NORME ISO

INTERNATIONALE 20166-1

Première édition
2018-12

Analyses de diagnostic moléculaire

in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour
les tissus fixés au formol et inclus en
paraffine (FFPE) —
Partie 1:
iTeh STANDARD
ARN extraitPREVIEW
(standards.iteh.ai)
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for
pre-examination processes for formalin-fixed and paraffin-embedded
ISO 20166-1:2018
(FFPE) tissue —
https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/403c100d-6f39-48ef-9ccd-
Part 1: Isolated RNA
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Numéro de référence
ISO 20166-1:2018(F)

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iTeh STANDARD PREVIEW

(standards.iteh.ai)
ISO 20166-1:2018
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Sommaire Page

Avant-propos............................................................................................................................................................................................................................... iv
Introduction...................................................................................................................................................................................................................................v
1 Domaine d’application.................................................................................................................................................................................... 1
2 Références normatives.................................................................................................................................................................................... 1
3 Termes et définitions........................................................................................................................................................................................ 1
4 Considérations générales............................................................................................................................................................................. 5
5 Hors du laboratoire............................................................................................................................................................................................ 7
5.1 Recueil des prélèvements............................................................................................................................................................... 7
5.1.1 Généralités............................................................................................................................................................................. 7
5.1.2 Informations relatives au donneur/patient.............................................................................................. 7
5.1.3 Informations relatives au prélèvement......................................................................................................... 7
5.1.4 Traitement du prélèvement..................................................................................................................................... 7
5.2 Exigences de transport..................................................................................................................................................................... 8
6 Dans le laboratoire.............................................................................................................................................................................................. 8
6.1 Informations relatives à la réception des prélèvements...................................................................................... 8
6.2 Fixation au formol du prélèvement ou de l’échantillon........................................................................................ 9
6.3 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection du ou des échantillons...................... 10
6.4 Post-fixation d’échantillons congelés................................................................................................................................ 11
6.5
6.6
iTeh STANDARD PREVIEW
Décalcification....................................................................................................................................................................................... 11
Traitement et inclusion en paraffine.................................................................................................................................. 11
6.7 (standards.iteh.ai)
Exigences relatives au stockage............................................................................................................................................. 12
6.8 Extraction de l’ARN............................................................................................................................................................................ 12
6.8.1 Généralités..........................................................................................................................................................................
ISO 20166-1:2018 12
6.8.2 https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/403c100d-6f39-48ef-9ccd-
Informations générales relatives aux protocoles d’extraction de l’ARN........................ 12
6.8.3 Utilisation de kits commerciaux....................................................................................................................... 13
9c9cdbc0f876/iso-20166-1-2018
6.8.4 Utilisation des protocoles propres aux laboratoires....................................................................... 13
6.9 Évaluation quantitative et qualitative de l’ARN extrait....................................................................................... 14
6.10 Stockage de l’ARN extrait.............................................................................................................................................................. 15
6.10.1 Généralités.......................................................................................................................................................................... 15
6.10.2 Utilisation de kits disponibles dans le commerce pour l’extraction d’ARN................. 15
6.10.3 Utilisation des protocoles propres au laboratoire pour l’extraction d’ARN................ 15
Annexe A (informative) Contrôle de la qualité de l’ARN extrait d’échantillons de tissus fixés
au formol et inclus en paraffine: conséquences pour les analyses basées sur la RT-qPCR...17
Bibliographie............................................................................................................................................................................................................................ 23

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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www​
.iso​.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www​.iso​.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
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pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
(standards.iteh.ai)
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
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de l’ISO aux principes dehttps://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/403c100d-6f39-48ef-9ccd-
l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien9c9cdbc0f876/iso-20166-1-2018
suivant: www​.iso​.org/iso/fr/avant​-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d’analyses de
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20166 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www​.iso​.org/fr/members​.html.

