2) ont été déterminés à l’aide des séquences FID (Free Induction Decay) et CPMG (Carr-
Purcell-Meiboom-Gill) à 25 °C. Pour la séquence FID, le nombre de points est de 2048 et le
nombre d’acquisitions de 128. La séquence par échos CPMG permet de détecter les protons
les plus mobiles sans que le signal ne soit influencé par l’inhomogénéité du champ
magnétique ; par contre, les protons engagés dans des structures plus organisées, de mobilité
très réduite (T2 < τ) ne seront pas ou mal détectés. La simple séquence de retour à la
précession libre (FID) est également utilisée pour détecter le pourcentage correspondant aux
protons les moins mobiles. Le Tableau 5 indique les paramètres utilisés pour la séquence
CPMG.

Tableau 5 : Paramètres d’acquisition des séquences CPMG.

Séquence CPMG
Durée des impulsions (P90) 2,7 µs
Durée des impulsions (P180) 5,4 µs
Nombres d’échos 2048
Nombre d’acquisition (NS) 512
Temps entre les acquisitions (RD) 4s
τ 40 µs

Les courbes de relaxation à partir de la séquence CPMG sont modélisées comme une
distribution continue d’exponentielle à l'aide du logiciel Win DXP (Resonance Instrument,
Oxford, UK) via l’Équation 2.

 = ∑   ⁄ Équation 2

Avec T2i et Ii respectivement, temps de relaxation et intensité des différentes populations.

Les courbes obtenues sont déconvoluées à l’aide du logiciel OriginPro (OriginPro 8, Origin
Lab) pour évaluer le T2 de chaque population (position des pics) et le nombre de protons
correspondant (intensités des pics). Ces intensités sont exprimées en pourcentage du FID
c'est-à-dire en pourcentage de protons mobiles et ramenées à une masse identique de spores
de 100 mg.

58
 Matériel & Méthodes

2.2. Utilisation de la spectroscopie infrarouge à transformée de

Fourier (FTIR)

2.2.1. Principe de la spectroscopie infrarouge

Le FTIR permet l’étude des propriétés d’un matériel par rapport à son interaction avec
les infrarouges. Il s’agit d’une technique de spectroscopie vibrationnelle, les spectres obtenus
reflétant à la fois la structure moléculaire et l’environnement moléculaire. Les échantillons
sont irradiés par des radiations infrarouges, l’absorption de ces radiations stimulant des
mouvements vibrationnels. Cela se traduit par une absorption d'énergie à des fréquences
correspondant au mode de vibration moléculaire entrainant des variations de dipôle de la
molécule correspondante ou d'un groupe chimique. Ces changements dans les mouvements
vibrationnels donneront des bandes sur le spectre, chacune étant caractérisée par sa fréquence
et son amplitude (Duygu et al., 2009; Alvarez-Ordonez et al., 2011). Ainsi lorsqu’un
échantillon est étudié par spectroscopie infrarouge, un spectre complexe, caractérisé par des
bandes spécifiques, est obtenu. Une « empreinte digitale », qui peut être utilisée pour
l’identification, la caractérisation et la quantification d’échantillon, est ainsi obtenue.

En biologie, le FTIR permet ainsi de visualiser de manière globale les constituants de

microorganismes mais aussi l’identification et la différenciation d’espèces bactériennes
(Naumann et al., 1995; Forrester et al., 2009; Garip et al., 2009). La spectroscopie infrarouge
a beaucoup été utilisée par exemple pour les protéines, la région entre 1500 et 1700 cm-1 étant
caractéristique de leur structure secondaire. D’autres constituants cellulaires, comme les
phosphates ou les polysaccharides, possèdent également des bandes (ou régions)
caractéristiques. Le Tableau 6 liste ainsi divers bandes caractéristiques obtenues pour les
cellules végétatives de Clostridium ou Bacillus ainsi que pour des spores de Bacillus spp.

59
 Matériel & Méthodes

Tableau 6: Attribution des fréquences de bandes classiques observées en FTIR pour les cellules
végétatives et les spores de Bacillus et Clostridium (v : stretching, δ : bending, a : antisymétrique, s :
symetrique). Sp Bacillus : Spores de Bacillus. D’après (Schuster et al., 1999; Naumann, 2000; Perkins et al.,
2004; Johnson et al., 2005; Forrester et al., 2009; Garip et al., 2009; Johnson et al., 2010).

Région d’absorption phosphates et carbohydrates

Région d’absorption des lipides 3000-2800 cm-1
1300-900 cm-1
Valeur du pic Composé Composé
-1
Groupement Valeur du pic (cm-1) Groupement
(cm ) cellulaire cellulaire

Composé
Bacillus : 2956 Bacillus : 1256 -
lipidique/ ester ?

Acide nucléique
va CH3 Lipides
Clostridium : Bacillus et Sp Bacillus et petites
va PO2-
2959 : 1235-1233 contributions des
phospholipides

Bacillus et Sp Sp Bacillus : 1277 -

va COO DPA
Bacillus : 2923 1279
va CH2 Lipides
Clostridium : Sp Bacillus : 1439- Ring vC-N
CaDP-3H2O
2921 1441 ; 1015 Ring v C-C

Région d’absorption des protéines 1800-1500 cm-1 Région « empreinte digitale » :

Valeur du pic Composé Composé

-1
Groupement Valeur du pic (cm-1) Groupement
(cm ) cellulaire cellulaire

Bacillus : 1656-
1657 Structure secondaire
v C=O
Sp Bacillus : protéines (amide I)
1656 - 1658

Bacillus : 1540- Structure secondaire

δ N-H
1542 protéines (amide II) Sp Bacillus : 766 ;
- CaDP-3H2O
Vibration de 725 ; 701 ; 659

Sp Bacillus : l’anneau
v C-N
1540 - 1541 hétérocyclique du
CaDPA

Groupe ester des

Bacillus: 1739 v>C=O
lipides

60
 Matériel & Méthodes

2.2.2. Préparation des échantillons et acquisition du signal

Les expériences ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre infrarouge à transformée de
Fourier BRUKER IFS Vector 22 (Bruker, Allemagne). La méthode ATR (réflectance totale
atténuée) a été utilisée avec un cristal ZnSe (séléniure de zinc). Une goutte de 10 µl
d’échantillon (spores ou cellules végétatives) à une DO600 nm d’environ 10 est déposée sur le
cristal puis séchée sous un flux d’azote pendant 5 à 10 min pour obtenir un film homogène.
Les spectres sont obtenus par l’acquisition de 10 scans à une résolution de 2 cm-1 et à une
température de 25 °C. Avant chaque mesure, un background est réalisé afin de soustraire le
bruit de fond. La température est contrôlée à l’aide d’un bain à circulation HAAKE
DC30/DL30 (Thermo Electron, Allemagne). La Figure 19 schématise la procédure utilisée.

a N2

Cristal
ZnSe

b N2 Dépôt d’une goutte (10 µl) DO600nm

~ 10

Film d’échantillon
5-10 min

Cristal ZnSe
IR

Figure 19 : Principe de l’obtention et de la mesure d’un film d’échantillon sur le cristal ZnSe du
spectromètre infrarouge. (a) Photographie du système. (b) Schématisation de l’obtention d’un film.
N2 : azote U.

Le logiciel OPUS (Bruker, Allemagne) est utilisé pour obtenir la dérivée seconde des spectres
et obtenir la position des pics. Ce logiciel est également utilisé pour obtenir des spectres
moyens des spores ou des cellules végétatives.

61
 Matériel & Méthodes

2.2.3. Suivi de la germination

Pour l’étude de la germination, une suspension de spores est préalablement activée

thermiquement puis re-suspendue
suspendue dans du milieu LB (DO600 nm = 1).. Des échantillons sont
prélevés au cours du temps, lavés et concentrés avant de déposer une goutte de 10 µL
d’échantillon sur le cristal. Un film est ensuite obtenu avant acquisition de la même manière
maniè
que décrit précédemment.

3. Utilisation de la fluorescence pour étudier les

structures de la spore

3.1. Spectrofluorimètrie

3.1.1. Principe

La mesure d’émission de fluorescence polarisée permet l’observation de mouvements

rotationnels de fluorophores durant leur durée de vie à l’état excité. Cette technique repose sur
le principe suivant : lorsque des molécules sont exposées à de la lumière polarisée, celles dont
le dipôle d’absorption est orienté dans la même direction que la lumière sont
préférentiellement excitées,
ées, c’est la photosélection. Une fois excitées ces molécules peuvent
avoir des mouvements de rotation durant la durée de vie de l’état excité (~10-9 s-1), ceci va
dépolariser l’émission de fluorescence. Ainsi, la mesure des composantes d’émission
polarisée, via des polariseurs, permet le calcul du type et de l’étendue des mouvements de
rotation des molécules. La mesure de l’anisotropie (r) est alors obtenue à partir de l’intensité
des composantes verticales, dites parallèles (I║) et horizontales, dites perpendiculaires
pendiculaires (I┴) de
l’émission de fluorescence (Figure
Figure 20).

Figure 20 : Principe de la mesure d'anisotropie de fluorescence (Lakowicz, 2006).

62
 Matériel & Méthodes

La vitesse de rotation des molécules dépend de leur taille, forme et de leur environnement
local. Un changement de viscosité du milieu de la sonde entraînera un changement
d’anisotropie de fluorescence. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour détecter des
changements dans l’environnement de ces molécules (viscosité locale, transition de phase,..)
(Fluorolog, 2001; Lakowicz, 2006).
Le DPH a par exemple déjà été utilisé en analyse de l’anisotropie de fluorescence sur les
spores de B. megaterium ou B. subtilis, dans l’idée de mesurer une fluidité membranaire
(Skomurski et al., 1983; Ishihara et al., 1999). Le DPH s’insère dans les feuillets de manière
parallèle aux chaines acyles des phospholipides mais aussi au centre de la bicouche (Van der
Heide et al., 1996).

3.1.2. Mesure de l’anisotropie de fluorescence

Les mesures ont été réalisées sur un spectrofluorimètre de type Fluorolog-3 équipé
d’un double polariseur en T (Jobin-Yvon, HoribGroup, USA). Une solution de DPH
concentrée à 1 mM est préparée dans du tétrahydrofurane (THF) et conservée à -20 °C à l’abri
de la lumière. 6 µl de solution de DPH à 1 mM sont ajoutés à 3 ml de suspensions cellulaires
de concentration définie (spores : 108 spores / ml ; cellules végétatives : 107 bactéries / ml).
Les longueurs d’onde d’émission et d’excitation sont respectivement de 360±2 nm et de
431±5 nm (Simonin et al., 2008). Le mélange est réalisé dans une cuve de spectroscopie en
verre poli à 30 °C sous agitation. Quatre signaux sont acquis au cours du temps avec un délai
de 8 s : les intensités IHH, IHV, IVV et IVH, qui sont utilisées pour calculer l’anisotropie de
fluorescence (r) selon la formule suivante :

     
= avec  =  Équation 3
      

3.1.3. Détermination du temps d’insertion de la sonde

Il est aussi intéressant de suivre la vitesse d’insertion de la sonde. Pour cela, les
variations de fluorescence (IVV) ont été suivies au cours du temps. Les courbes sont
normalisées à l’aide du logiciel Origin Pro et le temps d’insertion est ensuite défini comme le
temps nécessaire pour atteindre 95 % de l’intensité maximale.

63
 Matériel & Méthodes

3.1.4. Réalisation d’une rampe de température

Les différents échantillons (spores ou cellules végétatives) ont été soumis à des
modifications de température. Ces variations de température ont été effectuées au sein même
du spectrofluorimètre, dans l’enceinte contenant la cuve de spectroscopie à l’aide d’un
système Peltier. Ainsi, les suspensions de spores et de cellules (3 mL) vont subir les rampes
de température suivantes:
- de 30 à 80 °C puis retour à 30 °C avec pour paramètres : +/- 5 °C toutes les 180 s pour
les spores ;
- de 40 à 5 °C puis retour à 30 °C avec pour paramètres : +/- 5 °C toutes les 180 s pour
les cellules végétatives.

3.2. Microscopie confocale

3.2.1. Mesure de la perméabilité des spores aux sondes fluorescentes

Plusieurs sondes fluorescentes ont été utilisées en microscopie confocale : l’iodure de

propidum (IP), l’acridine orange (AO) et le meso-phenyl-4,4′-difluoro-4-bora-3a,4adiaza-s-
indacene (Bodipy-C12).

3.2.1.1. L’iodure de propidium (IP)

L’IP est un intercalant de l’ADN d’environ 668 g/mol. Il est capable de se lier à l’ADN (à
raison d’une molécule toutes les quatre à cinq paires de bases) ainsi qu’à l’ARN. Cette
molécule fluoresce vingt à trente fois plus lorsqu’elle est liée à des acides nucléiques
(maximum de fluorescence à 617 nm sous forme liée). Ce fluorophore est par ailleurs un
marqueur de viabilité car il est connu pour ne marquer que les cellules dont les membranes
ont perdu leur intégrité (Williams et al., 1998). Pour l’ensemble des expérimentations, l’IP a
été ajouté aux suspensions cellulaires (~5.107 spores /mL) à raison de 4 µL/mL à partir d’une
solution mère aqueuse de 1 mg/mL.

d)

64
 Matériel & Méthodes

3.2.1.2. L’acridine orange (AO) :

L’Acridine Orange est une sonde fluorescente de 301,8 g/mol qui, lorsqu’elle s’intercale
au niveau de l’ADN, émet une fluorescence verte (Emission : 525 nm, Excitation : 500 nm) et
rouge lorsqu’elle interagit avec l’ARN (Emission > 630 nm, Excitation : 460 nm). Ce
fluorophore est un perméant cellulaire qui pénètre ainsi dans les cellules mortes et vivantes.
Etant plus hydrophobe que l’IP, il passe aisément la membrane plasmique et se lie alors aux
acides nucléiques. Une solution stock à 0,1 g/L dans l’eau distillée est conservée à 4 °C. Pour
les essais de marquage pendant la sporulation la sonde est ajoutée à T0, c'est-à-dire en début
de phase stationnaire, à une concentration finale de 5 µg/mL pour une concentration finale
d’environ 5.108 spores/mL.

3.2.1.3. Le Bodipy-C12 :

Cette sonde d’environ 455 g/mol a été synthétisée par l’équipe de Marina Kuimova de
l’Imperial College London (Kuimova et al., 2008). Il s’agit d’un rotor moléculaire qui a déjà
été utilisé pour mesurer des micro-viscosités dans divers systèmes : cellules vivantes, sol-gels,
mono et bicouches lipidiques (Kuimova et al., 2008; Hungerford et al., 2009; Levitt et al.,
2009; Hosny et al., 2013). Elle est stockée à -20 °C à une concentration de 1 mg/ml dans du
diméthylsulfoxyde (DMSO). Pour les essais d’insertion avant ou après sporulation, elle est
utilisée à une concentration de 4,3 µM (pour une concentration de 1 à 5.108 spores/mL). Sa
formule chimique est donnée en Figure 21.

Figure 21 : Formule chimique du Bodipy-C12, (Kuimova et al., 2008)

Compte tenu de la structure hydrophobe du Bodipy-C12, en particulier sa chaine

hydrocarbonée saturée (C12), une localisation de la sonde dans les structure hydrophobes des

65
 Matériel & Méthodes

microorganismes étudiés est attendue. La localisation de cette sonde dans la bicouche se fait
en profondeur dans le feuillet et son temps de vie reflète la viscosité de la chaine carbonée de
la bicouche, bien que dans une phase gel, la localisation pourrait être un peu différente et
moins profonde (Wu et al., 2013).

3.2.2. Acquisition d’image

Pour toutes ces sondes fluorescentes, les images en fluorescence et en transmission ont été
acquises sur un microscope confocal Nikon C1Si Eclipse TE 2000 U avec le logiciel EZ-C1
3.50 (Nikon, Japon). Un objectif à immersion à huile PlanApo x100 a été utilisé (NA : 1,4)
(Nikon, Japon). Un laser argon à 488 nm a été utilisé pour l’excitation avec un miroir
dichroïque 408-488nm. Les longueurs d’onde d’émission étaient de 550-700 nm pour l’IP,
500-550 nm pour l’AO et 500-600 nm pour le Bodipy C12.

3.3. Imagerie en temps de vie de fluorescence (FLIM)

3.3.1. Principe

Cette méthode est basée sur l’utilisation du décalage temporel entre excitation et
émission de fluorescence. Les molécules fluorescentes ne sont pas seulement caractérisées par
leurs spectres d’excitation et d’émission mais également par leur temps de vie (τ), c'est-à-dire
le temps pour lequel les molécules restent à l’état excité avant de revenir à l’état fondamental.
En d’autres termes, la distribution des temps de vie de fluorescence correspond à la
décroissance exponentielle de l'émission après l'excitation (par une impulsion laser courte
<10-9 s) d'une sonde fluorescente. La Figure 22 montre un exemple de courbe de décroissance
obtenue pour la rhodamine B.

66
 Matériel & Méthodes

Figure 22 : Exemple de courbe de décroissance de fluorescence mesurée pour la Rhodamine B en solution

dans l’eau. L’impulsion correspond à la réponse instrumentale. D’après (Szabelski et al., 2010).

En plus d’être spécifique d’un fluorophore, le temps de vie possède plusieurs avantages
comme le fait d’être indépendant de la concentration, et de varier selon l’environnement du
fluorophore (pH, viscosité, concentration en ions,…) (Swift and Trinkle-Mulcahy, 2004;
Ishikawa-Ankerhold et al., 2012; Suhling et al., 2012). L’imagerie par durée de vie de
fluorescence est une mesure de la probabilité d'émission de fluorescence d'une certaine durée
de vie. Ainsi le processus doit être répété plusieurs fois pour construire un « temps de vie
moyen » pour chaque pixel qui a été imagé (Swift and Trinkle-Mulcahy, 2004), comme le
montre la Figure 23.

Décroissance exponentielle (e-t/τ ) :

Histogramme de temps de vie de
fluorescence

Un procédé statistique:
Départ du « chronomètre » avec un pulse Grande répétition de la procédure :
laser. Arrêt du chronomètre avec l’arrivée du Combien de photons arrivent après quel
premier photon temps
construction d’un histogramme

Figure 23 : Schématisation du principe du FLIM (méthode « time domain (TCSPC) »). D’après
PicoQuant GmbH

67
 Matériel & Méthodes

Le FLIM est ainsi utilisée

isée pour discriminer différents fluorophores sur la base de leur temps
de vie mais aussi pour distinguer différents environnements dans un système basé sur les
changements d’environnement local d’un fluorophore. La Figure 24 montre le type d’image
qui peut ainsi être « construite », ici basée sur de l’autofluorescence.

Figure 24 : Image en intensité de pollen de marguerite (a) et sa correspondance

correspondance en temps de vie (b). Le
graphe (c) représente l’histogramme de temps de vie et l’échelle de couleur correspondante utilisée dans
l’image b. Il s’agit d’auto-fluorescence.
fluorescence. D’après PicoQuant GmbH.

Seule la méthode
éthode dans le domaine temporel (time domain)
omain) est présentée ici mais le temps de
vie peut aussi être mesuré dans le domaine fréquentiel (frequency domain).
domain).

3.3.2. Détermination de la viscosité

3.3.2.1. Principe des rotors moléculaires

La viscosité est une propriété clé qui résulte de la friction des molécules
molé entre elles et
qui gouverne les processus de diffusion et mobilité dans les fluides. Il s’agit donc d’un
paramètre important à mesurer dans les membranes. Les rotors moléculaires sont des sondes
fluorescentes qui ont la capacité de subir un mouvement intramoléculaire de rotation à l’état
excité (« twisted intra-molecular
molecular charge transfer » = TICT). Le 4-(Dicyanovinyl)
(Dicyanovinyl) Julolidine
DCVJ (Figure 25a)) en est un exemple. Le retour à l’état fondamental peut se faire via deux
voies de désexcitation concurrentes : une relaxation non fluorescente à partir de l’état de
torsion (TICT) ou une émission
ission de fluorescence à partir de l’état excité « plan » (LE).
La Figure 25b est une extension du diagramme de Jablonski pour les rotors moléculaires et
présente ces deux voies.

68
 Matériel & Méthodes

Figure 25 : (a) le DCVJ, exemple de rotor moléculaire (b) Extension du diagramme de Jablonski pour les
rotors moléculaires (Haidekker and Theodorakis, 2010).
2010)

Dans les environnements visqueux, il y a augmentation de la barrière d’énergie entre l’état

excité LE et l’état TICT. Il y aura ainsi une dépendance de la formation de l’état TICT par
rapport à la microviscosité de l’environnement.
l’environnement Lee rendement quantique de fluorescence
augmente dans les solvants de plus haute viscosité (Haidekker and Theodorakis, 2010;
Kuimova, 2012).. Ainsi, en pratique, à la fois l’intensité de fluorescence et le temps de vie sont
très dépendent de la viscosité pour ces molécules (Haidekker and Theodorakis,
Theod 2007;
Kuimova et al., 2008).. Cependant, pour les mesures basées sur l’intensité de fluorescence, il
existe des incertitudes liées aux variations locales de concentration, de
de propriétés
proprié optiques du
milieu, ainsi l’utilisation du temps de vie semble plus adapté (Levitt et al.,, 2009).
2009) Ces sondes
ont été utilisés pour mesurer
urer les microviscosités dans une variété de systèmes, y compris des
cellules vivantes, des sols-gels
gels et des mono et bicouches lipidiques (Haidekker et al., 2001;
Kuimova et al., 2008;
008; Hungerford et al., 2009; Levitt et al., 2009). Ces sondes représentent
représent un
outil intéressant dans l’étude de la fluidité membranaire.

