Travaux pratiques
Filière BCG, LST BIOP S5
ETUDE DE LA NUTRITION
MINERALE
Pr. AMIR Soumia
& Pr Khadraji Ahmed
Introduction
Les végétaux chlorophylliens étant des organismes autotrophes (fabriquent eux mêmes leur
matière organique), vivent dans un environnement essentiellement minéral (inorganique)
prélevant le gaz carbonique dans l’atmosphère, l’eau et les éléments minéraux dans la solution
du sol (pour les plantes terrestres) ou dans le milieu aquatique (pour les plantes aquatiques).
La nutrition minérale de la plante concerne l’ensemble des mécanismes impliqués dans le
prélèvement, le transport, le stockage et l’utilisation des éléments minéraux nécessaires au
métabolisme, la croissance et au développement de la plante.
Certains minéraux (ex N, P et K) sont indispensable à la plante on parle de macro-éléments et
d’autres sont accessoires (Fe, Cu, Co Mn,…), on parle alors d’oligo-éléments, la présence de
ces constituants est très variable au sein des végétaux, de son environnement (sol, eau..).
L’absorption de ces éléments minéraux sous forme d’ions correspond donc à l’activité de
prélèvement de ceux-ci dans le sol, le sol constitue alors l’apport fertilisante de la plante.
Dans ce TP nous allons extraire et doser l’élément minéral P dans une feuille de plante et dans
un sol.
Dans le sol, le phosphore se trouve sous différents états :
- Dans la solution du sol (HPO2-4, HPO-4), il est directement disponible pour la plante
(phosphore assimilable).
- Adsorbé sur le complexe argilo-humique par le biais des formes calciques et magnésiennes.
- Insoluble : sous forme de phosphates de calcium (dont certaines formes sont insolubles) au
niveau des sols calcaires ou immobilisé en partie par les hydroxydes de fer et d’aluminium.
- Non labile ; sous forme minérale ou organique.
La teneur du phosphore total varie de 200 à 1500 ppm (mg/kg). La majeure partie de ce
phosphore est engagé dans des combinaisons moléculaires relativement stables. La part de P
disponible (assimilable) pour la plante est faible et ne représente que près de 1 % de P total.
L’absorption de l’ion monovalent excède celle de l’ion bivalent (HPO2-4, HPO-4). Cette
absorption est fonction du pH.
Le phosphore a une importance majeure dans la nutrition des plantes (0.1- 0.4 % de la matière
sèche). Il participe à la plupart des activités biochimiques à l’intérieure de la plante et
intervient dans les processus de transport d’énergie par l’intermédiaire de l’ATP et l’ADP tant
pour l’activité photosynthétique que pour la synthèse et la dégradation des glucides
(respiration).
Le phosphore est un facteur de précocité, il tend à raccourcir le cycle végétatif et intervient
dans la maturation.
le Phosphore assimilable
(P Olsen)
Principe :
Le phosphore est extrait du sol par une solution de bicarbonate de sodium 0.5M à pH constant
de 8.5. Dans les sols calcaires, alcalins ou neutres contenant du Phosphore lié au calcium,
cette solution d’extraction diminue la concentration du calcium en causant sa précipitation
sous forme de CaCO3 et augmente la concentration de P dans l’extrait. Le dosage du
phosphore est fait par colorimétrie basée sur la formation et la réduction d’un complexe de
l’acide orthophosphorique et de l’acide molybdique. La réduction du phosphore – molybolate
s’accompagne d’une coloration bleue ciel dont l’intensité est proportionnelle à la quantité du
phosphore présent dans le milieu considéré.
Réactifs :
Bicarbonate de sodium 0.5M
Solution mère KH2PO4 (100 mg de P /l)
Réactif A = Molybdate de sodium 2.5 %
Réactif B = Sulfate d’hydrazine 0.15 %
Acide sulfurique H2SO4 (10 N)
Matériels:
Erlenmyer de 125 ml et 50 ml.
Agitateur va et vient
Entonnoirs
Papier filtre
Fioles jaugées (1000 ml et 500 ml) et béchers de 50 ml
Pipettes
Tubes à Essai
Spectrophotomètre
Préparation des solutions :
Préparation de la solution mère KH2PO4 (100 ppm ou bien 100 mg de P /l)
PM (KH2PO4) => X g
PM (P) => 0.1 g
X = 0.1 x PM (KH2PO4) = 0.1 x 136.09 = 0.44 g de KH2PO4 dissout dans 1 litre d’eau
PM (P) 30.973
distillée.
