RAPPORT DE STAGE :

Laboratoire d’anatomie-pathologie

Réalisé par : période de stage : du 20/9/21 au 5/11/21

Saliha EL OUADDANE filière : technique de la sante
Siga JAITEH option : laboratoire
Mohammed BLLOULANE Promotion : 2019-2022
Salima ACHEKAJ
Encadré par :
DR HKMAOUI Abdelmalk

Année universitaire : 2021/2022

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Remerciements :
Tout d’abord, je voudrais remercier notre coordinatrice Dr EL
MOUAHID qui déploie toute leur efforts pour nous garantir une
meilleure formation, à travers leur disponibilité et leur recherche pour
des meilleurs professeurs pour nous enseigner et nous
encadrer.
Je souhaite ensuite adresser mes remerciements au corps
professoral et administratif de l’institut supérieur des
professions infirmiers et techniques de santé, pour la qualité de
l’enseignement offert et le soutien de l’équipe administrative.
Je voudrais exprimer ma gratitude pour tous les enseignants
spécialement Dr HKMAOUI Abdelmalk, et les majeurs de services,
les techniciens de laboratoires et les médecins biologistes qui
m’ont apporté leur soutien moral et intellectuel tout au long de
mon stage je les remercie pour leur compréhension, leur
patience, leur disponibilité pour nous expliquer tous les détails
et les techniques du travail et rendre la période de stage aussi
enrichissante, bénéfique et agréable.

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TABLE DES MATIERES :

I. INTRODUCTION :……………………………………………………………4
II. PRESENTATION DE LABORATOIRE :………………………………..5
III. LA RECEPTION DES PRELEVEMENTS :……………………………..5
IV. EXAMEN EXTEMPORANE………………………………………………..7
V. HISTOLOGIE :………………………………………………………………….8
1. FIXATION………………………………………………………….9
2. MACROSCOPIE………………………………………………….10
3. CIRCULATION…………………………………………………….13
4. ENROBAGE………………………………………………………..14
5. MICROTOMIE……………………………………………………15
6. COLORATION STANDARD…………………………………..16
7. MONTAGE…………………………………………………………18
8. COLORATIONS SPECIALES………………………………….20
VI. CYTOLOGIE………………………………………………………………………24
VII. IMMUNOHISTOCHIMIE……………………………………………………30
VIII. BIOLOGIE MOLECULAIRE…………………………………………………33
IX. CONCLUSION………………………………………………………………….49

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 I. INTRODUCTION

L'anatomo-pathologie est une spécialité médicale technique, qui se

consacre à l'étude des lésions macroscopiques et microscopiques des
tissus pathologiques et l’analyse histologique des cellules prélevés
sur un sujet vivant ou décédé (Autopsie). Il s'intéresse aux grands
processus lésionnels concernant les éléments fondamentaux d'un
organisme : l'inflammation, la cancérologie, les troubles vasculaires,
les altérations cellulaires, la nécrose, la cicatrisation etc. Elle a pour
objectif d’analyser les prélèvements humains (tissus, frottis,
liquides) et d’en déduire le diagnostic et les principaux facteurs de
gravité de la tumeur, contribuant ainsi pour la plus grande part à la
décision thérapeutique.

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 II. PRESENTATION DE LABORATOIRE

Le service d'Anatomie Pathologique comporte six secteurs

techniques :

 Salle de Réception
 Salle Macroscopique
 Salle d’Enrobage, Microtomie, Coloration
 Salle de Cytologie
 Salle d’Immuno-histochimie
III. RECEPTION DES PRELEVEMENTS

La réception est de la responsabilité des secrétaires. Elle doit respecter

une procédure précise afin de déceler toute anomalie d’identification,
d’acheminement ou de transmission. Bien vérifier que:

 Le nom de patient sur le fiche de renseignement remplie par le

médecin prescripteur est bien le même que celui inscrit sur le(s)
flacon(s) et/ou la (les) lame(s).
 La date de réception
 le nom et coordonnées du médecin prescripteur
 le siège, la date (jour et heure) et la nature du prélèvement
(biopsie ou exérèse).
 les circonstances cliniques et para-cliniques qui ont motivé le
prélèvement, éventuellement les hypothèses diagnostiques.
 L'aspect macroscopique ou endoscopique des lésions l'aspect
d'imagerie, en particulier pour les tumeurs osseuses.

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  Les antécédents pathologiques du patient, les antécédents
d’examens anatomopathologiques effectués dans un autre
laboratoire et la nature des traitements éventuellement
administrés au malade.

Après vérification rigoureuse des données, le prélèvement doit

recevoir un numéro d’enregistrement attribué de préférence par un
logiciel informatique.

Les différents types de prélèvement reçu dans laboratoire sont :

Les prélèvements cytologiques -Liquides (les épanchements des

cavités, liquide céphalo-rachidien,
urines, liquide articulaire,
expectorations, aspiration
bronchique, lavage bronchiolo-
alvéolaire, brossages)
– Frottis
Les prélèvements tissulaires – Biopsies
– Biopsies exérèses
– Pièces opératoires
– Autopsie

Enregistrement des prélèvements

L’enregistrement est une étape particulièrement importante ne

souffrant aucune erreur et nécessitant une grande vigilance. Chaque

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prélèvement reçoit numéro d’indentification qui le suit durant toutes
les étapes techniques et de lecture jusqu’à l’archivage.

IV. EXAMEN EXTEMPORANE

L’examen extemporané est un acte médical qui a pour but d’établir un
quelques minutes (moins de 10 minutes) une orientation diagnostique
(de bénignité ou de malignité) d’une lésion prélevée au cours de
l’invention chirurgicale (que le chirurgien suspend en attendant le
résultat du pathologiste pour la poursuivre). C’est la pathologiste, et
lui seul, qui a la responsabilité d’étudier la pièce entière fournie et de
décider des échantillons qui sont prélevés. Le résultat est
exclusivement transmis par le pathologiste au chirurgien.

