REPUBLIQUE DU CAMEROUN

Paix – Travail – Patrie REPUBLIC OF CAMEROON

----------------------------- Peace – Work - Fatherland
UNIVERSITE DE DSCHANG -----------------------------
Scholae Thesaurus Dschangensis Ibi Cordum UNIVERSITY OF DSCHANG
----------------------- Scholae Thesaurus DschangensisIbiCordum
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FACULTE DE MEDECINE ET DES SCIENCES
FACULTY OF MEDICINE AND
PHARMACEUTIQUES
PHARMACEUTICAL SCIENCES
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DEPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE- DEPARTMENT OF MICROBIOLOGY-
HEMATOLOGIE-IMMUNOLOGIE HEMATOLOGY-IMMUNOLOGY
BP/ P.O. Box 96, Dschang; Tél/Phone (237) 233 45 13 81; Website: http://www.univ-dschang.org; E-mail: [email protected]

Présenté par :
1. NDONGMO DONJIO CORINE LEADER
2. TAGAKO KAMWA SYLVIA DIOR

Sous la supervision de :

Dr. TCHOUANGUEU THIBAU FLAURANT

 PLAN DE TRAVAIL
INTRODUCTION
I. GENERALITES

II. EPIDEMIOLOGIE

1- REPARTITION DE L’INFECTION

2- MODE DE TRANSMISSION

III. PHYSIOLOGIE ET COMPLICATIONS

IV. DIAGNOSTIC

1- PRELEVEMENT

a- CONDITIONS PREANALYTIQUES

b- TRANSPORT ET CONDITIONNEMENT DU SPECIMEN

2-TESTS DE DIAGNOSTIC

a- PRINCIPES

b- MODE OPERATOIRE

c- RESULTATS REACTIFS/ NON REACTIFS

d- CONTROLE QUALITE INTERNE

e- CRITERS DE VALIDATION DU TEST (S4, SP, VPP, …)

2- INTERPRETATION DES RSULTATS DE DIAGNOSTIC

CONCLUSION

LEXIQUE

SOURCES
 INTRODUCTION

Les rétrovirus sont les virus à ARN enveloppé, définis par plusieurs mécanismes de
réplication utilisant une transcriptase reverse, produisant des copies d’ADN qui s’intègrent
dans le génome de la cellule hôte. Plusieurs rétrovirus tels que les deux types de VIH (VIH 1
et VIH2) provoquent de sérieux troubles chez les patients infectés. L’infection initiale peut
entrainer un état fébrile non spécifique. Le risque de manifestations ultérieures liées au déficit
immunitaire peut entrainer une maladie proportionnelle au taux de déplétion de LT CD4+. Ce
virus peut léser directement le cerveau, le cœur, les gonades, provoquer une cardiomyopathie.
L’infection au VIH peut être diagnostiquée au moyen des tests sérologiques, des tests utilisant
des acides nucléiques (ARN du VIH), des antigènes(P24). Le traitement a donc pour but de
supprimer la réplication du virus en utilisant des associations de plus de 2 médicaments qui
inhibent les enzymes du VIH.
 I. GENERALITES
Le VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine) est un virus qui cible les cellules
immunitaires affaiblie les défenses de l’organisme en éliminant les LT helpers CD4 +.
L’infection du VIH traverse ensuite de nombreuses étapes avant de se transformer en SIDA.
C étapes sont entre autre :
-La maladie de seroconservation : ceci se produit 1 à 6 semaines après avoir acquis
l’infection.
- Une infection asymptomatique : après seroconvertion, les niveaux de virus sont bas et
la réplication continue lentement, les niveaux de LT CD4 et CD8 sont normaux. Cette
étape n’a aucuns symptômes et peut persister des années en phase de latence.
- La lymphadenopathie généralisée persistante : les ganglions lymphatiques des patients
sont gonflés pendant trois mois ou plus, et non en raison de toute autre cause.
- Les infections symptomatiques : cette étape manifeste des symptômes ; de plus, il peut
y avoir des maladies opportunistes.
- Le SIDA : cette étape et caractérisée par un déficit sévère du système immunitaire. Il y
a des signes d’infections potentiellement mortelles et des tumeurs exponentielles.

II. EPIDEMIOLOGIE
1. Répartition de l’infection
En 2015, on estime à 36,7 millions le nombre de personnes infectées par le virus.
Le virus de l’immunodéficience Humaine(VIH) a une prévalence variable d’un pays à l’autre.
La pandémie de ce virus est plus grave en Afrique Australe ; plus de 10% de toutes les
personnes vivant avec le VIH/SIDA résident dans la région. La prévalence du VIH chez
l’adulte dépasse 20% au Botswana et au Lesotho tandis que six autres pays signalent une
prévalence du VIH chez l’adulte d’au moins 10%.
 Au Cameroun, cette prévalence est comprise en moyenne entre 5 et 8 %.
Cette prévalence augmente rapidement. En 1990, on comptait 32000 séropositifs, en 1995, ce
nombre avait augmenté de plus de huit fois soit 264000 personnes infectées en raison de
l’augmentation de la population et de l’accès aux trithérapies.

