CHAPITRE DE RAPPELS

1) ADN ET GENES

ADN = molécule porteuse de l’information génétique et est

soluble dans l’eau.
Gène = segment d’ADN et contient l’information pour la
production des protéines.
mARN (protéine), rARN et tARN

2) COMPOSITION ET ORGANISATION DES ACIDES NUCLEIQUES

nucléoside-5’-mono/di/tri-phosphate

ADN

Double hélice

1
 ARN plus court que l’ADN dû aux introns
et des parties non codantes qui ne
codent pas pour une protéine.

ADN ARN
Fonction Support de l’information génétique Copie d’une portion de
l’ADN
Sucre Désoxyribose Ribose
Bases Adénine, guanine, thymine, cytosine Adénine, guanine, uracile,
cytosine
Structure 2 brins enroulés en double hélice 1 brin plus court que l’ADN

3) LES CHROMOSOMES PROCARYOTES

Support physique des gènes, ADN nu et ADN bicaténaire et circulaire.

- ADN génomique : Obligatoire, porte l’information génétique.

- ADN plasmidique : Facultatif, apporte des avantages (résistance à des antibiotiques,….).
- Épisome : Facultatif, rôle dans la conjugaison.

Procaryote donc pas d’histones et une seule molécule d’ADN par chromosomes.

4) LES CHROMOSOMES EUCARYOTES

Support physique des gènes, ADN + protéines (Histones : protéines qui s’enroulent autour de
l’ADN), ADN bicaténaire.

- ADN génomique : Linéaire, porte l’information génétique de la cellule.

- ADN mitochondrial : Circulaire, porte l’information génétique de la mitochondrie.
- ADN chloroplastique : Circulaire, porte l’information génétique du chloroplaste (se trouve
chez les végétaux et font la photosynthèse).
2
5 types d’histones : H1, H2A, H2B, H3 et H4.

a) Arrangement de l’ADN dans les chromosomes

- Kinétochore : départ du fuseau mitotique

- Télomères : sécurité perte d’informations. « Sécurité » du

chromosome qui se situe à l’extrémité et permet son intégrité.

- Origines de réplication multiples : Phase S

Mécanisme épigénétique : Le mode de vie influence sur la génétique.

5) MECANISME DES ACIDES NUCLEIQUES

Réplication : ADN -> ADN

Transcription : ADN -> ARN
Traduction : ARN -> Protéine

a) Réplication ADN -> ADN (Phase S)

- Unidirectionnelle 5’ 3’ du nouveau

brin
- Semi-conservative

Localisation : origine de réplication.

3
Cette origine est formée de nucléotides répétés auxquels se fixe une protéine capable
d’initier la réplication. Il y a également une séquence riche en paires A-T (2 ponts H), plus
faciles à ouvrir que les pairs G-C (3 ponts H). Il régule le nombre de réplication et assure la
synchronisation avec le cycle cellulaire.

b) Transcription ADN -> ARN

Première étape de la synthèse des protéines : Un seul brin est transcrit et unidirectionnelle
5’-> 3’.
Promoteur : Amont du gène
Procaryotes : Région -35 TTGACA et TATAAT
à -10
Eucaryotes : plus complexes
TATA à -10 et CAAT plus en amont
Silencer = produit moins.
Enhancer = produit plus.

Région Stop : En aval du gène

Complexité variable
Série de G-C
Suivi d’une paire A-T
-> épingle à cheveux
Minimum 4T -> ARN polymérase se détache

4
c) Traduction ARN -> Protéine

Code génétique : Universel, non-

chevauchant et dégénérer.

Exercice

5'-TTACACCATGTTAGAGGAGTCACATAGCTAACA-3'
3'-AATGTGGTACAATCTCCTTAGTGTATCGATTGT-5‘

Que va donner la réplication ?

5'-TTACACCATGTTAGAGGAGTCACATAGCTAACA-3'
3'-AATGTGGTACAATCTCCTTAGTGTATCGATTGT-5‘
et
5'-TTACACCATGTTAGAGGAGTCACATAGCTAACA-3'
3'-AATGTGGTACAATCTCCTTAGTGTATCGATTGT-5‘

Quel est le brin codant ?

5'-TTACACCATGTTAGAGGAGTCACATAGCTAACA-3'

Que va donner la transcription ?

5'-UUACACCAUGUUAGAGGAGUCACAUAGCUAACA-3'

Que va donner la traduction ?

Met-Leu-Glu-Glu-Ser-His-Ser

1 géne, un ARNm = ARN polycistroniques.

1 géne, different ARN = ARN monocistroniques.

5
Modifications post-traductionnelles
1. Glycosylation dans le RER et l’appareil de golgi
2. Stabilisation par la formation de ponts disulfures
3. Protéolyses (lyse de protéines)
4. Polymérisations  structures quaternaires
5. Translocation vers le compartiment (noyau, membrane, …)…

6) MITOSE ET MEIOSE

- Mitose : 2n -> 2n, 3n -> 3n,…

1 cellule mère donne deux cellules filles
identiques

- Méisoe
2n -> n
1 cellule mère donne 4 cellules filles
génétiquement différentes de la cellule
mère

a) Mitose et cycle cellulaire

G1, S et G2 = interphase pour préparer tous les organites

6
Phase G0 = quiescence
Le cycle ne se fait pas forcément en 24h mais dépend du cycle cellulaire.
Phase G1 = replication
Phase S = traduction
Phase G2 = transcription

a) La mitose

1. Interphase : Les chromatines se

condensent et deviennent visible au
microscope.
2. Prophase : l’enveloppe nucléaire
commence à disparaitre.
3. Métaphase : les chromosomes
s’alignent sur la plaque équatorial de
la cellule. Les microtubules se lient au
centromère via le kinétochore.
4. Anaphase : séparation des
chromatines sœurs
5. Télophase : division

La prophase durant laquelle les paires de chromatides deviennent visibles au microscope

optique : les chromosomes s’individualisent par condensation et s’épaississent ; l’enveloppe
nucléaire disparait ;
La métaphase durant laquelle les chromosomes s’alignent sur la plaque équatoriale de la
cellule. Au niveau des deux pôles cellulaires s’étend un réseau de fibres, les microtubules, qui
se fixent aux centromères des chromosomes via le kinétochore ;
L’anaphase : suite à la force de traction des microtubules, chaque centromère se clive et les
deux chromatides sœurs se séparent ;
La télophase : les chromatides sont aux pôles ; chaque pôle regroupe un lot identique de
chromosomes. Les fibres du fuseau dégénèrent, une enveloppe nucléaire se reforme autour
de chaque noyau et le cytoplasme se divise (cytodierèse).

b) La méiose

7
deux divisions successives :
- la méiose I (ou division réductionnelle)
Lors de la méiose I, et plus particulièrement en prophase I, les chromosomes homologues
s’apparient physiquement ; les chromatides non-sœurs peuvent alors s’engager dans un
processus de recombinaison appelé crossing-over où des fragments d’ADN sont échangés
entre chromosomes homologues. En métaphase I, les chromosomes se disposent à la plaque
équatoriale de la cellule, les chromosomes homologues sont les uns au-dessus des autres.
Puis, chacune des deux paires de chromatides sœurs ségrége vers un pôle différent de la
cellule lors de l’anaphase I. La télophase I ressemble à la télophase mitotique si ce n’est qu’à
son terme, on obtient deux cellules haploïdes.
- la méiose II (ou division équationnelle).
La méiose II reproduit le processus de mitose : chaque chromatide sœur ségrége vers un pôle
différent de la cellule.