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Introduction
Le diagnostic moléculaire in vitro, y compris la pathologie moléculaire, a permis de faire
considérablement progresser la médecine. D’autres avancées sont attendues avec les nouvelles
technologies d’analyse des acides nucléiques, des protéines et des métabolites dans les tissus
humains et les fluides corporels. Toutefois, les profils et/ou l’intégrité de ces molécules peuvent varier
considérablement au cours du prélèvement des échantillons primaires, du transport, du stockage et du
traitement, et engendrer ainsi un résultat de diagnostic ou de recherche peu fiable, voire impossible,
car l’analyse subséquente ne déterminera pas l’état du patient, mais un profil artificiel généré pendant
le processus préanalytique.
Par conséquent, une normalisation de l’ensemble du processus, allant du prélèvement des échantillons
primaires jusqu’à l’analyse de l’ARN, est nécessaire. Des études ont été réalisées afin de définir les
facteurs ayant un impact important. Le présent document se fonde sur ces travaux pour codifier et
normaliser les étapes des processus dits de la phase préanalytique pour tissus fixés au formol et inclus
en paraffine (FFPE) au regard de l’analyse de l’ARN.
Le processus de fixation au formol et d’inclusion en paraffine conduit à des modifications des molécules
d’ARN, ce qui peut avoir un impact sur la validité et la fiabilité des résultats des analyses.
Les profils d’ARN dans les tissus peuvent changer considérablement avant, pendant et après le
prélèvement et peuvent varier différemment parmi les différents donneurs/patients. Il est donc
essentiel de prendre des mesures particulières afin de réduire le plus possible, au sein des tissus, les
changements et modifications de profil d’ARN décrits, pour l’analyse ultérieure.
iTeh STANDARD PREVIEW
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilisées:
—
(standards.iteh.ai)
«doit» indique une exigence;
— «il convient de/que» indique une recommandation;
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— «peut/il est admis/permis» indique une autorisation;
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— «peut/il est possible» indique une possibilité ou une capacité.

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Analyses de diagnostic moléculaire in vitro —

Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour
les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) —
Partie 1:
ARN extrait

1 Domaine d’application
Le présent document fournit des lignes directrices concernant la manipulation, la documentation, le
stockage et le traitement de prélèvements tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) destinés
à l’analyse de l’ARN durant la phase préanalytique précédant la réalisation d’une analyse moléculaire.
Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro, y compris les analyses
développées en laboratoire réalisées par des laboratoires de biologie médicale et des laboratoires
de pathologie moléculaire. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des
développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des
institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des
iTeh STANDARD PREVIEW
autorités de réglementation.
NOTE (standards.iteh.ai)
Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également
s’appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
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2 Références normatives 9c9cdbc0f876/iso-20166-1-2018
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Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 15189:2012, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
ISO 15190, Laboratoires de médecine — Exigences pour la sécurité
ISO/IEC 17020:2012, Évaluation de la conformité — Exigences pour le fonctionnement de différents types
d'organismes procédant à l'inspection

3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 15189, ainsi que les suivants,
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:​//www​.iso​.org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:​//www​.electropedia​.org/.

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3.1
aliquote
partie d’une quantité plus importante d’un matériau homogène, prélevée avec une erreur
d’échantillonnage supposée négligeable
Note 1 à l'article: Le terme s’applique généralement à des fluides. Les tissus sont hétérogènes et ne peuvent donc
pas être aliquotés.

Note 2 à l'article: La définition est issue des Références [28], [29] et [30].

3.2
température ambiante
température non régulée de l’air environnant
3.3
analyte
composant indiqué dans le nom d’une grandeur mesurable
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2, modifiée — L’EXEMPLE a été supprimé.]
3.4
performance analytique
l’exactitude, la précision et la sensibilité d’une analyse pour mesurer l’analyte (3.3) concerné
Note 1 à l'article: D’autres caractéristiques de performance d’analyse, telles que la robustesse ou la répétabilité,
peuvent également s’appliquer.