Préparation de la solution d’acide sulfurique H2SO4 (10 N) :
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi : volume recherché (?)
Ci : Concentration initiale (36 N)
Vf : Volume final (500 ml )
Cf : Concentration finale (10 N)
Vi = 500 x 10 = 138.88 ml de H2SO4 (36 N), compléter à 500 ml par l’eau distillée.
36
Préparation de la solution de bicarbonate de sodium (0.5 M)
PM (NaHCO3) = 84.01 (1 M)
Dissoudre 21.00 g de NaHCO3 dans 500 ml d’eau distillée pour avoir une solution de
NaHCO3 (0.5 M)
Préparation du réactif AB
A = Molybdate de sodium 2.5 %
Dissoudre 2.5 g de molybdate de sodium dans 100 ml d’ H2SO4 (10 N)
B = Sulfate d’hydrazine 0.15 %
Dissoudre 0.15 g de sulfate d’hydrazine dans 100 ml d’eau distillée
AB = prendre 20 ml du réactif A + 10 ml du réactif B, compléter à 100 ml par l’eau distillée.
Remarque : (Ne pas mélanger les deux réactifs qu’au moment du dosage par contre les 2
réactifs peuvent être conservés séparément).
Mode opératoire :
Peser 1 g de sol, ajouter 20 ml de bicarbonate de sodium 0.5 M (NaHCO3), agiter pendant 1
heure puis filtrer. Prendre 1 ml du filtrat + 4 ml de l’eau distillée + 5 ml du réactif AB, porter
au bain marie pendant 10 min, laisser refroidir puis faire la lecture au spectrophotomètre à
820 nm.
Préparation de la gamme étalon :
Nous avons une solution mère de 100 mg de P /L, à partir de laquelle nous avons préparé une
solution diluée de 10 mg de P/L.
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi : volume recherché (?)
Ci : Concentration initiale (100 mg/l)
Vf : Volume final (50 ml )
Cf : Concentration finale (10 mg/l)
Vi = 10 x 50 = 5 ml à prendre de la solution mère 100 ppm et compléter à 50 ml par l’eau
100
distillée.
Pour préparer la solution mère de 2 mg P/L :
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi : volume recherché (?)
Ci : Concentration initiale (10 mg/l)
Vf : Volume final (100 ml )
Cf : Concentration finale (2 mg/l)
Vi = 2 x 100 = 20 ml à prendre de la solution mère 10 mg P/L et compléter à 100 ml par l’eau
10
distillée.
Nous voulons préparer la gamme étalon suivante :
0 mg de P /L
0.2 mg de P/ L
0.4 mg de P / L
0.6 mg de P / L
0.8 mg de P / L
1 mg de P / L
Exemple de calcul :
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi = 0.2 x 10 = 1 ml de la solution 2 mg/l et compléter à 5 ml par l’eau distillée + 5 ml du
2
Réactif AB. De même pour les autres solutions.
Concentrations Quantités à prélever
(gamme étalon) de la solution 2 mg/l
0 0 ml
0.2 1 ml
0.4 2 ml
0.6 3 ml
0.8 4 ml
1 5 ml
Pour les échantillons où nous avons ajouté du TSP ou bien du PN nous aurons besoin de faire
des dilutions après filtration de l’échantillon pour que l’on puisse faire la lecture au
spectrophotomètre.
Prendre 1 ml de l’échantillon (filtrat) puis compléter à 5 ml par l’eau distillée + 5 ml du
réactif AB, puis faire la lecture au spectrophotomètre à 820 nm.
Calcul :
Tracer un graphe où l’axe des X comportera les concentrations et l’axe des Y le pourcentage
de transmitance.
Ou bien, à partir de la gamme étalon, nous déterminons la courbe, à partie de laquelle nous
aurons la relation : Y=0.4787x+0.0021 5 (Obtenue dans nos conditions expérimentales)
* La teneur en phosphore dans le sol et le phosphore exporté par les plantes.