Prévalence du VIH chez les personnes adultes en Afrique

2-Mode de transmission

Seuls cinq liquides organiques peuvent contenir suffisamment le VIH pour que
la transmission du virus soit possible à savoir lesquels : le sang, le sperme (y
 2. Modes de transmission
compris le liquide pre-éjaculat), les secrétions rectales, les secrétions vaginales et le lait
humain.
Ce virus ne peut être transmis que lorsque ces liquides entrent en contact avec la
circulation sanguine d’une personne séronégative pour le VIH, soit par lésion cutanée, soit par
muqueuse (‘‘ les tissus humides’’ tapissant les orifices de l’organisme). Ceci étant, plusieurs
modes de transmissions du VIH peuvent être possibles, à savoir :
- Une activité sexuelle non protégée
- Une pénétration anale ou buccale
- Le partage ou la réutilisation d’aiguilles ou d’autres fournitures servant à l’injection des
drogues ou au tatouage/ perçage corporel
- La transmission de la mer a l’enfant : durant la grossesse (par transmission périnatale,
par le placenta au fœtus, pendant le travail, a l’accouchement) et l’alimentation des
nourrissent

Quelques facteurs nécessaires à la transmission du VIH :

Trois facteurs principaux sont nécessaires à la transmission du VIH, nous notons ainsi :
- Un liquide
- Une voie d’accès
- Une activité ou un évènement.
Une certaine quantité de virus contenue dans un liquide organique porteur du VIH doit
entrer dans l’organisme d’une personne séronégative, ce qui n’est possible que dans un nombre
limité d’activités.
Quelques méthodes de prévention :
Plusieurs méthodes de prévention ont prouvé leur haut niveau d’efficacité dans la réduction du
risque d’infection à VIH et la protection contre cette infection, notamment :
- Les préservatifs masculins et féminins
- L’administration des antirétroviraux en guise de prophylaxie preexposition
- Les campagnes de sensibilisations
 I. PHYSIOPATHOLOGIE ET COMPLICATIONS
1. Physiopathologie
La quantité de virus dans le sang et les autres liquides organiques d’une personne
séropositive pour le VIH s’appelle ‘‘ charge virale’’ et s’exprime en copies du virus par
millilitres de sang (copies/ ml). Lorsqu’un patient présente une charge virale inferieure a un
seuil de certains tests (cas des tests récemment utilisés au canada dont l’une des valeurs
seuils est de 20 copies/ ml), alors, cet individu présente une charge virale indétectable. Ceci
étant, un malade nouvellement infecté qui suit un traitement efficace sans interruption peut
voir sa charge virale devenir indétectable au bout de trois à six mois environ. Le fait d’avoir
une charge virale indétectable réduit considérablement ou élimine le risque de transmission
du VIH d’une personne a une autre.

 La charge virale
  Action
Le VIH est dû à deux rétrovirus similaires (VIH1 et VIH2) qui détruisent les lymphocytes
T CD4+ et perturbent le fonctionnement de l’immunité a médiation cellulaire, ce qui entraine
une augmentation du risque de certaines infections et certains cancers.
L’infection initiale peut entrainer un état fébrile non spécifique. Le risque de manifestations
ultérieures lié au déficit immunitaire est proportionnel au taux de déplétion* des LTCD4+.

Variation des LT CD4 en fonction du temps

Ce virus ne peut se répliquer de manière autonome et pour cela, doit donc prendre le contrôle
des cellules de cibles immunitaires (LT CD4 pour sa réplication) Il peut donc léser directement
le cerveau, les gonades, les reins, le cœur, pouvant provoquer un déficit cognitif, un
hypogonadisme, une insuffisance rénale.

Ces manifestations peuvent aller des formes asymptomatiques au Syndrome de l’Immunodéf

