BIOCHIMIE CLINIQUE

Les principes fondamentaux des méthodes utilisées en

biochimie clinique.
Etudier la répartition, les rôles et les métabolismes au niveau
de l’organisme humain des groupes suivants :
L’eau et les éléments minéraux
les protides
les éléments azotés non protéiques
Les vitamines, Les Coenzymes et enzymes d’intérêt clinique
Les glucides
Les lipides
Etudier les variations physiopathologiques des bilans
biochimiques suivants:
hydro électrolytique et ionogramme
protidique
azoté non protéique et paramètres de l’exploration fonctionnelle
rénale
glucidique et épreuve dynamique d’exploration fonctionnelle du
pancréas endocrine
lipidique
enzymatique et marquage tissulaire
Etudier les paramètres du bilan hormonal d’intérêt clinique.
MÉTHODES
SPECTROSCOPIQUES

Dr. Ahmed IDMOUSSA

MÉTHODES SPECTROSCOPIQUES
Les méthodes spectroscopiques utilisent la lumière
pour effectuer des études qualitatives et
quantitatives des molécules dans différents
milieux

Elles sont largement utilisées dans les laboratoires

De nombreuses méthodes automatisées ou non

utilisent les propriétés spectrales de la lumière
PROPRIÉTÉS
DE LA LUMIÈRE
I- NATURE DE LA LUMIÈRE
Phénomène physique: transport d’énergie sans
transport de matière.

Se propage en ligne droite dans tout les milieux

homogènes et isotrope (liquides et gaz)

Une simple différence de température rend le

milieu hétérogène et le trajet de la lumière n’est
plus rectiligne

La lumière possède une double nature: une

nature ondulatoire et une nature corpusculaire
I- NATURE DE LA LUMIÈRE
NATURE ONDULATOIRE DE LA LUMIÈRE
La lumière se comporte comme une onde
électromagnétique qui ne nécessite aucun matériel
pour se propager
Elle est caractérisée par:
sa longueur d’onde λ (nm=10 -9 m) [angström, 1Ä=0,1nm]
sa période T (secondes s)
sa fréquence ν (s -1 ou en Hertz Hz )
v = 1/T = c/ λ
λ = c/v
c: vitesse de la lumière dans le vide (2,998 . 10 8 m/s)
I- NATURE DE LA LUMIÈRE
NATURE ONDULATOIRE DE LA LUMIÈRE

Dans le vide, toutes les radiations quelque soit leur

longueur d’onde se déplacent à la même vitesse c
Dans un autre milieu homogène autre que le vide,
d’indice de réfraction n, la vitesse de la lumière est
égale à c/n.
Dans la plus part des milieux, n est > 1 pour les
radiations visibles
La lumière visible est plus lente lorsqu’elle traverse la
matière que dans le vide
Lorsque la lumière traverse deux milieux d’incidences de
réfraction différents, la fréquence reste constante alors que
la longueur d’onde change.
I- NATURE DE LA LUMIÈRE
NATURE CORPUSCULAIRE DE LA LUMIÈRE

Effet photo-électrique (détecteurs, transfert

d’énergie intervenant dans la fluorescence)
La lumière est constituée de photons.
Chaque photon possède sa propre énergie E:
E = hv
h: constante de Plank (h = 6,626 . 10-34 j.s)
Sachant que vλ = c E = hc / λ
L’énergie du photon est inversement proportionnelle à la
longueur d’onde: les rayonnements UV sont plus
énergétiques que les infrarouges
II- DIFFÉRENTS DOMAINES DES ONDES
ÉLECTROMAGNÉTIQUES

La lumière ne représente qu’une petite partie des

ondes électromagnétiques.
7 couleurs classiques dans le domaine du visible:
rouge, orange, jaune, vert, bleu, indigo et violet
Il y a une infinité de longueurs d’ondes comprises
entre le rouge et le violet.
A chaque domaine de radiations
électromagnétiques correspond une méthode
spectroscopique.
Chaque domaine de radiation nécessite l’emploi
de matériaux aux propriétés bien définies.
Méthodes spectroscopiques
III- DIFFRACTION DE LA LUMIÈRE
Lorsque un faisceau rencontre une fente fine, la lumière ne se
propage plus en ligne droite, mais est diffractée faisceau
divergent
Ce phénomène est d’autant plus important que la fente est petite
Il dépend aussi de la longueur d’onde de la lumière
IV- RÉFLEXION ET RÉFRACTION DE LA LUMIÈRE