3.3.2.2. Mesure de la viscosité

visco par le Bodipy C12

Pour la mesure de la viscosité, la sonde Bodipy-C12 a été utilisée. En effet, il a été mis
en évidence que l’intensité et le temps de vie de fluorescence de cette sonde sont fortement
dépendants de la viscosité. Le temps de vie de fluorescence a été utilisé dans ce travail. Il
semble en effet un meilleur marqueur que l’intensité de fluorescence puisqu’il n’est pas
affecté par la concentration (Kuimova et al., 2008; Levitt et al.,, 2009).
2009) Une courbe de
calibration entre le temps de vie du rotor et la viscosité d’une solution de méthanol/glycérol
variant de 15 et 1500 cP a été réalisée et a permis d’établir l’équation suivante (Kuimova et
al., 2008) :

69
 Matériel & Méthodes

 = , "" × $ + , %  Équation 4

Avec τf, temps de vie de fluorescence en ps et η, viscosité en cP.

Cette expression permet de convertir directement le temps de vie du rotor en une mesure de la
micro-viscosité de l’environnement de la sonde.
Il a également été vérifié que la sonde ne forme pas d'agrégats dans les systèmes utilisés. En
effet, des concentrations élevées en Bodipy peuvent former des agrégats qui sont caractérisés
par un maximum d'émission supérieur à 630 nm (pour le chromophore non modifié), et
également probablement par une durée de vie de l'état excité beaucoup plus courte (Bergstrom
et al., 2002; Kuimova et al., 2008). La Figure 26 présente ainsi les spectres de fluorescence
obtenus dans des spores sauvages en spectrofluorimétrie pour une excitation à 488 nm.

100000

80000

60000
Intensité (u.a)

40000

20000

0
500 550 600 650 700 750
Longueur d'onde (nm)

Figure 26 : Spectre de fluorescence de la sonde Bodipy-C12 intégrée dans des spores sauvages au cours de
la sporulation (Exitation : 488 nm).

Aucun maximum d’émission n’est observé pour des longueurs d’onde supérieure à 630 nm,
ce qui confirme l’absence d’agrégats. Cette vérification a été réalisée pour les différents
échantillons testés.

70
 Matériel & Méthodes

3.3.3. Intégration de la sonde

3.3.3.1. Marquage de spores

Pour les spores, la sonde Bodipy-C12 a été incorporée au cours de la sporulation

environ 1 à 2 h après le T0 de sporulation (cf. Figure16) à une concentration de 4,3 µM afin
de marquer les structures les plus profondes. Dans ce cas, les spores sont cultivées dans des
fioles bafflées de 125 mL. Le même ratio d’inoculation (1/10) et de volume de la fiole (1/5)
est utilisé que pour les autres productions. Il a été vérifié que la sonde n’a pas d’effet sur la
sporulation (suivi des courbes de croissance). La sonde a également été utilisée pour marquer
des spores déjà formées. Dans ce cas, les spores sont mises en contact avec la sonde pendant
environ 12 h.

3.3.3.2. Marquage de cellules végétatives

Les cellules végétatives ont été cultivées et marquées suivant la procédure adaptée de
(Cowan et al., 2004). Après une pré-culture d’une nuit, les cellules végétatives sont mises en
culture dans du milieu LB jusqu’à atteindre une DO600 nm d’environ 0,2. A ce moment là, la
sonde est ajoutée à une concentration de 4,3 µM et laissée en contact pendant encore 2 à 3
heures. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation (3500 g, 4 °C, 10 min), lavées et
remises en suspension dans du PBS pour les observations.

3.3.3.3. Acquisition des images FLIM

Pour ces expériences, une goutte de spores ou de cellules végétatives (~10 µL) est
placée sur une lamelle et recouverte par un petit bloc d’agarose à 10% afin de maintenir les
microorganismes en place et de préserver l’humidité. Les lamelles sont changées après 30 min
maximum d’observation. Le système FLIM utilisé est une extension LSM kit de Picoquant
ajouté au microscope confocal Nikon C1Si et consiste en une diode laser pulsée (485 nm,
FWHM (Full Fidth Half Maximum, largeur à mi-hauteur) = 83 ps, 40MHz) et en deux
détecteur SPAD (Single-photon avalanche diode). Des images à une dimension de 256*256
pixels ont été enregistrées pendant environ 210 s avec un temps d’exposition par pixel de 9,60
µs. L’enregistrement TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) du temps de vie a été
réalisé sur 200 canaux temporels (résolution finale de 128 ps/canal). Les images FLIM sont

71
 Matériel & Méthodes

ensuite analysées à l’aide du logiciel TRI2 version 2.4.4.1 (Gray Institute, Oxford, (Barber et
al., 2009)). Afin d’obtenir entre 1000 et 10000 coups au pic maximum par pixel, un binning
circulaire de 4 a été utilisé, sauf mention contraire. Un seuillage de 10-20% à 100% sur les
pixels a également été utilisé afin d’enlever des signaux relatifs au bruit de fond ou provenant
de structures très peu marquées. La réponse de l’instrument (IRF) a été obtenue en mesurant
la très courte durée de vie de fluorescence de la fluorescéine (0,2 mM) diluée dans une
solution saturée en iodure de potassium. Cette dilution dans le KI permet en effet le
quenching de la fluorescéine et la courbe de décroissance obtenue, dans les mêmes conditions
que les échantillons, peut alors être utilisée comme IRF (Szabelski et al., 2009).

3.3.3.4. Analyse et traitement des données

Les différents échantillons de spores sauvages ou issus de spores sauvages ont été
analysés à l'aide d'un ajustement bi-exponentiel pour chaque pixel ou groupe de pixels
(binning) de la courbe de décroissance (modèle Marquardt, Équation 5). Les spores mutantes
cotE gerE ont été analysées par un ajustement mono-exponentiel (Équation 6) puisque le bi-
exponentiel n'a pas produit une amélioration du χr2 (mono-exponentiel χr2 1.1-1.2, bi-
exponentiel χr2 1.0-1.1). Plus le χr2 est faible, meilleur est l’ajustement. Dans notre cas, il doit
s’approcher de 1. Les cellules végétatives ont été analysées à l'aide d'un fit mono-exponentiel
avec l'algorithme Bayesian (Équation 7) qui permet d’analyser les courbes de décroissance
avec un nombre inférieur de pixels. Cette procédure permet d'éviter un binning excessif et une
diminution de la résolution spatiale. Pour les cellules végétatives, un binning circulaire de 2 a
été appliqué. Pour les analyses en algorithme bi-exponentiel, l’amplitude de chaque
composante est représentée sous forme d’intensité fractionnelle (Fi) qui varie entre 0 et 1
(équivalent à 0-100 %) (Équation 8).
Les différents modèles utilisés sont les suivants (avec A, l’amplitude et τ, le temps de vie) :

 = & + '  (⁄ + '  (⁄ Équation 5

 = & + ' (⁄ Équation 6
 = & + '& (⁄ Équation 7
'
) = ∑ 
Équation 8
' 

Où Ai correspond à l’amplitude de la composante i.

Les histogrammes de temps de vie et d’intensités fractionnelles obtenus ont été exportés et
analysés à l’aide du logiciel OriginPro. Les outils « Fit peak » ou « Fit multiple peak » ont été

72
 Matériel & Méthodes

utilisés pour déterminer le maximum et les FWHM de chaque pic. Les maximum on été
utilisé pour déterminer les valeurs moyennes et les FWHM pour déterminer les barres
d’erreurs de chaque temps de vie ou intensité fractionnelle.

3.4. Cellules de visualisation

3.4.1. Fixation des spores

Pour certaines expérimentations réalisées en FLIM, des cellules de visualisation ont

été utilisées. Les spores sont alors fixées de la manière suivante, adaptée du protocole utilisé
par (Kong et al., 2010) : une goutte d'une suspension de spores (10 µl, ~ 1.108 spores / mL
dans l'eau) est déposée sur la surface d'une lamelle. Ces lamelles sont ensuite disposées à 4 °C
pendant 30 min afin de permettre aux spores d’adhérer à celle-ci. Le surplus de liquide est
ensuite éliminé en laissant une fine pellicule de spores sur la surface de la lamelle. Celle-ci est
ensuite placée dans un dessiccateur pendant au moins 15 min afin de sécher le film mince, les
spores sont ainsi fermement adhérées à la surface.

3.4.2. Germination

Pour la germination la lamelle est ensuite disposée dans une chambre thermostatée
FCS2 (Bioptechs, USA). Environ 100 µl de solution de germination à 37 °C sont injectés dans
la chambre thermostatée à une température de 37 °C. Le moment de l’addition du germinant
est considéré comme le T0 de la germination.

3.4.3. Modification de la température

Pour visualiser l’effet de la température sur la viscosité des spores, un système

thermostaté pour lamelle carrée a été utilisé (Bioscience tools, USA). Un joint en silicone est
utilisé pour délimiter un volume (~ 50µl) entre deux lamelles, les spores sont fixées sur l’une
d’entre elle. Avant le début des expérimentations, de l’eau distillée est ajoutée à l’aide d’une
aiguille afin de maintenir les spores dans un état hydraté. La Figure 27 est une représentation
de la chambre carrée réalisée.

73
 Matériel & Méthodes

Lamelle supérieure

Joint en silicone
( ~ 1 mm d’épaisseur) Spores fixées
Lamelle inférieure

Vue en 3D de la chambre crée Injection d’eau dans la chambre

Figure 27 : Schéma de la chambre réalisée à l’aide de lamelles carrées et d’un joint en silicone

Cette chambre est ensuite placée dans un élément chauffant (TC-E35)

( ) adapté pour la chambre
et relié à un contrôleur de température (TC-1-100,
( Biosciencee tools, USA). Des températures
allant de 20 à 75 °C ont été appliquées. Une photographie du système chauffant est donnée en
Figure 28.

Figure 28 : Photographie de la chambre utilisée pour modifier la température des spores bactériennes.
http://www.biosciencetools.com/catalog/images/CSC
http://www.biosciencetools.com/catalog/images/CSC-IC.gif

4. Evaluation
n de l’effet d’un traitement éthanol sur les
spores bactériennes

4.1. Barèmes des

de traitements utilisés

Les spores ont été traitées pendant 2 h à 65 °C avec une solution d’éthanol à 70% préparée
à partir d’éthanol absolu (Sigma
Sigma Aldrich,
Aldrich France) et d’eau distillée. Les spores sont traitées à
une DO600 nm de 1 dans 2 mL d’éthanol contenus dans des tubes Falcon de 15 mL. Ce

74
 Matériel & Méthodes

traitement est connu pour inactiver les spores et modifier leurs barrières de perméabilité
(Setlow et al., 2002). D’autres barèmes de traitements ont été étudiés : 1 h à 70 °C avec des
solutions d’éthanol à 30, 50 et 70%. Immédiatement après le traitement, l’éthanol contenant
les spores est dilué 5 fois par ajout d’eau distillée froide. Les tubes sont ensuite placés dans de
la glace pendant 5 min avant les étapes suivantes. Chaque traitement a été réalisé au minimum
3 fois sur au moins 2 productions de spores différentes.

4.2. Estimation de la viabilité

Deux méthodes sont utilisées pour estimer la viabilité. En effet, des expérimentations
ultérieures avec des sondes fluorescentes étant réalisées, il était nécessaire d’éliminer alors la
présence d’éthanol. Cependant les lavages et centrifugations ne permettent pas de récupérer
toutes les spores traitées. Afin de s’assurer que la méthode d’estimation de la viabilité n’est
pas biaisée par la perte due aux lavages des spores totales, la viabilité a également été estimée
sans lavage préalable.

4.2.1. Pourcentage d’inactivation sur spores lavées

Après le refroidissement des tubes dans la glace, les spores sont centrifugées à 4 °C
pendant 15 min à 4000 g. Les spores sont ensuite lavées au moins 3 fois avec de l’eau distillée
froide. Après lavage, les spores sont resuspendues dans environ 1 mL d’eau et la DO600 nm est
alors mesurée. Cette densité optique nous permet d’obtenir le nombre total de spores après
lavages, un certain nombre de spores ne pouvant être récupérées. Par la suite, un
dénombrement sur gélose de spores traitées et non traitées est réalisé. Après plusieurs
dilutions décimales, 100 µl de suspensions de spores sont étalées sur milieu BCP (Biokar
diagnostics) et incubées une nuit à 37 °C. Le dénombrement est réalisé sur les boites de Petri,
les boites comptées sont celles ayant un nombre d’unité formant colonie (UFC) compris entre
30 et 300. L’étalement des spores non traitées nous permet d’obtenir la corrélation exacte
entre la DO600 nm et le nombre de spores (~ 1 à 1,5.108 spores / mL). La viabilité des spores
traitées est alors estimée comme suit :

Nombre de spores viables comptées sur boites après traitement et lavage

% de spores inactivées = 100 −  × 100
Nombre total de spores après traitement et lavages DOCDDEF mesurée

75
 Matériel & Méthodes

4.2.2. Pourcentage d’inactivation sur spores non lavées

Les tubes de spores refroidies, et dont l’éthanol est dilué par 5, sont dilués directement
de manière décimale. Le nombre de spores totales avant et après traitement n’a donc pas été
modifié. 100 µL de dilutions adéquates sont étalés sur milieu BCP et incubés comme
précédemment. Le dénombrement est également réalisé après une nuit à 37 °C pour les spores
traitées et non traitées. La viabilité des spores traitées est alors estimée comme suit :

Nombre de spores viables comptées sur boites après traitement

% de spores inactivées = 100 −  × 100
Nombre de spores totales correspondant à une DOCDDEF de 1

La Figure 29 schématise ainsi les deux méthodes d’estimation de la viabilité.

Mesure DO600nm = Nb tot après
traitement

Dilutions et étalements

traitement

2
Dilutions et étalements
2 mL éthanol Dilution par 5 avec eau 4°C
Spores DO600nm = 1 Bac de glace (5 min) Nb tot inchangé, DO600nm = 1

Figure 29 : Méthodes d’estimation de la viabilité après les différents traitements à l’éthanol

4.3. Estimation de la perméabilisation des spores

Afin d’estimer le nombre de spores perméabilisées par le traitement, un marquage à

l’IP pendant 15 min est réalisé sur les spores lavées. Pour chaque traitement ou témoin, un
nombre minimum de 100 spores est ensuite observé en microscopie confocale. Les spores
considérées comme marquées sont celles dont le protoplaste présente une fluorescence rouge
intense, comme le montre la Figure 30.

76
 Matériel & Méthodes

a b c

Figure 30 : Images en microscopie confocale de spores sauvages traitées pendant 1 h à 70 °C avec 30%
d’éthanol et marquées à l’IP. (a) Image en transmission (b) Image superposée en transmission et en
fluorescence. (c) Image en fluorescence. (Excitation : 488nm ; Emission : 550-700 nm). Echelle= 2 µm. Les
flèches indiquent les spores au protoplaste marqué.

4.4. Evaluation de la viscosité des spores traitées

Une estimation de la viscosité des spores traitées est également réalisée sur ces spores.
Pour cela, le rotor est ajouté à une concentration de 0,43 µM la concentration en spores étant
beaucoup plus faible (~3 à 5.107 spores/mL). Les spores sont alors mises en contact avec la
sonde pendant environ 1 à 2 h pour les spores mutantes traitées et 4 h pour les spores
sauvages. Un temps plus long est utilisé pour les spores sauvages pour s’assurer de marquer
toutes les structures, celle-ci possédant encore leur enveloppe.

5. Traitement statistique des données

Les différentes analyses statistiques des résultats ont été effectuées à l’aide du logiciel
Sigmaplot version 11.0 (Systat software). Pour comparer deux échantillons, un test de Student est
réalisé. Lorsque plus de deux échantillons sont comparés, un test ANOVA est utilisé, le test de
Student-Newman-Keuls (SNK) permet alors de comparer les moyennes par paires. En cas de non
homogénéité des variances, le test ANOVA est réalisé sur les rangs (test de Kruskal-Wallis), la
comparaison par paire est alors réalisée par un test de Dunn. Les différences ont été considérées
comme significatives pour un risque α ≤ 0,05, sauf mention contraire.

77
RESULTATS

78
79
RESULTATS

1. Caractérisation des structures de la spore impliquées

dans sa faible perméabilité

Objectif de l’étude :

Cette étude a pour but d’identifier et de caractériser les structures de la spore bactérienne
impliquées dans la faible perméabilité et la rigidité. Pour cela, différentes approches sont
utilisées.
Dans un premier temps, une étude structurale globale et dynamique utilisant des méthodes
non intrusives a été initiée. Deux techniques ont été choisies : la résonance magnétique
nucléaire pulsée à bas champs (RMN) et la spectroscopie infrarouge. Ces méthodes
permettent d’obtenir des signaux donnant des informations sur l’état, la composition et parfois
la mobilité des différents constituants de la spore bactérienne. Par la suite, des méthodes plus
ciblées ont été envisagées. Ces techniques utilisent des sondes fluorescence pour marquer
sélectivement les compartiments cellulaires. L’analyse de cette fluorescence par
spectrofluorimétrie donne une vision globale du compartiment ciblé pour autant que la sonde
soit suffisamment sélective. Par l’utilisation de la polarisation de fluorescence, il est possible,
à partir de sondes adéquates, d’obtenir des informations sur la fluidité membranaire. Pour
obtenir des informations à l’échelle d’un individu et non plus uniquement d’une population, la
microscopie de fluorescence, et plus particulièrement la microscopie confocale, a été
envisagée. L’utilisation de sondes spécifiques (rotors moléculaires) a permis d’utiliser le
temps de vie de fluorescence (FLIM) afin d’obtenir des informations sur la microviscosité du
compartiment ciblé. Le Bodipy-C12 a en effet été mis en évidence comme une sonde
hydrophobe particulièrement sensible à la viscosité de son environnement.

80
 1.1. Approche non intrusive des structures et de la dynamique
de la spore

Afin de caractériser les spécificités des structures de la spore bactérienne, des méthodes non
intrusives ont été utilisées en premier lieu. Ces méthodes permettent d’obtenir des signaux
globaux sur l’ensemble des couches de la spore.

1.1.1. RMN pulsée à bas champ

La RMN pulsée à bas champs du proton a été utilisée sur des spores déshydratées
équilibrées à différentes aw. On s’intéresse ici à la distribution des temps de relaxation spin-
spin (T2) obtenue à partir de mesure par la séquence CPMG (τ = 40 µs). La séquence par
échos CPMG permet de détecter les protons les plus mobiles sans que le signal ne soit
influencé par l’inhomogénéité du champ magnétique ; par contre, les protons engagés dans
des structures plus organisées, de mobilité très réduite (T2 < τ) ne seront pas ou mal détectés.
La simple séquence de retour à la précession libre (FID) est également utilisée pour détecter le
pourcentage correspondant aux protons les moins mobiles. Plus le temps T2 est important plus
la mobilité des protons est importante, et le signal est proportionnel à la quantité de protons.
La Figure 31 présente ainsi le spectre obtenu par CPMG pour la souche de B. subtilis sauvage
équilibrée à une aw de 0,5, correspondant aux protons mobiles.

6000

1
5000
Intensité (u.a)

4000

3000

2000

1000 2
3
4
0
1E-3 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

T2 (ms)

Figure 31 : Distribution des temps de relaxation T2 de spores de Bacillus subtilis équilibrées à une aw de
0,5 obtenu en RMN basse résolution du proton.

81
Tous les protons mobiles sont visibles, ils peuvent provenir de plusieurs constituants :
• tous les solutés et biopolymères de la spore pour peu qu’ils soient mobiles ;
• les phospholipides et lipides des membranes ;
• l’eau présente dans les différentes structures de la spore ;

Ces protons ne se distinguent que par leur mobilité. Afin d’essayer d’attribuer une population
de protons à des constituants de la spore, différents paramètres (équilibre des poudres à
différentes aw, modification de la température) ont été appliqués afin de mieux comprendre les
distributions de mobilités de protons obtenus. Une population de protons importante est
obtenue à un temps de relaxation moyen de 0,23 ± 0,02 ms (pic 1) et selon l’aw trois autres
populations (ou deux pour des aw 0,1, 0,7 et 0,8) sont également visibles.
La Figure 32 présente l’évolution de l’intensité (cercle rouge, échelle de droite) et du temps
de relaxation T2 (carré bleu échelle de gauche) du pic 1 en fonction (a) de l’aw mesuré à
température ambiante et (b) de la température à une aw de 0,5.

0.5
a 14 0.5
b 14
0.45 0.45
12 12

Intensité (% H+ totaux)
Intensité (% H+ totaux)

0.4 0.4
0.35 10 0.35 10
0.3 0.3
T2 (ms)

8
T2 (ms)

8
0.25 0.25
0.2 6 0.2 6
0.15 4 0.15 4
0.1 0.1
2 2
0.05 0.05
0 0 0 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 15 25 35 45 55 65 75 85 95
Activité de l'eau (aw) Température (°C)

Figure 32 : Evolution du temps de relaxation T2 exprimé en ms (en bleu) et de l’intensité (en rouge)
exprimé en % de protons totaux du pic 1 en fonction (a) de l’aw à température ambiante et (b) de la
température pour des spores à aw 0,5 (b).