3.5
iTeh STANDARD PREVIEW
ischémie froide (standards.iteh.ai)
état d’un tissu suite à son prélèvement de l’organisme jusqu’à sa stabilisation ou sa fixation
3.6 ISO 20166-1:2018
ADNc https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/403c100d-6f39-48ef-9ccd-
ADN complémentaire 9c9cdbc0f876/iso-20166-1-2018
ADN de brin simple complémentaire à un ARN donné et synthétisé en présence de transcriptase inverse
pour servir de modèle à la synthèse de copies d’ADN
[SOURCE: ISO 17822‑1:2014, 3.12]
3.7
diagnostic
identification d’un état de santé sain ou pathologique à partir de ses signes et/ou symptômes, dans
laquelle le processus de diagnostic peut impliquer des analyses (3.10) et essais pour la classification
de l’état d’un individu en catégories ou sous-classes distinctes, laquelle permet la prise de décisions
médicales concernant le traitement et le pronostic à établir
3.8
ADN
acide désoxyribonucléique
polymère de désoxyribonucléotides se présentant sous la forme de double brin (ADNdb) ou de simple
brin (ADNsb)
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.9
DNase
désoxyribonucléase
enzyme catalysant la dégradation de l’ADN (3.8) en composants plus petits

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3.10
analyse
phase analytique
ensemble des opérations destinées à déterminer la valeur ou les caractéristiques d’une propriété
Note 1 à l'article: Les processus débutent avec l’analyte extrait et comprennent toutes sortes d’essais
paramétriques ou une manipulation chimique en vue de réaliser l’analyse quantitative ou qualitative.

[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modifiée — Les Notes à l’Article 1 à 3 ont été supprimées, la Note 1 à
l’article a été ajoutée, le terme «examen» a été remplacé par «analyse» et «phase analytique» a été
ajouté comme terme privilégié.]
3.11
formol
solution aqueuse saturée en formaldéhyde qui, à 100 %, contient 37 % de formaldéhyde en masse
(correspondant à 40 % en volume)
3.12
fixation au formol
traitement d’un échantillon avec une solution de formol tamponnée standard (3.25) à des fins de
stabilisation
3.13
macroscopie
analyse macroscopique
contrôle de prélèvements pathologiques à l’œil nu, au cours de leur traitement à des fins d’analyse
iTeh STANDARD PREVIEW
microscopique ultérieure, en vue d’obtenir des informations de diagnostic
3.14 (standards.iteh.ai)
substances interférentes
substances endogènes d’un prélèvement (3.17)/échantillon
ISO 20166-1:2018 (3.23) ou substances exogènes (par exemple,
solution de stabilisation) susceptibles d’altérer le résultat d’une analyse
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3.15
inclusion en paraffine
processus dans lequel un échantillon de tissu est placé dans de la paraffine en vue de produire une
matrice rigide environnante permettant le découpage de fines coupes microscopiques
3.16
processus préanalytique
phase préanalytique
flux de travail préanalytique
processus commençant chronologiquement par la prescription des analyses par le clinicien, comprenant
la demande d’analyse, la préparation et l’identification du patient, le prélèvement de l’échantillon
primaire, son acheminement jusqu’au laboratoire et au sein du laboratoire médical ou de pathologie,
l’extraction des analytes, et finissant au début de l’analyse
Note 1 à l'article: La phase préanalytique comprend des processus de préparation qui influencent le résultat de
l’analyse prévue.

[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modifiée — «Flux de travail préanalytique» a été ajouté comme terme
privilégié, la Note 1 à l’article a été ajoutée et la définition a été complétée.]

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3.17
échantillon primaire
prélèvement
spécimen
partie discrète d’un liquide corporel, d’une haleine, d’un cheveu ou d’un tissu prélevé à des fins
d’examens, d’étude ou d’analyse (3.10) d’une ou plusieurs grandeurs ou propriétés pour déterminer le
caractère de l’ensemble
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modifiée — Les Notes à l’Article 1 à 3 ont été supprimées.]
3.18
essai d’aptitude
évaluation de la performance d’un participant par rapport à des critères préétablis au moyen de
comparaisons interlaboratoires
[SOURCE: ISO 17043:2010, 3.7, modifiée — Les Notes à l’Article 1 et 2 ont été supprimées.]
3.19
profil d’ARN
quantités de molécules d’ARN individuelles qui sont présentes dans un échantillon et qui peuvent être
mesurées en l’absence de toute perte, inhibition ou interférence
3.20
ARN
acide ribonucléique
polymère de ribonucléotides se présentant sous la forme de double brin ou de simple brin
iTeh STANDARD PREVIEW
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.3]
(standards.iteh.ai)
3.21
RNase ISO 20166-1:2018
ribonucléase https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/403c100d-6f39-48ef-9ccd-
enzyme catalysant la dégradation de l’ARN9c9cdbc0f876/iso-20166-1-2018
en composants plus petits
3.22
température de laboratoire
pour les besoins du présent document, température dans la plage de 18 °C à 25 °C
Note 1 à l'article: Des réglementations locales ou nationales peuvent stipuler des définitions différentes.