 PROTOCOL
 Prélèvement sur la pièce fraîche
 Collée sur un plot
 Congélation rapide à -30°C
 Coupe au cryostat (20 m)
 Etalement sur la lame
 Coloration express
 Lecture au microscope
 Communication du résultat (en 5- 10 minutes)
L’examen extemporané peut être effectué pour les raisons suivantes :

 Etablir un diagnostique susceptible de modifier le geste

chirurgical ;

7
  Confirmer la qualité des limites d’exérèse (en zone rechercher
une tumorale ou en zone saine) ;
 Rechercher une infiltration tumorale métastatique notamment
ganglionnaire.

Un cryostat est une enceinte réfrigérée contenant un microtome

permettant de réaliser aux dépens du tissu frais, déposé sur un plot
puis durci par le froid, une coupe à congélation.

V. HISTOLOGIE

Histologie correspond à l’examen de prélèvements tissulaires obtenus

soit par biopsie, soit par dissection d’une pièce opératoire ou
d’organes au cours d’une intervention chirurgicale. L’étude anatomo-
pathologique repose sur l’aspect macroscopique des lésions, l’analyse
des cellules et des tissus par diverses méthodes principalement basées
sur la morphologie. Elle a pour but de confirmer ou de préciser le
diagnostic d’une lésion, et de fournir le bilan topographique, surtout
pour s’il s’agit d’un cancer.

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Afin que cette étude soit réalisable, une suite d’étapes complexes qui
doivent s’enchainer avec rigueur et précision est nécessaire. Chacune
d’entre elles est importante et la qualité de leur réalisation est
primordiale pour obtenir une section tissulaire fine pour être traversée
par les rayons lumineux et colorée, car les tissus sont incolores, afin
d’analyser les structures au microscope optique.

1. Fixation

La fixation tissulaire est un temps essentiel qui conditionne toutes les

étapes ultérieures. Consiste à immerger le prélèvement dans le liquide
fixateur choisi. Elle a pour fonction principale de conserver les
différents éléments structuraux des tissus. Son principe repose
principalement sur l’utilisation d’un mélange de réactifs pouvant
assurer une bonne fixation des protéines, importante dans le maintien
de la structure (morphologie) des tissus. De plus, le fixateur doit
posséder des propriétés polaires pour une bonne miscibilité à l’eau
contenue dans les tissues. Elle a pour but de :

 Bloquer les enzymes endogènes responsables de la destruction

des organites cellulaires et la population microbienne ;
 Maintenir les structures cellulaires, tissulaires et moléculaires
dans un état aussi proche que possible de l’état physiologique ;
 Préserver leur réactivité pour une étude immuno-histochimique ;
 Préparer l’inclusion en paraffine.

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 La durée de la fixation dépend de la taille (l’épaisseur) du
prélèvement :
 Biopsies : minimum 6h
 Pièces opératoires : minimum 24h

-Le volume du liquide fixateur doit être au moins trois fois

équivalent à celui du tissu à fixer (3 vol formol/1 vol tissu).
- Température de fixation : réalisé à température ambiante.
Le principal fixateur utiliser dans le laboratoire est le formol qui est
resté le fixateur de référence en anatomie pathologique. Il réunit à la
fois les propriétés d’un liquide fixateur et d’un liquide conservateur.
Le formol est commercialisé à une concentration 37 % p/p ou 40 %
p/v, lui-même dilué au 10ème lors de son utilisation en laboratoire.

2. Macroscopie

L’analyse macroscopique est une observation soigneuse, à l’œil nu,

des altérations tissulaires. Elle permet de décrire la ou les lésions
observées et d’orienter dés lors le diagnostic. La dissection (découpe)
consiste à faire un échantillonnage des lésions de telle sorte que les
coupes finales observées soient représentatives des lésions. La qualité
de la réalisation de cette étape permet le bon déroulement de la suite
de l’analyse. Cette étape est fondamentale dans l’analyse histologique
puisque la lecture et l’interprétation microscopique des préparations
en dépendent.

Cet examen s’effectue sous la responsabilité du médicine qui réalise

les étapes suivantes :
10
  Description macroscopique des échantillons (la pièce est
examinée, mesurée, pesée, palpée puis des fragments à étudier
au niveau histologique sont préparés.)
 Les fragments d’organe doivent être orientés par rapport à la
pièce initiale ;
 Les tissus doivent être découpés proprement pour maintenir
l’architecture tissulaire.

Le nombre des coupes et les plans de coupe dépendent de la taille du

prélèvement, de sa nature, du type de lésion observée et des
observations macroscopiques. La dissection revient à faire un
échantillonnage de la lésion et comme tout échantillon, il se doit d’être
représentatif, d’où la difficulté de cette étape. Les parties tissulaires
représentatives (zones lésées, zones d’aspect macroscopique sain et
limites d’exérèse) de la lésion tumorale sont prélevées, découpées en
11
tranches au scalpel ou au couteau, puis placée dans des cassettes
identifiées. Les échantillons prélevés sont positionnés sur la fiche de
macroscopie (grille de coupe) ou la photographie quadrillée.

Les prélèvements qui ne peuvent pas être recoupés, comme les

biopsies, sont conditionnés dans des cassettes. Si le prélèvement est
trop fin ou plat, il est placé soit dans une cassette de biopsie, soit entre
deux mousses dans une cassette pour tissue afin d’éviter de la perdre à
travers les trous de la cassette et mieux le visualiser lors de l’inclusion
(l’enrobage).

Cas particuliers

Les tissus imprégnés de sels de calcium (cartilage, dents, lésions

caséeuses de la tuberculose, micro-calcifications, os et certaines
tumeurs) doivent faire l’objet d’un traitement particulier, la
décalcification, car ils ont une dureté qui rend impropre à la coupe au
microtome. Donc, il faut enlever de ces tissus la portion responsable

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de cette dureté par des agents décalcifiants. La décalcification est
réalisée après avoir fixé les tissus.