L’intensité de la population 1 dépend de façon quasi linéaire de l’activité de l’eau à laquelle la

poudre de spores a préalablement été équilibrée. Ceci signifie que cette population de protons
peut être attribuée en grande partie à l’eau présente dans les structures de la spore. Cette eau
pourrait correspondre à l’eau présente dans les couches externes de la spore, notamment
l’enveloppe et le cortex, qui sont des structures qui gonflent sous l’effet d’une hydratation
plus importante La relaxation spin-spin (T2) diminue quant à elle légèrement jusqu'à l’ aw 0,5
pour augmenter de nouveau par la suite. Cette première population mobile correspond aux
protons de l’eau mais aussi aux protons mobiles des solutés ou des polymères (la mobilité des
protons des lipides étant attendue à plus fortes valeurs de T2 et surtout ces protons sont

82
insensibles en intensité à des variations d’aw). Lors de l’hydratation, l’ajout de molécules
d’eau provoque un effet anti plastifiant provoquant d’abord une diminution de mobilité. Les
interactions avec l’eau dans les gammes d’hydratation faible redonnent à la matrice
suffisamment de mobilité à l’échelle locale (échelle du proton) pour provoquer une
densification des constituants, d’où une diminution de la mobilité globale du système. Ce
comportement d’antiplastification de l’eau, est souvent observé pour des matrices
biopolymeriques conservées à l’état vitreuse, pour lesquelles une densification lors de
l’hydratation est mesurée (Seow et al., 1999).
En ce qui concerne les autres populations de protons (pic 2, 3 et 4 en Figure 31), l’intensité ne
semble pas être modifiée par l’aw et la variation du nombre de populations rend difficile
l’interprétation de ces données. Il peut donc s’agir de populations de protons correspondant à
des zones hydrophobes de la spore ou à des zones hydrophiles où les molécules d’eau ne
parviennent pas à diffuser. Il est difficile d’attribuer les protons de différentes mobilités aux
membranes ou au protoplaste mais l’observation d’un nombre variable de populations en
fonction de l’hydratation pourrait être reliée à la mobilité relative des protons des membranes
interne et externe. La membrane externe peut voir sa fluidité modifiée par le gonflement
(modification) plus ou moins importante du (cortex + manteau) lors de sa réhydratation.
La température a peu d’effet sur la mobilité des protons de la première population puisque la
valeur de T2 évolue très peu. Elle semble par contre avoir une légère influence sur l’intensité
des pics avec une augmentation de la proportion entre 40 et 70 °C puis une stagnation voire
une diminution. Au cours du chauffage cette population s’enrichit de composants de la spore
qui au départ avait une faible mobilité et qui sous l’effet de la température gagne en mobilité.
Les T2 moyens de cette population restent quasi inchangés car l’effet de la température
attendu sur la mobilité est compensé par la mise en mouvement de solutés qui arrivent à ce
niveau de mobilité. L’effet de la température, alors que le niveau d’hydratation est constant,
est double : permettre une augmentation de mobilité de solutés immobiles et permettre une
répartition de l’eau dans cette zone mobile.
Ainsi, cette méthode a permis d’analyser la mobilité des protons de spores à l’état sec.
Cependant, cette méthode n’a pas permis d’étudier les protons provenant des membranes,
aucun pic n’ayant pu être clairement attribué à ceux-ci. Ceci est peut être dû à la faible
proportion en phospholipides comparée à celle de l’enveloppe et du cortex dans une spore
(leur signal pourrait faire partie des populations mineures identifiées) mais aussi au fait que
leur mobilité est trop faible pour être détectée ou différentiée des protons de l’eau (leur signal
est dans le FID ou dans le 1er pic).

83
 1.1.2. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)

La spectroscopie infrarouge permet d’obtenir des spectres qui apportent des

informations sur plusieurs structures de la spore de manière simultanée. En effet, les spectres
obtenus correspondent aux nombres d’onde pour lesquelles les liaisons entrent en vibrations
et qui sont caractéristiques de molécules ou de constituants cellulaires. Ainsi, cette méthode a
été utilisée initialement sur des spores sauvages et des cellules végétatives afin d’identifier les
constituants spécifiques de la spore et leurs caractéristiques. La Figure 33 présente les
spectres entiers et coupés dans différentes régions spectrales de spores et cellules végétatives.

spores sauvages
a cellules végétatives
1.0
Absorbance normalisée (u.a)

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

-1
Nombre d'onde (cm )
b c d
1540.4
1539.2
1651.4
1654.8

1279.1
2851.3
2851.2

1.0 1.0 1.0

Absorbance normalisée (u.a)

Absorbance normalisée (u.a)

Absorbance normalisée (u.a)

0.8 0.8 0.8

1746.8

0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4

0.2 0.2 0.2

0.0 0.0 0.0

3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1340 1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180 1160
-1 -1
-1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure 33 : Comparaison des spectres IR moyennés (n ≥ 3) de spores et cellules végétatives de Bacillus

subtilis obtenus à 30 °C. (a) spectres entiers, (b) région des lipides, (c) région des protéines, (d) DPA. Les
valeurs correspondent aux fréquences de vibrations mesurées sur les dérivées secondes des spectres.

Il faut préciser que ces spectres sont obtenus par dépôt de gouttes concentrées en
microorganismes sur la fenêtre d’analyse (cristal ATR) et séchage sous un flux d’azote afin
d’obtenir le meilleur signal possible. En ce qui concerne la position des pics, on constate sur
la Figure 33c que la bande Amide I n’a pas tout fait à la même longueur d’onde selon l’état du

84
microorganisme : 1651 cm-1 et 1655 cm-1 pour les cellules végétatives et les spores
respectivement. Cette fréquence permet généralement d’obtenir des informations sur les
protéines et leur structure secondaire. La position des pics est obtenue par l’analyse de la
dérivée seconde de chaque courbe, que ce soit pour les spores ou les cellules végétatives, cette
longueur d’onde est caractéristique de vibrations de structures protéiques en hélice α (Johnson
et al., 2005; Garip et al., 2009).
Un pic à la fréquence de 2851 cm-1 est également observé sur les deux spectres (Figure 33b),
celui-ci est caractéristique de la vibration d’élongation symétrique de la liaison C-H des
groupements >CH2 dans les acides gras. Cette vibration semble « masquée » dans les spores
ce qui rend difficile l’analyse des membranes par cette méthode. Ce faible signal obtenu pour
les spores est peut être relié à sa structure multicouche dans laquelle une des membranes est
localisée en profondeur. Ainsi, à température ambiante, il n’y a pas ou peu de différence pour
cette vibration selon la forme du microorganisme. De plus, dans le cas de spores entières les
spectres ne permettent pas de différencier les deux membranes.
Chaque forme bactérienne possède des spécificités, on peut observer un épaulement à
1747 cm-1 pour les cellules végétatives. Ce pic a déjà été observé dans la littérature et peut
être attribué à un composé de réserve polyester, le PHB (ou acide poly-β-hydroxybutyrique)
(Helm and Naumann, 1995). D’autres auteurs l’ont associé à un composé liposoluble,
probablement un phospholipide comme le phosphoglycérol (PG) ou
phosphatidyléthanolamine (PE) (Johnson et al., 2009). Ce composé n’est pas retrouvé sur le
spectre des spores, le PHB étant en majorité dégradé pendant la sporulation, apportant
l’énergie nécessaire à ce processus. Ce pic permet d’observer la pureté d’un échantillon de
spores puisqu’il est absent sur un échantillon de spores suffisamment purifié. En ce qui
concerne les spores, plusieurs pics proviennent de la vibration de liaisons du DPA, notamment
à 1279 cm-1 (Figure 33d) et un épaulement à 1570 cm-1 et ne se retrouvent donc pas pour les
cellules végétatives.
Enfin, en ce qui concerne la région 3000-2800 cm-1, en observant la dérivée seconde des
spectres on peut constater une légère différence au niveau du pic à 2920-2930 cm-1 comme le
montre la Figure 34.

85
 Spores sauvages
Cellules végétatives

1.0

Absorbance normalisée (u.a)

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

3100 3050 3000 2950 2900 2850 2800 2750 2700

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure 34 : Spectre d’absorbance IR (en trait plein) et dérivée seconde (en trait pointillé) des spectres de
spores (en noir) et cellules végétatives (en rouge) de Bacillus subtilis sur la plage de fréquence 2700-
3100cm-1.

Sur le spectre dérivé seconde, les pics apparaissent ainsi comme des « creux ». En effet pour
les cellules végétatives, un seul pic est dominant aux alentours de 2921 cm-1 et peut être
attribué à la vibration d’élongation asymétrique de la liaison C-H des groupements >CH2 dans
les acides gras. Un épaulement est aussi observé aux alentours de 2933 cm-1. Pour les spores,
le pic est plutôt visible aux alentours de 2924 cm-1 et un autre pic d’intensité similaire est
observable à 2934 cm-1. Ce dernier pic est également attribué à des vibrations d’élongation
asymétrique de la liaison C-H des groupements >CH2, mais pas forcément dans les acides
gras. Ce pic peut être induit par une différence dans la structure et/ou composition
membranaire des spores ou bien par un autre constituant sporal. Il n’existe que peu d’étude
des vibrations associées aux spores bactériennes dans cette région. L’étude de Johnson et al.,
en discute brièvement mais les dérivées secondes ne sont pas présentées (Johnson et al.,
2009).

1.2. Approche de la structure de la spore par la fluorescence

Les méthodes précédentes ont permis d’observer des spécificités dynamiques et

structurales propres aux spores bactériennes via des signaux globaux. Ces signaux ne
permettent pas de cibler directement la contribution de chaque structure au signal obtenu.
Pour cibler un organite, il est possible d’introduire une sonde dont les propriétés permettent de
marquer spécifiquement un compartiment de la spore. Les méthodes suivantes utilisent les

86
propriétés de la fluorescence dans le visible qu’ont certaines molécules. Elles vont consister à
intégrer ces molécules fluorescentes spécifiques permettant l’étude d’un paramètre (comme la
fluidité membranaire) ou d’une structure (liaison à l’ADN).

1.2.1. Incorporation de sondes fluorescentes dans les spores

La spore est une structure multicouche de petite taille et peu perméable. L’étude de la
sporulation ou des spores dormante emploie généralement la GFP (Green Fluorescent Protein)
ou un fluorochrome analogue pour étudier la localisation des protéines et l'expression des
gènes au cours de la sporulation. Incorporer des sondes dans cette structure peut s’avérer
difficile (il ne faut pas que la sonde affecte la sporulation) et peu de travaux ont été menés sur
le marquage spécifique de structure de la spore dormante comme la membrane interne
(Pogliano et al., 1999; Cowan et al., 2004; Hofstetter et al., 2012).
Afin d’insérer des sondes fluorescentes dans les structures les plus profondes, différentes
stratégies ont été utilisées. La sonde est soit insérée après la sporulation, soit pendant la
sporulation. Deux sondes, aux spécificités différentes, ont été utilisées : un intercalant de
l’ADN, l’acridine orange et une sonde hydrophobe, le Bodipy-C12 dont l’utilisation est
envisagée afin de caractériser les membranes de la spore. Des résultats de marquage avant ou
après la sporulation avec ces différentes sondes sont présentés en Figure 35.

a b
Bodipy C12

c d
Acridine orange

Figure 35 : Images en fluorescence obtenues en microscopie confocale pour des spores marquées après
(a,c) et pendant (b,d) la sporulation avec du Bodipy-C12 ou de l’acridine orange (AO). Echelle = 2 µm pour
les images a et b et 1 µm pour c et d.

87
Les images obtenues en microscopie confocale permettent d’observer que lorsque le Bodipy-
C12 est inséré après la sporulation, seul un anneau périphérique est marqué pour les spores
entières, même après 24 h de contact (Figure 35a). Les structures les plus internes, notamment
la membrane interne, ne semblent ainsi pas être atteintes bien que la membrane externe soit
probablement marquée. La sonde a également été insérée en cours de sporulation selon un
protocole similaire à celui de Cowan et al. (Cowan et al., 2004). Ainsi, 2 à 3 h après la mise
en culture, ce qui correspond au T0 de la sporulation, la sonde est introduite dans le milieu de
sporulation. Les images acquises en microscopie confocale dans ce cas sont obtenues 7 jours
au moins après la récolte des spores.
La Figure 35b montre que la sonde atteint alors des structures plus profondes et possède une
fluorescence verte intense typique du Bodipy. Pour autant, la sonde ne semble pas marquer le
protoplaste, l’intensité de fluorescence dans cette partie ne représente qu’environ 10% de la
fluorescence des autres structures. La fluorescence apparait uniforme le long des couches de
la spore et il n'est ainsi pas possible de distinguer les différentes structures basées seulement
sur l’intensité de fluorescence (à la limite de résolution optique). L’AO est un intercalant de
l’ADN pénétrant dans toutes les cellules. En ce qui concerne les spores, cette sonde ne peut
pas pénétrer dans le protoplaste si celles-ci sont marquées après la sporulation, même après
20 h de mise en contact (Figure 35c). Par contre, l’insertion de la sonde au préalable de la
sporulation permet d’atteindre plus profondément la spore, notamment jusqu’à l’ADN localisé
dans le noyau. En effet, on obtient alors une fluorescence intense localisée dans le protoplaste
(Figure 35d).
Ainsi, ces résultats de marquage montrent que l’insertion en cours de sporulation permet
d’atteindre les structures les plus internes contrairement à un marquage sur des spores déjà
formées. Un marqueur de l’ADN pourra atteindre le noyau des spores s’il est inséré avant la
sporulation. De même, un marqueur hydrophobe ou membranaire, s’intégrera dans des
couches plus profondes ce qui permettra de marquer probablement la membrane interne. Le
marquage ainsi obtenu n’est cependant pas possible avec n’importe quel marqueur
fluorescent. En effet, le marqueur peut être expulsé lors de la sporulation ou métabolisé par la
cellule durant cette même phase ou encore (photo) oxydé durant le stockage. La sonde utilisée
doit donc être particulièrement stable et pouvoir s’accrocher à un organite ou une structure
maintenue lors du passage de la cellule à la spore (ADN, membrane, …).

88
 1.2.2. Mesure de la mobilité des membranes et des structures hydrophobes
d’une population de spores par le DPH

Le DPH s’incorpore naturellement à l’intérieur des membranes. Il est possible

d’utiliser la technique de polarisation de fluorescence pour mesurer la mobilité de cette sonde
(grâce aux paramètres de polarisation et d’anisotropie) et ainsi d’approcher la viscosité de la
membrane. La mesure de l’anisotropie du DPH insérée dans les spores et les cellules
végétatives a été comparé afin d’approcher une mesure de la rigidité globale des structures
cellulaires ciblées et principalement des membranes. Dans ce cas, un marquage après
sporulation a été réalisé. En effet, le DPH a un poids moléculaire plus faible que le Bodipy-
C12 (232,2 contre 454,0 g/mol) et a déjà été utilisé sur des spores bactériennes après formation
(Ishihara et al., 1999). De plus, des travaux précédents réalisés au laboratoire ont montré que
la sonde était métabolisée si elle est insérée au cours de la sporulation. Le DPH est de nature
hydrophobe et se localise préférentiellement dans les solvants et les structures apolaires où il
fluoresce fortement. Ainsi dans un milieu cellulaire, le DPH va migrer vers les membranes
cellulaires et certaines zones hydrophobes. Dans une membrane, le DPH se localise
principalement au centre de la bicouche phospholipidique (Kaiser and London, 1999), une
fraction reste cependant dans les feuillets phospholipidiques (Van der Heide et al., 1996).
L’un des avantages du DPH provient du fait que son positionnement dans les membranes
s’accompagne par une forte augmentation de fluorescence alors que celle-ci est quasiment
négligeable dans l’eau (Laroche et al., 2001). La Figure 36a présente l’évolution de l’intensité
moyenne et normalisée obtenue dans des cellules végétatives et des spores après insertion du
DPH à 30 °C.
a Cellules végétatives
b
1.2 Spores sauvages 0.30
95%
0.23
1.0 0.25 a 0.22
0.18
0.8 0.20
Anisotropie
Intensité (u.a)

0.6 0.15

0.4 0.10

0.2 0.05

0.0 0.00
0 100 200 300 400 500 600 cellules végétatives spores spores cotE gerE
Temps (s)

Figure 36 : Comparaison du pourcentage de l’intensité maximum du DPH pour des spores et des cellules
végétatives de Bacillus subtilis. (a) Evolution de l’intensité de fluorescence (polarisation parallèle)
normalisée du DPH inséré dans des spores ou des cellules végétatives de Bacillus subtilis à 30 °C (b)
Anisotropie moyenne du DPH mesuré dans des spores avec ou sans enveloppe et des cellules végétatives à
30 °C. a,b : les colonnes portant des lettres différentes sont significativement différentes (Test SNK avec un
risque α de 5%).

89
Afin d’étudier l’intégration de la sonde dans les différents microorganismes, l’évolution de
l’intensité après insertion a été étudiée. Ainsi, pour obtenir 95% de l’intensité maximale, il
faut en moyenne 416 secondes pour les spores sauvages contre 120 secondes pour les cellules
végétatives, soit environ 3,5 fois plus de temps. Ce résultat montre que pour les spores, la
sonde met plus de temps pour arriver à des structures qu’elle peut marquer, comme les
membranes, par comparaison aux cellules végétatives. Ceci est en accord avec les couches
supplémentaire que cette sonde doit traverser, notamment l’enveloppe et/ou le cortex
En ce qui concerne les spores mutantes cotE gerE, l’allure de la courbe se rapproche de celle
des spores sauvages mais avec un temps pour atteindre 95% de l’intensité maximum
d’environ 350 secondes, soit environ 2,9 fois plus long que les cellules végétatives. Dans ces
spores, une grande partie de l’enveloppe est absente mais également la membrane externe
(Ghosh et al., 2008). On peut alors supposer que l’enveloppe joue un rôle dans l’accessibilité
des membranes à la sonde mais qu’il ne s’agit pas de la seule structure impliquée.
La mesure de l’anisotropie du DPH inséré dans les cellules végétatives apparait plus faible
que celle des spores (Figure 36b). Les spores entières ont en moyenne une anisotropie de 0,23
(± 0,018) comparée à une anisotropie d’environ 0,18 (± 0,004) pour les cellules végétatives, la
différence entre les deux étant significatives. Les spores cotE gerE ont elles aussi une
anisotropie plus élevée que les cellules végétatives : 0,22 (± 0,006). Les valeurs d’anisotropie
plus élevée mesurée pour les spores concordent avec la présence de différentes structures
hydrophobes dont la membrane interne qui possède une faible mobilité de ces lipides (Cowan
et al., 2004). La plus faible valeur d’anisotropie (non significative) obtenue pour les spores
mutantes comparée aux spores sauvages, suggère que les parties externe (membrane externe
et/ou enveloppe) sont peut être également responsable d’une valeur d’anisotropie plus élevée.
Le DPH ne semble pas avoir dans la spore une localisation suffisamment précise pour pouvoir
interpréter ces variations d’anisotropie.

1.2.3. Mesure de la viscosité des membranes et des structures hydrophobes

de spores individuelles par le Bodipy-C12

Les méthodes précédentes ont permis d’obtenir des informations globales sur la
perméabilité et la fluidité de la spore. Ainsi, l'anisotropie du DPH permet d'obtenir une vision
globale de la rigidité de la spore, cependant la ou les membranes ne sont pas forcément les
seules structures marquées. Afin de pouvoir distinguer la contribution de chacune des
couches, nous avons tenté de les séparer spatialement grâce à la microscopie de fluorescence.

90
La polarisation de fluorescence ainsi que l’utilisation d’excitation UV étant difficilement
applicable en microscopie, une autre sonde sensible à la viscosité a été développée : le
Bodipy-C12. Il s’agit d’un rotor moléculaire qui permet par l’analyse de la décroissance de
fluorescence de mesurer la viscosité de l’environnement de la molécule. Cette sonde est
hydrophobe et semble donc adaptée pour l'étude de la viscosité de la ou les membranes de la
spore.

1.2.3.1. Contrôles du système FLIM et de l’utilisation du Bodipy-C12

La mesure en temps de vie de fluorescence par un système TCSPC sur un microscope

confocal est un système qui demande à être précisément étalonné. Ce système n’ayant jamais
été utilisé au niveau du plateau d’imagerie PIMS, différentes procédures ont été mises en
place. Dans un premier temps, afin de vérifier le bon fonctionnement du système FLIM et des
paramètres utilisés, le temps de vie (τ) de deux sondes fluorescentes connues a été mesuré : la
Rhodamine B (Rh B) et la Rhodamine 6G (Rh 6G). Ces sondes ont en solution, des temps de
vie qui leur sont spécifiques. En effet, celui-ci est une caractéristique intrinsèque de chaque
molécule fluorescente. La Figure 37 présente les courbes de décroissance ou déclin de
fluorescence de ces deux sondes ainsi que les valeurs de τ qui en sont extraites.

4000 Rhodamine B
Fit RhB
3500
Rhodamine 6G
Fit Rh6G
3000
Intensité (nombre de coups)

2500

2000
τRhB : 1.7 ns

1500 τRh6G: 3.9ns

1000

500

0 5 10 15 20 25
Time (ns)

Figure 37 : Courbe de déclin de la fluorescence de la Rhodamine B et de la Rhodamine 6G dans de l’eau

mesuré par le système de détection FLIM couplé au microscope confocal.

Le logiciel TRI2 a été utilisé pour modéliser les courbes. Comme on peut l'observer, il est
possible de modéliser ces deux courbes comme des courbes de décroissance
monoexponentielle. Les valeurs de τ obtenus (1,7 ns et 3,9) ns sont proches des valeurs
mesurées dans la bibliographie pour la Rhodamine B (1,73-1,68 ns) et la Rhodamine 6G

91
(4,04-4,08 ns) respectivement (Magde et al., 2002; Waharte et al., 2006; Szabelski et al.,
2010).
Dans les échantillons homogènes comme les solvants organiques, les bicouches lipidiques
modèles ou même les membranes cellulaires, le déclin du rotor Bodipy-C12 est
monoexponentiel (Kuimova et al., 2008; Hungerford et al., 2009; Levitt et al., 2009). Nous
avons mesuré le temps de vie de fluorescence du rotor dans de l’éthylène glycol, la courbe de
déclin de fluorescence obtenue est également monoexponentielle et donne un τ de 0,84 ns
cohérent avec les valeurs obtenues par l’équipe anglaise ayant mis au point la sonde (0,9 ns).

1.2.3.2. Application à la spore bactérienne

Les images obtenues en microscopie confocale ont permis de valider une stratégie de
marquage en cours de sporulation afin d’atteindre les structures les plus internes (Figure 35).
Le rotor utilisé est une sonde hydrophobe qui devrait marquer les couches hydrophobes de la
spore, les membranes mais aussi potentiellement l'enveloppe. L’utilisation de cette sonde doit
permettre de différencier plusieurs structures en se basant sur leur viscosité bien que leur
éloignement soit sous la limite de la résolution de la microscopie optique.

