Cours de Microbiologie LV342

Université Pierre & Marie Curie (Paris 6)

UFR 927 Sciences de la Vie
 Présentation &
Principales Caractéristiques des Microorganismes
 Définition et Objet de la Microbiologie
Défini&on:  
C'est l’étude des organismes trop petits pour être vus à l’oeil nu,
c'est-à-dire des microorganismes ou microbes, du grec mikros "petit"

Cette étude implique des techniques spécifiques comme par exemple

la microscopie et la mise en culture

Occupe une place centrale en biologie :

Biochimie Génétique

Ecologie Microbiologie Immunologie

Evolution et origines de la vie

Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Hippocrate 460-370 av, J-C, est considéré comme le père de

la médecine moderne, et ses disciples ont été les premiers à classer
de nombreuses maladies aiguës, chroniques, endémiques et épidémiques

Ibn Zakaria Al-Razi 865-925 médecin pluridisciplinaire perse

Dans son célèbre traité de médecine « Kitab fi al-jadari wa-al-hasbah»
a été le premier à décrie la variole et la rougeole, et préconise
des règles d'asepsie en chirurgie

Garcia de Orta 1500-1568 médecin et botaniste portugais a été

le premier à décrire le choléra et d'autres maladies tropicales
et leur traitement par des plantes
Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Francesco Redi 1626-1697 est le premier à remettre en question

la génération spontanée en montrant que les asticots proviennent de
la ponte des mouches.

Antonie van Leeuwenhoek 1632-1723, naturaliste hollandais,

en fabricant ses propres microscopes grossissant 100 à 300 fois a pu
observer pour la première fois:

-des protozoaires, des levures, des spermatozoïdes, des hématies

-des bactéries en1670 nouvellement découvertes ont été nommées

"animalcules".
Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Robert Hooke 1635-1703,astronome, mathématicien et naturaliste anglais

- perfectionnement de la conception et l'utilisation du microscope

- confirme en 1678 les observations de bactéries faites par Antoine
van Leeuwenhoek

Lazzaro Spallanzani 1729-1799, grâce à l'emploi de flacons chauffés

et scellés, porte en 1785 un rude coup à la théorie de la génération
spontanée.

Edward Jenner 1749-1823, médecin et naturaliste anglais

-tente son premier essai de "vaccination" contre la variole en 1796
Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Robert Bunsen 1811-1899, chimiste allemand, est crédité à tort

d'avoir perfectionné le bec de gaz qui porte son nom,alors qu'il s'agit
en fait de son assistant Peter Desdega en 1885

Rudolf Virchow 1821-1902, médecin allemand

- fondateur de l'anatomie pathologique en observant de nombreuses

cellules de malades au microscope

- émet en 1858 l'hypothèse que toute cellule vivante ne peut provenir

que d'une autre cellule préexistante (omnis cellula e cellula)
 Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Louis Pasteur 1822-1895 est un des fondateurs de la microbiologie

moderne par l'exploration de domaines variés :

1861: confirmation de l’inexistence de la génération

spontanée par l’emploi de flacons à "col de cygne"
qui laissent passer l'air mais pas les microorganismes

1876 : invention d'un procédé de conservation : la pasteurisation

et la stérilisation pour la mise en culture des microorganismes

1881 : vaccins contre le charbon et le "choléra" des poules

1885 : vaccins contre la rage

1888 : création de l’Institut Pasteur à Paris

 Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Robert Koch 1841-1910 est le rival allemand de Pasteur

1876 : 4 postulats essentiels :
- L’agent infectieux doit être détecté chez chaque malade
- L’agent infectieux doit être isolable ex vivo
- La maladie doit être reproduite par inoculation de l’agent purifié
- L’agent infectieux doit être re-isolé à partir de l’hôte infecté
expérimentalement

1877: : le charbon est dû à Bacillus anthracis

1880 : invention du milieu de culture solide par

utilisation de la gélatine

1882 : découverte et culture du bacille de la tuberculose

1883 : confirmation de l'identification du bacille responsable du choléra,

initialement traité par Garcia de Orta 1500-1568 puis décrit
par le naturaliste italien Filippo Pacini en 1854

1905 : obtention du prix Nobel de médecine

Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Alphonse Laveran 1845-1922, médecin militaire français

découvre en 1880 le protozoaire parasite responsable du paludisme
Prix Nobel de médecine en 1907 (pose des bases de la parasitologie)

Hans Gram 1851-1928, microbiologiste danois,

met au point en 1884 la célèbre coloration GRAM qui porte son nom

Martinus Beijerinck 1851-1931, microbiologiste hollandais,

découvre en 1898 le premier virus, celui de la mosaïque du tabac

Albert Calmette 1863-1933 et Camille Guérin 1872-1961,

microbiologistes français, développent en 1921 un vaccin contre
la tuberculose (BCG = Bacille de Calmette et Guérin).
Repères Historiques et Découvertes Marquantes

Alexander Fleming 1881-1955, médecin écossais,

découvre la pénicilline en 1929
prix Nobel de médecine en 1945

Jacques Monod 1910-1976, microbiologiste français

1940 découverte de la diauxie chez Escherichia coli (voir plus loin)

1961 découverte de l'opéron lactose et postulat l'existence

de l'ARNm, avec François Jacob et André Lwoff

1965 proposition d'un modèle d'enzyme allostérique

1965 prix Nobel de médecine

 Chronologie des 1ers Génomes Séquencés

1977 Bactériophage : ΦX174 (5386 pb, 11 gènes)

1984 Virus eucaryote : Epstein-Barr (172 kb, 80 gènes)

1995 Bactérie : Haemophilus influenzae (1,83 Mpb, 1900 gènes)

1996 Eucaryote : Saccharomyces cerevisiae (17,4 Mpb, 6600 gènes)

Pour comparaison
2006 Homosapiens sapiens (3,2 Gpb, 22000 gènes)
 Evolution, Vie Microbienne & Biosphère
Origine  de  la  terre  et  de  la  vie
En étudiant les isotopes radioactifs (40K qui se décompose en 40Ar,
demi-vie de 1,26 Mds d’années), les scientifiques ont estimé l’âge
de l’univers à ~13,7 Mds d’années.