Homozygote = individu qui possède une paire d’allèles identiques pour un caractère donné
(ex.: BB ou bb)

Hétérozygote = individu qui possède une paire d’allèles différents pour un caractère donné
(ex.: Bb)

Hémizygote = individu qui ne possède qu’un seul allèle pour un caractère donné dans un
organisme diploïde. (ex: gènes portés par X chez l’homme)

Allèles = les différentes formes possibles d’un même gène (ex.: allèles B et b)

8
 CHAPITRE 1 : ELECTROPHORESE, BLOT, TRANSFORMATION ET PCR

1) INTRODUCTION

Un peu d’histoire…

Découverte des enzymes de restriction (enzyme qui coupe l’ADN) : Werner Arber, Daniel
Nathans et Hamilton O. Smith vers 1965. (Prix Nobel 1978).

Mise au point de méthodes de séquençage (technique qui permet de lire les nucléotides) :
Paul Berg, Walter Gilbert et Frederick Sanger, dans les années 1970. (Prix Nobel 1980).

Création du premier OGM (organisme génétiquement modifié) : Plant transgénique de

tabac, en laboratoire en 1983.

a) Définitions

Clonage de gènes = isolement et amplification d’un gène afin de l’étudier mais également le
modifier.

Génie génétique = ensemble des techniques de manipulation des génomes (humain 2n).

Transgenèse = transfert d’un gène étranger ou modifié, nommé transgène, dans le génome
d’un organisme.

b) Applications

- Outil technologique au service de la recherche (Séquençage de l’ADN notamment)

- Création d’organisme génétiquement modifié (OGM) utiles en recherche, en agronomie et
en industrie pharmaceutique
- Caractérisation génétique des individus afin de diagnostiquer des maladies génétiques
- Thérapie génique

c) Organismes hôtes utilisés pour le clonage

- E. Coli
- B. subtilis
- Pseudomonas (différentes espèces)
- Levures
- Champignons filamenteux
- Eucaryotes supérieurs

=> Utilisé pour mettre de l’ADN

2) DEFINITIONS

9
- Transformation cellule procaryote ou eucaryote avec ADN étranger
- Réplication ADN étranger dans la cellule hôte
⇒ origine de réplication ou intégration dans le génome

Un réplicon est une molécule d'ADN ou d'ARN, ou une région d'ADN ou d'ARN pouvant se
répliquer à partir d'une seule origine de réplication (ori). Le réplicon est l'unité de réplication
de l'ADN bicaténaire

2) VECTEURS

Plasmides : se trouve chez les procaryotes. Molécule d’ADN bicaténaire, circulaire.

Bactériophages : virus qui infectent des bactéries.

Faciles à isoler et à manipuler et ne doivent pas être intégrés dans le génome de l’hôte

3) PRINCIPE DE CLONAGE

Clonage = ADN étranger (insert) + vecteur de clonage + organisme hôte

1. Purification du vecteur et coupure au niveau des sites de restriction (Hind III)

2. Préparation et insertion (par LIGATION) de l’ADN étranger dans le vecteur coupé

ADN étranger = insert qui doit également être pure. Il doit avoir des extrémité compatibles
(Hind III) pour pouvoir se mettre dans le vecteur.
ADN ligase = ligation càd récréer des liens phosphodiester entre les brins.

3. Introduction de l’ADN RECOMBINANT, par transformation (introduire un plasmide dans

un ADN recombinant), dans la cellule hôte

Vecteur « ouvert » = vecteur digéré.

Vecteur = plasmide.

-> Ligation avec l’ADN ligase.

4) ELECTROPHORESE DES ACIDES NUCLEIQUES

10
a) Nature des gels

1. Agarose : ADN de grande taille, séparation

fragments entre quelques centaines de pb à
20 kb et horizontal.
OU
2. Polyacrylamide : Fragments plus petits ou
pour l’ARN de plus il est envertical.

b) Principe

Séparation des molécules d’ADN ou d’ARN selon leur taille.

- Application d’un champ électrique : L’ADN, étant naturellement chargés - à cause des
phosphates de leur structure, migrent vers l'anode qui est +.
- Distance de migration inversement proportionnelle au log MM (masse moléculaire)

Relation entre la distance de migration

d'un fragment d'ADN lors d'une
électrophorèse sur gel et sa taille
(nombre de paires de bases) sur une
échelle logarithmique.

L'axe vertical indique la taille des fragments (en paires de bases) sur une échelle
logarithmique, et l'axe horizontal indique la distance de migration à partir du point de départ
(puits). Les barres verticales montrent la distance parcourue par deux échantillons différents,
et les lignes pointillées permettent de lire leur taille estimée en les rapportant à la courbe
standard.

c) Suivi de la migration et révélation

1. Suivi
-> Colorants visibles

- Bleu de bromophénol : migre à la vitesse d‘un fragment d’ADN de 300 pb.

- Xylène cyanol : migre à la vitesse d‘un fragment d’ADN de 2 kpb (le plus haut dans le gel).
11
2. Révélation
-> Agents intercalants

- Bromure d’éthidium
- GelRed
- SyberSafe
- Midori Green
Visibles sous UV

d) Estimation de la taille d’un fragment linéaire d’ADN

Via un marqueur de taille (marqueur de poids moléculaire) et par

interpolation.

Étapes de la méthode d'électrophorèse sur gel

d'agarose pour les échantillons d'ADN :
1. Préparation du Gel
2. Chargement des Échantillons
3. Électrophorèse
4. Coloration de l'ADN
5. Visualisation

e) Applications de l’électrophorèse d’ADN

- Estimation du poids moléculaire de fragment d'ADN après digestion par enzymes de

restriction
- Purification de fragments d’ADN
- Analyse ADN après PCR
- Séparation de fragments ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de
Northern Blot
- Expérience de gel retard
EXAM !