L’indice de réfraction absolu n pour une radiation est lié à

la vitesse par la relation: n = c/v
IV- RÉFLEXION ET RÉFRACTION DE LA LUMIÈRE
V- DIFFUSION DE LA LUMIÈRE
Lorsque la lumière traverse la matière il y a absorption de
l’énergie immédiatement suivie d’une réémission dans
toutes les directions
L’intensité du rayonnement diffusé augmente avec la taille
des particules
Diffusion Rayleith:
diffusion de la lumière par des particules de taille très
inférieure à la longueur d’onde de la lumière incidente
Diffusion par les macromolécules et les colloïdes:
la diffusion est très importante, c’est l’effet tyndall visible à
l’œil nu.
Propriété utilisée pour déterminer la taille des particules et
pour analyses quantitatives et qualitatives par turbidimétrie
et néphélommétrie
Diffusion Raman:
dans ce phénomène une fraction du rayon lumineux diffusé n’a
plus la même longueur d’onde
SPECTROPHOTOMÉTRIE
D’ABSORPTION MOLÉCULAIRE
I- INTRODUCTION
Définition:
Technique d’analyse quantitative qui met
en jeu la capacité des substances chromogènes à
absorber, en milieu liquide limpide, une lumière
monochromatique

Intérêt:
Facilement automatisable et contrôlable
Largement utilisée dans les laboratoires pour le
dosage des substances et pour la détermination des
activités enzymatiques
II- PRINCIPES DE BASE
1/ Solution colorée
Une solution colorée absorbe certaines radiations
du spectre de la lumière blanche.
La couleur de la solution est la somme des
radiations non absorbées.
Le diagramme des couleurs complémentaire
permet de connaître rapidement les radiations
absorbées en fonction de la couleur de la solution:
une solution de couleur violette absorbe
principalement dans la couleur complémentaire,
le jaune
II- PRINCIPES DE BASE
2/ Chromogène ou chromophore :
Substance colorée possédant au moins un
système de double liaison conjuguée an quantité
proportionnelle à celle de la solution à étudier
Les groupes fonctionnels des composés
organiques (cétone, amines, dérivés nitrés, etc)
responsables de l’absorption en UV/visible sont
appelés groupements chromophores.
Une espèce formée de squelette carboné
transparent porteur d’un ou de plusieurs
chromophores est un chromogène.
II- PRINCIPES DE BASE
3/ Flux lumineux monochromatique :
De longueur d’onde fixe et définie.
Le domaine spectral UV-visible est divisé en 3
plages :
Proche UV 185-400 nm
Visible 400-700 nm
Poche infrarouge 700-1100 nm
II- PRINCIPES DE BASE
4/ Loi de Beer-Lambert:
Un flux lumineux monochromatique d’intensité I0
Traversant une solution limpide d’une substance de concentration C
dans une cuve de faces parallèles sur un trajet optique L
Le flux transmit en sortie de cuve a une intensité I
Tel que:
I=I0 e-IcL ou log I/I0= 6cL= DO=A
I0= intensité lumineuse incidente
I= intensité lumineuse transmise
DO : densité optique ou absorbance (A)
L= épaisseur en cm de la solution traversée
C= concentration molaire
I : coefficient d’extinction molaire à la longueur d’onde choisie.(L.mol-1.cm-1).
Ce coefficient propre au composé étudié dépend en outre de la température,
du solvant et du PH. Généralement, sa valeur est repérée pour seule la
longueur d’onde du maximum d’absorption.
II- PRINCIPES DE BASE
5/ Conditions d’application de la Loi de Beer-Lambert:
La DO est une fonction linéaire de C. C’est sur linéarité que
reposent toutes les mesures photométriques, elle n’est respectée
que dans certaines limites et sous certaines conditions:
Faisceau incident monochromatique : coefficient I constant
Concentration c dans un intervalle limite = faible
concentration
Solution limpide (non hétérogène) non fluorescente à PH
constant
Température de chromogène constante (thermostat)
Soluté ne doit pas donner des associations variables avec le
solvant (interactions moléculaires risquent de modifier I).
III- APPAREILLAGE
III- APPAREILLAGE
a/ source lumineuse :
La qualité essentielle d’une source lumineuse est sa stabilité : son
énergie ne doit pas varier au cours des mesures.
4 types de sources sont utilisés :
Lampes à filaments de tungstène :
lampe utilisant un filaments de tungstène porté à incandescence (3000° Kelvin*)
par un courant électrique.
Elles fournissent des radiations lumineuses dans le visible et l’infrarouge.
Leurs durée de vie est réduite à cause de l’augmentation du la température du
filament.