Selon la théorie du « Big Bang », l’univers est en expansion, et

notre système solaire et la terre se sont formés il y’a qqs 4.5 Mds
d’années.

L’étude des fossiles microbiens ou paléon-microbiologie a été

fondée en 1950 par deux scientifiques américains Stanley Tyler et
Elso Barghoorn.
Mise en Evidence des Microorganismes Fossiles (1)
Les plus anciens fossiles, découverts à ce jour en Australie et en
Afrique du Sud, sont les stromatolites datant de 3.5 Mds d’années
(Soit 1 Mds d’années après la formation de la terre)
Fossiles Microbiens découverts
dans des roches sédimentaires laminaires
(stromatolites, Bolivie, Amérique du Sud)

Les microorganismes déposent

du carbonate de calcium et d’autres minéraux,
pour former les feuillets successifs de la structure.

L'analyse du soufre prélevé dans des roches du nord de l'Australie

et datées de 3,47 Mds d'années indique une réduction biologique du
sulfate, ce qui laisse supposer une respiration anaérobie (voir plus loin)
Mise en Evidence des Microorganismes Fossiles (2)

La présence de dérivés du 2-méthylhopane, stérols caractéristiques

des cyanobactéries, a été mise en évidence dans des dépôts carbonés
inclus dans des roches datant de 2,5 Mds d'années.

Cela suppose que la photosynthèse oxygénique était donc déjà

en place à ce moment-là, ce qui n'implique pas forcément la présence
de quantités importantes d'oxygène atmosphérique
(atmosphère anoxique sans oxygène libre sous forme gazeuse O2)

La teneur en oxygène est estimée de:

-1 à 5 % entre 1 Mds et 1.5 Mds d'années

-10 % il y a 0,5 Mds d'années
-~21% actuellement
 Tentative de Définition de la Vie
Système complexe compartimenté et hautement organisé
(à faible niveau d'entropie):

-échange de la matière avec son environnement

-assure sa maintenance par renouvellement de ses composants

-utilise l’énergie de son environnement en état de déséquilibre

thermodynamique

-persiste par auto-réplication et transfert d'information

L’astrobiologie est l’étude de la vie dans l’univers.

En raison de leur rapide évolution et leur résistance, les microorganismes
pourraient constituer des organismes vivants bien plus fréquents que les
macro-organismes.
 Origine de la Vie sur Terre

Beaucoup de questions restent suspendus concernant la période

primitive du début de la vie sur terre:

-Comment la vie-elle apparue ?

-Quelles sont les premières formes de vie ?
-Quelles sont les conditions qui ont permis l’origine de la vie
sur terre?

Aucune observation directe

ne permet de répondre à ces questions

mais certains pré-requis d’apparition

( peut être insuffisantes)
ont été avancés
 Pré-requis d’Apparition de la Vie sur la Terre (1)
La vie n’a pu exister sans une eau sous forme liquide

Facteurs physiques dont la grandeur doit se situer dans une

certaine plage : température, pression, rayonnement, gravité…etc

Présence de composés organiques

-il est inconcevable que les cellules puissent avoir émergé de novo
en l’absence de ces composés (acides aminés, sucres…etc)

-en 1953 Stanley et Miller ont pu synthétiser au laboratoire des composés

organiques à partir de sources inorganiques

-Certains composés organiques tels que les acides aminés et les hydrocarbures
polycycliques aromatiques ont été découverts dans l’espace intergalactique.

Cela soulève l’hypothèse

L’origine de la vie pourrait être extra-terrestre (apportée par
des comètes et des météorites)
Pré-requis d’Apparition de la Vie sur la Terre (2)

Beaucoup de Scientifiques pensent que la vie a évolué sur la terre

dans des endroits à l’abri des impacts des astéroïdes et des
facteurs physiques agressifs (haute température, UV….)

-Environnements marins profonds tels les cheminés hydrothermales

-Environnements souterrains

Fumeur
au Pacifique
Comment Pouvant Nous Suivre l’Evolution Biologique ?
Deux  approches  sont  possibles:

Observation des microorganismes fossiles dans les dépôts

sédimentaires

Construction d’un arbre de l’évolution en se basant sur les

connaissances des organismes vivants contemporains

-La seconde approche suppose l’analyse des séquences de macromolécules

telles que les ARN ribosomiques (ARNr) 16S et 18S (unité Svedberg) en
raison de leur:

-Evolution très lente au cours du temps

-Nature très conservée
-Caractère ubiquitaire
 Arbre Phylogénétique Universel
Trois  grands  domaines  d’organismes  (Carl  Woese  fin  des  années  1970)
Procaryotes Eucaryotes
Domaines   Bactéries Archées Eucaryotes

Last Universal Common Ancestor LUCA

qui est dit progénote c'est-à-dire
ni procaryote ni eucaryote

origine  de  la  vie

Les types cellulaires des Eucarya sont structurellement différents de ceux des
Bacteria et des Archaea
Les Bactéries et les Achées se différencient principalement par les composés
qu’elles utilisent comme nutriment et/ou comme source d’énergie
 Diversité Microbienne
Domaine  des  bactéries:
Comprend beaucoup des microorganismes (~30 phylums ou règnes)
présents typiquement dans:
-Les sols
-Environnements aquatiques
-Responsables de maladie

Domaine  des  archées:

Constitué d’une ensemble séparé de microorganismes dont certains
se trouvent dans:
-Environnements saturés en sels ou à température élevée

Domaine  des  eucaryotes:

Comprend
-les microorganismes eucaryotes tels que les protistes
(protozoaires et protophytes); les champignons, les algues
les animaux et les végétaux
 Tableau Comparatif des Trois Domaines (1)
Domaine Bacteria Archaea Eucarya
Caractéristique (eubactéries) (archées) (eucaryotes)

Taille moyenne 0,2 à 15 µm 0,2 à 15 µm 10 à 100 µm

Présence d'organites Non Non Oui
Noyau entouré d'une membrane Non Non Oui
Lipides membranaires :
- Chaîne carbonée liée au glycérol Acide gras Alcool isoprénoïde Acide gras linéaire,
et type de liaison linéaire, ester ramifié, éther ester
- Présence de stérol Oui Non Oui
Paroi : - Présence Oui Oui Oui
- Composant principal Peptidoglycane Très variable, sans Pectocellulose (plantes)
(muréine) peptidoglycane ou chitine (champignons)
Croissance à température > 90°C Non Oui Non
Formation de spore Oui Non Oui
Photosynthèse Oui Non Oui
Chimio-lithotrophie Oui Oui Non
Méthanogénie Non Oui Non
Fixation de l'azote atmosphérique Oui Oui Non
ATP synthétases/ATPases F1F0 A1 A0 F1F0, V1V0
 Tableau Comparatif des Trois Domaines (2)
Domaine Bacteria Archaea Eucarya
Caractéristique (eubactéries) (archées) (eucaryotes)

Pouvoir pathogène Oui Rare et indirect Oui

Organismes pluricellulaires Non Non Oui
Présence de virus (10 à 400 nm) Bactériophages Oui Oui
Présence de plasmides Oui Oui Rare
Présence de transposons Oui Oui Oui
Présence d'opérons Oui Oui Non
Chromosomes : - Ploïdie Haploïde Haploïde Le plus souvent diploïde
- Nombre 1 (2) 1 (2) Plusieurs
- Forme Circulaire Circulaire Linéaire
- Télomères Non Non Oui
- Histones Non Oui Oui
- Origine(s) de réplication Unique Multiples Multiples
ARN polymérase ADN dépendante :
- Nombre d'enzymes 1 2 3
- Sous-unités 5 (!2""'#) Jusqu'à 13 Au moins 33
- Rifampicine Sensible Résistante Résistante
ARNm : - Epissage Non Parfois Très souvent
- Polycistronique Oui Oui Non
- Complexe exosome Non Oui Oui
Initiation de la traduction N-formyl-Met Met Met
Ribosome : - Taille 70 S 70 S 80 S
- Chloramphénicol Sensible Résistant Résistant
- Toxine diphtérique Résistant Sensible Sensible
Cas Particulier des Virus (voir cours de virologie)

Les virus (du latin "poison") sont les êtres vivants les plus simples
qui existent et sont présents dans les 3 domaines

Parasites intracellulaires obligatoires, incapables de se répliquer

en dehors de leur hôte si bien que certains ne les considèrent pas
comme des organismes "vivants" à part entière

Constitués d’un seul type d’acide nucléique ADN ou ARN encapsidé

par des protéines structurales / génome compacté 3-200 gènes

Leur taille est variable 20 à 300 nm Ø, donc très inf. à la taille

d’une cellule (exception des Mimivirus qui peuvent atteindre 400nm Ø)

Une diversité insoupçonnée: 10.000 virus connus

on estime qu’il existe plus de 1031 particules virales différentes
(diversité supérieure à celle cumulée des trois domaines du vivant)
Arbre Phylogénétique des Archées (ou Archaea)
Basé  sur  les  séquences  de  la  région  codant  les  ARNr  16  -­‐18S

Elles se répartissent actuellement dans 4 (?) phylums (ou règnes ?)

distincts, selon l'arbre phylogénique simplifié et provisoire

Crenarchaeota Archaea
Sulfolobales*
Desulfurococcales* Euryarchaeota
Caldisphaerales*
Thermoplasmatales
Eucarya Archaeoglobales* Halobacteriales
Thermoproteales* Methanosarcinales
Thermococcales*
Bacteria Methanocellales
Methanomicrobiales
Korarchaeota Methanococcales*

Methanobacteriales*
LACA* ? Methanopyrales*
?
Nanoarchaeota

LUCA ?

∗ indique la présence des hyperthermophiles

 Classification des Archées (1)
Phylum  des  Crenarchaeota:  comprend  4  ordres

La plupart des Archaea cultivables de ce phylum ont un métabolisme

énergétique lié au soufre.

Phylum  des  Euryarchaeota:  comprend

-Les méthanogènes (voir plus loin)
-Les halophiles extrêmes
-Les réducteurs de sulfate
-Les thermophiles
Crenarchaeota Archaea
Sulfolobales*
Desulfurococcales* Euryarchaeota
Caldisphaerales*
Thermoplasmatales
Eucarya Archaeoglobales* Halobacteriales
Thermoproteales* Methanosarcinales
Thermococcales*
Bacteria Methanocellales
Methanomicrobiales
Korarchaeota Methanococcales*

Methanobacteriales* +Méthanogènes
LACA* ? Methanopyrales*
?
Nanoarchaeota

LUCA ?
 Classification des Archées (2)
Phylum  des  Korarchaeota:

surtout connu par métagénomique (techniques ne faisant pas appel

à la mise en culture), car ce n'est que tout récemment qu'un de ses
membres a pu être enfin cultivé