 1- Complications
Le virus peut être transmis de la mère a l’enfant. En cas d’absence de traitement contre ce
dernier, il y a 15 à 30% de risque qu’un bébé né d’une femme vivant avec le VIH le contracte
pendant la grossesse ou l’accouchement. Cependant, la meilleure façon de prévenir la
transmission a son bébé est de suivre un traitement anti-VIH pour maintenir une charge virale
indétectable.
NB : Des études ont montré que si une femme enceinte commence un traitement anti-VIH
avant la grossesse et maintient une charge virale indétectable pendant la grossesse et
l’accouchement, elle ne transmet pas le virus a son bébé. Lorsque le traitement est entrepris
après la conception et qu’il est suivi pendant le reste de la grossesse et l’accouchement, le
risque de transmission du virus est faible. Ainsi, un court traitement avec des médicaments
anti-VIH est également administré au nourrisson immédiatement après la naissance afin de
prévenir la transmission du VIH.
Si le virus peut se répliquer pendant un a trois jours sans obstacles, il peut alors se
propager a d’autres parties de l’organisme, ce qui rend l’infection permanente Les personnes
infectées par le VIH peuvent présenter par la suite les symptômes d’infections aigues telles
que : la fièvre, les frissons, les éruptions cutanées, les douleurs musculaires, le mal de gorge,
l’enflure des ganglions lymphatiques, la fatigue, les aphtes, la sensibilité aux maladies
opportunistes, la progressassions de l’infection jusqu’à la phase sidéenne et bien d’autres qui
peuvent durer quelques jours à quelques semaines.

Eruptions cutanées

Insuffisance rénale Asthénie

Aphtes
 V. DIAGNOSTIC
1. Prélèvement

Il est à noter que, ces prélèvements (sanguins, rectaux, vaginaux, le LCR, le prélèvement des
muqueuses) doivent être réalisés dans des conditions aseptiques pour éviter toute
contamination.
Le sérum, le plasma et le sang total doivent être réalisés de manière a éviter une éventuelle
hémolyse.

a. Conditions preanlytiques :
Parlant de phase pre-analytique, il s’agit de l’ensembles des étapes allant du
prélèvement au traitement de l’échantillon. Durant cette étape, le risque de dégradation de la
qualité des échantillons est majeur. Il est donc indispensable de contrôler chacune d’entre elles
et ce dès que l’échantillon n’es plus irrigue par la circulation sanguine.
L’analyse se fait sur une petite quantité de matière qui doit être sélectionnée avec soin
pour être représentative a l’état physiopathologique d’un patient. Ainsi donc, des précautions
doivent être prises à savoir :
- Le port des gants
- Ne pas effectuer des pipetages a la bouche
 - Nettoyer et désinfecter toutes les éclaboussures d’échantillons et de réactifs à l’aide d’un
désinfectant antimicrobien approprié.

b. Transport et conditionnement du spécimen

 Transport
Après le traitement preanalytique, la conservation de la qualité est toujours prioritaire. Dans
le cas où la totalité de l’échantillon n’est pas utilisée, il peut servir à de futures analyses soit
dans l’optique d’évaluer le nombre de mutations après un certain temps, soit pour reprendre le
même examen en cas d’erreurs de manipulation ou pour diverses autres raisons.
Une fois les spécimens prélevés, ils peuvent être contenus dans des tubes sec, selon que le
biologiste désire obtenir un sérum pour une éventuelle réaction sérologique, soit dans des tubes
a EDTA pour obtenir un plasma, etc.
En ce qui concerne les prélèvements vaginaux/ cervicaux, le spécimen peut être contenu dans
un écouvillon
Le LCR quant à lui peut-être transporter soit dans des tubes … soit dans des écouvillons et
maintenus à température adéquate.

Conditionnement du spécimen
La conservation des échantillons peut se faire par :
-Cryoconservation : pour les tissus solides
-Par fixation avec du formol et inclus en bloc de paraffine (l’inclusion en paraffine se fait à
température contrôlée selon le point de fusion du type de paraffine utilisée, dans le but d’éviter
toute dégradation des tissus. Les paraffines recommandées ont généralement un point de fusion
entre 55 ̊C et 58˚C
-Soit par congélation
En ce qui concerne le VIH, l’exposition a une température de 60 ̊ C pendant 30 inactivera
probablement le VIH :
*Si le test est effectué dans les 7 jours qui suivent le prélèvement, les échantillons de
sérum et de plasma doivent être conservés à des températures comprises entre 2 ̊ et 8 ̊C. Sils
sont analyses plus de 7 jours après le prélèvement, ils doivent être congelés à une température
inférieure ou égale à -20 ̊C

NB: NE PAS CONGELER LES ECHANTILLONS E SANG TOTAL. LE SANG

PRELEVE AU BOUT DOIGT, DOIT ETRE ANALYSE IMMEDIATEMENT.
 2. Test de diagnostic
Le diagnostic du virus de l’immunodeficience humaine(VIH) peut être mis en évidence de
diverses manières, soit de manière directe, soit de manière indirecte. Les méthodes directes
permettent de rechercher soit l’antigènes sous différentes formes (larves, œufs, etc.), soit des
fragments antigéniques (capside, matériel génétique, épitope, etc.) présents dans notre
spécimen à analyser. Les méthodes indirectes quant à elles permettent d’évaluer la réponse de
l’organisme a une agression pathogène.