Relation entre viscosité et temps de vie

Il a été précédemment montré que pour ce fluorophore, la voie de désexcitation non
radiative est activée pour des faibles viscosités. Ainsi, à la fois l’intensité de fluorescence et le
temps de vie sont très dépendants de la viscosité.
Conformément à l’équation modifiée de Förster-Hoffmann (Kuimova, 2012), le temps de vie
(τf) des rotors moléculaires montre la dépendance suivante à la viscosité (η) :

L
HIJ  = HIJ K N + OHIJ $ Équation 9
M

où kr est la constante de vitesse de déexcitation radiative et z et α sont des constantes

nécessaires pour ajuster les données de l'équation.
Une calibration entre le temps de vie du Bodipy-C12 rotor en fonction de la viscosité a été
réalisée sur une large gamme de viscosité. En utilisant des mélanges méthanol/glycérol
correspondant à des viscosités allant de 15 à 1500 cP, il a été montré que pour le Bodipy-C12
l’Equation 9 devient :

92
 Résultats

ln  = 0,5336 × ln η + 4,5862
4,5862 Équation 10

où τf est le temps de vie du Bodipy-C12 en ps et η est la viscosité en cP.

Cette expression fournit un moyen direct de convertir le temps de vie du rotor Bodipy-C12 en
une mesure de la microviscosité de l’environnement de la sonde.

Etude de la viscosité dans des spores dormantes

Afin de différencier des structures sporales sur la base de leur viscosité, le temps de
vie du Bodipy-C12 a ainsi été utilisé. Dans les échantillons homogènes, le déclin de
fluorescence de la sonde est monoexponentiel. La courbe de décroissance obtenue dans les
spores ainsi que les histogrammes de répartition de temps de vie qui en sont extraits sont
présentés en Figure 38 a et b.

a Courbe de décroissance et modèle b

220
1000 τ1
200
800 τ2
180
Intensité (u.a)

600 160

400 140
Intensité
Frequency

120
200
100
0 80
0 5 10 15 20 25 60
Temps (ns)
Différence entre données et modèle 40
3
Residuals

2 20
1
0 0
-1
-2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
-3 Histogramme deLifetime
la répartition des temps de vie (ns)
0 5 10 15 20 25 Histogram

c Image τ1 Time/ns
d Image τ2 e Image χ 2 f Image Fi de τ1 g Image Fi de τ2

Figure 38 : Set de données « classiques » obtenues en temps de vie de fluorescence pour des spores
dormantes marquées avec 4,3 µM de Bodipy-C12. (a) Courbe classique de décroissance du temps de vie de
fluorescence montrant un déclin biexponentiel (b) Histogramme de la répartition des temps de vie et les
images correspondantes de τ1 (c), τ2 (d), χ2 (e) ainsi que les intensités fractionnelles (Fi) de τ1 (e) et τ2 (f).
L’échelle en fausse couleurs des images en temps de vie est de 0,2 à 5,6 ns, de 0,2 à 2 pour l’image χ2 et de
0,2 à 0,8 pour les intensités fractionnelles Fi.

93
 Résultats

La courbe de décroissance du rotor dans les spores nécessite une modélisation au moins
biexponentielle (χ2 de 1,03 contre 1,5 en monoexponeniel). Ainsi, si la sonde a gardé sa
caractéristique monoexponentielle, il semble que le rotor marque au moins deux
environnements dont les viscosités sont différentes dans chaque pixel de l'image. Cette
modélisation biexponentielle conduit à l’obtention de plusieurs valeurs de τ pour les spores :
un temps de vie court (τ2) de 1,1 ± 0,3 ns et un temps de vie plus long (τ1) qui s’étend de 3 à
5,5 ns (Figure 38). Pour la plupart des échantillons, cet histogramme montre clairement une
forme asymétrique. Cette courbe a alors été modélisée par le logiciel Origin Pro, ce qui
permet d’extraire deux Gaussiennes centrées sur des valeurs moyennes de τ différentes : 3,4 ±
0,2 ns et 4,2 ± 0,5 ns.
Afin de localiser τ1 et τ2, une analyse globale des images en temps de vie a été réalisée. En
effet, plusieurs valeurs de τ (plusieurs environnements) sont « mélangés » par pixel. L’analyse
globale permet, en « fixant » les valeurs de τ1 et τ2, de décomposer le signal de chaque pixel
selon ces deux valeurs en affectant un poids (intensité fractionnelle) à chaque temps. Cette
analyse peut permettre de localiser ces 2 durées de vie à l'intérieur de la structure de chaque
spore. En utilisant cet algorithme, les intensités fractionnelles (Fi) de chaque temps de vie
peuvent être déterminées plus précisément. Ces intensités fractionnelles correspondent à
l’amplitude de chaque temps de vie τ1 et τ2 réparti par pixel. Les images obtenues sont
présentées en Figure 38 f et g. L’échelle en fausse couleur correspond aux intensités
fractionnelles entre 20 et 80%. On peut observer à partir de ces images que le temps de vie
court, τ2 a l’intensité la plus importante (environ 65%, couleur rouge) au niveau d’une couche
en périphérie des spores, et est faible à l’intérieur des spores (35%, couleur bleue).
Inversement, le temps de vie plus long τ1 a l’intensité la plus importante (65% couleur rouge)
dans la partie interne des spores. Ces images permettent donc de montrer une séparation
spatiale des deux temps de vie dans les spores dormantes et permet la séparation des
contributions de différentes structures de la spore. On observe ainsi que contrairement aux
images obtenues en intensité, la répartition des temps de vie du Bodipy-C12 n’est pas
homogène dans les spores. Bien que l’on ait déjà pu obtenir des informations intéressantes sur
la répartition des temps de vie dans la spore, des analyses supplémentaires sont nécessaires
pour attribuer des valeurs de temps de vie à des structures en particulier.

94
 Résultats

Séparation des contributions par analyses d’images

Comme on a pu le constater sur les images obtenues en intensités fractionnelles
(Figure 38f et Figure 38g), il est possible de séparer les spores en deux parties : une partie
interne et une plus externe. Afin d’améliorer les informations obtenues, l’outil « masque »
(définition de zones dont les pixels ne sont pas pris en compte) et un seuillage des pixels plus
important ont été utilisés pour diviser chaque spore en deux parties. La ligne de séparation
utilisée pour chaque spore, se localise à peu près au niveau du cortex, et on peut supposer
qu’elle sépare l’enveloppe et la membrane externe de la membrane interne. Les deux parties
possèdent surement une contribution liée au cortex qui ne doit cependant contribuer que
faiblement au signal du Bodipy-C12 puisqu’il est plutôt de nature hydrophile (Engleberg. NC,
2007). La Figure 39a et b montre ainsi une cartographie des intensités fractionnelles dans les
parties interne et externe des spores. τ1 contribue pour 56% de l’intensité totale dans la partie
interne (couleur rouge) et à 42% pour la partie externe (couleur bleue) alors que τ2 contribue
pour 58% du total dans la partie externe et 44 % pour la partie interne (Figure 39c).

5.0
a Image Fi de τ1 b Image Fi de τ1 4.5 c (56 ± 10)%Partie interne Partie externe

4.0 (42 ± 13)%

temps de vie (ns)

3.5
3.0
2.5
2.0
(44 ± 10)%
1.5 (58 ± 13)%
1.0

Partie interne Partie externe 0.5

0.0
τ1 τ2 τ1 τ2
τ

Figure 39 : Analyses d’images FLIM de spores sauvages par masquage spatial de pixels de la région
interne ou externe. Image en intensité fractionelle Fi dans la partie interne (a) et externe (b) de spores.
L’échelle en fausse couleur va de 0,2 à 0,8. (c) valeur moyenne de τ1 et τ2 (axe des ordonnées, les boites
représentent l’étendue) et les intensités fractionnelles correspondantes (% entre parenthèses).

Si maintenant on s’intéresse plus particulièrement aux valeurs de τ (Figure 39c), on constate

que τ2 varie très peu entre la partie interne (1,1 ± 0,4 ns) et externe (0,9 ± 0,4 ns). Ces valeurs
correspondent à peu près à une viscosité d’environ 80 cP (cf Équation 10). Au contraire des
différences sont observées pour les valeurs de τ1 avec un temps de vie de 4,1 ± 0,5 ns
(1090 cP) pour la partie interne et de 3,3 ± 0,5 ns (725 cP) pour la partie externe. Cette
dernière valeur est très proche de la valeur extraite de l’épaulement observé sur l’histogramme
des spores entières (Figure 38b). On peut ainsi supposer qu’une contribution du déclin lent
(τ1) dans la partie externe soit responsable de cet épaulement.

95
 Résultats

Spores sans enveloppe et résidus de germination

Afin d’aider l’attribution d’une viscosité à un domaine particulier dans les spores
sauvages, des images FLIM de différents types cellulaires (spores sans enveloppes, résidus
d’enveloppe) ont été acquises. La Figure 40a donne ainsi les valeurs moyennes de τ1 et τ2
obtenues.

5.5
a (66 ± 8)% c Images Fi de τ1
5.0
(56 ± 10)%
Temps de vie (ns)

4.5
100%
4.0 (42 ± 13)%

3.5

3.0
(28 ± 4)%

2.5

2.0
v. rne rn e v. rE
d'en exte inte s en cotEge
s idus a rtie a rtie e s san
é P P r
R Spo
τ1 or τ
3.0
b d Images Fi de τ1
2.5
(34 ± 8)%
Temps de vie (ns)

2.0
(44 ± 13)%
1.5
(58 ± 13)%

1.0 (72 ± 4)%

0.5

0.0
. ne rne v. rE
'env xter inte s en cotEge
id us d r tie e r tie san
Rés P a Pa r es τ2
Spo

Figure 40 : Comparaison des temps de vie mesurés dans différents échantillons. Temps de vie moyen τ1 ou
τ (a) and τ2 (b) , les % représentent les intensités fractionnelles correspondantes. Image en intensité
fractionelle Fi de spores sans enveloppe (c) et de résidus d’enveloppe (d). L’échelle en fausse couleur va de
0,2 à 0,8

Si on s’intéresse tout d’abord aux spores dont l’enveloppe a été retirée par traitement
chimique (« spores sans env. » sur la figure), on observe que la courbe de déclin de
fluorescence nécessite là encore une modélisation biexponentielle. L’intensité fractionnelle
moyenne mesurée, 66%, nous indique que la contribution la plus importante dans ces spores
provient de τ1 (4,4 ± 0,6 ns) (Figure 40). Au contraire, dans les résidus d’enveloppe obtenus
par germination, le temps de vie dominant est τ2 qui représente 72% du déclin total avec une
valeur moyenne de 0,7 ± 0,2 ns, proche de ce qui est mesuré dans la partie externe des spores.
Les spores cotE gerE, ont également été utilisé. Pour ces spores, il semble que le déclin de

96
 Résultats

fluorescence suit un modèle monoexponentiel, avec une valeur de temps de vie de 3,9 ± 0,2 ns
proche de la valeur de τ1 mesurée dans la partie interne des spores entières. Ainsi, pour ces
spores, il n’y a pas de temps de vie court aux alentours de 1 ns.
En considérant toutes ces données, la valeur de temps de vie court, τ2, a une contribution très
faible (34%), voire nulle (cotE gerE), dans les spores sans enveloppe et au contraire très
importante dans les résidus d’enveloppe (72%). Ceci suggère que ce temps de vie est associé
aux protéines de l’enveloppe et qu’ainsi la viscosité de 80 cP y est associée. Cette valeur ne
peut pas être imputée au cortex puisque ce τ n’est pas présent pour les spores cotEgerE qui
possèdent un cortex intact. Ces données peuvent être liées au fait que le procédé d’analyse
d’image par masque ne soit pas suffisamment précis. De plus, le fait que le traitement
chimique pour enlever l’enveloppe ne soit pas efficace à 100%, peut expliquer pourquoi
même les parties intérieures ont montré une certaine contribution de τ2.
En ce qui concerne la valeur de τ1 proche de 4 ns (3,9 à 4,4 selon l’échantillon), elle semble
pouvoir être attribuée à la membrane interne puisqu’il s’agit de la principale structure
hydrophobe qui reste dans les spores sans enveloppe. Ces valeurs correspondent à des
viscosités allant de 990 à 1220 cP. Enfin, la valeur de τ1 proche de 3 ns (3,3 -3,4 ns) peut être
associée à la membrane externe, ce temps de vie étant absent des spores sans enveloppe et
présent dans les zones périphériques des spores sauvages. Dans ce cas, cette membrane
possède une viscosité plus faible que la membrane interne d’environ 725 cP.

1.2.3.3. Viscosité de cellules végétatives et comparaison avec les spores entières

Le rotor moléculaire a également été utilisé dans les cellules végétatives afin de
mesurer une viscosité de la membrane plasmique et de la comparer à celle mesurée dans les
spores. Les cellules végétatives de B. subtilis ne possèdent qu’une seule membrane puisqu’il
s’agit d’une bactérie Gram-positive recouverte par une couche de peptidoglycane, c'est-à-dire
la paroi cellulaire. Au contraire des spores entières, la courbe de décroissance de la
fluorescence du Bodipy-C12 dans les cellules végétatives peut être modélisée par une courbe
monoexponentielle. La Figure 41 présente ainsi les images de τ obtenues pour les cellules
végétatives (a) en comparaison avec l’image τ1 obtenue pour des spores entières (b).

97
 Résultats

a Image τ b Image τ1

Figure 41 : Image FLIM de cellules végétatives et de spores sauvages. (a) Image du temps de vie du rotor
dans les cellules végétatives. Echelle en fausse couleur : 2,2 à 3,2 ns. (b) Image du temps de vie long (τ1) du
rotor dans des spores sauvages. Echelle de couleur : 2,5 à 5 ns.

L’échelle en fausse couleur est différente selon les échantillons allant de 2,2 à 3,2 ns pour les
cellules végétatives et de 2,2 à 5,1 ns pour les spores. Ceci montre déjà que les valeurs de τ
pour les cellules végétatives sont moins étendues et plus faibles que pour les spores. En effet,
le Bodipy-C12 possède en moyenne un temps de vie de 2,7 ± 0,2 ns dans les cellules
végétatives, ce qui correspond à une viscosité d’environ 500 cP.
Ainsi de manière similaire à ce qui a été mesuré avec l’anisotropie du DPH, les cellules
végétatives présentent une viscosité membranaire plus faible que les spores et notamment que
la membrane interne. De plus, il semble même que la membrane externe des spores soit plus
visqueuse que celle des cellules végétatives (725 cP contre 500 cP).

98
 Résultats

Cette première partie nous a permis de mettre en évidence des particularités spécifiques
aux spores bactériennes. Ainsi, ces spores possèdent des consituants internes qui leur
sont propres (comme le DPA) et qui permet de les différencier de cellules végétatives.
Nous avons pu mettre en évidence une forte rigidité et une faible mobilité des structures
de la spore à l’aide de méthodes d’investigation globales comme la RMN ou la
spectrofluorimétrie. Ainsi des spores sauvages présentent une mesure de fluidité
membranaire environ 1,3 fois plus élevée que des cellules végétatives. L’utilisation de
spores sans enveloppe montre cependant que le signal obtenu peut également provenir
de structures externes. L’utilisation de sondes fluorescentes afin de marquer les spores
après production a validé la faible perméabilité des structures sporales, celles-ci
pénétrant moins profondément que si elles sont additionnées en cours de sporulation.
Ces méthodes n’ont cependant pas permis de distinguer quelles étaient les structures qui
intervenaient dans ces caractéristiques de faible perméabilité et fluidité. L’ajout d’un
rotor moléculaire en cours de sporulation, nous a permis de mettre en évidence une forte
viscosité des structures de la spore. L’utilisation de spores modifiées nous a permis
d’identifier la membrane interne comme étant la structure majoritaire qui intervient
dans la rigidité des spores. Celle-ci possède ainsi une viscosité d’environ 2,3 fois plus
élevée que celle d’une cellule végétative classique. La Figure 42 reprend ainsi les valeurs
de viscosité mesurées dans les différentes structures de la spore et les cellules végétatives.

Forme
bactérienne
Spores entières Spores sans enveloppe Partie périphérique des Cellules végétatives
spores

4.4 ns (chimiques) ou
τ ou τ1 et τ2 (ns) 4.2 et 1.1 3.3 et 0.9 2.7
3. 9 ns (mutantes)

Viscosité (cP) 1140 et 93 1140 725 et 64 500

Figure 42 : Résumé des valeurs de τ et de viscosités obtenues dans les différents types cellulaires (rouge :
enveloppe et jaune : membrane).

Dans l’idée de relier les spécificités de la spore à sa résistance, différents paramètres

environnementaux (nutriments, température,…) vont être modifiés. Ces perturbations
permettront de visualiser comment évoluent les structures de la spore.

99
 Résultats

2. Modification de la perméabilité de la spore et de la

fluidité de ses membranes

Objectif de l’étude

L’étude précédente a permis la mise en place de méthodes d’analyses et d’identifier plus ou

moins les structures impliquées dans l’état de compaction extrême de la spore bactérienne :
notamment le cortex et la membrane interne. Il s’agit dans ce travail de voir si ces méthodes
permettent de suivre et d’identifier la nature des modifications que peuvent subir ces
structures. Pour cela, différents paramètres seront étudiés. Dans un premier temps, la
germination sera utilisée comme modification dite « naturelle ». Par la suite, l’effet de la
température sera étudié ainsi qu’un procédé d’inactivation des spores identifié par l’étude
bibliographique pour modifier les barrières de perméabilité : l’éthanol (couplé à la
température).

2.1. Modification « naturelle » des structures : la germination

La spectroscopie infrarouge est utilisée dans un premier temps pour visualiser quelles
structures sont modifiées au cours de ce processus et de quelle manière.

2.1.1. Libération de l’acide dipicolinique

Le DPA est un constituant de la spore présent en grande quantité dans le protoplaste.

L’utilisation du FTIR permet de visualiser l’évolution des vibrations caractéristiques de ce
composé lors d’une germination. Pour réaliser ces spectres, les spores sont germées dans une
étuve à 37 °C, lavées, puis une goutte de spores germées est déposée sur le cristal du FTIR et
séchée. La Figure 43 montre un exemple des spectres obtenus au cours des 55 premières
minutes de la germination.

100
 Résultats

témoin
5 min
10 min
1.0
20 min
35 min
Absorbance normalisée (u.a) 0.8 55 min

0.6

0.4

0.2

0.0

1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure 43 : Suivi en spectroscopie IR de la libération du DPA au cours de la germination de spores de

Bacillus subtilis en milieu nutritif. La flèche indique le pic d’absorbance caractéristique du DPA.

D’un point de vue qualitatif, les fréquences de vibrations caractéristiques du DPA (~ 1279 cm-
1
, épaulement à ~ 1570 cm-1 non présenté sur cette figure) disparaissent rapidement au cours
de la germination, notamment au cours des cinq premières minutes. Cette sortie du DPA
signifie que suite à l’activation des récepteurs de germination, une modification des structures
a lieu, permettant entre autre une libération d’un constituant présent dans le noyau des spores.
Il est connu que le DPA est libéré au cours de la germination via l’ouverture de canaux
spécifiques localisés dans la membrane interne, et que cela se produit très tôt au cours de la
germination (Vepachedu and Setlow, 2005; Yi and Setlow, 2010)

2.1.2. Modification de la membrane interne et de l’enveloppe

2.1.2.1. Spectres infrarouges

La Figure 34 permet d’observer les différences dans la région lipidique des spectres
infrarouge de spores et de cellules végétatives. Ces dernières présentent un pic aux alentours
de 2920 cm-1, faiblement présent chez les spores. L’évolution de ces vibrations au cours de la
germination a été suivie par spectroscopie infrarouge, un exemple en est donnée Figure 44.

101
 Résultats

spores
5 min
1.0
a 10 min
20 min
35 min

Absorbance normalisée (u.a)

0.8 55 min

0.6

0.4

0.2

0.0

3020 3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 2800
-1
Nombre d'onde (cm )

b spores
1.3
c
5 min
0.0010
10 min 1.2
0.0008 20 min 1.1
35 min
0.0006
55 min 1.0
0.0004 0.9 Essai1
Absorbance (u.a)

0.8 essai2
I2933/I2920
0.0002
essai3
0.7 moyenne spores
0.0000
0.6 moyenne veg.
-0.0002
0.5
-0.0004 0.4
-0.0006 0.3
-0.0008 0.2
-0.0010
0.1
0.0
3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 0 10 20 30 40 50
-1
Nombre d'onde (cm ) temps (min)

Figure 44 : Evolution des spectres infrarouges dans la région 3000-2700cm-1 de spores de Bacillus subtilis
au cours de la germination. (a) Evolution du spectre au cours du temps de germination. Pour une
meilleure visualisation, la ligne de base est corrigée. Les flèches indiquent les variations observées.
(b) Evolution du spectre dérivée seconde au cours de la germination (c). Evolution du rapport d’intensité
(2933 / 2920 cm-1) en fonction du temps de germination pour plusieurs essais réalisés. Les courbes rouges
et noires représentent les rapports moyens obtenus pour les cellules végétatives et les spores
respectivement.

Une modification de la fluidité membranaire entraine un déplacement des positions de

vibrations d’élongation des CH2 asymétrique (~2920 cm-1) ou symétrique (2850 cm-1)
(Wolkers and Hoekstra, 1995; Laroche et al., 2005; Fang et al., 2007).
Sur le spectre des lipides (Figure 44a), un déplacement est visible (indiqué par une flèche)
seulement pour la vibration proche de 2930 cm-1, qui pourrait correspondre à une
modification de la fluidité membranaire au cours de la germination. Cependant, cette variation
n’est pas visible pour la fréquence de 2850 cm-1. Par contre, l’intensité de cette dernière
semble augmenter avec la germination. Le spectre dérivé seconde a donc ensuite été analysé
(Figure 44b).