(Kelvin (K) correspond à -273,15°C)
Lampes à filament de tungstène à halogène (iode)
fournissent à la fois un spectre dans le visible et un spectre dans le proche UV.
Elles supportent une température haute d’où leur durée de vie double par rapports
aux lampes tungstène.
Lampe à vapeur de mercure ou à deutérium:
fonctionnent par décharges électriques dans un gaz raréfié (Deutérium ou vapeur à
mercure).
Donnent des radiations dans UV+ visible < 350 nm.
Leurs enveloppes sont en quartz car le verre est opaque aux UV.
Laser
donne des radiations monochromatiques (laser pulsé à colorants)
fournit des radiations de 200-1100 nm.
III- APPAREILLAGE
b/ Fente d’entrée :
Rectangulaire, habituellement de taille réglable,
elle constitue optiquement la véritable source
lumineuse.
Dans les appareils de grande qualité, les fentes
ont une mécanique très soignée et au voisinage
de zéro.
Il ne faut jamais les bloquées et ,lors du transport
de l’appareil, les maintenir légèrement ouvertes.
III- APPAREILLAGE
c/ système de sélection des longueurs d’onde
Il permet de séparer une radiation de longueur
d’onde définie à partir d’un mélange complexe de
radiations lumineuses.
Il en existe plusieurs types dont l’efficacité et le
prix de revient sont très variables.
Ce système n’est pas utilisé pour l’effet laser.
III- APPAREILLAGE
c/ système de sélection des longueurs d’onde
Système à filtres :
- Filtres colorés :
En verre ou en gélatine.
La bande passante est au mieux de 20 nm.
Leur pouvoir séparateur est donc médiocre mais
leur prix est bas.
- Filtres interférentiels :
formés de l’empilement successif de lames de verre sur
lesquelles sont déposés de minces couches métalliques.
Ces lames forment des miroirs et sont séparés les uns des
autres par un milieu d’indice de réfraction différent.
Par le jeu des interférences, obtenu en variant l’épaisseur et la
composition du film métallique, les longueurs d’ondes non
désirées sont éliminées.
Il laisse passer habituellement une bande de 5 à 10 nm.
III- APPAREILLAGE
c/ système de sélection des longueurs d’onde
Monochomateurs :(permettent de dérouler dans le
même appareil le spectre visible et souvent le
prolonger dans l’UV= spectrophotomètre)
Prismes :
en verre pour le visible et
en quartz au dessous de 340nm.
Les lumière bleue, violette et ultraviolette sont plus étalées
que les autres ; c’est donc dans cette zone que le
monochromatisme est le plus rigoureux.
La variation de l’orientation du prisme, grâce à un
dispositif mécanique, permet la sélection d’une seule
longueur d’onde.
Cette bande passante est plus étroite que celle obtenue par
le filtre.
III- APPAREILLAGE
c/ système de sélection des longueurs d’onde
Monochomateurs :(permettent de dérouler dans le
même appareil le spectre visible et souvent le
prolonger dans l’UV= spectrophotomètre)
Réseaux :
bloc métallique plan gavé de traits fins parallèles.
C’est un système dispersif qui décompose la lumière et
dévie les rayons selon leur longueur d’onde.
La sélection de la bande passante peut descendre au
dessous du nanomètre, jusqu’à 0,2nm.
Les réseaux présentent souvent certains défauts dus à
l’imperfection de la gravure sur le bloc métallique, d’où
naissance de lumières parasites (raies fantômes et raies
satellites).
III- APPAREILLAGE
d/Fente de sortie
Située après les prismes ou les réseaux.
Son ouverture est réglable ; si elle est largement
ouverte, le monochromateur est médiocre.
Elle faut toujours ouvrir la fente de sortie lors du
transport de l’appareil, afin d’éviter sa détérioration.
III- APPAREILLAGE
e/ Une cuve
Récipient à base carrée (faces parallèles
transparentes) contenant la solution à étudier.
Elle Doit être transparente aux radiations
sélectionnées par le monochromateur. Elle est en
verre ou en plastique pour le visible et en quartz
pour l’UV.
Sur chaque cuve est gravé la longueur réelle du
trajet lumineux (L de Beer-Lambert)
III- APPAREILLAGE
e/ Une cuve
Différents modèles de cuves :
- Cuve ordinaire
- microcuve
- Cuves à vidange : orifice inférieur lié à un système
de vidange.
- Cuves à circulation : orifices d’entrée et de sortie.
L’absorption est modifiée si les faces de la cuve
sont recouvertes de poussière ou si les parois sont
rayées ou recouvertes d’une fine pellicule de
produits chimiques secs.
III- APPAREILLAGE
F/système de détection des radiations