Phylum  des  Nanoarchaeota

dernier découvert. On n'en connaît pour l'instant que très peu de
représentants, qui pourraient être apparentés aux Euryarchaeota.
Crenarchaeota Archaea
Sulfolobales*
Desulfurococcales* Euryarchaeota
Caldisphaerales*
Thermoplasmatales
Eucarya Archaeoglobales* Halobacteriales
Thermoproteales* Methanosarcinales
Thermococcales*
Bacteria Methanocellales
Methanomicrobiales
Korarchaeota Methanococcales*

Methanobacteriales*
LACA* ? Methanopyrales*
?
Nanoarchaeota

LUCA ?
 LACA (Last Archaeal Common Ancestor)

Les nombreux échantillonnages effectués et étudiés par

métagénomique indiquent que les Archées sont présentes
partout sur la planète

LACA (Last Archaeal Common Ancestor) est supposé hyperthermophile

du fait de l'enracinement profond de toutes les Archaea
hyperthermophiles, et l’émergence de mésophiles aurait alors été
plus tardive.
Crenarchaeota Archaea
Sulfolobales*
Desulfurococcales* Euryarchaeota
Caldisphaerales*
Thermoplasmatales
Eucarya Archaeoglobales* Halobacteriales
Thermoproteales* Methanosarcinales
Thermococcales*
Bacteria Methanocellales
Methanomicrobiales
Korarchaeota Methanococcales*

Methanobacteriales*
LACA* ? Methanopyrales*
?
Nanoarchaeota

LUCA ?
 Diversité des Microorganismes Eucaryotes

Troisième domaine du monde du vivant, ce sont des organismes dont:

-ADN est séparé du cytoplasme par une membrane nucléaire

-Uni ou pluricellulaires

-les eucaryotes autres que les champignons, les algues, les plantes
ou les animaux sont appelés: Protistes regroupent les protozoaires
et les protophytes proche des algues unicellulaires

LUCA
 Les Protistes (règne) (1)

La classification des protistes reflète d’une grande complexité

et peut être +/- éclatée au sein des eucaryotes.
Par conséquent, d'autres classifications ont été proposées

Ce sont des eucaryotes unicellulaires, le plus souvent mobiles par

pseudopodes, flagelles ou cils.

Ils sont très répandus dans toutes les zones aqueuses ou humides.
Ils constituent, avec plus de 65 000 espèces recensées, une part
importante du plancton.

On en les trouve aussi dans les matières organiques en décomposition,

et certains sont des pathogènes parasites des plantes ou des animaux
(voir cours de parasitologie).
 Les Protistes (2)

En cas de conditions défavorables, de nombreux protistes

se différencient sous forme de kyste, cellule dormante protégée
par une paroi. Les parasites peuvent utiliser les kystes pour passer
d'un hôte à l'autre.

Certains possèdent 2 noyaux comme par exemple la paramécie

(voir TP)

La reproduction peut être asexuée (division binaire classique)

ou sexuée (soit par conjugaison de types sexuels complémentaires,
soit par formation de véritables gamètes).
 Les Protozoaires (sous règne)
Cons&tués  de  14  embranchements  dont  les  principaux  sont:
Les  Ac&nopodes
avec un squelette silicé comme les radiolaires
Paramécie (voir TP)
Les  Rhizopodes
Amibes, foraminifères

Les  Ciliés  ou  infusoires

Paramécie, Stantor et vorticelle
Les  Flagellés
-trypanosome (parasite responsable de la maladie du sommeil ou de Chagas)
-trichomonas (parasite responsable de la trichomonase,sexuellement transmissible)
-leishmania (parasite responsable de la leishmaniose ou kala-azar)
Les  Microsporidies
parasites intracellulaires comme le toxoplasme

Les  Sporozoaires
parasites, comme le plasmodium (hémotozoaire agent du paludisme ou malaria)
 Les Protophytes (sous règne)

Organismes proches des algues unicellulaires donc photo-autotrophes

Ils sont chimio-organotrophes et hétérotrophes :

-soit holozoïtes : ingestion de bactéries par phagocytose

-soit saprozoïtes ou osmotrophes : les nutriments traversent

la membrane plasmique par pinocytose (repli de la membrane qui englobe
une gouttelette du liquide)>>> diffusion ou transport actif

Ils possèdent souvent des vacuoles: Euglène (voir TP)

-pulsatiles, phagocytaires, sécrétoires.
 Les Champignons (ou Mycètes) (1)
Leurs  principales  caractéris&ques  sont  :

Les champignons sont des végétaux mais constituent un règne

distinct (100.000 espèces connues) de celui des plantes:

-très répandus dans l'environnement et sont estimés à plus

de 1.5 millions d’espèces (30 espèces comestibles en France)

Non photosynthétiques, Chimio-organotrophes et hétérotrophes

Saprophytisme: alimentation par absorption de composés organiques

Présence d'une paroi à base de chitine, différente de la paroi

pecto-cellulosique des plantes
Présence d'un thalle : structure végétative des végétaux inférieurs
où l'on ne peut distinguer ni racines, ni tiges, ni feuilles
 Les Champignons (ou Mycètes) (2)
Présence d'hyphes, longs filaments ramifiés de cellules septées
(cloisonnées) ou non, dont l'ensemble forme le mycélium.

Reproduction sexuée (avec appareil fructifère, issu de l'union

de filaments provenant de deux individus de types sexuels
différents pour former un organe reproducteur

zygospore
Appareil fructifière
avec fulcres de Phycomyces
(voir TP)

Reproduction asexuée de loin la plus importante et parfois le seul

mode connu, elle est assurée par la production de spores ou
conidies), ou les deux.
 Les Champignons (ou Mycètes) (3)
Certains champignons sont pathogènes pour:
-l'homme ou l'animal et provoquent des mycoses.
Ex: Candida, Aspergillus, Histoplasma, Trichosporon, Cryptococcus,

-D'autres sont pathogènes pour les plantes

Ex: Fusarium

Principaux groupes (classification complexe) :

zygomycètes (ex: Phycomyces, voir TP),
ascomycètes, basidiomycètes, deutéromycètes, Oomycètes
Cas des levures :
Une levure est un champignon unicellulaire se reproduisant par
fission ou par bourgeonnement (Saccharomyces cerevisiae, voir TP)
à certains stades de sa vie, et formant des cellules sexuelles
sans appareil fructifère.