Cette figure nous permet de constater que la position du pic aux alentours de 2920 cm-1, qui
n’est que peu présent chez les spores, n’est pas réellement modifié. Cependant, l’intensité de

102
 Résultats

ce pic (mais également celui à 2850 cm-1), augmente au cours de la germination (Figure 44b).
Le décalage observé sur le spectre premier semble ainsi être lié à l’augmentation de l’intensité
du pic à 2920 cm-1. Pour faire un suivi plus précis, la modification du rapport de l’intensité du
pic à 2933 cm-1 sur le pic à 2920 cm-1 a été évaluée (Figure 44c). Ceci permet de traduire
l’augmentation de la vibration du pic à 2920 cm-1 au cours de la germination (diminution du
rapport). Ainsi, on constate que dès les 10 – 15 premières minutes le rapport n’évolue
quasiment plus. On peut supposer que la germination conduit à une modification des
membranes soit en termes de « démasquage » des vibrations (augmentation de l’intensité),
soit en termes de modification structurale. Cependant, ce rapport n’a pas de réelle
signification et ne permet pas d’identifier réellement les modifications subies par ces
structures.
Les vibrations caractéristiques des membranes ne sont pas les seules à évoluer au cours de la
germination. La Figure 45 présente ainsi l’évolution du pic Amide I au cours de la
germination.

spores
5 min
10 min
0.002
20 min
35 min
0.001
55 min
1652.9
1652.7
1652.5
1652.1

0.000
Abosrbance (u.a)

-0.001

-0.002

-0.003
1653.7

-0.004
1656.1

-0.005

1700 1680 1660 1640 1620 1600

Nombre d'onde (cm-1)

Figure 45 : Evolution de la dérivée seconde du spectre Amide I obtenue en spectroscopie IR de spores de

Bacillus subtilis en fonction du temps de germination. Les valeurs indiquent les fréquences de vibrations
de la liaison Amide I.

On peut constater qu’en fonction du temps, la position du pic varie de 1655 cm-1 pour
atteindre une valeur d’environ 1652,0 cm-1, proche de la valeur obtenue en moyenne dans les
cellules végétatives (1651,4 cm-1). Ce shift apparait très tôt dans la germination (~ 5min), et
signifie que les caractéristiques des protéines de la spore germée sont rapidement modifiées et
se rapprochent de celles de cellules végétatives. Une étude réalisé en infrarouge a également

103
 Résultats

montré des modifications des protéines immédiatement après l’initiation de la germination ;

les auteurs ont ainsi quantifié une hydrolyse de 26 % des protéines (diminution de l’intensité
sur le spectre non dérivé) dans les premières 15 minutes de la germination (Cheung et al.,
1999). Ceci concorde avec la dégradation de protéines spécifiques de la spore (notamment des
SASP) dans les premières minutes de la germination (Johnson and Tipper, 1981; Mason and
Setlow, 1986).

2.1.2.2. Modification de la viscosité des structures

Observation de spores germées

Le FLIM a permis d’attribuer une valeur de viscosité aux structures sporales et
notamment à la membrane interne des spores. L’effet de la germination sur ces structures a
donc été étudié par cette méthode afin de visualiser et quantifier les modifications de
viscosités au cours de ce processus. Les résultats sont ainsi présentés Figure 46. La
germination a été réalisée à 37 °C avec de la L-alanine dans une étuve. Les spores ont ensuite
été lavées et observées en microscopie FLIM à température ambiante. L’évolution de la
viscosité a été réalisée à la fois sur des spores mutantes cotE gerE, après 1 h, mais également
sur des spores sauvages après 45 min. Dans les deux cas, les spores sont à l’étape II de la
germination (cf Figure 7), ce qui signifie que le cortex a été dégradé et que l’enveloppe
commence à s’ouvrir (Setlow, 2003). Pour les spores sauvages, deux temps de vie sont encore
présents après germination : τ1 = 3,0 ± 0,4 ns (41%) and τ2 = 0,9 ± 0,2 ns (59%). On observe
ainsi qu’en moyenne la valeur de temps de vie associée à l’enveloppe (τ2) n’est pas modifiée
par la germination. Au contraire, τ1 qui était associé aux membranes (~ 4,2 ns) atteint une
valeur plus faible (~ 3 ns) (Figure 46) correspondant à une valeur de viscosité de 610 cP.

Pour les spores mutantes, on peut également constater une diminution du temps de vie après
la germination, qui passe de 3,9 ± 0,2 ns à 2,9 ± 0,1 ns, ce qui correspond à une diminution de
la viscosité de 990 à 570 cP. Ces deux valeurs de temps de vie obtenues après la germination
pour les spores sauvages et les spores mutantes sont proches de ce qui est mesuré dans la
membrane des cellules végétatives (Figure 41).

104
 Résultats

a b c d

Image τ1 Image τ1 image τ Image τ

e 5.0
(50 ± 10) %

4.5

100 %
4.0

3.5 (41 ± 9) %

100 %
3.0

2.5

2.0
) ées ées
ières germ tE g
erE
germ
es (ent ges s co erE
vag uva o re tE g
au es s
a sp o
es s es c
spor spor spor

τ ou τ1

Figure 46 : Modification des temps de vie après germination pour des spores de Bacillus subtilis sauvages
et sans enveloppe. Images en temps de vie de spores sauvage avant (a) et après 45 min de germination (b)
et de spores cotE gerE avant (c) et après 1h de germination (c). Echelle en fausse couleur : 2,5 à 5 ns. La
barre d’échelle correspond à 1 µm. (e) Valeurs de temps de vie mesurées avant et après germination pour
des spores sauvages (τ1) et cotE gerE (τ). Les % représentent les intensités fractionnelles correspondantes.

Suivi de la germination en cellules de visualisation

Grâce à une cellule de visualisation, des essais de suivi de germination ont également
été réalisés pour des spores sauvages sous microscope à 37 °C. L’évolution des temps de vie
au cours de la germination de spores sauvages est ainsi présenté Figure 47.

105
 Résultats

a
Image τ1 0 – 3 τ1 6 – 9 min Image τ1 12 – 15 Image τ1 33 – 38
min min min

τ1 22 – 25 min

b τ2 τ1
1.0 0 - 3 min
6 - 9min
Intensité normaisée (u.a)

22 - 25 min

0.5

0.0

0 1 2 3 4 5 6
Temps de vie (ns)

Figure 47 : Evolution des temps de vie au cours de la germination de spores sauvages. (a) Images en temps
de vie (τ1). Echelle en fausse couleur: 2,5 à 5 ns. (b) Histogramme de la répartition des temps de vie τ1 et τ2.

L’évolution de la viscosité des membranes (τ1) n’apparait pas identique d’une spore à une
autre. Chaque spore ne germe pas forcément de manière identique, il existe même des spores
qui ont été identifiées comme « superdormantes » (Ghosh and Setlow, 2010). Ainsi on
observe que certaines spores restent à un temps de vie plus élevé (couleur jaune – orange
Figure 47) plus longtemps. De plus, si on s’intéresse aux histogrammes de temps de vie
(Figure 47b), il est visible que τ2, qui correspond à l’enveloppe, n’est que peu affecté par la
germination (une légère diminution de la valeur est cependant observée). Le suivi au cours du
temps, nous permet de constater que dès 4 - 6 min, le temps de vie de la sonde insérée dans la
membrane interne (τ1) diminue pour atteindre une valeur stable dès 9 à 12 min, proche de 3
ns. Ce temps est proche de ce qui est observé par spectroscopie infrarouge. Ainsi, au cours de
la germination, la membrane interne acquiert la même fluidité que la membrane d’une cellule
végétative et ceci semble se dérouler assez rapidement au cours de la germination.

106
 Résultats

2.2. Effet de la température sur les structures de la spore

2.2.1. Modification de la fluidité membranaire et autres structures

hydrophobes d’une population de spores

La sonde DPH a été insérée dans des spores de B. subtilis afin d’obtenir, via son
anisotropie de fluorescence, des informations sur les membranes de la spore et notamment sa
membrane interne. Pour étudier une éventuelle modification des membranes des spores sous
différentes contraintes, les spores marquées par le DPH ont été soumises à des rampes de
température. Des spores sauvages et des spores mutantes sans enveloppe (cotE gerE) ont été
utilisées. La Figure 48a présente l’évolution de l’anisotropie du DPH à l’intérieur de spores
soumises à une rampe de température allant de 30 à 80 °C.

140 Courbe moyenne température 85 160 a a

Anisotropie (% anisotropie initiale)

80 128.16 %
140 125.70 %
75
130
70 120
Température (°C)
% anisotropie initiale

65 100
120 60 avant une rampe de
80 T°
55
110 50 60 après rampe de
45 T°(retour à 30°C)
40
40
100 20
35
30 0
90 25 Spores sauvages Spores cotE gerE
0 500 1000 1500 2000 2500
Temps (s)

Figure 48 : Evolution de l’anisotropie du DPH inséré dans des spores de Bacillus subtilis soumises à une
rampe de température (a) Courbe moyennée de l’évolution de l’anisotropie du DPH (en % anisotropie
initiale) inséré dans des spores sauvages en fonction du temps et de la température (n = 6). (b)
Anisotropies moyennes du DPH (exprimées en % d’anisotropie initiale) mesurées avant et après une
rampe de température pour des spores sauvages et cotE gerE. a : différences non significatives au seuil α
de 5 %.

Initialement, on peut observer une variabilité importante des valeurs d’anisotropie mesurées
dans les spores bactériennes. Cela peut être relié à des différences dans les lots de spores
produites ou aux différentes structures des spores qui sont réellement marquées. Les résultats
d’anisotropie mesurée après la rampe sont ainsi exprimés en pourcentage de l’anisotropie
initiale. De manière étonnante, la valeur d’anisotropie du DPH mesurée dans les spores
augmente avec la température. Quelle que soit la valeur d’anisotropie initiale, cette valeur
augmente à partir d’une température proche de 55 °C jusqu’à atteindre un plateau vers 75 °C

107
 Résultats

(Figure 48a). Cette augmentation de la valeur d’anisotropie semble indiquer une augmentation
de la rigidité des structures marquées par le DPH, pouvant résulter d’une densification du
milieu. Le retour à 30 °C via une rampe de température ne modifie pas la valeur d’anisotropie
obtenue qui reste proche de celle mesurée à 75 °C. Ce comportement du DPH mesuré dans
des spores sauvages est également observé pour des spores mutantes sans enveloppes (cotE
gerE). La Figure 48b présente ainsi le pourcentage moyen d’augmentation de l’anisotropie
mesurée avant une rampe de température et après retour à 30 °C. Ainsi, quelle que soit la
souche, la rampe de température entraine une augmentation d’environ 26 % à 28% de la
valeur de l’anisotropie initiale. On passe d’une valeur moyenne d’anisotropie de 0,22 ± 0,028
à 0,28 ± 0,026 et de 0,23 ± 0,016 à 0,29 ± 0,012 pour les spores sauvages et mutantes
respectivement. De plus, l’effet d’un choc (70 °C / 30 minutes par exemple) sur des spores
marquées au DPH entraine un comportement similaire, c'est-à-dire une augmentation de la
valeur d’anisotropie. Dans des membranes « modèles », une augmentation de la température
s’accompagne d’une augmentation de la fluidité et donc d’une diminution de l’anisotropie du
DPH localisé dans ces membranes (Laroche et al., 2001; Laroche et al., 2005; Najjar et al.,
2007). Cette augmentation de l’anisotropie dans notre cas peut s’expliquer par une
délocalisation de la sonde dans une partie moins fluide (comme la membrane interne) plutôt
que par une augmentation irréversible de rigidité des structures marquées. La délocalisation
de la sonde dans des structures plus rigides peut être liée à la fois à une augmentation de la
vitesse d’insertion par la température mais aussi par une perméabilisation des structures
externes suite à modification d’état de ces structures (enveloppe et/ ou cortex). Ce résultat
montre une similitude avec ce qui a été observé en RMN lors de l’identification des pics
(Figure 32). L’utilisation de spores mutantes sans enveloppe montre que l’enveloppe ne
semble pas être la structure touchée, il s’agirait donc plutôt du cortex. On peut ainsi suggérer
que la valeur d’anisotropie obtenue après une rampe de température intègre beaucoup plus à
une mesure de la fluidité de la membrane interne. Il est important de noter qu’une fois
relocalisée ce signal bouge peu avec la température.

2.2.2. Modélisation de l’état de rigidité de la membrane interne

L’étude bibliographique a montré que la membrane interne des spores diffère peu en
composition d’une membrane de cellule végétative. Si on considère la valeur d’anisotropie
obtenue après la rampe comme celle du DPH inséré dans la membrane interne des spores
(0,28), cette valeur est bien plus importante que celle mesurée dans la membrane de cellules

108
 Résultats

végétatives (0,18, Figure 36). Afin d’étudier le comportement du DPH inséré dans des
cellules végétatives en fonction de la température, celles-ci ont également été soumises à une
rampe de température (Figure 49).

0.34 Spores après une rampe

Cellules végétatives
0.32
0.30
0.28
0.26
Anisotropie

0.24
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Température (°C)

Figure 49 : Evolution de l’anisotropie du DPH inséré dans des cellules végétatives de Bacillus subtilis en
fonction de la température (n= 5).

On observe ainsi logiquement que l’anisotropie du DPH, dans ce cas, diminue avec
l’augmentation de température. La valeur moyenne d’anisotropie mesurée dans des spores
après une rampe de température est représentée par une ligne noire. On constate que pour
s’approcher de cette valeur, les cellules végétatives doivent être amenées à une température
inférieure à 5 °C. Ainsi, elles atteignent à 5 °C une valeur moyenne d’anisotropie de 0,27 ±
0,02. Cette valeur de température traduit le haut degré de rigidité de la membrane interne des
spores.

2.2.3. Mesures individuelles de l’évolution de la viscosité de la membrane

interne des spores en fonction de la température

Des expériences préliminaires ont été réalisées afin de mesurer l’évolution de la

viscosité de la membrane interne des spores à l’aide de la sonde Bodipy-C12 et de l’analyse
FLIM en fonction de la température. Ces résultats ont été suivis à l’aide d’une chambre de
visualisation permettant une régulation de la température. La Figure 50 présente ainsi les
valeurs obtenues pour les spores sauvages.

109
 Résultats

a b Témoin
5.0 65 °C
τ2 τ1 70 °C
1.0
4.5

Intensité normalisée (u.a)

Temps de vie (ns)

4.0

0.5
3.5

3.0

2.5 0.0

2.0
temoin 35 °C 45 °C 65 °C 70 °C 0 1 2 3 4 5 6
τ1 Température de consigne (°C) Temps de vie (ns)

c
Témoin 65 °C 70 °C

Figure 50 : Evolution des temps de vie de spores sauvages en fonction de la température. (a) Valeurs
moyennes de τ1 mesurée dans la partie interne de spores sauvages. (b) Histogramme de la répartition des
temps de vie. (c) Images en temps de vie (τ1) de fluorescence. Echelle en fausse couleur : 2,5 à 5 ns.

Ces résultats montrent qu’une température de consigne de 70 °C permet de modifier la valeur

moyenne de viscosité de la membrane interne, celle-ci passant d’une valeur d’environ
1000 cP à température ambiante à 850 cP. Le retour à température ambiante s’accompagne
d’une réaugmentation de la viscosité (900 cP), cependant plus faible que la valeur initiale.
Cette température de 70 °C est très élevée et se rapproche là encore de la température
d’activation de la germination. Pour des températures plus faibles, aucune différence
significative n’est observée avec le témoin. A cette température critique, on peut supposer
qu’une des structures évolue, probablement le cortex, puisque peu de variations sont
observées au niveau de l’enveloppe (Figure 50b). Ceci permet peut être une modification de la
fluidité de la membrane interne.

110
 Résultats

2.3. Effet couplé de l’éthanol et de la température

2.3.1. Impact de l’éthanol sur l’inactivation des spores

2.3.1.1. Traitement à l’éthanol 70% pendant 2 h à 65 °C

L’étude bibliographique nous a permis d’identifier l’éthanol couplé à la température

comme un traitement possible permettant la modification des barrières de perméabilité des
spores bactériennes avec une modification apparente minime de la structure. Dans un premier
temps, les spores ont ainsi été soumises à un traitement éthanol à 70% pendant 2 h à 65 °C.
Lorsque les spores sauvages sont traitées à l’éthanol, leur densité est modifiée ce qui les rend
plus difficile à centrifuger et donc à récupérer. Au contraire, les spores sans enveloppe
semblent être moins touchées par ce phénomène, ceci étant peut être relié à une différence
dans leur hydrophobicité de surface et/ou à la modification de la densité de leur protoplaste.
La Figure 51 présente ainsi les résultats de viabilité (UFC) et de marquage à l’IP obtenus pour
des spores sauvages et sans enveloppe (cotE gerE).

100 95.6 98.0 93.5 93.6 96.8

92.4
90
80
% de spores inactivées (lav.)
UFC
70
60 % de spores inactivées (sans lav.)
50
%

% de spores non traitées marquées

40
IP

à l'IP
30 % de spores marquées à l'IP
20
10 5.4
1.7
0
spores sauvages cotE gerE

Figure 51 : Impact d’un traitement éthanol 70% à 65 °C pendant 2h sur l’inactivation (en %) et le
marquage à l’IP (en %) de spores sauvages et de spores sans enveloppe (cotE gerE) de Bacillus subtilis.
lav. : lavages, sans lav. : sans lavage.

Le traitement éthanol s’accompagne en moyenne de 1,7 log de destruction pour les spores
sauvages (~ 98% d’inactivation) et de 1,2 (~ 96.3 % d’inactivation) pour les spores sans
enveloppe. Ceci est cohérent avec les 1,7 log de destruction déjà observé dans la bibliographie

111
 Résultats

(Setlow et al., 2002). Aucune différence significative n’est observée entre l’inactivation (en
%) mesurée avec ou sans lavage et entre les deux souches de B. subtilis, bien que la souche
cotE gerE montre une tendance à être plus résistante. La présence ou non de l’enveloppe ne
semble pas protéger les spores de ce traitement puisqu’aucune différence significative n’a été
observée. Ceci a déjà observé pour des spores dont l’enveloppe a été retiré chimiquement
(Setlow et al., 2002).
L’IP est un marqueur d’ADN connu pour ne marquer que les cellules dont les membranes
lipidiques ont perdu leur intégrité. Le traitement à l’éthanol entraine bien une modification de
l’intégrité de la structure sporale puisque l’IP pénètre au cœur des spores et marque l’ADN de
ces dernières. Ainsi, l’inactivation semble corrélée à une perméabilisation, celle-ci étant
observée à la fois pour les spores mutantes et pour les spores sauvages.

2.3.1.2. Autres barèmes de traitement

D’autres barèmes de traitement ont été étudiés dans le but d’identifier les structures
modifiées par l’éthanol : 30, 50 ou 70% d’éthanol pendant 1 h à 70 °C. La Figure 52 présente
ainsi les résultats de marquage et de viabilité obtenus.

Spores sauvages Spores cotE gerE

120
120
100
100

80 80 % de spores inactivées (lav.)

UFC
60 60 % de spores inactivées (sans lav.)

40 40 % de spores non traitées marquées

IP
à l'IP
20 % de spores marquées à l'IP
20

0 0
30% 50% 70% 30% 50% 70%

Figure 52 : Effet de traitemens ethanol 30, 50 ou 70 % à 70°C pendant 1 h sur l’inactivation (en %) et le
marquage à l’IP (en %) de spores de Bacillus subtilis sauvages ou mutantes (cotE gerE). (a) Traitement à
30 % (b) Traitement à 50 % (c) Traitement à 70%. lav. : lavages, sans lav. : sans lavage.

On observe une tendance pour laquelle les spores cotE gerE sont plus résistantes que les
spores sauvages, quel que soit le barème utilisé. Pour le barème à 50 %, il semble que le
lavage entraine une sous estimation du nombre de spores inactivées pour les spores cotE gerE.
Le barème à 30% correspond à environ 0,4 log de destruction (~59% d’inactivation) pour les
spores sauvages comparé à 0,2 log (~39% d’inactivation) pour les spores mutantes. Les
traitements 50 et 70% s’accompagnent de 1,2 (~ 93,3 %) contre 0,8 (~ 85 %) et 2,8 (~ 99.9 %)

112
 Résultats

contre 2,1 (99.3 %) log de destruction pour les spores sauvages et mutantes respectivement.
Pour ces traitements, on observe également une bonne corrélation entre le marquage à l’IP et
l’inactivation
activation des spores, notamment pour les spores mutantes. Ainsi les spores inactivées
correspondent aux spores perméabilisées. Cette corrélation est moins nette pour les spores
sauvages traitées à l’éthanol 30%. Il est possible qu’une partie des spores mortes
mo n’ait pas été
perméabilisées. La variabilité observée dans les valeurs d’inactivation peut également
expliquer ces différences. Il est à noter que le pourcentage de spores marquées à l’IP n’évolue
pas si celles-ci
ci sont marquées le lendemain ou surlendemain après le traitement. La
perméabilisation créée par l’éthanol n’est ainsi pas réversible.

2.3.1.3. Etude de la perméabilisation

La Figure 53 illustre la perméabilisation de spores sauvages et mutantes après un

traitement à l’éthanol 50% ou 70% pendant 1 h à 70 °C.

Figure 53 : Observation en microscopie confocale de spores de Bacillus subtilis après traitement à

l’éthanol 50% (a, b, e, f) ou 70% (c, d, g, h) pendant 1 h à 70 °C. (a,c,e,f) Images en fluorescence
flu obtenues
en microscopie confocale de spores sauvages (a,c) et cotE gerE (e,g) marquées au Bodipy-C
Bodip 12 . Images en
fluorescence obtenues en microscopie confocale de spores sauvages (b,d) et cotE otE gerE (f,g) marquées à
l’IP.

Less spores traitées à l’éthanol sont effectivement altérées puisque l’IP peut pénétrer jusque
dans le protoplaste (Figure 53b,
53 d, f et h). La sonde hydrophobe Bodipy--C12 qui ne pouvait
pas pénétrer profondément dans des spores marquées après sporulation, semble pénétrer
pénétr après
traitement dans des structures plus profondes. Cependant, des différences sont observées selon

113
 Résultats

les traitements et selon la souche. En ce qui concerne la souche sauvage, le traitement à 50 %

70 °C 1h permet de marquer une structure interne, la plupart des spores étant marquées
(Figure 53a). Le traitement à 30% donne des résultats similaires, bien que moins de spores
soient marquées. Le traitement 70% donne des résultats assez différents. En effet, les spores
observées sont la plupart du temps marquées seulement en périphérie (Figure 53c), de
manière similaire à des spores non traitées. On peut supposer que la membrane interne est
trop altérée pour que la sonde puisse s’y fixer, les spores étant pourtant perméabilisées comme
le montre la Figure 53d. Des résultats similaires sont obtenus lorsque les spores sauvages sont
traitées à 70 % 65 °C pendant 2h.
Pour les spores mutantes, les résultats sont assez différents. En effet, de la même manière
pour le traitement à 50% (Figure 53e), les spores présentent une fluorescence, ce qui n’était
pas le cas pour des spores non traitées. Ce type de marquage est également observé pour les
spores traitées à 70% (Figure 53g) ou 70% à 65 °C pendant 2 h. Ce résultat peut signifier que
pour ces traitements la membrane interne des spores mutantes est moins altérée ce qui
concorderait avec leur résistance plus élevée par rapport aux spores sauvages.