Plusieurs techniques de décalcification peuvent être utilisées:

• Technique de décalcification par bain dans une solution d’acide

faible puis inclusion en paraffine +++

• Enlèvement du calcium par un agent chélateur (EDTA).

Le temps de décalcification dépend de la taille, du type et de la densité

du tissu, et de la concentration du décalcifiant qui exerce également
une influence.

3. Circulation

Le tissu lui-même est trop malléable pour que l’on puisse en tirer des
coupes de l’épaisseur désirée. Pour durcir un tissu, son imprégnation
par une matière rigide lui donne la résistance mécanique voulue.
L’étape de circulation repose sur la substitution de l’eau qui est dans
les tissus par une substance totalement hydrophobe et chimiquement
inactive, telle que la paraffine.

Cette étape Se fait par :

 Passages successifs dans des bains d’alcool de degré croissant,

ce qu’on appelle la déshydratation.
 La substitution consiste à remplacer l’éthanol qui n’est pas
miscible à la paraffine par un solvant : toluène ou xylène. Ces
deux sont miscibles à la fois au déshydratant et à l’agent

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 d’inclusion, on parle d’agents éclaircissants (car ils ont la
propriété de rendre translucides les tissus qu’ils imprègnent).

4. Inclusion en paraffine (Enrobage)

Technique qui consiste à enrober le tissu préalablement déshydraté

pour réaliser le bloc. L’inclusion est l’étape ayant pour objectif de
remplacer l’eau contenue dans les tissus par de la paraffine. Il
consiste deux étapes successives:

 au cours de l’imprégnation où la paraffine est incluse dans le

tissu (va remplacer l’eau des tissus),
 et au cours de l’enrobage où le tissu est inclus dans un bloc de
paraffine. Permet d’obtenir des pièces rigides autorisant une
coupe fine 2 à 10 μm pour la microscopie optique.

14
Principe

 Le prélèvement histologique est déposé bien à plat au fond d’un

moule adapté à sa taille dans lequel est coulée la paraffine
chaude (56° - 60°).
 Sa cassette d’identification est posée dessus et l’ensemble est
refroidi immédiatement sur un platine réfrigérante (pour durcir
la paraffine). Après démoulage on obtient le bloc.

5. Microtomie
La microtomie a pour but d’obtenir des rubans de qualité très fins de 2
à 4µm (micron ou millième de millimètre). Cette épaisseur permet aux
rayons lumineux du microscope de traverser la préparation et d’éviter
les superpositions tissulaires. Ils sont confectionnés à température
ambiante et nécessitent un microtome muni d’une lame de rasoir. La
réalisation de coupes minces dépend du matériel à couper (dureté,
élasticité), des performances du microtome et de l’habilité manuelle
du (de la) technicien(ne).
15
 6. Coloration standard : H.E
Etapes préparatoires à la coloration.
La première étape de toute coloration d’une coupe histologique est
d’éliminer la paraffine du tissu pour que les colorants puissent le
pénétrer. Après séchage, les lames subissent (dans un automate pour
une bonne reproductibilité) un déparaffinage afin d’éliminer la
paraffine à l’aide d’un solvant (toluène, xylène), puis une
réhydratation qui consiste à substituer progressivement le solvant du
tissu par des bains d’éthanol décroissants pour amener à l’eau.
Etant donné que la plupart des colorants sont utilisés en solution
aqueuse, leur pénétration ne peut être assurée que si les coupes sont
imprégnées d’eau. L’hydratation a pour objet de retirer le xylène et
remplacer par de l’eau. Les larmes doivent être entièrement
immergées dans des bains de xylène et d’éthanol propres (non polluer
par la paraffine).

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Coloration
Le fait de colorer les coupes permet de visualiser les trois principaux
constituants morphologiques des tissus. La coloration usuelle la plus
utilisée est la coloration hématoxyline éosine (HE). C’est une
méthode bichromique. L’éosine teinte en rose non seulement les
cytoplasmes mais aussi le collagène en rose pale et les fibres
élastiques en rose vif. L’hématoxyline teinte les noyaux en bleus.
 Protocol de la coloration HE
Etapes Temps Principe
Immerger dans 3 minutes Déparaffinage
Toluène
Immerger dans 5 minutes chacun Réhydratation
Alcool 100% puis
90%, puis 80%, puis
70% puis rinçage.
Hématéine puis 5 minutes Coloration des
rinçage noyaux
Eau acétifiée puis 30 secondes Elimination d’excès
rinçage d’hématéine
Eau lithinée puis 30 secondes Différenciation et
rinçage bleuissement
Eosine puis rinçage 5 minutes Coloration du
cytoplasme
4 bains d’alcool (70, 5 minutes Déshydratation
80, 90 et 100%)

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 7. Montage
Etapes préparatoires au montage
 Déshydration
Cette étape permet de préparer les lames après une coloration afin de
réaliser un montage en résine. Les préparations subissent une
déshydratation qui consiste à retirer l’eau des coupes par des bains
successifs d’éthanol absolu puis à un éclaircissement dans des bains
de toluène, celui-ci étant miscible avec le milieu de montage. Cette
étape doit être rapide car l’éthanol (surtout en faible concentration) est
susceptible d’extraire plusieurs colorants des coupes.

Etapes Temps
Ethanol absolu 2 minutes × 2 bains et 1 mins × 1 bains
Toluène 1 minutes × 2 bains

Montage
Cette opération consiste à fixer à l’aide d’une résine synthétique une
lamelle couvre-objet sur le coup afin de la protéger de la dégradation
chimique des colorants qui s’oxydent à l’air et des bris mécaniques.