GEL RETARD (utilisé en recherche pour l’études des facteurs de transcription notamment)
- Complexe ADN-protéine ou ARN-protéine migre moins vite dans un gel non-dénaturant
qu’un ADN ou un ARN nu
- Ce retard de migration permet de juger si une séquence particulière d’ADN ou d’ARN a été
reconnue et liée par une protéine

12
Les facteurs de transcription sont des protéines qui se lient à l'ADN spécifique (ex.au niveau
des promoteurs) pour réguler l’expression d’un gène donné. Mais également pour réguler la
transcription des gènes, en envoyant des signaux qui peuvent soit activer, soit réprimer cette
transcription. Pour identifier ces interactions in vivo, on utilise des sondes d'ADN marquées
qui sont incubées avec un extrait protéique. Si un facteur de transcription se lie à la sonde, il
provoque un retard dans la mobilité de l'ADN lors de l'électrophorèse sur gel. Ce retard
indique que le facteur de transcription se lie de la même manière à l'ADN dans la cellule.

5) TRANSFERT DES ACIDES NUCLEIQUES SUR DES MEMBRANES ET TECHNIQUES

APPARENTÉES

a) Southern Blot (pour l’ADN)

= TRANSFERT de l’ADN d’un gel d’agarose sur une membrane et détection via une sonde
marquée.

Étapes du Southern Blot :

0. Digestion de l’ADN par une enzyme de restriction

1. Électrophorèse
2. Dénaturation de l’ADN double-brin par traitement alcalin (NaOH)
3. Neutralisation dans une solution neutralisante
4. Transfert (par capillarité ou par application d’un courant électrique sur membrane de
nitrocellulose ou de nylon)
5. Fixation de l’ADN sur la membrane (chaleur ou UV)
6. Hybridation avec sonde
- Marquée ( radioactivité / molécule chimiluminescente, chromogénique ou fluorescente )
- Complémentaire de la séquence recherchée (T° d’hybridation dépend du Tm de la sonde)

13
Remettre sonde simple brin avec ADN simple brin -> appariment
+ la sonde est longue + ça sera spécifique
7. Lavages dans des conditions de plus en plus strictes ↑ T° et ↓ [sels]
8. Détection (autoradiographie, chimiluminescence, photographie, fluorescence)

1 et 4 : fragments d’ADN recherché

« Melting temperature » ou Tm = température à laquelle 50% des molécules d’ADN double

brin sont dénaturées.

Au labo : pour l’hybridation des

amorces (PCR), Tm favorable pour que
ça s’hybride.
Poly (AT) : tm 60
Poly (GC) : tm
ADN normal : tm aux alentours de 90

Tm dépend de :
- Concentration ADN
- Concentration ions (Mg+ et K+)
- Séquence ADN
- Longueur ADN
+ la sonde est grande + le tm sera élevé

- Plus la sonde est longue, moins il y a de chance qu’elle s’hybride à des séquences autres
que la cible dans des conditions strictes d’hybridation (« high stringency »). Stringence =
Spécificité, mettre les conditions les + favorables (en ions, en sels, …) pour que la réaction
soit spécifique.

- Plus la sonde a un contenu élevé en G et C, plus l’hybride sonde-cible sera stable.

14
Applications du Southern Blot

- Identifier un gène unique parmi des milliers de fragments d’ADN et détecter des séquences
dans le génome d’un organisme
- Utilisé dans la découverte des gènes et la cartographie des gènes
- Analyser les profils génétiques des organismes
- Identifier des mutations, délétions, duplications et des réarrangements de gènes impliqués
dans des maladies
- Déterminer le nombre de copies d’une séquence particulière d’AND présent dans le
génome d’un organisme
- Détecter certains cancers et maladies génétiques
- Réalisation d’empreinte génétique spécifique :
 Test de paternité
 Identification d’individu
 Détermination du sexe
 Exclusion d’espèce

b) Nothern Blot (pour l’ARN)

Électrophorèse : extrait de l’ARN

en fonction de la taille. Pourquoi
de l’ARN ? L’ARN est lié à
l’expression.
Sonde = molécule ADN marqué
de façon fluorescente ou autre
et va lier spécifiquement une
molécule d’intérêt. Pour pouvoir
détecter une séquence alors sera
complémentaire et doit être
simple brin.

Marqueur de poids moléculaires d’ARN = permet de savoir la taille de l’ARN idem que celui
d’ADN. Cuve avec tampon et un support solide. Ensuite, le buvard est complétement imbiber.
La membrane a la même taille que le gel ! Découper si nécessaire.
Les membranes de nylon/nitrocellulose sont toujours chargé positivement.
Le plus facile pour détecter de l’ARN : hybrider de l’ADN.
Enzyme reverse transcriptase = ARN simple brin à l’ADNc simple brin
Ne pas oublier l’étape de lavage.

Applications du Nothern Blot

- Détecter un mRNA spécifique dans un échantillon

- Screening des recombinants par détection de mRNA produit par un transgène
- Diagnostique de maladies
- Études de l’expression des gènes

15
 Différence Southern Blot Nothern Blot
s
- ADN - ARN
- Peut être réalisée sans - Réalisée en présence de formaldéhyde dans
formaldéhyde le gel pour dénaturer l'ARN (ARN est déjà en
- ADN simple brin, souvent simple brin) et empêcher la formation de
radiomarquée structures secondaires (en épingle à cheveux)
- Sonde : ADN complémentaire (ADNc) simple
brin, souvent radiomarquée ou marquée par
fluorescence (càd une copie en ADN d'une
séquence d'ARN, qui est également utilisée en
simple brin pour l'hybridation)

c) Western Blot (pour les protéines)

= TRANSFERT des protéines d’un gel d’acrylamide sur une membrane et détection via un
anticorps marqué ou non (réaction
« sandwich »).

Sur du gel d’acrylamide.

Détecte des protéines avec des Ac spécifique de la protéine que l’on cherche. Ac primaire
ensuite incubation avec Ac secondaire marqué qui détecte l’Ac primaire.
- LISA = mélange complexe de plusieurs protéines.
- SDS-PAGE = gel d’acrylamide se trouve entre 2 membranes en verre et est verticale et
contient du SDS (agent) pour que les protéines restent dénaturer.

On ajoute du SDS permet d’enlever différentes interaction et est chargé négativement.

- -mercaptoéthanol : très toxique, cliver les ponts disulfures
- glycérol : alourdir les protéines pour que les protéines rentrent bien au fond du puit
- bromophénol bleu : colorant

L’ADN (dénaturer) et l’ARN (formaldéhyde) est chargé négativement pas de probléme MAIS
les protéines ont différentes charge + ou – donc utilisation du SDS pour que la protéine ait
une structure linéaire et chargé -.
Taille d’une protéine = en dalton.

16
Détection : on ne doit pas fixer la membrane car elle s’y trouve déjà mais on plonge la
membrane dans une « blocking solution ». Cette « blocking solution » contient toujours de la
BSA (bovin serum albumin) = protéines. Le BSA s’attache partout où il n’y a pas de protéines.
Ensuite, l’ac primaire est mis et on lave pour enlever l’ac primaire qui ne se serait pas lier au
protéines. On ajoute l’ac secondaire qui reconnait l’ac primaire qui reconnait la protéine.