2.3.2. Modification des structures

L’utilisation de sondes fluorescentes a permis de mettre en évidence la perméabilisation

des structures de la spore. Cependant, les mécanismes conduisant à cette perméabilisation
restent hypothétiques, d’autres méthodes ont alors été utilisées.

2.3.2.1. Analyse FTIR des spores traitées à l’éthanol

Modification des protéines

Des spores sauvages et sans enveloppe traitées à l’éthanol 70% à 65 °C pendant 2 h
ont été passées en spectroscopie infrarouge pour évaluer les modifications des différentes
structures. La Figure 54 présente l’impact du traitement sur le spectre Amide I et Amide II.

114
 Résultats

Spores sauvages
a Spores sauvages traitées à l'éthanol 70% 65°C 2h
b Spores cotE gerE
Spores cotE gerE traitées à l'éthanol 70% 65°C 2h
1.0
1.0

témoins traités temoin traités

A b so rb a n ce n o rm a lisé e (u .a )

0.8

A b so rb a n ce n o rm a lisé e (u .a )
ratio "β/α" 0.17 1.29 0.8 ratio "β/α" 0.07 0.22
0.6
0.6

0.4
0.4

0.2
0.2

0.0
0.0

1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450

1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450
-1
Nombre d'onde (cm ) -1
Nombre d'onde (cm )

Figure 54 : Impact d’un traitement éthanol 70% 65 °C 2 h sur la structure secondaire des protéines de
spores de Bacillus subtilis. (a) Spectres infrarouge obtenus pour les spores sauvages. (b) Spectres
infrarouges obtenues pour des spores cotE gerE (sans enveloppe). Le ratio β/α correspond à l’intensité
normalisée mesurée à environ 1615-1618/1655-1656 cm-1 pour les spores non traitées et à 1628/1657-1658
cm-1 pour les spores traitées.

Pour les spores sauvages, on peut constater que le traitement à l’éthanol s’accompagne d’une
modification importante de la région Amide I des protéines. Un déplacement de la position du
pic correspondant à la structure en hélice α (1655 à 1658 cm-1) est visible, et l’apparition
importante d’un pic à 1628 cm-1 correspondant à une structure en feuillet β. Le rapport β/α
indique bien une augmentation de la proportion de cette structure. Ces modifications
observées dans le spectre infrarouge sont les résultats d’un changement dans la structure
secondaire des protéines due notamment à leur dénaturation, de manière similaire à ce qui est
observé pour des spores qui ont subi un traitement à l’autoclave (Perkins et al., 2004). Au
contraire, pour les spores mutantes sans enveloppe, on observe un très léger shift dans la
position du pic correspondant à la structure en hélice α (1655 à 1655-1656 cm-1). De plus, le
pic correspondant à la structure en feuillet β ne semble pas apparaitre, ce que traduit le rapport
β/α qui reste faible comparé aux spores sauvages. Ces résultats semblent montrer que les
protéines principalement modifiées par le traitement éthanol sont les protéines de l’enveloppe.
Les autres protéines présentes dans la spore ne seraient pas ou peu modifiées, ou sont
présentes en trop faible quantité pour être détectées en infrarouge.
La modification de la structure des protéines a également été suivie par infrarouge pour les
spores sauvages traitées à 30, 50 ou 70% (1 h à 70 °C), comme le montre la Figure 55.

115
 Résultats

Spores sauvages
Spores sauvages 30% 70°C 1h
Spores sauvages 50% 70°C 1h
1.0
Spores sauvages 70% 70°C 1h
A b so rb a n ce n o rm a lisé e (u .a )

0.8

0.6 témoins 30% 50% 70%

ratio "β/α" 0.20 0.31 0.65 2.36
0.4

0.2

0.0

1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure 55 : Impact de traitements à différents pourcentage d’éthanol (30, 50, 70%) pendant 1 h à 70 °C
sur la structure secondaire des protéines de spores de Bacillus subtilis. Le ratio β/α correspond à
l’intensité normalisée mesurée à environ 1615-1618/1655-1656 cm-1 pour les spores non traitées et à
1628/1657-1658 cm-1 pour les spores traitées.

La structure secondaire protéique en feuillet β augmente avec le pourcentage d’éthanol et

devient très importante avec le traitement à 70% 70 °C 1h (supérieure au traitement à 65 °C
2 h). L’augmentation de température de 5 °C semble entrainer une dégradation plus
importante des protéines malgré un temps de traitement moins long (1 h conte 2 h). Ainsi,
l’augmentation du pourcentage en éthanol s’accompagne d’une augmentation de la
dégradation des protéines de l’enveloppe, bien que cette structure n’ait pas de rôle dans la
résistance à l’éthanol.
Cependant, la spectroscopie infrarouge ne permet pas d’observer s’il s’agit d’une réponse tout
ou rien, c'est-à-dire si quelques spores sont particulièrement touchées ou si chaque spore est
plus ou moins endommagée.

Acide dipicolinique (DPA) et hydratation

La Figure 56 présente des exemples de résultats obtenus dans la région correspondant
au pic principal du DPA, c'est-à-dire aux alentours de 1279 cm-1.

116
 Résultats

a Spores sauvages
Spores sauvages traitées à l'éthanol 70% 65°C 2h b
Spores cotE gerE
Spores cotE gerE traitées à l'éthanol 70% 65°C 2h

1.0 1.0

Absorbance normalisée (u.a)

Absorbance normalisée (u.a)

0.8 0.8

0.6 0.6

0.4 0.4

0.2 0.2

0.0 0.0

1340 1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180 1340 1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180
-1
nombre d'onde (cm ) nombre d'onde (cm )
-1

Figure 56 : Impact d’un traitement éthanol 70% à 65 °C 2 h sur la présence de DPA dans les spores de
Bacillus subtilis. (a) Spectres infrarouge obtenus pour les spores sauvages (b) Spectres infrarouge obtenus
pour les spores cotE gerE

De manière similaire à ce qui a été observé lors de la germination (cf 2.1.1), les spores
sauvages montrent une diminution importante du pic correspondant au DPA suite au
traitement éthanol. Pour les spores mutantes, on observe également une diminution de la
quantité de DPA, bien qu’il semble qu’une petite quantité soit encore présente. Cette
diminution de la quantité de DPA s’observe également par la disparition de l’épaulement à
1570 cm-1, comme observée en Figure 54. Ce résultat est en concordance avec ce qui a déjà
été observé (Setlow et al., 2002). La Figure 57 présente les résultats obtenus pour les autres
barèmes de traitement ainsi que des images correspondantes obtenues en microscopie à
contraste de phase.
Témoin 30% 1h 70 °C 50% 1h 70 °C 70% 1h 70 °C

PB PG

b 1.0
Absorbance normalisée (u.a)

0.8 1279
0.6

0.4

0.2

0.0

1340 1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180 1160 1340 1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180 1160 1340 1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180 1160 1340 1320 1300 1280 1260 1240 1220 1200 1180 1160

Nombre d’onde (cm-1)

Figure 57 : Impact de traitements à différents pourcentage d’éthanol (30, 50, 70%) pendant 1 h à 70 °C
sur la réfringence (a) et la présence de DPA (b) de spores sauvages de Bacillus subtilis. PB : phase bright.
PG : phase grey.

117
 Résultats

On observe que le traitement à 70% est celui qui entraine la plus grande perte en DPA suivi
par le traitement à 50%. Cependant, comme pour la structure secondaire des protéines, on
peut se demander si chaque spore libère plus ou moins de DPA ou s’il s’agit d’un nombre
limité de spores ayant libéré tout le DPA. Les images en contraste de phase nous donnent
quelques informations supplémentaires. On peut observer que bien que les spores ne
deviennent pas « phase dark », celles-ci perdent une partie de leur réfringence et ainsi le
nombre de spores « phase grey » augmente avec la sévérité du traitement. Cette perte de
réfringence est associée pour des spores en germination à la libération du DPA et à
l’hydratation du protoplaste (Kong et al., 2010; Kong et al., 2011).
Dans tous les cas, ces résultats suggèrent un changement important dans une des barrières de
perméabilité, probablement la membrane interne. La quantité de DPA restante dans les spores
semble corrélée à la viabilité. En effet, on constate que plus le traitement entraine
d’inactivation plus la quantité de DPA perdue est importante. Ces résultats sont concordants
avec la littérature qui suggère que la perte de DPA avec l’hydratation associée du protoplaste
serait responsable de l’inactivation des spores par ces traitements (Setlow et al., 2002).

2.3.2.2. Evolution de la viscosité

L’utilisation du FLIM sur des spores traitées à l’éthanol a été envisagée afin de
visualiser l’effet de l’éthanol sur la viscosité de la membrane interne des spores. Pour cela, les
spores ont été marquées après le traitement (et les lavages) pour que la sonde ne soit pas
altérée par celui-ci.

Spores sauvages
Les traitements à 70% d’éthanol ne sont pas présentés puisque seule l’enveloppe
semble être marquée. Comme observé en Figure 53, les spores sont marquées différemment
selon les traitements. La Figure 58 présente les résultats obtenus sur les spores sauvages
entières.

118
 Résultats

a τ1 τ2 F1
Intensité
Témoin pendant
sporulation

Temoin pendant sporulation

b Temon après sporulation
30% 1h 70 °C
3.95 ns 50% 1h 70 °C
1.0

Intensité normaisée (u.a)

30 % 1h 70°C

3.8 ns 0.5
50 % 1h 70°C

0.0
3.6 ns

0 1 2 3 4 5 6 7
Témoin après
sporulation

Temps de vie (ns)

3.4 ns

Figure 58 : Impact de traitements éthanol 30 et 50% 1 h à 70 °C sur les spores sauvages de Bacillus
subtilis. (a) Images en intensité, temps de vie τ1 (échelle 2,5 à 5 ns) et τ2 (échelle 0,2 à 2 ns) et intensité
fractionelle de τ1 (15 à 80%). La valeur en blanc correspond à la valeur utilisé pour le fit global. (b)
Histogramme de la répartition des temps de vie τ1 et τ2 selon le traitement utilisé.

La valeur de τ1 évolue avec le traitement. En effet la couleur rouge, représentant les valeurs
les plus élevées, diminue avec le traitement (Figure 58a). Les spores traitées à 50% d’éthanol
présentent les modifications les plus importantes. La Figure 58b montre également la
tendance pour laquelle la valeur de τ1 diminue avec le pourcentage d’éthanol. La proportion
du pré-pic observé sur des spores marquées au cours de la sporulation (~ 3,3 ns) augmente en
termes d’aire dans les spores traitées. Le Tableau 7 présente ainsi la proportion moyenne
obtenue en déconvoluant l’histogramme de τ1 en deux Gaussiennes.

Tableau 7 : Proportion et valeurs moyennes de τ1 pour des spores de Bacillus subtilis traitées à l’éthanol.

Témoin Témoin
τ1 30% 1 h 70 °C 50% 1 h 70°C
pendant sporulation après sporulation
pic 1 (ns) pic 2 (ns) 3,3 4,3 3,2 3,3 4,0 3,1 3,8
Proportion Proportion
16,8 83,2 100,0 24,6 75,4 40,2 50,8
(%) (%)

Pour ces résultats, seules les spores marquées sont prises en compte. La valeur moyenne de
3,3 ns obtenue pour les spores non traitées a été attribuée précédemment à la membrane
externe. Pour des spores marquées après la sporulation, pour lesquelles la sonde ne peut pas

119
 Résultats

pénétrer très profondément, la valeur obtenue est très proche puisque seule cette membrane
semble pouvoir être marquée. Les spores traitées à l’éthanol montrent des différences. La
proportion du pic 1 (membrane externe) augmente en même temps que la sévérité du
traitement : 17% pour le témoin, 25 et 40% pour les traitements à 30 et 50% d’éthanol
respectivement. Sa valeur n’est pas différente du témoin en ce qui concerne le traitement à
30% mais est significativement différente pour le traitement à 50%, bien que les valeurs
restent proches.
Le pic 2 a quant à lui été attribué à la membrane interne. Sa proportion évolue de manière
inverse par rapport au pic 1. On note une diminution avec le traitement, passant de 83 % pour
le témoin à 51% pour les spores traitées à 50% d’éthanol. Sa valeur est également modifiée
puisque la valeur passe de 4,3 ns à 4 et 3,8 ns pour les traitements à 30 et 50%
respectivement, les différences étant significatives. Ces résultats indiquent que la membrane
interne est modifiée par le traitement éthanol avec une diminution globale de sa viscosité
(augmentation de la proportion de valeurs proche de 3 ns et diminution de la valeur proche de
4 ns). Ainsi, la modification de la membrane interne semble progressive, son altération évolue
avec la sévérité du traitement. La membrane va jusqu’à perdre son intégrité de manière
drastique pour les traitements à 70% d’éthanol puisque les spores sauvages ne montrent pas
de marquage avec le Bodipy-C12 (Figure 53).

Spores sans enveloppe

En ce qui concerne les spores sans enveloppe, les résultats obtenus sont un peu différents.
L’éthanol semble également provoquer une diminution de la fluidité membranaire, de la
même manière que précédemment, comme le montre la Figure 59.

120
 Résultats

Témoin pendant 30 % 1h 50 % 1h 70 % 1h 70 % 2h
sporulation 70 °C 70 °C 70 °C 65 °C
a
Intensité
Image τ

b temoin pendant c
1.0 30 % 70 °C 1h
50% 70 °C 1h
70 % 70 °C 1h
Intensité normalisée (u.a)

0.8 70 % 65 °C 2h

traitement 1h 70 °C 2h 65 °C
0.6
% d'étanol 30 50 70 70
valeur de τ
3.15 ± 0.15 3.30 ± 0.14 3.43 ± 0.08 3.24 ± 0.31
0.4
(ns)

0.2

0.0
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Temps de vie (ns)

Figure 59 : Impact de stress éthanol 30, 50 et 70% 1 h à 70 °C et 70 % 2h à 65 °C sur les spores mutantes
de Bacillus subtilis. (a) Images en intensité et en temps de vie τ1 (échelle 2,5 à 5 ns). (b) Histogramme de la
répartition des temps de vie selon le traitement utilisé. (c) Valeurs moyennes de τ et des (FWHM/2)
correspondants selon le traitement utilisé.

En général, les spores présentant une plus faible intensité du signal sont les spores présentant
une plus forte rigidité. On peut ainsi supposer que ce sont des spores qui sont moins touchées.
Contrairement, aux spores sauvages, la fluidification des membranes ne semblent pas se faire
de manière progressive, lorsque les spores sont touchées par l’éthanol, on mesure une valeur
de τ proche de 3,2-3,3 ns (Figure 59c). Cette valeur est proche du pic 1 qui augmente pour les
spores sauvages. De manière étonnante, il semble même que pour le traitement 1 h à 70 °C,
plus le pourcentage d’éthanol augmente plus la valeur de τ est élevée. Ceci correspond à une
rigidification de la membrane par l’éthanol qui peut, peut-être, être reliée aux dénaturations
protéiques membranaires.
Etonnamment, la présence de l’enveloppe (et de la membrane externe) semble atténuer la
fluidification de la membrane interne mais ne protège pas de l’inactivation et de la
perméabilisation.

121
 Résultats

La mise en place préalable d’outils de caractérisation des structures de la spore nous a

permis d’analyser l’évolution des couches de la spore sous différentes conditions
environnementales. Ainsi, la germination des spores permet de diminuer la viscosité de
la membrane interne (division par ~ 1,9 ) et de retourner à la fluidité d’une membrane
classique. De même, les propriétés vibrationnelles des structures par rapport aux
infrarouges (FTIR) s’approchent des propriétés d’une cellule végétative. Les
modifications provoquées par la température ont également été étudiées. Une
température (entre 60 et 70 °C), proche de la température d’activation de la
germination, modifie également la mobilité des structures. Celle-ci provoque une
« ouverture » d’au moins une des couches de la spore, probablement le cortex,
améliorant l’accessibilité de composés fluorescents comme le DPH. Cette plage de
température permet également d’observer une légère reprise de mobilité de la
membrane interne, confirmant son état rigide et très ordonné. Cet état peut par contre
être modifié de manière beaucoup plus importante par un traitement combinant à la fois
température et éthanol à un pourcentage élevé. Une diminution de la viscosité de la
membrane interne est ainsi observée accompagnée d’une augmentation de la
perméabilité (entrée de sondes fluorescentes et libération du DPA). L’éthanol a
également un effet important sur les protéines de l’enveloppe, une dénaturation
progressive de celles-ci apparait graduellement avec le pourcentage d’éthanol.
Cependant, cette couche ne semble pas avoir de rôle dans l’inactivation qui accompagne
les modifications structurales de la spore.

122
DISCUSSION GENERALE

123
124
DISCUSSION GENERALE

Les spores bactériennes sont des formes de résistance extrême pouvant être
responsables d’intoxications alimentaires ou de dégradation de la qualité des aliments. Les
particularités de la spore, et notamment sa composition et sa compartimentation, sont à
l’origine de son extrême résistance. Néanmoins, il subsiste encore des questions quant au rôle
et à l’organisation des différentes structures. Nous avons mis en place différentes méthodes
d’analyses afin d’étudier les propriétés de la spore, notamment l’utilisation d’un rotor
moléculaire couplée à l’imagerie en temps de vie. L’importante valeur de viscosité mesurée
pour la membrane interne soulève ainsi la question de l’état de cette membrane. En effet, ses
propriétés particulières sont encore peu comprises au regard de sa composition. La présence
de l’épais cortex et de sa résistance mécanique soulève également des questions quant à
l’interaction de ces deux structures notamment lorsque la température vient perturber cet
équilibre. L’utilisation d’éthanol est, semble-il, nécessaire pour perméabiliser les structures
sporales sans les détruire complètement. La question sous-jacente est de comprendre son
mode d’action.

Étude des propriétés de la membrane interne des spores bactériennes

Viscosité de la membrane de cellules végétatives

La viscosité des membranes a été estimée par l’utilisation de sondes fluorescentes
comme le DPH (dont l'anisotropie reflète leur mouvement de rotation dans la membrane), par
l’utilisation de rotors moléculaires ou encore par d'autres méthodes comme la résonance
paramagnétique électronique (RPE) (Shechter, 1990; Demchenko et al., 2009). Cette viscosité
correspond à la liberté relative de mouvement pour ses composants, en particulier les
phospholipides, et correspond à la combinaison de différents types de mobilité (Figure 60).
Les valeurs rapportées par les différentes méthodes dépendent de la sonde mais aussi de sa
localisation dans la membrane. Il n’est pas exclus que la sonde suivant sa concentration puisse
affecter même marginalement le comportement et l’organisation de la membrane.

125
Figure 60 : Schéma des différentes mobilités des phospholipides à l’intérieur de bicouches lipidiques

Peu de valeurs de viscosités sont reportées pour les membranes de cellules bactériennes.
Haidekker et al., ont ainsi rapporté des valeurs de viscosités variant de 70 à 120 cP selon la
température dans des bicouches phospholipidiques artificielles (Haidekker et al., 2001). La
viscosité membranaire de vésicules issues d’E. coli a également été mesurée par RPE. Ainsi,
une mesure de viscosité de 250 cP pour des vésicules issues de cellules cultivées à 23 °C a été
mesurée (Sinensky, 1974). Une microviscosité apparente (ῆ) peut aussi être estimée à partir
de l’anisotropie de fluorescence en utilisant l’équation de Perrin, comme décrite par Shinitzky
and Barenholz (Shinitzky and Barenholz, 1978).

, X Équation 11
ῆ=
 − X

avec ῆ, microviscosité en poise ; rs, anisotropie de fluorescence du DPH et r0 , anisotropie

limite de fluorescence du DPH égale à 0,362.

Cette équation permet de mesurer une valeur de microvisosité avec une approximation de ±
15%. Ainsi, cette équation a déjà été utilisée, par exemple, pour mesurer des viscosités de
membrane plasmique isolée à partir de foie de rats (258 cP) ou de liposomes composés de
différentes proportions en cholestérol et lécithine d’œuf (100 à 500 cP) (Salgia et al., 1993;
Pandey and Mishra, 1999). Les expérimentations réalisées en spectrofluorimétrie avec le
DPH, nous ont permis de mesurer une valeur d’anisotropie de 0,186 en moyenne à 25°C et de
0,211 à 20°C pour les cellules végétatives de B. subtilis. Ces valeurs sont proches de celles
déjà mesurées sur des cellules entières de B. subtilis (Ishihara et al., 1999; Cao-Hoang et al.,

126
 Discussion Générale

2008). En utilisant l’Équation 11, les valeurs d’anisotropie obtenues sur B. subtilis
correspondent à des valeurs de microviscosité apparente de 265 cP et 330 cP respectivement.
Les valeurs de viscosités calculées, sont environ 1,5 fois plus faible que celles obtenues grâce
aux rotors moléculaires. Cette divergence a également été observée entre des valeurs de
viscosités mesurées dans des cellules humaines avec le FLIM (140 cP) ou avec l’anisotropie
résolue dans le temps (80 cP) (Kuimova et al., 2008). Les différences entre les valeurs
obtenues par le DPH et par FLIM peuvent provenir de plusieurs points. D’une part, la
diffusion rotationnelle gouverne la tendance naturelle d’un rotor moléculaire à former un état
« twisté » et donc relie la diffusivité au rendement quantique de fluorescence et au temps de
vie de fluorescence. Ainsi, les rotors moléculaires informent sur la diffusivité de façon
similaire à des sondes mesurant l’anisotropie, comme le DPH. Cependant, le facteur dominant
dans leur émission de fluorescence est la rotation d’un segment par rapport à un autre. Ce
segment est généralement petit et bénéficie d’une plus grande liberté de rotation qu’une sonde
comme le DPH (Haidekker and Theodorakis, 2010). De plus, bien que ces deux sondes se
localisent parallèlement à la chaine acylé des phospholipides, certaines expériences ont
montré que le DPH peut également s’introduire dans le centre de la bicouche lipidique,
parallèlement à la surface (Van der Heide et al., 1996). Cependant, les deux méthodes
indépendantes s’accordent sur le même ordre de grandeur de viscosité.