-Les levures ne forment généralement pas de mycélium

La classification des champignons, et donc des levures, est complexe
et soumise à des remaniements fréquents.
 Les Algues

L’étude des algues est l'algologie ou phycologie

Les algues ne constituent pas un taxon mais plutôt un groupe

polyphylétique, c'est-à-dire qu'elles recouvrent plusieurs
catégories dans la classification :
-ce sont soit des plantes soit des protophytes.

Les algues sont dépourvues de racines, tiges et feuilles,

et possèdent des chloroplastes pour effectuer la photosynthèse
oxygénique (voir plus loin).

Elles peuvent être unicellulaires, en colonies, filamenteuses,

membraneuses ou tubulaires.
Evolution des Eucaryotes (Théorie Endosymbiotique)
Wolfram Zillig & Lynn Margulis suggèrent que l’apparition de la cellule
préeucaryote pourrait être issue à partir d’un événement de fusion
entre une prébactérie et une préarchée.

Cette cellule préeucaryote aurait évolué en cellule eucaryote avec

noyau puis en cellule eucaryote avec mitochondrie.

La mitochondrie serait issue de la symbiose entre une protéobactérie

et une cellule eucaryote primitive.

Cette lignée conduisant à l’évolution des plantes et des animaux.

Le chloroplaste apparaît suite à la fusion symbiotique entre une

Cyanobactérie et une cellule eucaryote.

La lignée conduisant à l’évolution des algues et des plantes

 Culture et Croissance des Procaryotes
Besoins Nutritionnels et Métabolisme Primaire
 Aliments Essentiels ou Nutriments (1)

Toute cellule vivante requiert les substrats indispensables lui

permettant de synthétiser l'ensemble des molécules qui composent
sa biomasse à partir de son métabolisme primaire (cours de biochimie)

Ce sont les aliments essentiels ou nutriments, qui doivent

obligatoirement être présents dans le milieu de culture
 Aliments Essentiels ou Nutriments (2)
Elément chimique Exemples de substrats utilisés comme sources de l'élément
(% du poids sec) Minéraux Organiques
C ( 50) CO2 , (CO) Glucides, lipides, acides aminés, ...
O ( 20) H2O, CO2, (O2) La plupart
N ( 15) NH4+, NO3 –, NO2 –, N2, ... Acides aminés, bases azotées, amines, ...
H ( 10) H2O, H+, (H2) La plupart
P ( 3) Phosphates Nucléotides, composés phosphorylés, ...
S ( 1) SO42–, SO32–, H2 S, ... Cys, Met, thiols, sulfonates, sulfides, ...
Sels (≤1) Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, Cl–, ... —
Métaux ou oligo- Fe2+, Zn2+ Mn2+, Cu2+, Co2+, Hème pour le fer, ...
éléments (<0,1) Ni2+, ...

C, O, N, H et P sont des macro-nutriments, car ils constituent

la plus grande partie de la biomasse.
L'apport d'oxygène et d'hydrogène en tant qu’éléments de la
biomasse ne nécessite pas de substrats spécifiques:

-soit ils sont associés aux sources de C et de N,

-soit ils proviennent d’échanges métaboliques d'eau
(qui est aussi le solvant) ou de protons avec le milieu.
 Aliments Essentiels ou Nutriments (3)
Elément chimique Exemples de substrats utilisés comme sources de l'élément
(% du poids sec) Minéraux Organiques
C ( 50) CO2 , (CO) Glucides, lipides, acides aminés, ...
O ( 20) H2O, CO2, (O2) La plupart
N ( 15) NH4+, NO3 –, NO2 –, N2, ... Acides aminés, bases azotées, amines, ...
H ( 10) H2O, H+, (H2) La plupart
P ( 3) Phosphates Nucléotides, composés phosphorylés, ...
S ( 1) SO42–, SO32–, H2 S, ... Cys, Met, thiols, sulfonates, sulfides, ...
Sels (≤1) Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, Cl–, ... —
Métaux ou oligo- Fe2+, Zn2+ Mn2+, Cu2+, Co2+, Hème pour le fer, ...
éléments (<0,1) Ni2+, ...

S et les principaux sels sont des micro-nutriments car ils sont

nécessaires en moins grandes quantités (de 0,1 à 1%).
La présence de sels est aussi nécessaire pour maintenir la pression
osmotique du milieu.
Les oligo-éléments ne sont nécessaires qu’à l’état de traces,
et comme ils sont souvent présents en tant que contaminants
d'autres composants, il n'est pas toujours utile d'en ajouter.
 Facteurs de Croissance
Un facteur de croissance est un constituant indispensable
de la biomasse que la cellule est incapable de synthétiser par
elle-même
-Elle doit alors se le procurer directement comme
substrat : acide aminé, vitamine ou coenzyme, base azotée, lipide

Un facteur de croissance, pour lequel la cellule est dite auxotrophe

ne doit pas être confondu avec un aliment essentiel !

L’auxotrophie peut être:

-soit naturelle et c'est alors une des caractéristiques du microorganisme
éventuellement utilisée en taxonomie

-soit provoquée par exemple par une mutation touchant la voie de biosynthèse
du constituant pour lequel le microorganisme devient alors auxotrophe

-soit conditionnelle dépendante des conditions de culture

 Types Trophiques ou Nutritionnels
Pour synthétiser sa propre matière, une cellule vivante nécessite
des aliments essentiels et d’éventuels facteurs de croissance,
du pouvoir réducteur (donneur d’électrons), et de l’énergie.