I- DIAGNOSTIC
1- Prélèvement sanguin, transport et conditionnement du spécimen
 Prélèvement des échantillons
Prélèvement de sérum, de plasma et de sang total par ponction veineuse
Le sérum, le plasma et le sang total humains prélevés par ponction veineuse doivent être
recueillis dans des conditions d'asepsie, de manière à éviter l'hémolyse.
REMARQUE: Pour les échantillons de sang total et de plasma, il faut utiliser des tubes de
prélèvement avec de l'EDTA.
Prélèvement de sang total sur le bout du doigt Avant de prélever un échantillon sur le bout du
doigt, placer un tube capillaire avec EDTA sur une surface propre et sèche.
1. Pour les adultes et les enfants de plus d'un an, choisir le bout du majeur, de l'annulaire ou de
l'index (choisir le moins calleux). Chauffer la main avec une serviette chaude et humide ou
bien avec de l'eau chaude afin d'augmenter le flux sanguin.
2. Nettoyer le bout du doigt avec de l'alcool; laisser sécher à l'air. Placer la main paume vers le
haut.
3. Utiliser une lancette différente pour chaque personne. Placer la lancette sur un côté du bout
du doigt. Appliquer une ferme pression sur la lancette placée sur le doigt et piquer la peau.
Jeter la lancette dans un récipient pour déchets biologiques pointus.
4. Essuyer la première goutte de sang avec une gaze stérile.
5. Maintenir le doigt un peu plus bas que le coude et appliquer par intermittence de faibles
pressions à la base du doigt piqué. Effleurer la goutte de sang avec l'extrémité du tube capillaire
contenant de l'EDTA*. Eviter la formation de bulles d'air.
*Si l'on utilise les tubes capillaires contenant de l'EDTA (7D2222), les remplir de sang jusqu'à
un niveau situé entre les deux traits (50 µL).
CONDITION PREANALITIQUES:
Les échantillons et réactifs doivent être manipulés conformément aux règles biologiques en
vigueur. Ces précautions comprennent, entre autres, les mesures suivantes
• Porter des gants. Ne pas effectuer des pipetages à la bouche
- Ne pas manger, boire, fumer, ni manipuler des produits cosmétiques ou des lentilles de
contact dans les locaux ou sont manipuler ces matériaux.
 - Nettoyer et désinfecter toutes les éclaboussures d'échantillons et de réactifs à l'aide d'un
désinfectant antimicrobien approprié tel qu'une solution d'hypochlorite de sodium à
0,5%. • Décontaminer et éliminer tous les échantillons, réactifs et autres substances
susceptibles d'avoir été contaminées conformément à la règlementation en vigueur.
CONSERVATION DES ECHANTILLONS
• Si le test est effectué dans les 7 jours qui suivent le prélèvement, les échantillons de sérum et
de plasma doivent être conservés entre 2 et 8°C. S'ils sont analysés plus de 7 jours après le
prélèvement, ils doivent être congelés (à une température inférieure ou égale à -20°C).
• Si le test est effectué dans les 7 jours qui suivent le prélèvement, le sang total prélevé par
ponction veineuse doit être conservé entre 2 et 8°C. Ne pas congeler les échantillons de sang
total. Le sang total prélevé sur le bout du doigt doit être analysé immédiatement.
PRINCIPES BIOLOGIQUES DE LA METHODE
Détermine TM HIV-1/2 est un test immunochromatographique pour la détection qualitative
des anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2. L'échantillon est déposé sur la zone de dépôt de
l'échantillon. Comme l'échantillon migre jusqu'à la zone de dépôt du sélénium-antigène. Ce
mélange continue à migrer sur la phase solide jusqu'aux antigènes recombinants immobilisés
et aux peptides synthétiques au niveau de la fenêtre-patient.
Si les anticorps anti-VIH-1 et/ou anti-VIH-2 sont présents dans l'échantillon, ils se lient à
l'antigène du sélénium antigène-colloïde et à l'antigène de la fenêtre-patient en formant une
ligne rouge au niveau de la fenêtre patiente.
Si les anticorps anti-ViH-1 et/ou anti-VIH sont absents, le conjugué-2 antigène-colloïde de
sélénium traverse la fenêtre-patient sans former de ligne rouge.
Une barre de contrôle de la procédure est incluse dans ce système de test afin d'assurer la
validité du test.
PROCEDURE D'ANALYSE
Le nombre souhaité de tests peut être détaché du carton de 10 tests en pliant et déchirant au
niveau de la perforation.
REMARQUE:
• Détacher les tests en commençant par la droite du carton de tests afin de préserver le numéro
de lot apparaissant sur la gauche de ce carton.