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  Préparation des plateaux de lecture
Cette étape post-coloration consiste en une vérification rigoureuse de
chaque lame avec son bloc d’origine et sa fiche de travail
(accompagnée éventuellement de la fiche de macroscopie) puis
identifiée avant d’être transmise au pathologiste pour l’interprétation
microscopique. Les lames sont classées sur des plateaux, par série en
ordre de la fiche de travail, et transmises au médecin pour la lecture.

Examen microscopique
Le pathologiste juge si l’interprétation des coupes colorées par HE est
suffisante pour établir un diagnostic ou s’il doit être complété par
d’autres techniques (histochimiques et/ou immuno-histochimiques).
Pour certaines cas, les premiers niveaux de coupe d’un bloc déterminé
ou d’une série de blocs ne sont pas informatifs pour mettre en
évidence des lésionnels. De ce fait, une recoupe du bloc ou une
macroscopie sur les résidus conservés en réserve (qui sont identifiés
comme un deuxième départ) sont demandées.

19
 8. Colorations spéciales
Les colorations spéciales ont pour but de mettre en évidence des
constituants particuliers au sein des cellules (glycogène, mucus,
pigments) ou de la matrice extracellulaire (amylose, collagènes, fibres
de réticuline), ainsi que des agents infectieux (bactéries, champignons,
parasites). L’histologie et la cytologie disposent d’un nombre
considérable de colorations spéciales et les variantes techniques
possibles sont presque infinies. De ce fait, sont cités ici, les
colorations les plus utilisée dans le laboratoire.
ORCEINE :
Protocole :
1-déparaffiner puis hydrater la lame
2-colorer dans l’orciene (30min)
3-rincer à l’eau distillée, essuyer
4-tramer dans alcool 95° pour enlever excès orciene
5-laver avec alcool absolu jusqu’à ce que coupe devient brun pale
6-décolorer le fond dans solution acide-alcool jusqu’à ce que coupe
devient incolore
7- laver ER (5min)
8-colorer les noyaux avec hématéine (5min)
9- alcool 95° puis alcool 100°
10- xylène
11- montage
Intérêt :
Mise en évidence des fibres élastique

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Résultats :
Fibre et lame élastique : brun noir
Noyaux : noir
PAS : ACIDE PERIODIQUE-SCHIFF
PROTOCOLE
1-après déparaffinage et réhydratation oxyder avec l’acide périodique
pendant 15 min
2-laver avec l’eau de robinet puis rincer avec l’ED
3-colorer avec le réactif de schiff pendant 10 min
4-laver avec l’eau chaude pendant 5min
5-colorer les noyaux avec l’hématéine de Harris pendant 2min
6- laver avec l’eau de robinet pendant 5 min
7- déshydraté puis monter
Intérêt
La coloration PAS (pour Periodic Acid Shiff) met en évidence les
mucines (épith. à bordures en brosse), les membranes basales, le
glycogène ainsi que les filaments et spores mycéliens.
Dans les tumeurs indifférenciées, cette coloration est utile pour
orienter le diagnostic vers une origine glandulaire (adénocarcinome).
Elle est demandée dans le diagnostic de pathologies du foie et rein.
Principe
La réaction à l’acide périodique de Schiff correspond à l’oxydation de
certains polysaccharides par l’acide périodique, révélée par une
coloration rouge
Résultats

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 Substance PAS rouge-rose-pourpre
Noyaux bleus
ROUGE CONGO :
Protocole :
1-après déparaffinage et réhydratation rincer à l’ED puis colorer à
l’hématéine de Harris pendant 3 à 5 min
2- rincer par l’eau lithinée
3-colorer avec le rouge congo 20min
4- rincer à l’ER puis déshydrater
5-monter la lame
Intérêt
Mise en évidence de dépôt d’amyloïde
Résultats
Amyloïde : rose à rouge
Noyaux : bleu
Picrosirius :
Protocole :
1- Après déparaffinage et réhydratation. Colorer au picrosirius
30min
2- Différencier à l’alcool éthylique à 96°
3- Laver à l’eau de robinet
4- Colorer le noyau par l’hémalun 3min
5- Rincer à l’eau courante puis déshydrater et monter
Intérêt
Mise en évidence des fibres de collagène et de réticuline

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Résultats
Les noyaux sont bleus
Les cytoplasmes sont jaunes
Les fibres de collagène et de réticuline en rouge
Trichrome
Protocole :
- Laver à l'eau distillée
- Placer sur les coupes Waigert hématoxyline A+B pendant 10
minutes (à reconstituer à parts égales)
- Laver à l'eau du robinet pendant 10 minutes
-Lavage à l'eau distillée
-Placer les coupes dans la solution de fuchine à l'acide écarlate de
Biebrich pendant 15 minutes
- Laver à l'eau distillée
- Différencier en acide phosphotungstique pendant 10-15 minutes.
Vérifiez que le collagène n'est pas rouge. Répétez la différenciation
fuchine si a tenu le rouge.
- Contre-colorer le feu vert (de l'acidification, l'acidification est très
subjective), pendant 1 à 2 minutes.
-Laver rapidement à l'eau distillée.
-Déshydrater, passer à l'alcool et au xylène
- Monter la lame
Intérêt
Mise en évidence les fibres de collagène
Résultats

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Noyaux : noir
Muscle cytoplasme et kératine : rouge
Collagène : vert
Méthode Mise en évidence
Bleu alcian (BA) Glucides
Periodic acid Schiff (PAS)
PAS diastase
Grocott Champignons
Huile rouge O (Oil red O) Lipids
Gram Les bactéries
Perls Dépôts ferriques
Ziehl-Neelsen Mycobactéries
Rouge Congo Amyloide
Trichrome de Masson Fibres de collagéne
Réticuline Fibres de réticuline
Giemsa Helicobacter Helicobacter

VI. CYTOLOGIE
La cytologie est l’examen microscopique de cellules, isolées ou en
petits amas, étalées sur lame de verre et colorées pour permettre de
distinguer plus aisément leur aspect, leur origine et leurs anomalies
afin d’établir un cytodiagnostic. Elle a l’avantage de montrer les
détails cellulaires et l’inconvénient de ne fournir aucune indication sur
l’indication sur l’organisation tissulaire, les anomalies architecturales

24
et les aspects d’envahissement. Elle donne un résultat urgent le jour
même, voir dans l’heure qui suit le prélèvement car les méthodes et
les techniques sont rapides.
La cytodiagnostique repose sur les connaissances des caractères
morphologiques des cellules normales ou pathologiques isolées de
leur contexte tissulaire : la taille et la forme des cellules, leur mode de
groupement, ainsi que le type des substances intercellulaires. Elle
permet donc de détecter la présence de cellules anormales mais ne
peut pas déterminer si un cancer est invasif ou pas.