L'ensemble de ces besoins permet de définir des type trophiques

généraux (du grec trophê "nourrir"):

Besoin Type trophique

Source d'énergie primaire lumineuse Phototrophe
chimique Chimiotrophe
Substrat énergétique oxydé minéral Lithotrophe
(donneur d'électrons) organique Organotrophe
Source de carbone minérale : CO2 Autotrophe
organique Hétérotrophe
Facteur de croissance indispensable Auxotrophe
inutile Prototrophe
Croissance en présence de forte Copiotrophe
concentration en substrat faible Oligotrophe

Il existe de plus des types trophiques correspondant à des besoins

particuliers : hydrogénotrophe, méthanotrophe, diazotrophe
(voir plus loin), méthylotrophe, ...
Types de Milieux de Culture selon leur Composition
Milieu  complexe  ou  empirique:
Milieu préparé à partir d'extraits de matières organiques
et dont la composition exacte n'est pas connue
Exemple : hydrolysat de protéines,
extraits de levure, de viande, de soja, de lait,de sang…

Ce type de milieu est parfois dit "riche" car il contient suffisamment

de composés pour permettre la croissance de la plupart des
microorganismes courants. Il a l'avantage d’être facile à préparer

Milieu  synthé&que  ou  chimiquement  défini:

Milieu dont la composition exacte est entièrement connue
Ce milieu est dit "minimum" lorsqu'il ne contient que les éléments
strictement indispensables à la cellule (les nutriments et les facteurs
de croissance éventuels).
Ce type de milieu est utile pour étudier précisément les besoins
nutritionnels du microorganisme, son métabolisme et sa physiologie
 Milieu Solide ou liquide
CH2OR2 O

Peut être rendu solide par addition d'agar HO O

O
OR1
O CH2 O
O

Agar: composé appartenant à une famille de polysaccharides

OH

gélifiants extraits de certaines algues rouges (agarose, guar…)

et aussi utilisé comme additifs alimentaires (E406)
L'unité répétitive est un disaccharide O-substitué (R1 et R2, variables)
formé de β-D-galactpyranosyl lié en 1-4 à du 3,6-anhydro-α-L-galactopyranosyl

Les milieux solides sont très utiles pour effectuer des isolements,
ce qui permet de trier un mélange de microorganismes différents (voir TP)

Un milieu peut être rendu "sélectif" par addition d'un ou plusieurs

inhibiteurs auxquels le microorganisme que l'on souhaite isoler est insensible
ou résistant.
Avant utilisation Après utilisation
 Conditions Optimales de Croissance
Paramètres Physico-chimiques
Les conditions optimales de croissance dépendent de 4 principaux
facteurs physico-chimiques :

Conditions optimales de croissance Catégorie

Température < 20°C Psychrophile ou cryophile
entre 20 et 40°C Mésophile
entre 40 et 80°C Thermophile
> 80°C Hyperthermophile
pH < 6 Acidophile
entre 6 et 8 Neutrophile ou neutralophile
> 8 Alcalophile ou basophile
Salinité > 2,8 M Halophile
Dessiccation Xérophile
Pression > 400 atm Barophile ou piézophile
Rappels : l'isotonicité est à 0,15 M en sels soit 9 g/L de NaCl
L'eau de mer est à une concentration moyenne en sels de 35 g/L soit 0,6M
de nombreux organismes dits halotolérants et appartenant aux 3 domaines y vivent
 Conditions Extrêmes de Croissance (1)
Parmi les hyperthermophiles capables de vivre au dessus de 90°C,
on ne rencontre pour l'instant que des archées.

Les records actuels sont détenus par des archées cultivées en laboratoire :
-113 °C pour Pyrolobus fumarii
-121 °C pour un coque pas encore identifié (Science 2003, 301 p934)

La température la plus élevée pouvant être supportée par

des microorganismes est estimée à 140-150 °C
(Trends Microbiol. 2004, 12 p58) mais cela reste à vérifier ??

Une archée piézophile (et hyperthermophile) du genre Pyrococcus

vivant dans une source hydrothermale du rift médio-Atlantique à
4100 m de profondeur et capable de supporter 1184 atm (1200 bars)
a été récemment décrite (ISME J. 2009, 3 p873).
 Conditions Extrêmes de Croissance (2)

Thiobacillus ferrooxidans:
Bactérie autotrophe, chimiolithotrophe, mésophile, aérophile
et acidophile avec des valeurs de pH optimales entre 1 et 4.

Psychromonas ingrahamii:
Bactérie psychrophile se développe à des températures inf. à -10°C

Deinococcus radiodurans:
Bactérie chimio-organotrophe, hétérotrophe, aérobie strict,
possédant 2 chromosomes avec 2 à 4 copies sous forme d'anneaux
condensés visibles au microscope optique.
capable de résister sans perte de viabilité à des doses de radiations
ionisantes de 5000 Gray (soit 20 fois plus que Escherichia coli)
 Croissance Microbienne (1)

En microbiologie, le terme « croissance » traduit en général

l’augmentation du nombre de cellules dans une population:
c’est la croissance de population

Lorsque la taille d’une cellule bactérienne ou archée augmente,

on parle alors de croissance cellulaire

Il est important de rappeler que la plupart des microorganismes

présents dans la nature n’ont pas encore été cultivés en laboratoire

Ces organismes sont viables mais notre incapacité à les cultiver est
liée à notre méconnaissance de leurs exigences de croissance.
 Cellules Viables mais non Cultivables (VBNC)
Sous certaines conditions environnementales, certains microorganismes
peuvent entrer dans ce que l’on appelle un état "viable mais non
cultivable" (VBNC en anglais).