3.23
échantillon
une ou plusieurs parties prélevées à partir d’un échantillon primaire (3.17)
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modifiée — L’EXEMPLE a été supprimé.]
3.24
stabilité
capacité d’un échantillon, lorsqu’il est entreposé dans des conditions spécifiées, à conserver une valeur
de propriété spécifiée dans des limites spécifiées pendant une période de temps spécifiée
Note 1 à l'article: L’analyte pour les besoins du présent document est composé d’ARN extrait.

[SOURCE: Guide ISO 30:2015, 2.1.15, modifiée — L’expression «matériau de référence» a été remplacée
par «échantillon», «caractéristique» a été remplacée par «capacité» et la Note 1 à l’article a été modifiée.]

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3.25
solution de formol tamponnée standard
formol neutre tamponné
NBF
solution de formol (3.11) à 10 % dans l’eau, avec une fraction massique de 3,7 % (correspondant à une
fraction volumique de 4 %) de formaldéhyde, tamponnée entre un pH 6,8 et un pH 7,2
Note 1 à l'article: Les solutions de formol tamponnées standards contiennent souvent de petites quantités de
méthanol pour inhiber l’oxydation et la polymérisation du formaldéhyde.

3.26
stockage
interruption prolongée du flux de travail préanalytique d’un échantillon, d’un analyte ou de leurs
dérivés, tels que des coupes colorées ou des blocs de tissus, dans des conditions appropriées afin de
préserver leurs propriétés
Note 1 à l'article: Le stockage à long terme a généralement lieu dans les sites d’archivage des laboratoires ou dans
les biobanques.

3.27
appareil de préparation des tissus
instrument automatisé où la fixation, la déshydratation, le nettoyage et l’infiltration de paraffine des
tissus sont opérés
3.28
validation
iTeh STANDARD PREVIEW
confirmation, par des preuves tangibles, que les exigences pour une utilisation spécifique ou une
application prévue ont été satisfaites
(standards.iteh.ai)
Note 1 à l'article: Le terme «validé» est utilisé pour désigner l’état correspondant.
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[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modifiée — Les Notes à l’Article 1 et 3 ont été supprimées.]
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3.29
ischémie chaude
situation avant que le tissu soit prélevé de l’organisme, tout en étant privé de son apport sanguin normal
3.30
flux de travail
série d’activités nécessaires à la réalisation d’une tâche
3.31
homogène
de structure et de composition uniformes

4 Considérations générales
Pour les instructions générales relatives aux systèmes de management de la qualité de laboratoire
de biologie médicale et portant en particulier sur le prélèvement, la réception et la manipulation
d’échantillons primaires (y compris la prévention des contaminations croisées), voir l’ISO 15189:2012,
4.2, 5.4.4, 5.4.6 ou l’ISO/IEC 17020:2012, Article 8 et 7.2. Les exigences relatives aux équipements
de laboratoire, aux réactifs et aux consommables conformément à l’ISO 15189:2012, 5.3 doivent
être respectées; l’ISO 15189:2012, 5.5.1.2 et 5.5.1.3 et l’ISO/IEC 17020:2012, 6.2 peuvent également
s’appliquer.
Toutes les étapes d’un flux de travail de diagnostic peuvent influencer le résultat final de l’analyse.
Par conséquent, le flux de travail complet, y compris la stabilité des biomolécules et les conditions de
stockage des échantillons, doit être vérifié et validé. Les étapes du flux de travail qui ne peuvent pas
toujours être contrôlées (par exemple, l’ischémie chaude) doivent être documentées. Une évaluation des
risques des étapes non contrôlables du flux de travail, incluant leur impact potentiel sur la performance