Utilité de l’examen cytologique

 Dépistage des lésions pour orienter un diagnostic.
 Indispensable pour les lésions difficilement accessibles à la
biopsie et/ ou infracliniques.
 Confirme ou «redresse» parfois un diagnostic radio-clinique de
bénignité ou de malignité.
 Face à une métastase révélatrice d’un cancer, il permet de
diriger la recherche d’une origine primitive.
 Confirme la métastase d’un cancer connu, ce qui permet
d’évaluer le stade clinique.
 Évacue un kyste ou un liquide d’une cavité.
 Frottis de détection ou de surveillance en gynécologie (frottis
cervico-utérins).
 Suivi thérapeutique et post-thérapeutique.

25
Prélèvement cytologique
La cytologie intéresse à des fins diagnostiques principalement la
gynécologie (frottis cervico-utérin et aspiration endométriale), mais
également les liquides de l’organisme (écoulement ; épanchement
ascite ; liquide pleural ; liquide céphalorachidien (LCR) ; urines),
l’hématologie (ganglion et moelle osseuse) et la pathologie des
organes (glandes salivaires, foie, poumon, rein, sein, thyroïde…). Les
cellules isolées ou les petits amas cellulaires ainsi que les liquides
peuvent être obtenus de diverses façons. Les prélèvements
cytologiques (selon leur origine) sont généralement réalisés par des
médecins spécialistes au cours de leur consultation, au bloc opératoire
ou au chevet du patient.

Cytopréparation des échantillons cellulaires

Les échantillons cellulaires soumis à la cytolopréparation sont
techniques selon des protocoles en vigueur et le plus rapidement
possible afin d’éviter les altérations cellulaires dans le but d’obtenir
des étalements contributifs et des colorations de qualité.
En cas de besoin, par exemple en dehors des heures d’ouverture du
laboratoire, un liquide peut être provisoirement stocké dans un
réfrigérateur à +4°C, excepté le LCR qui doit impérativement être
techniqué dans les plus brefs délais à cause de sa fragilité.

Méthode de préparation cytologique Selon le type du prélèvement

26
Au niveau de laboratoire CHU, les prélèvements cytologiques est reçu
soit sous forme des ;

 lames étalées
 les flacons contenant les liquides ou
 Dans une seringue

Pour les lames étalées, on passe directement à la fixation dans Ether-

Alcool puis coloration. Mais pour les liquides biologiques dans les
flacons ou seringue, doit subissent les étapes suivant

Cytopréparation des liquides

Il existe plusieurs procédés techniques pour récupérer des cellules en

suspension dans un liquide physiologique ou de conservation. Selon
l’origine de l’échantillon et son aspect (clair, hémorragique,
visqueux…) des modes opératoires différents peuvent être réalisés. La
cytocentrifugation représente une aide inestimable pour le diagnostic
grâce à la concentration des cellules et à leur étalement monocellulaire

27
sur une surface réduite offrant une lecture rapide de la préparation.
Ce système utilise la force centrifuge (dans une enceinte
fermée) pour déposer les cellules en couche mince et homogène dans
une zone bien définie d’une lame tout en préservant l’intégrité
cellulaire. La suspension est distribuée dans cuves ou des godets
auxquels sont associés un filtre et une lame, le tout assemblé grâce à
un support. Cette ensemble est disposé sur un roter à basculé qui doit
être équilibré. La force centrifuge 1provoque le basculement, les
cellules sont déposées sur la lame tandis que le surnagent est absorbé
par le filtre.

Cytospin

La centrifugeuse Thermo Scientifique Cytospin 4 est une

centrifugeuse à basse vitesse utilisée pour séparer et déposer une
monocouche de cellules sur des lames tout en maintenant l'intégrité
cellulaire. La centrifugeuse Thermo Scientifique Cytospin 4 dépose
les cellules sur une zone clairement définie d'une lame de verre et
permet au liquide résiduel d'entrer dans la carte filtrante de la chambre
d'échantillon. La Cytospin 4 traite 12 échantillons à la fois.

28
Coloration Papanicolaou

Etape Temps Principe

Fixation des ≥ 15 minutes
étalements par Ether-
Alcool
Eau robinet 5 minutes
Alcool 70% puis 5 minutes
rinçage
Hématoxiline 5 minutes Coloration des
noyaux
Eau lithinée puis 30 secondes
rinçage
Alcool 80%, puis 30 secondes chacune
90%
Orange G6 5 minutes Coloration du
cytoplasme des
cellules kératinisées
Alcool 95% 2 minutes
Alcool pur 30 secondes
EA50 5 minutes Coloration du
cytoplasme
3 bains d’Alcool pur Déshydrations

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Etapes préparatoires au montage

Etapes Temps
Ethanol absolu 2 minutes × 2 bains et 1 mins × 1 bains
Toluène 1 minutes × 2 bains