Cet état dans lequel les cellules perdent peu à peu leur capacité à
se diviser mais conservent une faible activité métabolique est considérée
comme une stratégie de survie

Pour mesurer le nombre de cellules VBNC, on se base sur des essais

prenant en compte certaines propriétés physiologiques comme:
-capacité respiratoire
-intégrité de la membrane
-activité métabolique
-marquages immunologiques
 Croissance Microbienne (2)

Au cours de la croissance et de la division, une bactérie peut

synthétiser:

-plus de 1800 protéines différentes

-plus de 400 molécules différentes d’ARN

-une copie complète de son génome

-une membre cytoplasmique et si nécessaire le matériel pariétal

pour entourer la nouvelle cellule.
 Temps de Génération

Tous ces processus sont régulés pour produire une cellule dans
un court laps de temps appelé: temps de génération
(temps nécessaire pour qu’une de cellule double en nombre)

La division en 2 cellules filles est appelée: scission transversale

ou division par scissiparité

En général, la taille d’une cellule bactérienne augmente avant

la division. Cette phase du cycle cellulaire correspond donc à
la croissance cellulaire.
 Exemples de Temps de Génération

Temps de génération approximatives de quelques microorganismes

cultivés dans des conditions optimales
 Mesure de la Croissance Microbienne (1)
Méthodes  directes:
Pour la numération directe, on utilise une cellule de comptage
(hématimètre de Thomas ou de Malassez), constituée:

-d'une lame sur laquelle est gravée un quadrillage de dimensions

connues
-surmontée d'une lamelle placée à une distance connue
-l'ensemble délimitant donc un volume connu.
-L’échantillon de la suspension de cellules à compter est introduit
entre lame et lamelle et observé au microscope.
L’ensembles des
100 grands carreaux
représente un volume de 1µl 1 petit carreau=
Hématimètre de Malassez
1/20° du grand carreau

Cellule bactérienne

La numération directe au microscope ne permet pas toujours de savoir si les cellules sont viables
 Mesure de la Croissance Microbienne (2)
Méthodes  directes  ??:
Comptage de colonies (CFU ou colony forming unit):
-une série de dilutions de la suspension cellulaire de l’échantillon
est préparée
-un volume connu de chaque dilution est entièrement étalé sur milieu gélosé
-Après incubation, les colonies sont comptées en comportant entre 10 et 200
pour la précision de la mesure
-le résultat est multiplié par la dilution correspondante pour obtenir
la concentration cellulaire de la suspension initiale.
 Mesure de la Croissance Microbienne (3)
Méthodes  indirectes:
Le poids sec ou biomasse est déterminé:

-après dessiccation au four pour éliminer l'eau extra et intracellulaire

d'un culot cellulaire correspondant à un volume de culture connu

-Cette mesure est proportionnelle à la totalité des cellules mais nécessite

un étalonnage avec une méthode de numération pour corréler la biomasse
au nombre de cellules.

Dosage chimique d’un composé cellulaire:

-l’élément le plus souvent dosé est l’azote.
-les cellules contiennent environ 14% d’azote. Son dosage dans un échantillon
donné fournira une estimation assez précise de la biomasse totale.

-Les cellules sont traitées par l’acide sulfurique afin de libérer et

transformer l’azote cellulaire en ammoniaque.
-La quantité NH4+ libérés est déterminée par méthode colorimétrique
 Mesure de la Croissance Microbienne (4)
Méthodes  indirectes:
Absorbance ou densité optique (DO):

-c'est une mesure turbidimétrique où la diminution de l'intensité lumineuse

est due la dispersion de la lumière par les cellules en suspension.

-un spectrophotomètre permet de mesure une absorbance (A) définie

par l’équation A=DO=-log (I/IO)
-I et Io sont reliés par la loi de Beer-Lambert où:
DO= -logI/Io <--> I=Io.10-εLC = ε.L.C

Source Filtre Chambre Ecran

lumineuse Monochromateur de mesure de lecture

λ(Io) λ(I)
Lumière Lumière
incidente transmise
(400 à 620 nm) Cuve en quartz
Largeur 1 cm (L)
 Mesure de la Croissance Microbienne (5)
Méthodes  indirectes:
Absorbance ou densité optique (DO):
-La DO est proportionnelle à la concentration de cellules,
à condition de respecter la loi de Beer-Lambert (DO = ε.L.C )
et de faire le zéro du spectrophotomètre avec le milieu de culture.

-Pour évaluer précisément la biomasse, la DO peut être corrélée au poids sec

ou nombre des cellules donnant cette absorbance.

-Le succès de la turbidimétrie est dû à sa simplicité, rapidité, reproductibilité

et n’affecte pas les cellules.

-La méthode n’est pas applicable aux cellules qui se développent en amas,
en suspensions non homogènes (ex actinomycètes) ou faibles concentrations
(moins de 107 cellules/ml; limite inférieure de turbidité visible)
 Description des Phases de Croissance (1)
1-­‐  Phase  de  latence  (faculta&ve):
Temps d'adaptation des cellules à de nouvelles conditions (mise en place de
la machinerie cellulaire de synthèse)
-aucune croissance n'est observée (pas d’augmentation du nombre de cellules).
-On peut arriver à supprimer cette phase en réensemençant plusieurs
fois de suite la culture dans les mêmes conditions.