Substrat = « nourriture de l’enzyme ».

Sur l’Ac secondaire enzyme (HRP) = ajout de substrat qui sera dégrader don réaction
enzymatique, réaction de chimiluniscence que l’on va pouvoir détecter. + il y a de la lumière
+ il d’ac secondaire qui réagissait donc indirectement + il y avait de protéines au départ
Bande plus faible donc protéine – exprimé.

Applications du Western Blot

- Méthode très sensible pour détecter une protéine spécifique à faible concentration
- Diagnostique médical
- Quantification de l’expression d’un gène

6) TRANSFORMATION D’ORGANISMES

a) Transformation d’Escherichia coli par traitement au CaCl2

1. Préparation de bactéries compétentes (= électro compétentes -> électrique et chimio

compétentes -> thermique)
 resuspension de bactéries en phase de croissance exponentielle dans CaCl2 50 mM
glacé
 1010 bactéries/ml
 30 minutes à 0°C
2. 0,1 µg de plasmide + 0,2 ml de bactéries compétentes 30 minutes sur glace
3. Choc thermique (2 minutes à 42°C)
4. Incubation dans milieu nutritif (30 minutes RT)
5. Étalement sur milieu sélectif

Ex. Seule celle résistante à l’ampicilline,…

Rendement :
 107 à 109 transformants/µg
 Limite de taille : Si >50kb, rendement proche de 0

b) Transformation d’Escherichia coli par électroporation

17
Décharges électriques de haute tension

Rendement :
- 109 transformants/µg
- 106 transformants/µg pour des tailles allant jusqu’à 240 kb
- Dépend de la température, le voltage, la résistance,…

c) Transformation des bactéries Gram+

- Bacillus subtilis naturellement compétent

- Actinomycètes transformation sous forme de protoplastes (= cellule dont la paroi a disparu)
+ électroporation ou méthode chimique

d) Transformation des eucaryotes

- Levures transformation sous forme de protoplastes (= cellule dont la paroi a disparu) +

électroporation ou méthode chimique
- Cellules animales transformation par canon à ADN
- Cellules végétales transformation
 Sous forme de protoplastes + électroporation ou méthode chimique
+ virus des plantes dans lequel on a encapsidé l’ADN
+ bactérie pathogène des plantes
 Via un canon à ADN
Billes contenant l’ADN

7) PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

But : Amplifier une région spécifique d’ADN

Réactifs :
- 2 amorces « primers » -> oligonucléotides ( = séquence d’ADN simple brin) (17-30 nt)
s’hybridant de part et d’autre de la région à amplifier
- ADN polymérase dans son tampon (contient souvent du magnésium)
18
- ADN à amplifier (ADN génomique, plasmide, cADN)
- 4 dNTP
cADN = ARN -> cADN (complémentaire) par la reverse transcriptase

Principe :

Répétition d’un cycle (30 à 35 x)

1. Dénaturation ADN 94°C 5 minutes
2. Hybridation des oligonucléotides t°<Tm 2 à 60 sec
3. Polymérisation 72°C 4 à 120 sec

ADN polymérase travaille toujours à partir de

l’extrémité 3’ OH

a) Rôles des réactifs et paramètres à optimiser

1. Amorces
- Double rôle :
 délimitent la région d’ADN à amplifier
 extrémité 3' OH libre = amorce pour l’ADN polymérase
- Connaissance séquence amplifiée
- Entre 17 et 30 nucléotides
- Tm comparables
- Contenu en G-C: 50% (surtout en 3’)
- Séquences non complémentaires entre elles
- Séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées
- Synthèse des deux oligonucléotides (d'une vingtaine de bases)

2. Polymérases
- Rôle dans l’élongation (et la correction d’erreurs)

19
- Fragment de Klenow
 Provient de l’ADN polymérase I d’E. coli (via traitement subtilisine)
 Activité 5’ – 3’ polymérase et 3’ – 5’ exonucléase
 Non thermostable ⇒ nécessité de renouveler l’enzyme à chaque cycle
- Taq polymérase
 Provient de Thermus aquaticus
 Activité 5’ – 3’ polymérase
 Thermostable, active jusque 75-80°C ⇒ aucun renouvellement nécessaire
- Pfu et Pwo polymérases
 Activité 5’ – 3’ polymérase et 3’ – 5’ exonucléase
 Thermostable
- Actuellement, utilisation de polymérases recombinantes

3. dNTP

- Rôle dans l’élongation

- Mélange dATP, dGTP, dCTP et dTTP en concentration égales
- En quantité suffisante (2 mM)
- Concentration diminue avec les cycles

4. Matrice d’ADN

- En théorie 1 copie ADN de la séquence recherchée est suffisante

- En pratique plusieurs copies sont nécessaires

ATTENTION
 mauvaise qualité
 quantité trop importante
d’ADN matrice peut conduire à
 une amplification aspécifique
 une inhibition enzymatique

5. Tampon

- Maintien du pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la polymérase

20
- Contient souvent Mg2+, cofacteur indispensable pour la polymérase
- Présence Mg2+ K+ ou NH4+
neutralisent les charges des PO43- au niveau de l’ADN ⇒ stabilisation des hybrides ADN/ADN

K+ et NH4 + car ADN contient des groupement P

Paramètres

1. Température :
- Dénaturation 95°C = dissociation complète des deux brins d’ADN
- Hybridation 50 à 60°C = association des amorces avec les séquences complémentaires de la
matrice
 dépend de la composition en bases des oligonucléotides amorces
 =Tm - 5°C
 Tm = 4*(nb paire GC) + 2*(nb paire AT) (amorce< 30 nucléotides)
- Polymérisation 72°C = température de « travail » de l’ADN polymérase thermorésistante
utilisée

2. Temps et nombre de cycle

- Temps d’hybridation dépend de la longueur des amorces et de la complémentarité avec la
matrice
- Temps d’élongation dépend de la longueur de la séquence à amplifier
- Nombre de cycle ~ 30-40 cycles au-delà amplification plus possible car
 viscosité augmente
 quantités amorces et dNTP diminuent
 libération d’ions pyrophosphates qui inhibent l’activité de la polymérase

8) PCR EN TEMPS RÉEL OU QUANTITATIVE (qPCR)

- Principe de la PCR classique mais utilisation de sondes fluorescentes (=ADN simple brin
marqué)

Repose sur deux principes :

- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)
- l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol

La PCR en temps réel fait donc le suivi de la

fluorescence émise pendant la réaction avec
un indicateur de la production des amplicons durant chaque cycle.
La technologie de la PCR en temps réel est basée sur la détection et la quantification d’un «
reporter» fluorescent.

21
L’augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité
d’amplicons générés durant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence
émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase
exponentielle où la première augmentation significative dans la quantité d’amplicons est en
corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice originale cible (template).