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analytique, doit être réalisée et des mesures d’atténuation doivent être mises en place pour obtenir la
performance analytique requise.
Avant ou pendant la conception d’une analyse, il convient donc d’étudier et de s’assurer que le ou
les profils d’ARN destinés à être analysés ne sont pas compromis de manière à avoir un impact sur
la performance analytique (par exemple, en réalisant une expérience ou une étude cinétique;
voir également l’Annexe A).
Avant que les tissus ne soient fixés dans une solution de formol tamponnée standard, le ou les profils
d’ARN peuvent considérablement varier en fonction de la durée des ischémies chaude et froide et de la
température avant la fixation au formol (induction de gènes, régulation à la baisse de l’expression de
gènes, dégradation de l’ARN, par exemple). De plus, ces altérations peuvent varier dans les tissus de
différents donneurs/patients.
En général, plus les durées d’ischémies chaude et froide sont longues et plus la température ambiante
est élevée avant la fixation du prélèvement tissulaire, plus le risque est élevé de voir se produire des
modifications du profil d’ARN.
NOTE L’ischémie chaude peropératoire peut entraîner des modifications plus marquées des profils d’ARN
que l’ischémie froide postopératoire[7][8]. Les profils d’ARN peuvent également varier en fonction de l’origine
et du type du tissu, de la maladie sous-jacente, de l’intervention chirurgicale, des médicaments administrés
pour l’anesthésie ou pour le traitement d’une maladie concomitante, et en fonction des différentes conditions
environnementales après le prélèvement du tissu sur l’organisme.

Comme une normalisation de l’ischémie chaude n’est pas facilement réalisable, sa durée doit être
documentée. Lorsqu’il n’est pas possible d’éviter l’ischémie froide (par exemple en cas de transport
iTeh STANDARD PREVIEW
vers le laboratoire avant la fixation au formol), sa durée doit être documentée et les températures aux
abords du récipient du prélèvement doivent être consignées. Lorsque le prélèvement est transporté
(standards.iteh.ai)
vers un autre établissement pour la fixation au formol, la durée du transport doit être documentée et il
convient de documenter également les conditions ambiantes.
ISO 20166-1:2018
De plus, la fixation au formol elle-même, ainsi que la durée et la température du stockage subséquent
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des tissus FFPE, entraînent des modifications des biomolécules et conduisent à une performance
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analytique sous-optimale de l’ARN extrait des tissus FFPE (voir A.2.1 et A.2.2). Il convient de tenir
compte de ce fait dans le contrôle de la qualité et l’application des analyses moléculaires, en particulier
dans le contexte des études d’expression des gènes[9][10][11][12]. Ces effets peuvent limiter la taille
de l’ADNc cible amplifiable et/ou influencer la séquence cible d’ADNc des amorces utilisées pour
l’amplification. L’optimisation des analyses des tissus FFPE ou l’utilisation de méthodes sans agent de
pontage en remplacement de la solution de formol tamponnée standard sont des options pour réduire
le plus possible ce problème en vue des analyses moléculaires[13][14].
Les instructions en matière de sécurité pour le transport et la manipulation doivent être prises en
considération et suivies conformément à l’ISO 15189:2012, 5.2.3 et 5.4.5, et à l’ISO 15190.
Des précautions doivent être prises au cours de l’ensemble du processus préanalytique afin d’éviter
toute contamination croisée entre les différents prélèvements/échantillons, par exemple en utilisant,
dans la mesure du possible, du matériel à usage unique ou en mettant en place des méthodes de
nettoyage appropriées entre les traitements des différents prélèvements/échantillons.
Si un produit commercial n’est pas utilisé selon les instructions du fabricant, la responsabilité de son
utilisation et de sa performance incombe à l’utilisateur.

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