2-­‐  Phase  d’accéléra&on:

Certaines cellules commencent à se diviser.
Cette phase peut être très courte et n'est pas toujours visible
 Description des Phases de Croissance (2)
3-­‐  Phase  exponen&elle:
Toutes les cellules se divisent régulièrement et leur nombre double
à intervalles de temps constants c'est-à-dire augmente selon
une exponentielle de base 2 (2>>>4>>>8>>>16>>>32…..ou 2n)
Équation de la phase ex est: NT= No x 2n

No :Nbre de bactéries au début de la phase ex

NT: Nbre de bactéries après un temps T de la phase ex
n: nbre générations
T: intervalle de temps entre No et NT

nombre de générations (n) temps de génération (t)

log NT = log No + nlog2 t = n/T

n= log NT - log No
log2

taux de croissance népérien (µ) taux de croissance binaire

exprimé (h-1)=pente µ = 1/t
µ = log2/t
 Description des Phases de Croissance (3)
4-­‐  Phase  de  ralen&ssement:
Certaines cellules cessent de se diviser car les conditions de culture
deviennent défavorables.
-Soit un des constituants du milieu indispensable aux cellules est épuisé (cas courant)

-soit un produit du métabolisme cellulaire s'est accumulé en entraînant des effets

négatifs (variation de pH ou production d’éthanol pour certaines levures).

5-­‐  Phase  sta&onnaire:

il n'y a plus aucune division, mais une partie du métabolisme est encore
actif ce qui permet certaines synthèses. Les cellules s'adaptent à
des conditions de stress (carence nutritionnelle…).

Contrairement une fausse idée très répandue, cette phase n'est absolument pas
un équilibre entre des cellules qui meurent et d'autres qui se divisent !
 Description des Phases de Croissance (4)
6-­‐  Phase  de  décroissance  ou  de  déclin  (faculta&ve):
Les cellules meurent et lysent
 Exemple de Courbe de Croissance Bactérienne
! " # $ %
10
9
8
En haut: la représentation du nombre de bactéries
N (108 cellules/mL)

en échelle arithmétique ne donne pas que peu

7
6
5 d’informations
4 >>> distinction entre phases de croissance difficile
3
2
1
0 Au milieu: la représentation en log décimaux permet
9 de distinguer 5 phases:
8,5
-P. Latence : 0 à 25 min
log(N)

7,5
-P. Accélération : 25 à 75 min
-P. Exponentielle : 75 à 325 min
-P. Ralentissement: 325 à 375 min
7

-P. Stationnaire : à partir de 375 min

6,5

6
Taux de croissance
µ = Ln2/G (h -1)

1 Temps de génération (g): 35 min

Taux de croissance binaire 1/g (h ): 1,72
-1
0,5

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Temps (min)
 Diauxie
On parle de diauxie (du grec auxein "augmenter")
lorsqu'il y a deux croissances à la suite l'une de l'autre,
traduisant le plus souvent les utilisations successives de deux
substrats différents.
-Ce phénomène a été découvert par Jacques Monod en 1940.

On observe une première croissance pendant laquelle seul le glucose

est consommé, qui s'arrête lorsqu'il est épuisé.
Après une phase de latence correspondant à l'induction de l'opéron
lactose qui était réprimé par le glucose, une seconde croissance
lui succède pendant laquelle le lactose est à son tour consommé.
E. coli E. coli
Glucose+lactose Glucose+fructose
Consommation successive Consommation simultanée

Diauxie Pas de diauxie

présence d’opéron absence d’opéron
lactose fructose
Rappel: Principales Régulations chez les Bactéries
Outre l'ensemble des régulations métaboliques faisant appel
principalement aux enzymes allostériques (voir cours de biochimie),

On peut citer (voir cours de génétique LV236) :

Opérons, répression catabolique, atténuation

Facteurs de transcription sigma alternatifs.

Petits ARN régulateurs non codants (sRNA ou ncRNA) :

anti-sens, interférents, microARN, snoRNA, ...

Systèmes capteur/effecteur (sensor/effector) avec phosphorylation

intermédiaire.

Quorum sensing et peptide phéromone

 Exemples des 2 Derniers Types de Régulations
Souvent Associés
Production et excrétion d'un peptide phéromone servant de signal, par
l'ensemble des cellules de la culture

Accumulation de ce peptide signal dans le milieu au fur et à mesure

de la croissance

Fixation de ce peptide signal sur le récepteur du domaine extracellulaire

d'une protéine transmembranaire servant de "capteur" (sensor)

Déclenchement du signal au delà d'un certain seuil de concentration du

peptide, correspondant à une densité cellulaire particulière (quorum sensing)

La protéine "capteur" est activée et son domaine intracellulaire possède une

activité kinase qui phosphoryle une protéine cytoplasmique régulatrice (effector)

La protéine régulatrice activée peut alors se fixer spécifiquement sur certains

promoteurs cibles pour activer ou inhiber la transcription des gènes correspondants
Pratique de la Culture de Microorganismes
Stérilité et Sécurité (voir TP)
 Conservation des Microorganismes

Les souches de microorganismes peuvent être préservées sur

plusieurs années, pour constituer des "collections" :

-Par congélation à -80°C ou mieux à -196°C en azote liquide

(surtout pas à -20°C), en présence de composés cryoprotecteurs comme
le glycérol.

-Par lyophilisation ou déshydratation sous vide et à froid

(efficace pour la plupart des procaryotes et limitée pour les eucaryotes)
Institutions Internationales « Collections des Souches »

Collections de microorganismes dans des institutions internationales

à la disposition de la communauté scientifique

-France CIP= Collection de l'Institut Pasteur à Paris.

-Belgique BCCM= Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms à Bruxelles

-Allemagne DSMZ= Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

à Braunschweig.

-Etats-Unis ATCC= American Type Culture Collection à Manassas en Virginie.

-Japon JCRB= Japanese Collection of Research Bioresources à Osaka.

 Site Internet de la Microbiologie à l’UPMC

Adresse Internet du site

http://www.edu.upmc.fr/sdv/microbiol/

Les supports de cours sont en accès privés et nécessitent

Loggin:
Mot de passe:

http://www.edu.upmc.fr/sdv/microbiol/VF/L3/docs-L3.htm