9) REVERSE TRANSCRIPTION - PCR OU RT-PCR

Principe : Une reverse transcriptase va convertir de l’ARN en cADN qu’on amplifiera par PCR

22
 CHAPITRE 2 : EXTRAIRE, COUPER ET JOINDRE DES MOLECULES D’ADN

Rappel chapitre 1 :

Les plasmides sont utilisés comme vecteur de clonage

Par des expériences de recombinaison in vitro- clonage, on sait intégrer dans la molécule
d'un plasmide un fragment d'ADN provenant d'une autre source. On obtient ainsi un
plasmide recombinant

On peut faire pénétrer ces molécules recombinées dans des cellules de Escherichia coli
dépourvues de plasmide (transformation).

On peut repérer les cellules qui ont reçu une molécule de plasmide grâce aux gènes du
plasmide qui sont sélectionnables (résistance à une drogue).

Parmi ces cellules, on pourra, dans certains cas, reconnaître (ou sélectionner) celles qui
portent un plasmide ayant intégré un fragment particulier de l'ADN étranger.
L'ensemble des descendants d'une telle cellule constitue un clone. On dit que l'on a cloné un
fragment d'ADN.

L’introduction d’un gène d’intérêt dans un plasmide permet sa propagation dans les cellules
bactériennes et la production de grandes quantités du matériel génétique souhaité.

Les plasmides sont utilisés comme vecteur d'expression

Une fois un fragment d'ADN cloné dans un plasmide on peut réussir à faire exprimer les
gènes qu'il porte dans les cellules d'Escherichia coli.
Cette expression nécessite la transcription de ce fragment et la traduction de l’ARN messager.
On peut ainsi faire fabriquer à Escherichia coli des protéines étrangères (par exemple,
l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine).

Les plasmides fonctionnent comme des vecteurs, facilitant l’expression des gènes souhaités
dans une cellule hôte désignée. Une fois le gène d’intérêt intégré dans la molécule d’ADN
plasmidique, il est introduit dans l’hôte, ce qui stimule l’expression du gène (et la production
de la protéine).

23
1) EXTRAIRE ET PURIFIER DES ACIDES NUCLEIQUES

Les acides nucléiques (ADN génomique, plasmidique ou ARN) sont situés à l’intérieur des
cellules. Pourtant, la plupart des techniques de biologie moléculaire implique qu’on les isole
du reste du matériel cellulaire. L’échantillon ainsi préparé servira par la suite à de
nombreuses analyses.

Les principales étapes de préparation de l’échantillon sont les suivantes :

- Récupération du spécimen (tissu, cellule) à partir duquel l’extraction sera réalisée: ce
spécimen doit être conservé dans des conditions adaptées (de T° notamment).
- Rupture des membranes cellulaires: en général par l’utilisation de détergents
- Inactivation des nucléases pouvant dégrader le matériel d’intérêt
- Séparation des acides nucléiques des protéines normalement associées
- Purification de l’acide nucléique d’intérêt par différentes méthodes
- Éventuellement concentration ou dilution du matériel

Le but étant d’obtenir des acides nucléiques plus ou moins concentrés plus ou moins purs
permettant des analyses ultérieures.
Il convient de garder à l’esprit l’extrême fragilité du matériel (surtout les ARNs).

Extraction des ADN :

De nombreuses méthodes existent en fonction des objectifs visés de la nature et de la source

d’ADN des critères de pureté attendus.
Extraction au phénol-chloroforme
Elle reste la méthode de référence donnant de bons résultats en terme de quantité
récupérée et de pureté. Elle se réalise en plusieurs étapes:
- Lyse des membranes et élimination des protéines indésirables: le plus souvent à
l’aide d’un mélange de détergent (souvent SDS) et protéinase K mais d’autres
techniques existent (choc mécanique ou hypotonique)
- Séparation de l’ADN des autres constituants cellulaires (notamment protéines et
ARN): du phénol (agent déprotéinisant) est ajouté au lysat (sol aqueuse) à pH neutre,
puis le mélange est centrifugé. On obtient alors deux phases avec les protéines
précipitées entre les deux phases. La phase aqueuse supérieure contenant les acides
nucléiques et une phase organique inférieure.
- Utilisation du chloroforme (CHCL3) pour éliminer les traces de phénol.
- Concentration de l’ADN par précipitation à l’éthanol (qui déshydrate l’ADN et le fait
précipiter) puis centrifugation.
- Lavage et resolubilisation du culot: éthanol à 70% puis reprise dans de l’eau.

24
2) PURIFICATION DE L’ADN PLASMIDIQUE

L’intérêt est de séparer l’ADN plasmidique de l’ADN génomique.

La méthode de référence utilisée est la lyse alcaline :
- Lyse alcaline + SDS: les ADN plasmidique et génomiques sont dénaturés.
- Neutralisation du pH: les ADN se renaturent, mais l’ADN plasmidique plus court se renature
plus rapidement. L’ADN génomique non renaturé précipite avec les protéines et le SDS alors
que l’ADN plasmidique reste soluble.
- Séparation de l’ADN plasmidique et concentration: dépôt du surnageant sur une colonne de
silice.

Resuspension du culot bactérien

- Centrifugation culture bactérienne
- Ajout ribonucléase

Étape 1 Lyse alcaline

Dénaturation ADN, protéines, lyse paroi et membranes

Étape 2 Neutralisation
Renaturation ADN plasmidique mais pas ADN chromosomique

Centrifugation

Étape 3 Purification de l’ADN plasmidique

Elimination sels, protéines, lipides

Facteurs influençant les rendements :

- Nombre de copies du plasmide/cellule

- Qualité de la préparation du lysat clarifié
- Taille du plasmide (plus le plasmide est grand, moins le rendement est bon)

Dosage des acides nucléiques

ADN maximum d’absorption à 260 nm.

280 nm pour protéines !

25
La plupart des molécules biologiques contenant des noyaux aromatiques absorbent les
rayons ultraviolets à différentes longueurs d’onde. Dans l’ultraviolet de très courte longueur
d’onde presque toutes les solutions de molécules biologiques sont opaques. Dans la région
d’émission des lampes à vapeur de mercure (254 nm) les bases puriques et pyrimidiques ont
des pics d’absorption spécifiques qu’on utilise pour comparer avec les spectres d’absorption
des acides aminés aromatiques dans la même région.
• Sur ce graphe les ordonnées représentent l’absorption de la lumière transmise en fonction
des longueurs d’onde représentées en abscisse.
• Les zones d’absorption des quatre bases s’étalent de 240 à 280 nm de sorte que les acides
nucléiques formés de ces quatre types de nucléotides ont un maximum d’absorption à 260
nm

A de l’ADN double brin : 50 μg/ml.