Montage
Cette opération consiste à fixer à l’aide d’une résine synthétique une
lamelle couvre-objet sur le coup afin de la protéger de la dégradation
chimique des colorants qui s’oxydent à l’air et des bris mécaniques.
VII. L’IMMUNOHISTOCHIMIE
L’immunochimie est une méthode qui permet de localiser des
antigènes (ou protéines) de nature et d’origines variées grâce à
l’utilisation d’anticorps spécifiquement dirigés contre eux et révélés
par une réaction colorimétrique enzymatique (visible au microscope
optique) ou par une substance fluorescente (visible au microscope à
fluorescence).
Elle peut être réalisée sur des coupes de tissus congelés
(cryocoupes) ou fixés et inclus en paraffine (immuno histochimie), ou
sur des préparations cellulaires (immunocytochimie) de diverse nature
(cultures cellulaires, liquides biologiques, produits de ponction)
Une immunoréaction se compose de trois éléments principaux :
•la préparation des échantillons cellulaires ou tissulaires contenant
l’antigène recherché ;
•un anticorps spécifique dirigé contre l’antigène ;
•le système révélateur qui permet de visualiser l’immunoréaction.
30
Principe générale

Appareil de l’immunohistochimie

Principe de la procédure :
L'incubation de l'échantillon avec un réactif de blocage de la
peroxydase endogène approprié permet d'inhiber toute activité
peroxydase endogène qui pourrait être présente. L'échantillon est
ensuite incubé avec un anticorps primaire de souris caractérisé et dilué

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de manière adéquate, puis avec le polymère marqué pendant deux
périodes d'incubation de 30 minutes chacune. La procédure
d'immunomarquage se termine par une incubation de 5 à 30 minutes
avec un substrat chromogène approprié.
Les étapes :
Etape 1 : DEPARAFFINAGE
ETAPE 2 : DEMASQUAGE
Permet de rendre accessibles les épitopes masqué naturellement on
suite à la fixation afin d’assurer la liaison anticorps-antigène avant
l’incubation aux anticorps
ETAPE 3: SOLUTION DE BLOCAGE DE LA PEROXYDASE
Appliquer suffisamment de solution de blocage de la peroxydase pour
couvrir l'échantillon.
Faire incuber pendant 5
ETAPE 4 : ANTICORPS PRIMAIRE
Appliquer suffisamment d'anticorps primaire dilué de façon optimale
pour couvrir l'échantillon.
Faire incuber pendant 30
ETAPE 5 : POLYMERE-HRP ANTI-SOURIS MARQUE
Appliquer suffisamment de polymère marqué pour couvrir
l'échantillon.
Faire incuber pendant 30
ETAPE 6 : SUBSTRAT CHROMOGENE
Appliquer suffisamment de substrat chromogène pour couvrir
l'échantillon.

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Incuber pendant 5 à 30 minutes.
ETAPE 7 : CONTRE-COLORATION À L'HEMATOXYLINE
Immerger les lames dans un bain d'hématoxyline aqueuse. La durée
d'incubation dépend de la force de l'hématoxyline utilisée.
À la fin du cycle, retirer le portoir à lames et immerger les portoirs
dans de l'eau déionisée propre.
▪ Déshydrater, éclaircir et monter les coupes et puis déposer sur
les lames des lamelles de protection.
▪ Chaque cycle de coloration doit comprendre un échantillon de
contrôle positif connu pour vérifier la bonne performance de tous les
réactifs appliqués. Si l'échantillon de contrôle positif ne présente pas
de coloration positive, le marquage des échantillons à analyser doit
être considéré comme non valide.
▪ Un réactif de contrôle négatif doit être également utilisé avec
chaque échantillon afin d'identifier toute coloration non spécifique. Si
une coloration non spécifique ne peut pas être clairement différenciée
de la coloration spécifique, le marquage de l'échantillon à analyser
doit être considéré comme non valide.
VIII. BIOLOGIE MOLECULAIRE
Les examens de biologie moléculaire effectués à partir de tumeurs
humaines permettent désormais d'optimiser l'offre de soins proposée,
dans le cas de patients atteints de cancer : ainsi, la mise en évidence de
mutation de gènes, grâce à leur amplification, ou celle de
réarrangements chromosomiques, contribuent à cibler plus
précisément la stratégie thérapeutique.

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 La détection d’une mutation de KRAS

METHODE
Trois étapes sont incluses à la procédure: (1) isolation de l’ADN, (2)
amplification PCR en utilisant des primers biotinylés, (3)
hybridisation des produits d’amplification sur une bandelette
contenant des sondes allèle-spécifiques, immobilisées sur un
arrangement de bandes parallèles. Des séquences biotinylées liées à la
bandelette sont détectées en utilisant de la streptavidine-phosphatase
alcaline et des substrats chromogènes.
1-L’extraction d’ADN :
Préparation de l’échantillon
- Racler une coupe FFPE à l’aide d’un scalpel et mettre dans un
tube de 1.5ml

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 - Centrifuger l’échantillon brièvement à vitesse maximum pour
collecter l’échantillon au fond du tube
- Ajouter 20ul de protéinase K et 180ul de « incubation buffer »
- Fermer le tube et incuber la nuit à 70°C

Thermomixer

Le protocole d’extraction :
1- Ajouter 400ul de lysis buffer
2- Vortexer brièvement
3- Prendre une cartouche d’extraction Maxwell 16 FFPE DNA et
en retirer le film
4- Placer un plongeur dans le puits 8 de la cartouche
5- Transférer les 400ul d’échantillon dans le puits 1 de la cartouche
6- Allumer le Maxwell
7- Sélectionner le protocole : DNA/FFPE
8- Placer la cartouche sur la plateforme Maxwell
9- Marquer vos initiales ainsi que ADN sur un tube d’élution et
ajouter 50ul d’eau nucléase free
10- Démarrer l’extraction

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 Maxwell :

Dosage par spectrophotomètre :

La concentration en ADN de l’échantillon est estimée par
spectrophotomètre. Les acides nucléiques présentent une pie
d’absorption dans l’ultraviolet. Le maximum de cette absorption se
situe à 260nm.
L’interférence par des contaminants se reconnait par calcul d’un ratio
Les protéines absorbant à 280nm, le ratio A260/A280 est utilisé pour
estimer la pureté l’acide nucléique
Au laboratoire de bio pathologie, le spectrophotomètre (Nano vue plus
BIOCHROM) et utilisé pour réaliser le dosage. Il suffit de déposedans
l’appareil 2ul d’ADN extrait pour déterminer sa concentration et
obtenir la courbe qui renseigner sur sa pureté.