Cas particulier de la membrane interne

A l’état physiologique, les phospholipides d’une membrane biologique, et en
particulier ceux d’une bactérie, sont majoritairement dans un état liquide-cristallin (Lα). Cet
état est essentiel pour les fonctions membranaires : transport passif de solutés, activité
d’enzymes membranaires, transport actif,… En effet, dans cette phase, les lipides adoptent
une conformation et une orientation désordonnée (Herbert, 1981). Dans des membranes
modèles, une modification des conditions environnementales (déshydratation, diminution de
la température, pression) peut induire une transition de phase de l’état liquide cristallin (Lα)
vers l’état gel (Lβ) pour lequel les lipides adoptent une conformation plus ordonnée (Shechter,
1990; Beney and Gervais, 2001). L’état Lα, plus mobile, implique une viscosité plus faible de
la bicouche par rapport à un état gel. La Figure 61 présente une schématisation des ces deux
états membranaires.

127
 Discussion Générale

Figure 61 : Schéma présentant les arrangements possibles des phospholipides dans une bicouche modèle.
(a) phase gel notée Lβ. (b) phase liquide cristalline notée Lα (Vigh et al., 1998).

La valeur d’anisotropie que nous avons mesurée pour des spores après une rampe de
température est de 0,28 ± 0,025 (~830 cP, Équation 11) et a été attribuée majoritairement à la
membrane interne. Cette valeur est environ 1,6 fois plus élevée que celle mesurée dans les
cellules végétatives et est signe d’une importante viscosité. De même, la viscosité mesurée
dans la membrane interne par le rotor moléculaire Bodipy-C12 est très élevée (~1100 cP).
L’équipe anglaise du Dr Marina Kuimova a réalisé des mesures de la décroissance de
fluorescence du Bodipy-C12 sur des bicouches de 1,2-dipalmitylphosphatidylcholine (DPPC).
Ils ont ainsi observé que le déclin de fluorescence du rotor est monoexponentiel quand la
bicouche est à un état fluide désordonné (au dessus de la température de transition) mais que
le déclin devient biexponentiel lorsque la bicouche est dans un état gel. Les valeurs de temps
de vie mesurées (1,5 ± 0,1 ns et 4,5 ± 0,3 ns) sont alors très proches de celles mesurées dans
les spores sauvages (Wu et al., 2013). Ainsi, bien que le déclin ne semble pas biexponentiel
dans les spores mutantes, ces données appuient l’hypothèse d’un état gel de la membrane
interne des spores. L'importante valeur de viscosité mesurée concorde avec une faible
dynamique membranaire et probablement à un état gel d'une partie ou de la totalité de la
membrane. En effet, une transition de phase de phospholipides (par une diminution de
température par exemple) s’accompagne d’une importante augmentation de la viscosité. Par
exemple, des extraits phospholipidiques de cellules d’E. coli produites à 43 °C présente une
viscosité de 200 cP (obtenue en RPE) à cette même température et de 1500 cP à 15 °C, la
transition de phase étant mesurée à 27 °C (Sinensky, 1974). Ces conclusions sont cohérentes
avec la littérature. En effet, des mesures réalisées en FRAP avec le di-4-ANEPPS sur des
spores dormantes ont montré que la mobilité des lipides est très faible dans la membrane
interne. La fraction mobile de la sonde mesurée dans la membrane des spores n’est que de
0,31 comparée à celle de 0,75 mesurée dans des spores germées ou des cellules végétatives.
Les auteurs suggèrent ainsi que le feuillet interne de cette membrane pourrait être en partie
dans une phase gel (Cowan et al., 2004). L’utilisation du Laurdan sur les spores de C.

128
 Discussion Générale

sporogenes suggère également un état compressé (« lipid packing ») et un degré d’ordre

important des lipides de cette membrane (Hofstetter et al., 2012).

Comment la membrane interne peut maintenir sa bicouche phospholipidique à l’état gel à

température ambiante ?
D’après la littérature, la composition phospholipidique de la membrane interne des
spores est peu différente de celles d’une cellule végétative, bien que l’on note une proportion
plus importante en CL (Cardiolipides) (Kawai et al., 2006; Griffiths and Setlow, 2009). A
l’état végétatif, les lipides de B. subtilis sont à état Lα. La composition lipidique n'est donc pas
responsable de cet état gel. Deux facteurs essentiels peuvent permettre de comprendre l’état
particulier de cette membrane interne : la compaction membranaire (pression latérale) et la
faible hydratation interne.
Au cours de la sporulation, le cortex se met en place entre les deux membranes. La
déshydratation du protoplaste (aw interne entre 0,4 et 0,6) implique qu’une contrainte et/ou un
support mécanique soit apporté par le cortex à la membrane interne (Popham, 2002) afin
qu’elle puisse créer puis maintenir un fort gradient osmotique de part et d’autre de cette
membrane. Cette contrainte mécanique peut être assimilée à une pression hydrostatique qui
s’appliquerait sur cette membrane et serait responsable de son état compacté (Cowan et al.,
2004; Hofstetter et al., 2012). De manière générale, l’application d’une pression élevée sur
une biomembrane (à une température donnée) va entrainer une diminution de sa fluidité qui
peut être accompagnée par une transition de phase réversible des lipides (Kato and Hayashi,
1999; Denich et al., 2003; Winter and Dzwolak, 2005). Le cortex pourrait ainsi être en partie
responsable de l’état gel de la membrane interne et de son maintien (ceci sera plus détaillé
dans une partie suivante).

La sporulation est également accompagnée par une sortie d’eau de la spore, et le protoplaste
contient une faible teneur en eau (~ 27 à 50 %) (Nicholson and Setlow, 1990; Storz and
Hengge, 2011). L’eau possède un rôle structurant pour les membranes des microorganismes.
La déshydratation a tendance à rapprocher les têtes polaires et peut également induire une
transition de phase des phospholipides (Beney and Gervais, 2001; Ragoonanan et al., 2008).
Par exemple, la variation de la pression osmotique est responsable d’une transition de phase
des phospholipides extraits d’E. coli entre 10 et 40 MPa. L’utilisation du DPH a également
montré une augmentation de la viscosité de la membrane de cellules entières d’E. coli entre
1,38 et 40 MPa et qui demeure presque constante au-delà de 40 MPa (Beney et al., 2004).

129
 Discussion Générale

Cette faible hydratation n’ést présente que du côté interne de la membrane ce qui pourrait
induire une différence de structure entre les feuillets internes et externes de la membrane
interne.

Ainsi, la forte déshydratation du protoplaste et la contrainte mécanique créée par le cortex

pourraient, de manière couplées ou non, être responsables de la viscosité importante mesurée
dans la membrane interne des spores.

Approche de l'état de la membrane interne

Les mesures effectuées en spectrofluorimétrie ont permis de constater que l’on peut
s’approcher de la valeur d’anisotropie associée principalement à la membrane interne (0,28 ±
0,025) en diminuant la température de l’environnement des cellules végétatives. Ainsi,
l’anisotropie du DPH atteint une valeur de 0,27 ± 0,02 lorsque les cellules atteignent une
température de 5 °C. La composition des cellules végétatives et des spores étant proches, on
pourrait penser qu’à même viscosité, la membrane de la spore est dans un état proche de la
membrane d’une cellule végétative à 5 °C (état gel de la majorité des phospholipides).
Cependant, certaines propriétés peuvent nous faire penser que l’état gel de la membrane
interne est différent de celui obtenu à basse température sur des cellules végétatives :

• les propriétés de perméabilité

Nous avons pu observer dans cette étude que des sondes fluorescentes polaires comme
l’acridine orange ou apolaires comme le Bodipy-C12 ne peuvent pas pénétrer profondément
dans la spore si elles sont ajoutées après sporulation. L’acridine orange, à laquelle les
membranes de cellules végétatives sont généralement perméables (Han and Burgess, 2010),
montre un marquage périphérique précédemment attribué au cortex dans les spores
bactériennes (Setlow et al., 2002; Magge et al., 2009).
Pour le rotor moléculaire utilisé, son statut hydrophobe suggère, comme montré
précédemment pour des sondes lipophiles (di-4-ANEPPS ou le 10-N-nonyl acridine orange)
(Magge et al., 2009), que le marquage des spores sauvages est associé aux protéines de
l’enveloppe (et éventuellement la membrane externe). Nos expérimentations réalisées sur les
spores mutantes cotE gerE appuient cette hypothèse. Il est suggéré que l’état compacté de la
membrane interne ne permet à aucune de ces sondes apolaires fluorescentes de s’y insérer
(Cowan et al., 2004; Magge et al., 2009) exceptés le Laurdan (Hofstetter et al., 2012) et le
DPH (ce travail et (Ishihara et al., 1999)) semble pouvoir y pénétrer Sur des membranes
modèles, certains travaux ont relié la fluidité membranaire à la perméabilité à des solutés qui

130
 Discussion Générale

traversent la membrane par des mécanismes de diffusion. La diminution de la fluidité, même

d’un seul feuillet, semble suffisante pour réduire la perméabilité (Lande et al., 1995; Hill et
al., 1999). Cependant, si sur des membranes modèles la compaction de la bicouche lipidique
(par les hautes pressions ou par la diminution de la température) conduit à une diminution de
la perméabilité passive, la présence de coexistences entre phase fluides et phase gel, où
l’interface semble être un lieu privilégié de passage des solutés, peut au contraire l’augmenter
(Macdonald, 1984; Crowe et al., 1989; Clerc and Thompson, 1995). Ainsi, une cellule dont la
membrane s’approche d’un état gel (par différentes perturbations dont la pression
hydrostatique, le refroidissement et la déshydratation) a plutôt tendance à voir sa perméabilité
membranaire augmenter.
Il est possible d’amener une membrane cellulaire au même niveau de fluidité que la
membrane des spores. Par contre, il semble difficile d’obtenir les mêmes propriétés de
perméabilités par modification physique de l’environnement (pression, température).

• La compression théorique de la membrane interne de la spore

D'après la littérature, la membrane interne est soumise à une augmentation de sa surface d’un
facteur 1,6 pendant la germination (soit une augmentation de 60%) sans synthèse ni
incorporations de nouveaux matériaux (Swerdlow and Setlow, 1984; Cowan et al., 2004) ce
qui suppose un très forte compaction initiale. Le passage d’une phase gel à une phase liquide
cristalline d'une membrane modèle s'accompagne d'une augmentation de la surface de la
bicouche (en termes d'aire par lipide). Par exemple une bicouche de DPPC voit sa surface par
lipide augmenter de 36% au cours d'une transition de phase (Lα à Lβ) par la température bien
que cette valeur ait peut-être été surestimée par la méthode utilisée (Lis et al., 1982). D'autres
études plus récentes parlent d'environ 25% (Nagle, 1993; Ebel et al., 2001). La compression
surfacique apportée par une déshydratation ou une pression hydrostatique même très élevée
ne permet pas non plus d’atteindre des variations de surface aussi importantes. Ainsi par
exemple, la surface par lipide de bicouche de phosphatidylcholine est diminuée par environ
15% entre une humidité relative de 23% et un excès d’eau (White and King, 1985). La
présence de protéines et la diversité des phospholipides dans une membrane cellulaire ont
tendance à réduire ces variations.

Ainsi, le passage d'un état gel à un état liquide-cristallin lors de la germination ne semble pas
suffisant à lui seul pour expliquer la variation de surface observée.

131
 Discussion Générale

• La variation de la viscosité avec la température

Une augmentation de la température conduit à une diminution de la viscosité de la membrane

des cellules végétatives (observée ici par une diminution de l'anisotropie du DPH). Des
extraits phospholipidiques d’E. coli à l’état gel affichent une diminution de la viscosité avec la
température (Sinensky, 1974). La membrane interne des spores semble réagir différemment.
En effet, après une première rampe de température qui permet l’insertion du DPH dans la
membrane interne, une modification de la température ne semble pas modifier fortement
l’anisotropie (résultats non montrés). Les expérimentations réalisées avec le Bodipy-C12
indiquent un comportement similaire, la viscosité n'étant que peu affectée par une
modification de la température (pour un niveau inférieur à 65 °C). Il semble ainsi que la
membrane soit dans un état particulier réagissant peu à la température ou qu’une structure,
probablement le cortex empêche sa mobilité.

Pour expliquer ces particularités de la membrane interne, on peut envisager plusieurs

hypothèses. La présence d’un état gel de l’ensemble des phospholipides au moins sur un
feuillet pourrait expliquer la faible perméabilité. De plus, une deshydratation de membranes
peut s’accompagner d’une endo-vésiculation (Beney et al., 2004; Simonin et al., 2007). Bien
que ceci n’ai jamais été observé ou mis en évidence pour la membrane interne des spores, ceci
pourrait expliquer l’augmentation de surface (Swerdlow and Setlow, 1984). Enfin, des
modifications de structures des protéines liées à la déshydratation (Cowan et al., 2004) et à la
compression par le cortex et/ou une relocalisation de certaines protéines membranaires par la
compression (Kato et al., 2002) pourrait également expliquer la diminution de surface.

En conclusion, le Bodipy C12 nous a permis de mesurer la viscosité de la membrane

interne séparément de la membrane externe (ce que beaucoup d’autres sondes ne permettent
pas car limitées par la résolution optique) mais ne permet pas d’approcher la structure
directement. Les propriétés de viscosité et de perméabilité obtenues au niveau de la
membrane interne des spores impliquent une structure particulièrement dense et probablement
asymétrique de la membrane. L'hypothèse d'un état gel a ainsi été avancée, bien que celui-ci
ne puisse à lui seul expliquer les comportements observés. Cet état ne peut s’expliquer par la
composition de la membrane elle-même, il résulte plutôt des propriétés des compartiments qui
l’entourent. L'évolution des propriétés des structures lors d'une variation de la température
peut nous aider à améliorer la compréhension de cet état membranaire particulier.

132
 Discussion Générale

Effet de la température sur les structures de la spore

Effet de la température sur la membrane interne

Nous avons émis dans ce travail l’hypothèse que la membrane interne soit en partie
proche d'un état gel dans une spore dormante. Un suivi de la viscosité dans la spore en
fonction de la température a été réalisé par la méthode FLIM. Celle-ci n'est que très peu
modifiée par la température et il faut atteindre des températures de 70 °C pour commencer à
observer une diminution de la viscosité de cette membrane. Dans une étude récente réalisée
sur des spores de Clostridium spp., les auteurs ont montré qu’un traitement à 90 °C modifie le
degré d’ordre des lipides de la membrane interne des spores (Hofstetter et al., 2013). Ces
auteurs avaient également suggéré dans une étude précédente un état gel de cette membrane
en utilisant la sonde Laurdan (Hofstetter et al., 2012). Ces spores de Clostridium ont été
soumises à des rampes de températures et une chute du GP du Laurdan pour une température
de 70-75 °C a été observée, traduisant une diminution de l’ordre des lipides (Hofstetter,
2012). L’étude a également permis d’observer à l’aide de la méthode FT-IR des modifications
de la vibration à 2850 cm-1. Ces auteurs ont alors suggéré qu’un passage de l’état gel à l’état
liquide est observé lors d’un chauffage jusqu’à 90 °C, les modifications commencent à être
très importantes pour une température proche de 60 °C (Figure 62).

(Absorbance)-1
Absorbance

Nombre d’onde (cm-1)

Figure 62 : Spectre infrarouge (A) et dérivée seconde (B) de spores de Clostridum sporogenes chauffées
jusqu’à 90 °C. Les mesures sont prises toutes les 10 min à une vitesse de 5 °C/10 min. (i) vibration
d’étirement des CH2 asymétriques (ii) membrane à “l’état gel” ; (iii) membrane à “l’état liquide”. D’après
(Hofstetter, 2012).

Nous n’avons observé qu’une faible modification de la viscosité par la température, celle-ci
passant d’une valeur d’environ 1000 cP (témoin) à 850 cP (70 °C) dans la membrane interne.

133
 Discussion Générale

En traçant une courbe ln η selon la loi d’Arrhenius, il est possible de voir une rupture de pente
à partir de la température de 65 °C. Ces données confirment qu’il est nécessaire d’augmenter
la température de façon importante pour modifier les propriétés de la membrane interne.

Effet de la température sur les couches externes de la spore

Les résultats obtenus en RMN et par l’utilisation de la spectrofluorimètrie nous ont
permis d’observer que la température est responsable d’une modification dans les structures
les plus externes de la spore. En effet, une rampe de température (ou bien un choc thermique)
de 50 °C à 70 °C entraîne des modifications structurales. L’accessibilité du DPH jusqu’à une
structure plus visqueuse (probablement la membrane interne) est en effet améliorée suite à ces
variations thermiques. Ces phénomènes sont observées à la fois sur des spores sauvages mais
également sur des spores ne possédant pas ou très peu de protéines de l’enveloppe (spore
modifiées chimiquement ou cotE gerE). Le matériel qui subit ces modifications correspond
probablement au cortex. Leuschner et Lillford, ont observé un phénomène thermique par
AED aux alentours de 50 °C et l’ont attribué à l’enveloppe de la spore (Leuschner and
Lillford, 2003). D'autres travaux réalisés au laboratoire, ont plutôt attribué cette relaxation
(observée vers 70 °C) au cortex de la spore (Nguyen Thi Minh et al., 2010b). Nos données
obtenues par des méthodes différentes semblent abonder dans ce sens et sont observées à la
fois sur des spores hydratées (spectrofluorimétrie) et à l’état sec (RMN). Les travaux réalisés
par Ablett et al., ont également montré une transition thermique pour des spores en milieu
hydraté, celle-ci a été attribuée à un état vitreux du protoplaste (Ablett et al., 1999). Nous
avons réalisé des mesures en AED sur des culots cellulaires de spores sauvages, qui sont donc
à l’état hydraté et sur des spores équilibrées à une aw de 0,5 (Figure 63).

134
 Discussion Générale

∆H= 6,14 J/g

∆Cp= 0,3 J/(g. °C)

Figure 63 : Thermogramme de spores hydratées (en violet) ou équilibrées préalablement à une aw de 0,5
(en rouge) chauffées à une vitesse de 10 °C/min. Trait plein : premier chauffage Trait pointillé = deuxième
chauffage. Les flèches indiquent les « pics » endothermiques.

Pour ces différentes hydratations, un pic endothermique est observé (indiqué par la flèche) au
premier chauffage mais pas sur le deuxième scan. Ce pic endothermique pourrait être relié à
une relaxation enthalpique associée à une transition vitreus. Cette relaxation est observée dans
de nombreux polymères synthétiques mais a aussi été étudiée plus récemment sur des
biopolymères comme le gluten ou la gélatine (Badii et al., 2005). Cette relaxation structurale,
aussi appelée vieillissement physique, a lieu en général à une température inférieure à la
température de transition vitreuse (Tg) mais lorsque le matériel est stocké à une température
éloignée de sa Tg. Les variations d’énergie mesurées (∆Cp et ∆H, Figure 63) sont faibles et
confirment qu’il ne s’agit pas d’un autre phénomène thermique comme une fusion par
exemple. L’observation de ce phénomène suggère qu’un composant de la spore pourrait être
dans un état vitreux et que la température de la transition vitreuse associée pourrait être plus
élevée que celle de la relaxation (65-70 °C). Des auteurs ont réalisé une étude en AED sur des
peptidoglycanes extraits de spores bactériennes et ont observé une transition réversible
suggérant un rôle du cortex dans la présence d’un état vitreux (Stecchini et al., 2006). Les
températures de transitions vitreuses associées au cortex mesurées par ces auteurs sont aux
alentours de 90-115 °C. Nous n'avons pas observé de transition vitreuse associée à cet
événement à des températures plus élevées probablement parce que cette transition vitreuse
pourrait se propager sur une large plage de température et se confondre alors avec la ligne de

135
 Discussion Générale

base (Nguyen Thi Minh et al., 2010b). L’état vitreux du cortex n’empêcherait cependant pas
la diffusion de molécules jusqu’à la membrane interne. En effet, les nutriments peuvent
diffuser jusqu’aux récepteurs de la germination (Paidhungat and Setlow, 2001). Nous pouvons
cependant supposer qu’une augmentation de la température au-delà de 50 °C et notamment
proche de 65 °C permet d’augmenter la mobilité du cortex ou en tout cas de passer d’un état
dense à un état plus perméable (“rajeunissement” lié à la relaxation enthalpique) et pourrait
expliquer l’amélioration de l’accessibilité observée sur le DPH. En effet, d'une manière
générale, la relaxation d'enthalpie de matériaux amorphes s'accompagne d'une modification
des propriétés macroscopiques, telles que la densité et les propriétés de transport (Jin Kim et
al., 2003). Ces températures correspondent aux températures connues pour activer la
germination des spores bactériennes (Keynan et al., 1964; Yi and Setlow, 2010). On peut
supposer que l’activation thermique de la germination, correspondrait à cette transition
réversible qui améliorerait l’accessibilité des nutriments aux récepteurs de la germination
localisés au niveau de la membrane interne. Il faut rappeler que l’activation de la spore
bactérienne seule ne permet pas la germination, elle nécessite toujours la présence de
germinants. Cette activation thermique est de plus décrite comme réversible (Keynan et al.,
1964).