Simple brin: 37 μg/ml.
ARN : 40 μg/ml.
A = 260/280 > 1,8
l= 1 cm; RT; [Na+] = 0,3 M

3) COUPER L’ADN

Restriction et modification de l’ADN chez les bactéries

Systèmes de restriction
↳ permettent aux bactéries de vérifier l’origine de tout ADN pénétrant dans la cellule et de le
détruire s’il est étranger (bactériophage)

↳ Les endonucléases de restriction reconnaissent des séquences SPECIFIQUES dans l’ADN

(sites de restriction) et le coupent en fragments de restriction

Système de modification
↳ Pour protéger leur ADN, les bactéries le modifient (par méthylation) pour qu’il ne soit pas
digéré par les enzymes de restriction

Nomenclature des enzymes de restriction

- 1ère lettre du genre + 2ères lettres de l’espèce (en italique)

- 1 lettre pour la souche
- 1 chiffre romain pour désigner le numéro de l’enzyme

26
Sites de restriction

Le site de restriction est une séquence ( 6 à 8 nt.) la plupart du temps palindromique (chaque
brin lu de 5' vers 3' est identique à son complémentaire inversé).

/ = couper donc sera palindromique

Examen !

Isoschizomères = enzymes de restriction qui reconnaissent la même séquence et coupent de

la même façon.
SphI (CGTAC/G) and BbuI (CGTAC/G)

Néoschizomères = enzymes de restriction qui reconnaissent la même séquence coupent

différemment.
SmaI (CCC/GGG) et XmaI (C/CCGGG)

Types de coupure

a) Bouts collants ou sortants (cohesive or sticky or protruding ends)

Examen !

Extrémité différentes
1. 5’ débordante (idem sortant) (le + grand
fragment correspond à l’extrémité 5’)

Enzymes de restriction compatibles = enzymes de restriction qui génèrent des extrémités

sortantes complémentaires !
DpnI (/GATC) et BscfI (/GATC)

3 possibilités lorsqu’on sépare le brin par une enzyme de restriction compatibles et que 2
extrémités cohésives sont identiques :
1. Le vecteur se referme
2. L’insert se met dans le bon sens
3. L’insert se met dans l’autre sens

b) Bouts francs

On génère toujours des

extrémités 5’P !

27
Nombre des fragments de restriction

↳ Dépend de la fréquence de répétition du site de restriction dans l’ADN

Exemple (dans un ADN contenant 50% de G-C et 50% A-T)

1 site de restriction de 4 pb apparaît toutes les 44 pb = 256 pb

1 site de restriction de 6 pb apparaît toutes les 46 pb = 4096 pb
1 site de restriction de 8 pb apparaît toutes les 48 pb = 65536 pb

Rem: certaines enzymes montrent une préférence pour certains sites de coupure (exemple
des 5 sites de restriction d’EcoRI dans l’ADN du phage )

Analyse des fragments de restriction sur gel d’agarose (carte de restriction)

Enzyme 2 : 2 fragments donc coupe 1 x

4) ENZYME DE RESTRICTION

= une protéine capable de couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de

nucléotides caractéristique appelée site de restriction.

Pour illustrer comment une enzyme de restriction reconnaît et coupe une séquence d'ADN,
prenons l'exemple de EcoRI, une enzyme de restriction couramment utilisée en laboratoire.
EcoRI coupe au niveau du site suivant :

Lorsque EcoRI reconnaît et coupe ce site, elle le fait toujours selon un motif très spécifique
qui produit des extrémités d'ADN simple brin qui dépassent :

Extrémités cohésives-
bouts « collants »

28
Si un autre fragment d'ADN présente des extrémités correspondantes (par exemple, parce
qu'il a également été coupé par EcoRI), ces dernières peuvent se coller sous l'effet de
l'appariement complémentaire des bases. C'est pourquoi on dit que les enzymes qui
exposent des bouts d'ADN simple brin produisent des extrémités cohésives. Les extrémités
cohésives sont utiles pour le clonage, car elles maintiennent la cohésion de deux morceaux
d'ADN afin qu'ils puissent être liés par l'ADN ligase.

Toutes les enzymes de restriction ne génèrent pas des coupures à bouts collants (extrémités
cohésives). Certaines réalisent des coupures franches, en coupant directement au milieu
d'une séquence cible sans laisser d'extrémités qui dépassent. Par exemple, l'enzyme de
restriction SmaI effectue des coupures droites :

Extrémités droites-
bouts « francs »

Dans le cadre de la réplication de l'ADN, le rôle de la ligase est de joindre les fragments
d'ADN nouvellement synthétisés pour former un brin homogène. Les ligases utilisées dans le
clonage de l'ADN font à peu près la même chose. Si deux morceaux d'ADN présentent des
extrémités complémentaires, l'ADN ligase peut les réunir pour former une molécule
continue.
Les extrémités
cohésives ou
droites peuvent
être recollées par
l’ADN ligase

Couper des brins d’ADN (différents) pour pouvoir les recoller ensuite est une technique de
base de la biologie moléculaire et du génie génétique.

La ligation :

29
5) CONSTRUIRE UN PLASMIDE RECOMBINANT (EXEMPLE D’UN CLONAGE)

Voyons comment la digestion par des enzymes de restriction et la ligature peuvent servir à
insérer un gène dans un plasmide. Supposons qu'on dispose d'un gène d'intérêt flanqué de
sites de reconnaissance EcoRI, et d'un plasmide contenant un seul site EcoRI :

Notre objectif est d'utiliser l'enzyme EcoRI pour insérer le gène dans le plasmide. Tout
d'abord, on digère (coupe) séparément le gène et le plasmide avec l'enzyme EcoRI. Cette
étape génère des fragments avec des extrémités cohésives.

Ensuite, on prend le gène et le plasmide linéarisé (ouvert) et on les combine grâce à l'ADN
ligase. Les bouts collants des deux fragments s’assemblent par appariement complémentaire
des bases :

30
Une fois réunis par la ligase, les fragments constituent un unique morceau continu d'ADN. Le
gène d'intérêt est maintenant inséré dans le plasmide, ce qui donne un plasmide
recombinant.

Que se passe t- il si ses deux extrémités cohésives sont identiques ?

Dans l'exemple ci-dessus, on a vu le résultat de la ligature d'un gène et d'un plasmide digérés
par EcoRI. Cependant, ce n'est pas le seul résultat possible. Par exemple, le plasmide coupé
pourrait se circulariser à nouveau (se refermer) sans incorporer le gène. De même, le gène
peut être introduit dans le plasmide, mais se retrouver à l'envers (puisque ses deux
extrémités cohésives EcoRI sont identiques).

6) JOINDRE DES FRAGMENTS D’ADN

Comment ? Via une ligase, lie 2 fragments d’ADN. Mécanisme par lequel on crée des liaisons
phosphodiesters.