Transforme le flux lumineux émergeant de la cuve en

flux électronique d’intensité proportionnelle.
Doit être prêt de la cuve pour éviter la déperdition de
l’énergie. On utilise généralement 2 cellules ; l’une
pour l’UV et l’autre pour le visible car la sensibilité
des cellules varie selon la longueurs d’onde.
Composé d’un :
Phototube (cellule émissive) : 2 électrodes sous vide dans
une enveloppe de verre ; Anode collectrice et cathode
émissive
Photomamplificateur : jusqu'à 106. dynodes (électrodes
multiples)
III- APPAREILLAGE
g/ amplification du signal
Le signal émergeant du système de détection
peut être repris par un circuit électronique
amplificateur qui peut atteindre 1010 au total
permettant de mesurer les flux lumineux
extrêmement faibles inaccessibles à l’œil nu.
Il aboutit finalement à un enregistreur ou à un
système d’affichage digital indiquant
l’absorbance ou directement la concentration
après action d’un calculateur approprié.
IV- MISE EN ŒUVRE
1/ PRINCIPAUX TYPES DE MONTAGES
Spectrophotomètre monofaisceau

Spectrophotomètre à double faisceau

IV- MISE EN ŒUVRE
2/ DIFFÉRENTS TYPES DE DOSAGES
a / En point terminal :
Pour doser un substrat S, il faut placer dans le milieu
réactionnel un excès d’enzyme de façon à ce que tout le S
soit consommé et transformé rapidement d’une façon
irréversible en Produit P.
On mesure la quantité du P formé au temps T, au terme
des réactions génératrices quand tout le S est consommé.
La DO est convertie en concentration selon une courbe
d’étalonnage dans la limite de linéarité.
b/ Méthode cinétique :
Mesure la vitesse de formation du P sur une période de
temps ∆t ; et ce en mesurant la DO en différents temps T1,
T2, T3, …etc
La DO du produit est donc la moyenne de la différence des
DO entre les différents temps de dosage.
V-APPLICATIONS :

La spectrophotométrie est la première analyse utilisée dans les

laboratoires, elle s’applique à tous les domaines d’analyse, à titre
d’exemple on cite :
Biochimie :
Substrats ;
Enzymes généralement à 340nm en cinétique (ASAT, ALAT) ;
Protéines (cycle aromatique à 278nm) ;
Calcium par l’arsénasoIII (complexant coloré) ;
Fer par la ferrosine ou la ferrine (compléxométrie) ;
ADN à 245nm ou 260nm.
Chimie analytique :
Dosage des médicaments (UV-visible ou HPLC) ;
Dosage des nitrates et des nitrites dans l’eau.
Toxicologie :
Morphiniques ;
Cannabis… ;
Ethanol par l’alcool déshydrogénase ;
Salicylés « réaction de Trinder » ;
Méthémoglobine ;
CONCLUSION :

La spectrophotométrie d’absorption moléculaire

UV-visible est la méthode analytique la plus
utilisée dans les laboratoires.
L’évolution majeur de ces dernières années
porte essentiellement sur le traitement du signal
grâce au développement de l’informatique et des
microprocesseurs.