PROCEDURE D'ANALYSE
Le nombre souhaité de tests peut être détaché du carton de 10 tests en pliant et déchirant au
niveau de la perforation.
REMARQUE:
• Détacher les tests en commençant par la droite du carton de tests afin de préserver le numéro
de lot apparaissant sur la gauche de ce carton.
• Le dosage devra être effectué dans les 2 heures suivant le retrait du film de protection
recouvrant chaque test.
1. Enlever la protection plastique de chaque test.
2. Pour les échantillons de sérum ou de plasma :
a. Distribuer 50 µl d'échantillon (à l'aide d'une pipette de précision) sur la zone de dépôt de
l'échantillon (symbole : flèche).
b. Attendre au moins 15 minutes (maximum : 60 minutes) et lire le résultat
3. Pour les échantillons de sang total (ponction veineuse):
a. Distribuer 50 µl d'échantillon l'échantillon à l'aide d'une pipette de précision sur la zone de
dépôt de l'échantillon (symbole : flèche).
b. attendre une minute, puis distribuer une goutte de fixation sur la zone de dépôt de
l’échantillon.
C. Attendre au moins 15 minutes (maximum : 60 minutes) et lire le résultat
4. Pour les échantillons de sang total (bout du doigt) :
a. Distribuer 50 µl d'échantillon l'échantillon à l'aide d'une pipette de précision sur la zone de
dépôt de l'échantillon (symbole : flèche).
b. attendre que le sang soit absorbé par la zone de dépôt, puis distribuer une goutte de tampon
de fixation sur la zone de dépôt de l'échantillon.
C. Attendre au moins 15 minutes (maximum : 60 minutes) et lire le résultat
CONTROLE DE QUALITE INTERNE
Un contrôle de la procédure annoté "Control" est inclus dans ce système afin d’assurer la
validité du test. Si la barre de contrôle ne vire pas au rouge à la fin du test, le résultat n’est pas
valide et l’échantillon doit être réalisé.
INTERPRETATION DES RESULTATS
POSITIF (deux barres)
Les barres rouges apparaissent dans la fenêtre-contrôle (annotée Control") et la fenêtre-patient
(annotée "Patient") sur la bandelette. Toute barre rouge visible dans la fenêtre-patient doit être
interprétée comme un résultat positif.

NEGATIF (une barre)

Une barre rouge apparaît dans la fenêtre-contrôle (annotée Control"), la barre rouge de la
fenêtre-patient (annotée "Patient") n'apparaissant pas sur la bandelette.
NON VALIDE (pas de barre)
Si la barre rouge n'apparaît pas dans la fenêtre-contrôle de la bandelette et même si une barre
rouge apparaît dans la fenêtre-patient de la bandelette, le résultat n'est pas valide et le test doit
être recommencé.
REMARQUES :
• Le résultat du test est positif même si la barre-patient est plus claire ou plus foncée que la
barre-contrôle.
• La ligne de contrôle peut être de faible intensité avec certains échantillons de patients,
notamment ceux présentant un titre élevé de VIH.
• Dès lors qu'une ligne rouge apparaît dans la fenêtre de contrôle, quelle que soit son intensité,
le résultat est considéré comme valide
• Si un résultat non valide venait à se répéter ou pour toute assistance technique, contacter votre
fournisseur local ou le support technique.

2- Algorithme de diagnostic

ELISA INDIRET : KIT DE DIALAB

PRÉLÈVEMENT, TRANSPORT ET STOCKAGE DES ÉCHANTILLONS

Prélèvement des échantillons : Aucune préparation particulière du patient n'est requise.
1.Recueillir l'échantillon conformément aux pratiques normales de laboratoire. Des
échantillons de sérum ou de plasma frais peuvent être utilisés avec ce test. Le sang prélevé par
ponction veineuse doit pouvoir coaguler naturellement et complètement - le sérum/plasma doit
être séparé du caillot le plus tôt possible afin d'éviter l'hémolyse des globules rouges. Des
précautions doivent être prises pour s'assurer que les échantillons de sérum sont clairs et non
contaminés par des micro-organismes. Toute matière particulaire visible dans l'échantillon doit
être éliminée par centrifugation à 3000 tr/min (tour par minute) pendant 20 minutes à
température ambiante ou par filtration.
2. Les échantillons de plasma prélevés sur EDTA, citrate de sodium ou héparine peuvent être
testés, mais les échantillons hautement lipémiques, ictériques ou hémolytiques ne doivent pas
être utilisés car ils peuvent donner des résultats erronés dans le test. Ne pas inactiver à la chaleur
les spécimens. Cela peut entraîner une détérioration de l'analyte cible. Les échantillons
présentant une contamination microbienne visible ne doivent jamais être utilisés.
3. Le test ELISA Dialab HIV 1&2 Ag/Ab est destiné UNIQUEMENT au test d'échantillons
individuels de sérum ou de plasma. Ne pas utiliser le test pour tester des échantillons de
cadavres, de la salive, de l'urine ou d'autres fluides corporels ou du sang (mélangé) mis en
commun.
4. Transport et stockage : Conservez les échantillons à 2-8°C. Les échantillons non requis pour
le dosage dans la semaine doivent être conservés congelés (-20°C ou moins). Les cycles de gel-
dégel multiples doivent être évités. Pour l'expédition, les échantillons doivent être emballés et
étiquetés conformément aux réglementations locales et internationales en vigueur pour le
transport des échantillons cliniques et des agents éthologiques.