ADN ligase d’E. coli :

- Utilise le NAD+ comme coenzyme (= enzyme qui favorise la réaction)
- Pour lier des fragments à bouts collants (à bouts francs si PEG)

T4 ADN ligase :
- Provient du bactériophage T4 d’E. coli
- Utilise l’ATP comme coenzyme
- Pour lier des fragments à bouts collants et francs

Clonage de gènes = isolement et amplification d’un gène afin de l’étudier

31
Le clonage de l'ADN est une technique de biologie moléculaire qui fabrique de nombreuses
copies identiques d'un morceau d'ADN, tel qu'un gène.

Dans une expérience typique de clonage, un gène d'intérêt est inséré dans un morceau
d'ADN circulaire appelé un plasmide.

Le plasmide est introduit dans les bactéries par un processus appelé la transformation, et les
bactéries transportant le plasmide sont sélectionnées à l'aide d'antibiotiques.

Les bactéries dotées du bon plasmide sont utilisées pour fabriquer davantage de ce plasmide
ou, dans certains cas, pour induire l'expression du gène et produire des protéines.

Pourquoi est-il utile de fabriquer de nombreuses copies d’une séquence d’ADN dans un
plasmide ?

Dans certains cas, on a besoin de beaucoup de copies d'ADN pour réaliser des expériences
ou construire de nouveaux plasmides.
Dans d’autres cas, le fragment d’ADN encode une protéine utile, et les bactéries sont utilisées
comme "usines" pour fabriquer la protéine.
Par exemple, le gène de l'insuline humaine est exprimé dans la bactérie E coli pour produire
de l'insuline utilisée par les diabétiques.

1. Couper et coller l'ADN

L'objectif du clonage est d'insérer un gène d'intérêt (par exemple, l'insuline humaine) dans
un plasmide. En utilisant une enzyme de restriction soigneusement choisie, on digère :
 Le plasmide, qui possède un seul site de restriction.
 Le fragment d'ADN du gène d'intérêt, qui possède un site de restriction près de
chacune de ses extrémités.

Ensuite, on combine les fragments à l'aide de l'ADN ligase, qui les lie pour produire un
plasmide recombinant contenant le gène.

2. Transformation des bactéries et sélection

32
Des plasmides et d'autres formes d'ADN peuvent être introduits dans des bactéries, comme
le E. coli communément utilisé en laboratoire, par un processus que l'on appelle
transformation. Au cours de la transformation, des bactéries soumises au préalable à un
traitement spécial reçoivent un choc (comme une forte température) qui les pousse à
incorporer l'ADN étranger.

Un plasmide contient généralement un gène de résistance aux antibiotiques, qui permet

aux bactéries de survivre en présence d'un antibiotique spécifique. Ainsi, les bactéries qui
incorporent le plasmide peuvent être sélectionnées sur des plaques nutritives contenant
l'antibiotique. Les bactéries sans plasmide meurent, tandis que les bactéries transportant un
plasmide sont capables de vivre et de se reproduire. Chaque bactérie survivante donne
naissance à un petit groupe, ou colonie, de bactéries identiques qui possèdent toutes le
même plasmide.

Toutes les colonies ne contiennent pas nécessairement le bon plasmide, car au cours de la
ligature, les fragments d'ADN ne sont pas toujours "collés" exactement comme on le
souhaite. En fait, on doit collecter l'ADN de plusieurs colonies et s'assurer que chacune
contient le bon plasmide. On utilise couramment des méthodes telles que la digestion par
une enzyme de restriction et la PCR pour vérifier les plasmides.

3. La production de protéines

33
Une fois qu'on a trouvé une colonie bactérienne avec le bon plasmide, on cultive une grande
quantité de bactéries porteuses du plasmide. Ensuite, on fournit aux bactéries un signal
chimique qui leur ordonne de fabriquer la protéine d'intérêt.
Les bactéries sont utilisées comme des "usines" miniatures qui produisent de grandes
quantités de protéines. Par exemple, si notre plasmide contient le gène de l'insuline
humaine, la bactérie va commencer à transcrire le gène et à traduire l'ARNm pour produire
de nombreuses molécules d'insuline humaine.

Conditions expérimentales :
- Température entre 4 et 15°C
- Excès d’ADN étranger (excès en masse molaire d’insert
3x plus que le vecteur
- Déphosphorylation du vecteur et phosphorylation des
fragments PCR (si nécessaire pour éviter qu’il ne se
referme)
Déphosphorylation

Comment déphosphoryler le vecteur ? Via la phosphatase alcaline.

- Enzyme présentant une activité optimale en milieu alcalin

- Enlève le groupement 5’-P des acides nucléiques

Phosphorylation

Comment phosphoryler des fragments PCR ? Via la polynucléotide kinase T4.

- Transfert du phosphate γ de l’ATP sur une fonction alcool du carbone 5’ d’un ADN ou d’un
ARN
- Utilisée au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif ( 32P) sur l’extrémité 5’
d’un acide, si l’on veut faire une sonde.

a) Ligation extrémités à bouts collants compatibles

Fragments compatibles générés par la terminal transférase

34
- Additionne des désoxynucléotides (purines si Mg2+ et pyrimidines si Co2+ ou Mn2+) en 3’
de l’ADN
- Préfère les extrémités 3’ sortantes (mais agit aussi sur des fragments à bouts francs ou sur
des extrémités 3’ rentrantes)

Comment obtenir des extrémités 3’ sortantes ?

Via l’exonucléase  (également au niveau de la réplication)

- Possède une activité 5’ → 3’ exonucléase
- Libère des nucléosides-5’-phosphate
- Permet d’obtenir de l’ADN simple brin au départ d’ADN double brin

b) Ligation des extrémités à bouts francs

On peut transformer des fragments d’ADN à bouts collants en

fragments à bouts francs.

7) EN RESUME…

35
1. Ligation entre des fragments d’ADN à bouts collants générés par la même enzyme de
restriction.

2. Ligation entre des fragments d’ADN à bouts collants compatibles générés par des enzymes
de restriction différentes.

EXAMEN !

Les 2 extrémités sont compatibles.

3. Ligation entre des fragments d’ADN à bouts collants générés par la terminal transférase.
ADN recombinant = ADN qui a été recombiné par clonage.

4. Ligation entre des fragments d’ADN à bouts francs.

5. Ligation entre des fragments d’ADN à bouts francs générés par l’ADN polymérase.

36
 CHAPITRE 3 : PROPRIETES BIOLOGIQUES DES VECTEURS

1) RAPPEL

Vecteur = Plasmide (la plupart du temps)

Vecteur de clonage et d’expression : plasmide et bactériophage (=virus qui infecte les
bactéries, un vecteur)

- Réplicon extrachromosomique
- Transmis à la descendance
- ADN double brin, circulaire
- Non essentiel à la survie de la bactérie
- Confère différents avantages à la bactérie (résistance aux antibiotiques, fermentation de
sucres,…)
- Conjugatif ou non
- En nombre élevé ou en faible nombre d’exemplaires.