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 2. Amplification In Vitro :
Tenir tous les réactifs PCR et la matrice d'ADN au frais pendant la
procédure. Exécuter toutes les étapes jusqu’au commencement du
programme du thermocycleur sur glace pilée (0-4°C).
• Préparer une nouvelle solution de travail (1:25, concentration
finale 0.2 U/µl) de « Taq DNA Polymerase » (couvercle rouge)
dans du « Taq Dilution Buffer » (couvercle transparent).
• Préparer un tube à réaction par échantillon à amplifier. Placer
les tubes sur glace pilée.
• Préparer sur glace un mixe de réaction PCR (A et B) finales par
échantillon:
15 µl Amplification Mix A (couvercle jaune)
5 ul Taq DNA Polymerase diluée
5 µl matrice d'ADN
• Bien fermer les tubes. Préchauffer le thermocycleur à 37°C.
• Introduire les tubes à réaction et dérouler le programme
thermocycleur comme suit:
pré-PCR: 37°C/10 min
94°C/2 min
Thermocyclage : 94°C/1min - 70°C/50 sec - 56°C/50 sec-
60°C/1min (35cycles)

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 Extension finale: 60°C/3min

Termocycleur

3-Analyser les produits d’amplification par gel électrophorèse :

Préparation de gel d’agarose :
1- Mélanger tampon TBE et agarose à raison de 0,9 g d'agarose pour
75mL de tampon
2- Faire fondre l'agarose au four à micro-ondes en surveillant pour
éviter les projections ou au bain marie. Agiter de temps à autre pour
homogénéiser le mélange.
3- Laisser refroidir jusqu'à ce qu’il devienne possible de saisir le
flacon à main nue (environ 60 °C).
4- Placer les joints fournis avec la cuve pour fermer le support de gel
et positionner le peigne à 1 mm du fond et à environ 1 cm de
l’extrémité du support. Régler le niveau pour que le support de gel soit
horizontal.
5- Couler lentement le gel sur 3 à 5 mm d'épaisseur en veillant à ce
qu’il entoure bien les dents du peigne.

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6- Laisser refroidir, enlever le peigne et les joints. Le gel est prêt pour
le dépôt des échantillon

Réalisation de l’électrophorèse sur gel d’agarose :

 Mélanger le colorant (bleu de bromothymole) 5ul et l’ADN 5ul
sur un morceau de parafilm et prélever le mélange avec une
micropipette réglée sur le volume approprié en changeant de
cône à chaque prélèvement.
 Placer le support avec le gel chargé dans la cuve
d'électrophorèse en positionnant les puits du côté de la cathode
 Remplir la cuve de tampon TBE en versant délicatement et très
lentement lorsque le gel commence à être recouvert pour éviter
les fuites d’ADN vers le tampon.
 Remplir les puits en faisant attention de ne pas déchirer le fond
du gel avec la pointe de la pipette.
 Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension.

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  Laisser migrer jusqu’à ce que le colorant de charge arrive à
proximité du bord du gel (environ 55 min à 100 V pour un gel de
80 mm dans une minicuve).
 Couper l’alimentation, débrancher les connections et récupérer le
gel dans son support.

Visualisation :

4-hybridisation (45°C; bain-marie agitant) :

Préchauffer « Hybridization Buffer » et « Wash Solution A » à 45°C.
(Attention: Toutes les précipitations formées à 2-8°C doivent être
complètement solubilisées.)

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Amener les « Tests trips », le « DNAT », le « Conjugate
Solution », la « Wash Solution B » et le « Color Developer » à
température ambiante. Préparer les plateaux de typage.
Sortir une « Teststrip » par échantillon de l’emballage en utilisant des
pinces propres. (Ne toucher les « Teststrips » qu’avec des gants!)
Etiqueter les « Teststrips » en dehors des bandes de marquage avec un
crayon. (Pas de stylo à bille, pas de marqueurs etc.)
• Pipeter 10µl de « DNAT » (couvercle bleu) au bas de chaque couloir
prévu pour l’utilisation dans les plateaux de typage (un couloir par
échantillon).
• Ajouter 10 µl de produit d’amplification A à la goutte
correspondante de « DNAT ».
Mélanger soigneusement en utilisant une pipette. (La solution restera
bleue.)
• Laisser pendant 5 min à température ambiante.
• Ajouter 1 ml de « Hybridization Buffer » (préchauffé à 45°C) à
chaque couloir.
Agiter le plateau délicatement. (La couleur bleue disparaîtra.)
• Insérer les « Teststrips » avec la face marquée vers le haut (bandes
visibles!) aux compartiments correspondants. Immerger
complètement.
• Incuber pendant 30 min à 45°C sur la plaque d’agitation du bain-
marie.

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Mettre une fréquence d’agitation modérée (env. 50 rpm) pour éviter
les pertes. Laisser fermer le couvercle du bain-marie pour éviter des
variations de température.
• A la fin de l’incubation, enlever les solutions d’hybridisation par
aspiration à vide.
Continuer immédiatement. Eviter l’assèchement des « Teststrips »
durant la totalité de la procédure.
5. Lavage rigoureux (45°C; bain-marie agitant) :
• Ajouter 1 ml de « Wash Solution A » (préchauffé à 45°C). Rincer
brièvement (10 sec).
Enlever les liquides par aspiration à vide.
• Ajouter 1 ml de « Wash Solution A » (45°C).
• Incuber pendant 15 min à 45°C dans le bain-marie.
Enlever les liquides par aspiration à vide.
• Ajouter 1 ml de « Wash Solution A » (45°C).
• Incuber pendant 15 min à 45°C dans le bain-marie.
Enlever les liquides par aspiration à vide.
6. Développement de la coloration (température ambiante) :
• Ajouter 1 ml de « Conjugate Solution ».
• Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur
basculant ou rotatif.
Enlever les liquides par aspiration à vide.
• Ajouter 1 ml de « Wash Solution B ». Rincer brièvement (10 sec).
Enlever les liquides par aspiration à vide.
• Ajouter 1 ml de « Wash Solution B ».