DIAGNISTIC PROPREMENT DIT

PRINCIPES DU TEST

Le test DIALAB HIV 1&2 Ag/Ab ELSIA est un kit de dosage immunoenzymatique en
« sandwich » à incubation en deux étapes, qui utilise des barrettes de micropuits en polystyrène
pré-enduites d'antigènes du VIH recombinants (recombinant HIV-1 gp41, gp120 et
recombinant HIV-2 gp36) et des anticorps anti-VIH (p24). Dans un premier temps, des
anticorps anti-VIH biotinylés (p24) ainsi que l'échantillon de sérum ou de plasma du patient
sont ajoutés dans les puits. Pendant l'incubation, les anticorps spécifiques du VIH-1/2, s'ils sont
présents dans l'échantillon, seront capturés à l'intérieur des puits. Simultanément, si l'antigène
p24 du VIH est présent dans l'échantillon, il sera également capturé sous la forme d'un
complexe « sandwich » d'anticorps double comprenant les anticorps enrobés-anticorps p24-
biotinylés. Les micropuits sont ensuite lavés pour éliminer les protéines sériques non liées. La
détection du complexe antigène p24-anticorps biotinylé du VIH capturé ou des anticorps VIH-
1/2 est réalisée au cours de la deuxième étape d'incubation en ajoutant de l'enzyme peroxydase
de raifort (HRP) qui a été conjuguée aux deuxièmes antigènes recombinants du VIH 1+2 et à
avidine.
Détection de p24 : lorsque p24 a été capturé à l'intérieur des puits, l'avidine réagira avec la
biotine et attachera la HRP au complexe Ab-p24-Ab.
Détection des anticorps VIH 1&2 : se lie aux anticorps capturés pour former un
immunocomplexe « sandwich » Ag-Ab-Ag (HRP). Les micropuits sont lavés pour éliminer le
conjuguer non lié et des solutions de chromogène sont ajoutées aux puits. Dans les puits
contenant le "sandwich" Ag-Ab-Ag (HRP) et/ou Ab-p24-Ab (HRP) Lorsque des anticorps
VIH-1/2 ont été capturés à l'intérieur des puits, les antigènes conjugués à HRP seront
hydrolysés par le HRP en un produit de couleur bleue. La couleur bleue vire au jaune après
l'arrêt de la réaction avec l'acide sulfurique. La quantité d'intensité de couleur peut être mesurée
et est proportionnelle à la quantité d'anticorps ou de p24 capturés dans les puits et à l'échantillon
respectivement. Les puits contenant des échantillons négatifs pour anti-VIH-1/2 ou p24 restent
incolores.