2) SPECTRE D’HOTES DES PLASMIDES

↳ Déterminé par la région ori du plasmide. Région ori = point de l’origine de réplication.
↳ Plasmides à large spectre codent pour la plupart (voire la totalité) des molécules
nécessaires à leur réplication

Différents vecteurs et taille de l'insert accepté

Cosmides = Vecteur artificiel (par génie génétique) hybride d’un plasmide contenant la
séquence cos de lambda.

BAC = des ADN circulaires, comme un chromosome bactérien, dont l’origine de réplication
est issue de l’épisome sexuel F d’E. coli (plasmide impliqué dans la conjugaison
bactérienne).

YAC = Contient les parties du chromosome de la levure nécessaires à sa réplication et à sa

ségrégation dans la cellule hôte : levure.
• Capable de véhiculer de grands gènes eucaryotes avec promoteur et séquences
régulatrices.

37
Propriétés requises des plasmides utilisés comme vecteur de clonage

Masse moléculaire peu élevée

↳ Facile à manipuler
↳ Grand nombre d’exemplaires
↳ Sites uniques de restriction

Capacité de conférer un phénotype sélectionnable (ex: résistance à un antibiotique)

↳ Sélection des cellules hôtes ayant incorporé le plasmide

Sites uniques de restriction localisés dans des gènes dont l’expression phénotypique est
facilement détectable
↳ Pour savoir si l’ADN étranger a bien été inséré dans le vecteur de clonage (ex: test blanc-
bleu)

Caractéristiques la plus importante : grand nombre d’exemplaire dans la bactérie !

3) EXEMPLE DE PLAMSIDE CLONAGE

1. pBR322

ü Construit de toutes pièces

ü Origine de réplication contrôle relâché
• 10 à 20 copies/cellule conditions
standard de culture
• ~1000 copies/cellule en présence de
chloramphénicol
ü 2 gènes de résistance à des antibiotiques
• bla code la β-lactamase qui dégrade
l'ampicilline [AmpR][AmpS]
• tet confère la résistance à la tétracycline

Mode d’emploi :

3. Ligation : recréation des liens

phosphodiesters.
Nucléase = enzyme de restriction.
Recombinant = modifié.

38
 Sélection des bactéries
transformées et repérage des
bactéries portant un plasmide
recombiné

Le géne lacz code pour la beta-

galactosidase.

2. pUC18

Mode d’emploi : Sélection des bactéries transformées portant un plasmide pUC recombiné

CHAPITRE 4 :
SEQUENÇAGE ET
MUTAGENESE DIRIGEE
DE L’ADN

39
1) DEFINITIONS ET INETRETS

Séquençage = détermination de la séquence de l’ADN

Mutagenèse dirigée = changement spécifique d’un ou de plusieurs nucléotides dans une
séquence d’ADN ≠ mutagenèse aléatoire.

1. Du séquençage :
- Comprendre la cause d’une maladie héréditaire humaine
- Pouvoir planifier des manipulations de l’ADN (connaissance des sites de restriction,…)
- Cartographie précise des génomes (humain et autres espèces)

2. Du mutagenèse
- Etudier la relation structure-fonction
- Faire du « protein engineering »

2) SEQUENCAGE DE L’ADN

a) Principe

→ Méthode de Sanger ou méthode de terminaison des chaînes (méthode manuelle).

Sanger : utilisation d’une ADN polymérase à partir d’une extrémité 3’ OH.

Réactifs utilisés (dans 4 tubes) :

- ADN à séquencer
- Fragment de Klenow dans son tampon
- Amorce
- 4 dNTP (en excès) dont un est marqué au 32P
- 1 ddNTP (différent dans chaque tube)

Exploitation de deux propriétés des

ADN polymérases :
1. Leur capacité de synthétiser une copie complémentaire d’un ADN modèle
2. Leur capacité d’utiliser des 2’,3’-didésoxynucléotides (ddNTP) (terminateurs de chaîne).
NTP = ribose

- PCR -> population de fragments d’ADN de différentes tailles

40
- Séparation par électrophorèse.

Gel de polyacrylamide (6 à 20%)

+ urée 7M
70°C

Le gel de séquence permet de

séparer des fragments d’ADN
simple brin, différant d’une
base.

Révélation par
autoradiographie.

b) Les variantes

- dNTP marqué au 33P ou 35S pour améliorer la netteté,

- fluorogènes, chromogènes,… MAIS la sensibilité plus faible
- Séquenase ou la Taq polymérase.

1. Fragment de Klenow
- Provient de l’ADN polymérase I d’E. coli (via un traitement par la subtilisine)
- Activité 5’ – 3’ polymérase et 3’ – 5’ exonucléase
- Non thermostable  nécessité de renouveler l’enzyme à chaque cycle

2. ADN polymérase I
- Assure la réplication de l’ADN chez E. coli
- Activité 5’ – 3’ polymérase, 5’ – 3’ et 3’ – 5’ exonucléase

3. Séquenase ou T7 polymérase
- Provient du bactériophage T7
- Activité 5’ – 3’ polymérase
- Aucune activité exonucléasique (1 erreur/1000 pb)

4. Taq polymérase
- Provient de Thermus aquaticus
- Activité 5’ – 3’ polymérase
- Thermostable (active jusque 75-80°C)
- Aucune activité exonucléasique (1 erreur/100 pb)

5. Pfu et Pwo polymérases

- Activité 5’ – 3’ polymérase et 3’ – 5’ exonucléase
- Thermostable

41
3) SEQUENCAGE AUTOMATISE
Méthode des « dye terminators »

Réactifs utilisés (dans 1 tube) :

- ADN à séquencer
- ADN polymérase
- Amorce
- 4 dNTP (en excès)
- 4 ddNTP marqués par un
fluorochrome différent

Détection :

Comparaison des méthodes

de séquençage nouvelle-
génération :

42
4) MUTAGENESE DIRIGEE DE L’ADN

- Par cassettes
- Par prolongement des amorces (« primer extension »)
- Par PCR

a) Mutagenèse par cassette

On remplace un fragment d’ADN par un fragment

synthétique contenant la mutation.
Avantage : Simple et efficace (100%)
Inconvénient : Nécessité d’avoir des sites de restriction

Plasmide recombiant

b) Mutagenèse par
prolongement des amorces
(« primer extension »)

On synthétise de l’ADN, in vitro,

avec un oligonucléotide (7 – 20
nt) contenant la mutation.

c) Mutagenèse par PCR

Nécessité de cloner le produit PCR dans un

vecteur pour l’introduire dans l’organisme hôte
Nécessité de séquencer.

Nécessite 2 PCR
1e mutation avec primers 1 et 4

43
2e mutation ave primer 2 et 3

d) Mutagenèse par PCR

sans étape de clonage dans
un vecteur

Nécessité de séquencer

44