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• Incuber pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur
basculant ou rotatif.
Enlever les liquides par aspiration à vide.
• Ajouter 1 ml de « Wash Solution B ».
• Incuber pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur
basculant ou rotatif.
Enlever les liquides par aspiration à vide.
• Ajouter 1 ml de « Color Developer ».
• Incuber pendant 15 min à température ambiante à l’obscurité sur un
agitateur basculant ou rotatif
Une couleur pourpre apparaîtra comme résultat d’une réaction
positive.
• Laver les « Teststrips » plusieurs fois avec de l’eau distillée.
Laisser sécher les « Teststrips » à l’obscurité sur du papier absorbant.
Eviter d’exposer les « Teststrips » à la pleine lumière après le
développement de la coloration
Interprétation des résultats:
Le génotype d’un échantillon est déterminé en utilisant le «
CollectorTM » inclus au coffret.
Placer la « Teststrip » traité dans une des zones désignées, aligner sur
le schéma en utilisant la bande de marquage rouge (en haut) et la
bande de marquage verte (en bas), et fixer avec du ruban adhésif.
 Une réaction positive de la bande de contrôle tout en haut
indique le bon fonctionnement des réactifs « Conjugate Solution

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 » et « Color Developer ». Cette bande devrait toujours être
colorée positive.
 Une réaction positive de la bande « PCR Positive Control »
valide la présence de tous les composants nécessaires à la PCR,
et assure une qualité adéquate de l’ADN matrice pour l'analyse
des mutations. Si la « PCR Positive Control » est négative avec
l’ADN matriciel, répéter l’analyse en repartant de l’étape de
préparation de l’ADN.
 Aucune bande obtenue au niveau des « PCR Negative Control »
atteste de l’absence d’amplification de copies sauvages de
EGFR. Si un « PCR Negative Control » est par contre positif (ce
qui traduit par ex. un excès d’ADN génomique dans la réaction
de PCR), la sensibilité du test peut être abaissée.

EGFR PCR Negative PCR Positive Interprétation

Control Control
une ou plusieurs négative positive Mutation KRAS
bandes positives respective présente

négative négative positive aucunes mutations

KRAS présentes

négative négative négative contrôle négatif ou

échec expérimental

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 Absence de mutation pour les deux premiers patients
Présence de mutation dans KRAS du patient 3 et 4
Système de diagnostic moléculaire automatisé de PCR en temps
réel : idyla
. • Traitement « échantillon à résultat » du tissu FFPE en 90 minutes

• Préparation de l’échantillon en moins de 2 minutes

• Tous les réactifs sont intégrés dans la Cartouche

• Conception qui limite la contamination

• Aucun déparaffinage manuel requis

• Contrôles de traitement d’échantillon dans toutes les chambres de

PCR

• Haute spécificité et sensibilité

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• Détection des mutations

Principe :

 Liquéfaction
 Lyse cellulaire Extraction d’ADN/ARN(1)
 Amplification et détection PCR en temps réel
 Analyse des données et génération de rapports

Détection d’helicobacter pylori par PCR en temps réel multiplexe

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Principe :

Le test RIDA GENE Helicobacter pylori est un test de PCR en temps

réel multiplexe pour la détection qualitative directe de Helicobacter
pylori dans échantillons de biopsies d’origine humaine.

Après isolation de l’ADN, on procède à l’amplification des fragments

géniques spécifique à Helicobacter pylori et responsables d’une
possible résistance à la clarithromycine.

Les cibles amplifiées sont détectées grâce à des sondes (Taq Man)
pour hydrolyse qui sont caractérisées à une extrémité par un extincteur
et à l'autre extrémité par un indicateur fluorescent de colorant
(fluorophore). En présence d'une cible, les sondes s'hybrident aux
amplicons. Pendant l'étape d'extension, la Taq - Polymerase rompt la
proximité indicateur - extincteur. L'indicateur émettant un signal de
fluorescence qui est détecté par l'unité optique d'un instrument de PCR
en temps réel. Le signal de fluorescence augmenté avec le nombre
d'amplicons formés. Le test RIDAGENE Helicobacter pylori contient
un ADN de contrôle interne (ICD ) en tant que contrôle interne de la
procédure de préparation des échantillons et / ou pour déterminer une
éventuelle inhibition de la PCR .

Les réactifs utilisés :

 Reaction mix
 Taq-Polymérase
 Internal control DNA

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  Contrôle négatif
 Contrôle positive

Configuration du canal de détection :

H. pylori : FAM

Contrôle interne : HEX

Résistance à la clarithromycine : Cy5

Interprétation des résultats :

cas1 :

Présence d’Helicobacter pylori (bleu)

Absence de résistance à la clarithromycine

(violet)

cas2 :

Absence d’Helicobacter Pylori

Absence de résistance à la clarithromycine

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 IX. CONCLUSION
Le diagnostic anatomopathologique a un rôle majeur dans l’évaluation
du pronostic clinique et dans le choix thérapeutique.
L’intégration complète de l’activité anatomo-pathologique dans le
trajet de soins du patient
est primordiale. Ceci nécessite une grande responsabilité qui est
confiée aux
techniciens de laboratoire pour un bon diagnostic.
Au cours de ce stage, les objectifs ont été atteints et nous avons pu
approfondir nos
connaissances dans le domaine de l’anatomopathologie et mieux
comprendre les cours
théoriques que nous avons acquis.

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