MODE OPERATOIRE

Étape 1
Préparation des réactifs : Laisser les réactifs et les échantillons atteindre la température
ambiante) Vérifier la présence de cristaux de sel dans le concentré de tampon de lavage. Si des
cristaux se sont formés, resolubiliser en chauffant à 37°C jusqu'à dissolution des cristaux.
Diluer le Week Buffer 1 :20 avec de l'eau distillée ou déminéralisée. Utilisez uniquement des
récipients propres pour diluer le bue. Tous les autres réactifs sont PRÊTS À UTILISER TEL
QUE FOURNI.
Étape 2
Préparation : Marquez trois puits comme contrôle négatif (par exemple B1, C1, D1), trois puits
comme contrôle positif (par exemple E1 pour VIH-1, F1 pour VIH-2 et G1 pour VIH-Ag) et
un blanc (par exemple A1, ni les échantillons ni le conjugué ne doivent être ajoutés dans le
puits à blanc). Si les résultats sont déterminés à l'aide d'un lecteur de plaque à double longueur
d'onde, l'exigence d'utilisation du puits blanc pourrait être omise. Utilisez uniquement le
nombre de bandelettes requis pour le test.
Étape 3
Ajout du conjugué de biotine : ajoutez 20 pl de conjugué de biotine dans chaque puits, sauf
dans le blanc.
Étape 4
Ajout d'échantillons : ajoutez 100 µl de contrôles positifs, de contrôles négatifs et
d'échantillons dans leurs puits respectifs, mélangez doucement. Remarque : Utilisez un embout
de pipette de mise au rebut séparé pour chaque échantillon, contrôle négatif, contrôle positif
afin d'éviter la contamination croisée.
Etape 5
Incubation : Couvrir la plaque avec le couvercle de la plaque et incuber pendant 60 minutes à
37°C
Etape 6
Lavage : A la fin de l'incubation, retirer et jeter le couvercle de la plaque. Laver chaque puits
5 fois avec du tampon de lavage dilué. À chaque fois, laissez les micropuits tremper pendant
30 à 60 secondes. Après le dernier cycle de lavage, retournez la plaque sur du papier buvard
ou une serviette propre et tapotez-la pour éliminer tout liquide restant. Étape 7 Ajout de
conjugué enzymatique : ajoutez 100 pl de conjugué enzymatique dans chaque puits, sauf dans
le blanc.
Étape 8
Incubation : Couvrir la plaque avec le couvercle de la plaque et incuber pendant 30 minutes à
37°C.
Étape 9
Lavage : À la fin de l'incubation, retirer et jeter le couvercle de la plaque. Laver chaque puits
5 fois avec du tampon de lavage dilué. À chaque fois, laissez les micropuits tremper pendant
30 à 60 secondes. Après le dernier cycle de lavage, retournez la plaque sur du papier buvard
ou une serviette propre et tapotez-la pour éliminer tout liquide restant.
Étape 10
Coloration : Ajouter 50 pL de solution de substrat A puis 50 pL de solution de substrat B dans
chaque puits, y compris le blanc, mélanger doucement. Incuber la plaque à 37°C pendant 30
minutes en évitant la lumière. La réaction enzymatique entre les solutions de substrat et le
conjugué enzymatique produit une couleur bleue dans les contrôles positifs et VIH 1/2 positif
pour les puits d'échantillons d'antigènes/anticorps.
Étape 11
Arrêt de la réaction : à l'aide d'une pipette multicanaux ou manuellement, ajoutez 50 pl de
solution d'arrêt dans chaque puits et mélangez doucement. Une couleur jaune intense se
développe dans les puits de contrôle positif et VIH 1/2 positif pour les échantillons
d'antigènes/anticorps.
Étape 12 Mesure de l'absorbance : Calibrez le lecteur de plaques avec le puits à blanc et
lisez l'absorbance à 450 nm. Si un instrument à double filtre est utilisé, réglez la longueur
d'onde de référence à 600-650 nm. Calculez la valeur de coupure et évaluez les résultats.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS ET CONTRLE DE QUALITÉ