Relation entre état vitreux du cortex et état de la membrane interne

Selon Atrih et Foster, le cortex de la spore est composé de peptidoglycanes similaires
à ceux de la paroi de la cellule végétative (Atrih and Foster, 1999). Cependant le cortex est
beaucoup plus épais (140 à 200 nm d’épaisseur) (Driks, 1999). Le cortex agit
vraisemblablement comme une structure rigide de forte résistance mécanique pour supporter
la pression de turgescence générée par la forte concentration des solutés dans le protoplaste
(Popham, 2002). D’après Cowan et al., le cortex pourrait jouer un rôle dans la stabilisation de
la membrane interne dans un état compressé durant la sporulation (Cowan et al., 2004).
Nous avons supposé précédemment que lors d’une rampe de température (ou d’un choc
suffisamment long), le cortex subit une transition thermique associé à une modification
structurale. La résistance mécanique du cortex serait alors modifiée permettant un
relâchement de la pression exercée sur la membrane et ainsi une diminution de sa viscosité.
La diminution de la viscosité de la membrane interne lors de la germination que nous avons
pu observer permet d’appuyer cette hypothèse. En effet, l’hydratation et l’hydrolyse du cortex
dans les premières minutes de la germination permet de diminuer rapidement et de manière
importante la contrainte mécanique exercé par celui-ci. Cette hydrolyse conduit rapidement à

136
 Discussion Générale

une expansion de la surface et à une diminution de la viscosité de la membrane interne

comme discuté précédemment.

Ainsi, la température pourrait à la fois être responsable d’une meilleure diffusion de solutés au
travers du cortex mais aussi d’un léger relâchement de la pression exercée sur la membrane
interne, modifiant ses propriétés. L’activation thermique connue pour synchroniser et
améliorer la germination, correspondrait à ce phénomène réversible. La température
permettrait de faciliter l'accès aux récepteurs de la germination et/ou à une modification de
leur structure par la modification des propriétés membranaires. La Figure 64 schématise ce
phénomène.

nutriments nutriments

Cortex Rampe T° Cortex

MI MI

Core Core
Figure 64 : Schématisation de l’évolution des structures au cours d’une rampe de température. La
température permet une relaxation enthalpique et/ou transition vitreuse du cortex et un léger relâchement
de la membrane interne de son état compressé. Les flèches indiquent la facilité de diffusion des nutriments
jusqu’à la membrane interne. MI : Membrane interne.

La température est donc un paramètre environnemental pouvant modifier les structures de la

spore. La perméabilisation aux solutés par la température reste limitée aux couches externes,
le passage de la membrane interne reste un obstacle pour la plupart des molécules. Pour
perméabiliser durablement la spore et accéder au protoplasme, il faut utiliser un agent
chimique qui va affecter la structure de la spore. L’éthanol est une des molécules pour
laquelle cette perméabilisation est efficace tout en préservant la structure multicouche de la
spore. Nous avons pu voir dans ce travail que l'éthanol couplé à ces températures peut
également modifier les propriétés particulières (faible perméabilité aux solutés et importante
viscosité) de la spore bactérienne. Ce traitement entraîne une perméabilisation puisqu'il
améliore l'accessibilité de certaines sondes fluorescentes au protoplaste. L’effet de ce
traitement sur les structures de la spore et son mécanisme d’inactivation est encore peu connu.
Ainsi, il s'agit d'un stress intéressant dans l'étude des modifications des structures qui sera
discuté dans la partie suivante.

137
 Discussion Générale

Impact de l’éthanol sur les structures de la spore

Nécessité de coupler l’éthanol à la température

Les alcools sont des agents de largement et efficacement utilisés pour la désinfection,
notamment l’éthanol à un pourcentage proche de 70% (Prescott et al., 2010). Les alcools
présentent une activité antimicrobienne à large spectre contre les bactéries végétatives (y
compris les mycobactéries), les virus et les champignons mais ne sont cependant pas
sporicides (McDonnell and Russell, 1999). L’éthanol (même à faible pourcentage) peut
cependant avoir un impact sur la germination, l’inhibant de manière réversible (Trujillo and
Laible, 1970). En ce qui concerne les spores bactériennes, le traitement à l’éthanol doit
s’accompagner d’une augmentation de la température pour permettre leur inactivation (Setlow
et al., 2002). La température est connue pour améliorer l’effet sporicide de certains agents
chimiques (Russell, 2004). Il a été montré sur des membranes plasmiques issues de cellules de
souris un effet augmenté du désordre provoqué par l’éthanol avec l’augmentation de la
température (Chin and Goldstein, 1981). Cependant il s’agit de faible pourcentage en éthanol
(<10 %) et les températures utilisées sont faibles (10 à 30 °C au maximum) comparées à
celles utilisées dans cette étude. L'éthanol seul n'agit pas sur la membrane interne des spores,
ou sur un temps très long (2 mois minimum à 90% d’éthanol) (Thomas, 2012)). Pourtant
l’éthanol par ses caractéristiques est susceptible de diffuser presque aussi librement que l’eau
dans les structures de la spore. On peut ainsi supposer que cette absence d'effet est liée à
l’impossibilité de l’éthanol à s’intégrer et/ou à diffuser dans la membrane interne. La
température semble ainsi être nécessaire pour que l'éthanol puisse agir sur la membrane
interne. Nous avons vu précédemment que la température provoque une modification de la
perméabilité et de la mobilité à l’intérieur du cortex. Ceci ne semble pas pourtant être l’effet
principal puisque le cortex est naturellement perméable aux nutriments qui peuvent accéder
aux récepteurs localisés au niveau de la membrane interne (Paidhungat and Setlow, 2001).
L’éthanol possède en effet une masse molaire faible comparée à un nutriment comme le
glucose (46 g/mol et 180g/mol respectivement) et diffuse généralement bien dans les milieux
biologiques. Cependant, on peut supposer que la transition subie par le cortex suite à une
augmentation de la température permet un relâchement de la pression mécanique qu’il exerce
sur la membrane, facilitant alors l’accès de l'éthanol à la membrane. De plus, le traitement est
peut être responsable d'une dénaturation importante et irréversible du cortex. Ainsi la
température couplée à l’éthanol aurait un double effet :

138
 Discussion Générale

• effet synergique de l’action des deux paramètres sur la membrane interne.

• amélioration de l’accessibilité de l’éthanol jusqu'à la membrane interne (dénaturation
du cortex).
L'utilisation de l'AED sur des spores traitées puis stockées pourrait être envisagée afin
d’observer si le traitement provoque la disparition de la relaxation enthalpique et/ou de la
transition vitreuse.

Modifications des protéines de la spore

L’utilisation de la spectroscopie infrarouge a permis d’observer l’impact de l’éthanol
sur la structure secondaire des protéines. Le traitement éthanol/température conduit ainsi à
l’apparition de structure en feuillet β, notamment à 70%. L’apparition de ce type de structures
a déjà été observée lors d’un traitement de spores sauvages à l’autoclave (Perkins et al.,
2004). L’effet de l’éthanol sur des protéines modèles à haute concentration en éthanol (~ 80%
sur du lysozyme) ou sur des protéines de la muqueuse gastrique humaine a également montré
l’apparition de structures en feuillet β (Lin et al., 1995; Goda et al., 2000). L’augmentation de
la proportion de cette structure secondaire a été attribuée à une agrégation des protéines
(Haris, 1999; Wang, 2005). En effet, il est connu que l'activité bactéricide des alcools est
notamment due à leur capacité à dénaturer les protéines (Larson and Morton, 1991). L'éthanol
déstabilise les protéines et peut entrainer leur dénaturation à des températures élevées (où la
température elle-même n'a pas d'effet de dénaturation) ou à des concentrations plus élevées
d'éthanol (Yoshikawa et al., 2012). L’augmentation de la concentration en éthanol a tendance
à augmenter la dénaturation des protéines (Booth, 1930; Liu et al., 2010). En ce qui concerne
les spores bactériennes, ceci explique pourquoi une augmentation de la proportion en éthanol
augmente la proportion de structures en feuillet β. Cependant, cette modification des protéines
ne semble pas être la cause de la destruction des spores par l’éthanol. Nous avons constaté
dans ce travail que bien que les spores mutantes soient également inactivées par l’éthanol,
celles-ci ne présentent que très peu de modification au niveau de la structure secondaire des
protéines. Ces protéines dénaturées correspondent ainsi vraisemblablement aux protéines de
l’enveloppe des spores sauvages. L’enveloppe a déjà été montrée comme une structure
n’intervenant pas dans la résistance des spores à l’éthanol (Setlow et al., 2002). La faible
proportion de structures en feuillet β observée dans les spores sans enveloppe pourrait être
attribuée à la dénaturation d’autres protéines de la spore comme celles de la germination.
Cependant, il ne semble pas que ce soit le mécanisme d’inactivation des spores par l’éthanol
(l’ajout de lysozyme ne permet pas de refaire germer ces spores).

139
 Discussion Générale

Modification de la membrane interne

L'éthanol provoque des perturbations membranaires sur les microorganimses quand il
est utilisé comme désinfectant (Møretrø et al., 2012). Dans le cas des spores bactériennes,
seul l’effet physique de l’éthanol sur les membranes semble pertinent à étudier, les spores ne
possédant pas de métabolisme. L’étude de l’effet de l’éthanol sur des membranes modèles a
montré qu’il provoquait en général une diminution de l’ordre lipidique (Goldstein, 1984;
Ingram, 1989; Gurtovenko and Anwar, 2009) et pouvait affecter la perméabilité aux solutés,
ions, colorants fluorescents ainsi que la diffusion au sein des bicouches lipidiques (Mansure et
al., 1994; Mizoguchi and Hara, 1996; Patra et al., 2006). Comme mentionné précédemment,
l’eau a un rôle important dans la structuration des membranes. L’éthanol peut cependant avoir
un effet dépresseur de l’aw (Hallsworth, 1998). Slater et al., ont montré que l'éthanol perturbe
le rôle de l'eau intramembranaire (Slater et al., 1993). L'éthanol affecte négativement les
interactions entre les têtes et/ou déplace les molécules d'eau dans ce réseau eau-hydrogène et
abaisse ainsi la température de transition. L’éthanol aurait tendance à se placer au niveau des
têtes polaires des lipides plutôt que dans la région acyle comme le montre la Figure 65.

ETOH

DPPC

DMPC
Figure 65 : Schéma montrant l’insertion de l’éthanol au niveau des phospholipides. DPPC :
Dipalmitoylphosphatidylcholine DMPC : dimyrystoylphosphatidylcholine (Chanda and Bandyopadhyay,
2004; Patra et al., 2006).

Des études réalisées sur l’effet de l’éthanol sur des bicouches modèles (phosphocholines) ont
montré que l’effet d’une désorganisation provoquée par l’éthanol, est visible à la fois sur les
membranes à l’état liquide mais aussi à l’état gel (Pillman and Blanchard, 2010).
Les traitements utilisés dans ce travail entraînent une modification de la membrane interne
puisqu'ils sont responsables d'une diminution de sa viscosité et d'une augmentation de sa

140
 Discussion Générale

perméabilité (entrée de sondes fluorescentes, sortie du DPA). Nous avons également observé
une sortie du DPA au cours de ces traitements. L’IP est une sonde fluorescente connue pour
ne pénétrer que dans des cellules dont la membrane est altérée (Williams et al., 1998). La
membrane interne est supposée être dans un état proche de l’état gel. On peut émettre
l’hypothèse que la désorganisation de la membrane interne (observée par une diminution de la
viscosité) provoquée par l’éthanol conduit à l’apparition d’une coexistence de phases
responsable d’une augmentation importante de la perméabilité. L’apparition de coexistence de
phases est observée sur des membranes modèles (Pillman and Blanchard, 2010). De plus, ceci
pourrait être assimilé à ce qui est observé lors de la déshydratation de bactéries (Beney et al.,
2004). Nous avons observé que les traitements utilisés sont à l'origine d'une inactivation des
spores bactériennes, cette inactivation augmentant avec le pourcentage d'éthanol. D'après la
littérature (Setlow et al., 2002), la dénaturation des enzymes de germination ne serait pas la
cause principale de la mort des spores. En effet, l'utilisation de lysozyme pour dégrader le
cortex (ce qui permet normalement une germination sans intervention des récepteurs à la
germination) ne permet pas un retour à l'état végétatif. Ces auteurs suggèrent plutôt que la
libération du DPA qui est observée serait à l’origine d’une sensibilisation des spores à la
chaleur et/ou à l’éthanol (Setlow et al., 2002). On peut ainsi imaginer que les perturbations
membranaires peuvent être responsables de cette libération et donc de manière indirecte de
l’inactivation.

Cas du traitement à 70%

Pour le traitement à 70%, nous avons observé une différence dans l'insertion du
Bodipy-C12 pour les spores sauvages et les spores mutantes sans enveloppe. En effet, l’éthanol
entraîne une dénaturation des protéines. Liu et al., ont ainsi montré qu’une augmentation de la
concentration en éthanol provoque une augmentation de l’agrégation de l’albumine de sérum
bovin (Liu et al., 2010). Le pourcentage d’éthanol utilisé pour désinfecter les surfaces et les
mains est de 70%. Il est suggéré que l’éthanol à une trop forte concentration provoquerait une
agrégation des protéines en surface trop rapidement pour permettre la pénétration de celui-ci
plus profondément et diminuerait alors son efficacité (Stoker, 2011). On peut supposer que
dans notre cas l’effet couplé d’un traitement éthanol à 70% 2 h 65 °C ou 70% 1 h 70 °C
provoque une agrégation importante des protéines en surface. Ceci formerait une barrière
empêchant le rotor de pénétrer profondément dans les spores bien que celles-ci soient tout de
même inactivées. L’IP pourrait quant à lui rentrer par un mécanisme différent.

141
 Discussion Générale

En conclusion, ces résultats confirment la particularité des structures de la spore bactérienne.

L'effet de l'éthanol seul, ne permet pas d'inactiver les spores bactériennes. Il semble ainsi que
les éléments cibles (protéines et lipides) soient protégés. La membrane interne est maintenue
dans un état particulier ou protégé de telle sorte que l'effet de l'éthanol seul ne soit pas
suffisant pour la désorganiser. L'éthanol couplé à une augmentation de température serait
responsable d’une modification du cortex (irréversible ?) et donc de l'accessibilité et/ou des
propriétés de la membrane. En conséquence, une désorganisation de la membrane interne
provoquerait probablement une perméabilisation responsable directement ou non de la
libération du DPA. Ces résultats confirment ainsi l'hypothèse pour laquelle une barrière de
perméabilité est modifiée par l’effet du traitement à l’éthanol couplé à la température,
probablement la membrane interne. Ces traitements, notamment ceux permettant une
perméabilisation sans altération majeure de la membrane et de l'enveloppe, pourraient ainsi
être utilisés pour encapsuler des substances d'intérêts dans le protoplaste des spores.
Cependant, il est nécessaire d’améliorer les barèmes à utiliser car ceux présentés dans ce
travail entraîne une perméabilisation irréversible.

142
CONCLUSION – PERSPECTIVES

143
144
 Conclusion – Perspectives

CONCLUSIONS – PERSPECTIVES

En conclusion, malgré la faible taille de la spore (1 µm) et son importante compartimentation,

ce travail de thèse a permis de développer une méthode permettant de visualiser la viscosité
des structures de la spore. La perméabilité des spores matures étant très faible aux solutés,
l’insertion du rotor moléculaire Bodipy-C12 au cours de la sporulation a ainsi permis
d’atteindre les structures de la spore les plus internes. Par la suite, l’utilisation de l’imagerie
en temps de vie de fluorescence a permis de réaliser une cartographie de la viscosité des
structures de la spore. Le Bodipy-C12 représente donc un marqueur intéressant pour la spore
qui pourra être utilisé pour évaluer l’effet d’autres perturbations sur la membrane interne
comme les hautes pressions ou l’H2O2. De plus, l’utilisation couplée de cette technique avec
de la super résolution pourrait permettre de mieux cibler le signal. Cette méthode de
visualisation pourrait également être envisagée sur d’autres microorganismes. Une première
étude a ainsi déjà été initiée sur la levure Saccharomyces cerevisiae afin de caractériser une
structure membranaire hétérogène. L’utilisation d’un rotor moléculaire hydrophile pour la
mesure de la viscosité du protoplaste des spores est également à l’étude.

A l’aide de cette méthode, nous avons démontré que la viscosité de la membrane interne de la
spore bactérienne est environ 2 fois plus importante que celle d’une cellule végétative. Cette
importante viscosité a été reliée à un état membranaire probablement dans un état gel. Le
cortex, en raison de sa contrainte mécanique, est en partie responsable de cet état, puisque lors
de la germination et de son hydrolyse, la viscosité de la membrane interne est diminuée par
1,7. La viscosité d’une membrane de cellule végétative à basse température (~ 5 °C) est
proche de celle attribuée à la membrane interne. Cependant, l’état gel de la membrane interne
semble particulier car cette membrane possède des propriétés de perméabilité et de
compression différentes d’une membrane de cellules à faible température. Des travaux
complémentaires menés avec des sondes fluorescentes mesurant des paramètres différents
(hydratation, ordre) pourraient permettre de mieux définir l’état membranaire. Il est également
envisagé d’utiliser les pressions hydrostatiques et/ou osmotiques sur la membrane de cellule
végétative pour en visualiser l’effet sur la viscosité et sur la perméabilité. Ceci permettrait
peut être de s’approcher au plus près des propriétés de cette membrane.

145
 Conclusion – Perspectives

Des mesures en anisotropie de fluorescence du DPH, et également en AED, ont permis

d’observer une modification d’une structure de la spore, probablement le cortex, au cours
d’une élévation de température (proche de 60-70 °C). Cette structure subit au cours d’un
chauffage une transition thermique (relaxation enthalpique et/ou transition vitreuse). Cette
transition permet une augmentation de la perméabilité et/ou de la mobilité du matériau. La
contrainte mécanique alors exercée sur la membrane interne diminue (mesure d’une légère
diminution de sa viscosité) et permet semble-t-il, d’améliorer l’accessibilité de sondes
fluorescentes jusqu’à cette dernière. L’activation thermique de la germination semble pouvoir
être reliée à ces modifications. Cependant, certaines expérimentations supplémentaires sont
nécessaires (par exemple en fonction du temps) afin de mieux comprendre la relation entre
cette transition réversible (et notamment l’augmentation de perméabilité) et l’activation
thermique de la germination.

Enfin, nous avons mis en évidence les modifications structurales engendrées par une
perturbation éthanol/température. Une augmentation du pourcentage en éthanol conduit à une
augmentation de l’inactivation des spores couplée à une augmentation de la perméabilisation.
Sur des spores sauvages, ce traitement dénature de manière importante les protéines de
l’enveloppe (notamment à 70%). L’utilisation de spores sans enveloppe a cependant permis
de confirmer que cette structure ne joue pas de rôle dans l’inactivation des spores par ce
traitement. Au contraire, les perturbations subies par la membrane interne (diminution de sa
viscosité et augmentation de sa perméabilité) conduisent à la libération du DPA et participe
ainsi de manière indirecte à l’inactivation. La température élevée nécessaire pour inactiver les
spores en présence de l’éthanol semble, en plus d’un effet synergique, confirmer le rôle du
cortex dans le maintien de l’intégrité de la structure de la spore. Un suivi précis de la
température à laquelle l’éthanol (à une concentration donnée) a un effet sur l’inactivation des
spores, pourrait permettre de confirmer ce point. Un passage de spores traitées en AED
pourrait également confirmer si l’éthanol modifie de manière irréversible le cortex.
Comme perspective de travail, nous avons identifié le traitement éthanol/température comme
une perturbation intéressante à utiliser pour encapsuler des molécules d’intérêts. Le stress à
50% semble être particulièrement intéressant car il permet une perméabilisation importante
tout en minimisant l’effet sur les structures. Des expérimentations préliminaires ont été
réalisées avec la rhodamine B (qui ne pénètre pas dans les spores entières). Le « suivi » de sa
libération en cellule de visualisation à 37 °C montre que le lysozyme pourrait être utilisé pour

146
 Conclusion – Perspectives

libérer la molécule encapsulée (Figure 66a et b), bien que des expérimentations
supplémentaires soient nécessaires.

a 30 s 20 min 30 min 60 min

Eau 37 °C
Lysosyme 37 °C

b 110
c
Eau 37 °C
100
Lysosyme 37 °C
90
% Intensité initiale

80

70

60

50

40

30
0 20 40 60 80
temps (min)

Figure 66 : Exemples d’expériences d’encapsulation réalisées sur des spores sauvages traitées à l’éthanol
50% pendant 1 h à 70 °C. (a) Suivi de la libération dans de l’eau ou du lysozyme (0,05 g/mL) à 37 °C de la
rhodamine B « encapsulée » dans des spores traitées 50% pendant 1 h à 70 °C. Les images sont réalisées
en cellules de visualisation en microscopie confocale (Excitation : 514 nm, Emission : 540-625 nm)
Echelle : 1µm. (b) Suivi de l’intensité de fluorescence au cours du temps en % de l’intensité initiale. (c)
Encapsulation de curcumine dans des spores sauvages traitées à 50% pendant 1 h à 70 °C. Echelle = 1 µm.

La curcumine a aussi été envisagée comme molécule d’intérêt. Cette molécule sensible
semble pouvoir être encapsulée dans des spores traitée à l’éthanol 50% comme le montre la
Figure 66c. Pour envisager cette méthode d’encapsulation, il sera nécessaire d’améliorer les
données sur l’efficacité d’encapsulation mais surtout de « mesurer » la protection apportée par
la spore à cette molécule face à différentes conditions de stockage (température, humidité,…)
et de stress environnementaux (comme ceux du tractus gastro-intestinal). Cependant, l’éthanol
n’est peut être pas la meilleur solution, car la perméabilisation créée est irréversible. Ainsi,
l’utilisation d’autres perméabilisant à haute température peut être envisagée. Avec la
progression des connaissances sur les propriétés et les fonctions de la structure des spores, il

147
 Conclusion – Perspectives

est envisageable de mettre en place une capsule artificielle se rapprochant des propriétés de la
spore. Cette encapsulation pourrait permettre à terme de protéger une molécule sensible quel
que soit l’environnement extérieur (température, agression chimique,…) et dont la libération
serait maitrisée.

148
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ANNEXES

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166
167
168
169
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171
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