Chaque microplaque doit être considérée séparément lors du calcul et de l'interprétation des
résultats du dosage, quel que soit le nombre de plaques traitées simultanément. Les résultats
sont calculés en reliant chaque valeur de densité optique (DO) d'échantillon à la valeur de
coupure (C.O.) de la plaque. Si la valeur seuil de lecture est basée sur un lecteur de plaque
filtrante unique, les résultats doivent être calculés en soustrayant la valeur DO du puits blanc
des valeurs du rapport d'impression des échantillons et des contrôles.
Calcul de la valeur seuil : (CO) = "Nc + 0,12 *Nc = la valeur d'absorbance moyenne pour trois
contrôles négatifs
Gamme de contrôle qualité
Les résultats du test sont valides si les critères de contrôle qualité sont vérifiés. Il est
recommandé que chaque laboratoire établisse système de contrôle qualité approprié avec un
matériel de contrôle qualité similaire ou identique à l'échantillon du patient analysé.
1. La valeur de DO du puits à blanc, qui ne contient que le substrat et la solution d'arrêt, est <
0,080 à 450 nm.
2. La valeur de DO des contrôles positifs doit être de 2 0,800 à 450/600-650 nm ou à 450 nm
après le blanking.
3. La valeur de DO du contrôle négatif doit être de 0,100 à 450/600-650 nm ou à 450 nm après
le blanking IN.
Si l'une des valeurs de DO du contrôle négatif ne répond pas aux critères de contrôle qualité,
elle doit être rejetée et la valeur moyenne calculée à nouveau en utilisant les deux valeurs
restantes. Si plusieurs valeurs de DO du contrôle négatif ne répondent pas aux spécifications
de la plage de contrôle de qualité, le test n'est pas valide et doit être répété.
Interprétation des résultats
Résultat négatifs (DO/CO<1) : Les échantillons donnant une absorbance inférieure à la valeur
seuil sont négatifs pour ce test, ce qui indique qu'aucun anticorps VIH 1&2 ou antigène p24 n'a
été détecté avec le kit Dialab HIV 1et2 Ag/Ab ELISA, donc le patient n'est probablement pas
infecté ou l'unité de sang ne contient pas d'anticorps contre l'antigène VIH 1&2 ou p24 et
pourrait être transfusée en cas d'absence d'autres marqueurs de maladies infectieuses. Résultats
positifs (DO/CO21) : les échantillons donnant une absorbance égale ou supérieure à la valeur
seuil sont considérés comme initialement réactifs, ce qui indique que les anticorps VIH 1&2
et/ou l'antigène p24 ont probablement été détectés à l'aide de Dialab HIV 1&2 Ag/Ab Kit
ELISA. Tous les échantillons initialement réactifs doivent être retestés en double à l'aide du kit
ELISA Dialab HIV 1&2 Ag/Ab avant l'interprétation finale des résultats du test. Les
échantillons réactifs à plusieurs reprises peuvent être considérés comme positifs pour les
anticorps dirigés contre l'antigène VIH 1/2 et/ou p24 avec le kit Dialab HIV 1&2 Ag/Ab
ELISA. Limite (DO/C.O. = 0,9-1,1) : les échantillons avec un rapport absorbance/seuil compris
entre 0,9 et 1,1 sont considérés comme limites et un nouveau test de ces échantillons en double
est recommandé pour confirmer les résultats. Un suivi, une confirmation et des tests
supplémentaires de tout échantillon positif avec un autre système analytique (par exemple, WB,
PCR) sont requis. Le diagnostic clinique ne doit pas être établi sur la base d'un seul résultat de
test. Il doit intégrer les données et les résultats cliniques et autres de laboratoire.
• Si, après retest des échantillons initialement réactifs, les deux puits sont des résultats négatifs
(DO/CO<0,9), ces échantillons doivent être considérés comme positifs non reproductibles (ou,
faux positifs) et enregistré comme négatif. Comme avec de nombreux tests ELISA très
sensibles, des résultats faussement positifs peuvent se produire pour plusieurs raisons, dont la
plupart sont liées, mais sans s'y limiter, à une étape de lavage inadéquate.
• Si, après un nouveau test en double, un ou les deux puits sont des résultats positifs, le résultat
final de ce test ELISA doit être enregistré comme réactif à plusieurs reprises. Les échantillons
réactifs à plusieurs reprises peuvent être considérés comme positifs pour les anticorps anti-VIH
1&2 et/ou l'antigène p24 et, par conséquent, le patient est probablement infecté par le VIH 1&2
et l'unité de sang doit être jetée.
* Après un nouveau test en double, les échantillons dont les valeurs sont proches de la valeur
seuil doivent être interprétés avec prudence et considérés comme des échantillons de zone
« limite » ou ininterprétables au moment du test.
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE
Les caractéristiques de performance analytique et clinique du kit ELISA Dialab HIV 1&2
Ag/Ab ont été évaluées par deux centres d'évaluation externes.
Sensibilité diagnostique : 100 % (500/500 échantillons positifs) testés sur 310 anti-HIV-1, 100
anti-HIV-2 et 40 anti-HIV-1 non sous-types (AC, D, F, G, H, J, K , O, CRF01 AE et autres
formes recombinantes circulantes) échantillons de sérum/plasma et 50 échantillons positifs
anti-HIV-Ab / HIV-1 étaient positifs sur le kit Dialab HIV 1&2 Ag/Ab ELISA Échantillons
du même jour : aucune interférence du complément n'a été observée sur 25 échantillons frais
du même jour dopés avec une petite quantité d'un échantillon VIH Ag/Ab positif.
Spécificité diagnostique : 99,96 % testés sur 5004 échantillons de plasma négatifs de donneurs
de sang - sur la base des résultats après des tests répétés sur des échantillons initialement
réactifs.
Spécificité analytique : 200/200 patients hospitalisés étaient négatifs sur le kit ELISA Dialab
HIV 1&2 Ag/Ab. 95/101 échantillons contenant des substances potentiellement croisées, y
compris des échantillons de femmes enceintes, étaient négatifs sur le kit Dialab HIV 1&2
Ag/Ab ELISA. L'équivalence Ag/Ab VIH 182 est démontrée sur 25 couples sérum/plasma
EDTA/plasma héparine/plasma citrate de sodium positifs et 25 négatifs.

CONCLUSION
En somme de notre travail dans lequel il était question de, présenter le VIH (Virus de
l’Immunodéficience Humaine), il en ressort que ce virus à ARN présent des effets
cytopathologies graves voire mortels, et doit être diagnostiqué par diverses techniques
notamment la TDR, l’ELISA, la PCR, le Western Blot afin de décrire un meilleur traitement
pour une bonne prise en charge des malades.
LEXIQUE:
Déficit cognitif : ensemble de symptômes incluant des troubles de la mémoire, de la perception,
un ralentissement de la pensée et des difficultés à résoudre des problèmes ; pouvant avoir une
origine neurologique, psychiatrique ou médicamenteuse.
Prophylaxie preexposition au VIH : traitement médicamenteux qui empêche l’infection par le
virus de VIH chez des personnes séronégatives.
Cryoconservation : processus par lequel des prélèvements peuvent être conserves en les
refroidissant à basses températures (environ -196 ̊C)
Seroconversion: période durant laquelle les anticorps anti-VIH apparaissent dans le corps d'’un
patient.

SOURCES
-GOOGLE
-WIKIPEDIA
-SUPPORT DE COURS
-CONNAISSANCES PERSONNELLES