Pour calculer la teneur du Phosphore dans la plante ou bien dans le sol, il faut tenir en
considération les dilutions et les quantités prises pour effectuer les analyses, les exemples de
calcul suivants illustrent ceci :
* Pour le sol :
D’après la gamme étalon du P et à partir de la courbe de tendance qui en résulte :
Y=0.4787x+0.0021
D.O. (S2TTSP) = 0.322 (Remplaçant X par sa valeur de DO dans la relation)
X S2TTSP = 0.322-0.0021 = 0.668 mg/l
0.4787
0.668mg 1000 ml
X 10 ml (Volume de la solution contenue dans le tube à essai)
X=6.68 10-3 mg
(1)
6.68 10-3mg 1 ml (Prise d’essai à partir de la solution d’extraction)
X 10 ml (La dilution au 1/10)
X=0.0668 mg
0.0668 mg 1 ml (Prise d’essai à partir de la dilution)
X 20 ml (volume de la solution d’extraction)
X=1.3365 mg de P/ 1g de sol
1.3365 mg 1g de sol
X 500g de sol (Quantité de sol contenue dans chaque pot)
X= 668.25 mg de P/ Pot
(1)
Le TSP contient une grande partie facilement solubilisée, c’est pourquoi dans les analyses
on trouve des concentrations élevées de P assimilable, ce qui nous mène à faire des dilutions,
par contre pour le sol avec ou sans amendement en PN, il ne faut pas tenir en considération
cette étape dans le calcul.
Le Phosphore dans la plante
Principe :
La calcination des plantes consiste à brûler l’échantillon à une température précise pendant
une durée bien déterminée et de diluer les cendres obtenues avec de l’acide chlorhydrique à
0.1N.
Cette méthode est utilisée pour la détermination du Ca, Mg, K, Na, Zn, Mn, Fe, Cu par
l’absorption atomique et le phosphore par colorimétrie.
Réactifs :
Eau oxygénée H2O2 (110 volumes)
Acide Chlorhydrique HCl (concentré et dilué au 1/10)
Solution mère KH2PO4 (100 mg de P /l)
Réactif A = Molybdate de sodium 2.5 %
Réactif B = Sulfate d’hydrazine 0.15 %
Acide sulfurique H2SO4 (10 N)
Matériels:
Erlenmyer de 125 ml et 50 ml.
Fioles jaugées de 100 ml
Entonnoirs
Papier filtre
Fioles jaugées (1000 ml et 500 ml) et béchers de 50 ml
Pipettes
Tubes à Essai
Creusets et four pour calcination
Spectrophotomètre
Mode opératoire :
Peser 500 mg du matériel végétal (partie aérienne ou racinaire) préalablement séché à
l’étuve. Calciner les échantillons au four, par paliers de 100°C (30 min), 250 °C (30 min) et
puis 600 °C pendant 6 heures. Laisser refroidir (pendant une nuit).
D’abord reprendre les cendres par 0.5 ml d’H2O2 (110 volumes) avec évaporation à sec au bac
à sable, puis par 2ml d’HCl concentré et évaporation à sec au bac à sable.
Enfin, reprendre les cendres par 5 ml d’HCl dilué au 1/10 (homogénéisé à l’aide d’une
baguette en verre). Dans une fiole jaugée de 100 ml et sur un petit entonnoir, filtrer la
suspension obtenue sur papier filtre (d’abord mouiller par l’eau distillée les papiers filtre afin
d’éviter que la solution ne colle sur les parois des filtres entraînant ainsi des pertes) et verser
environ les deux tiers de la solution puis au reste, ajouter un peu d’eau distillée et ainsi de
suite, sans cendres. Après filtration ajuster le filtrat à 100 ml.
Puis procéder comme pour le P. Olsen (prendre 1ml de la solution, ajouter les réactifs puis lire
la DO au spectrophotomètre à 820 nm)
* Pour la plante (Partie aérienne):
D’après la gamme étalon du P et à partir de la courbe de tendance qui en résulte :
Y=0.4787x+0.0021
D.O. (P2LSA) =0.108
X P2LSA = 0.108-0.0021 = 0.2212 mg/l
0.4787
0.2212 mg 1000 ml
X 10 ml (Volume de la solution contenue dans le tube à essai)
X=2.212 10-3 mg
(2)
2.212 10-3 mg 1 ml (Prise d’essai à partir de la solution d’extraction)
X 10 ml (La dilution au 1/10)
X=0.02212 mg
0.02212 mg 1 ml (Prise d’essai à partie de la solution diluée)
X 100 ml (Volume de la solution « fiole »)
X=2.212 mg de P/ 0.5 g de matière sèche (Poids de la prise d’essai)
2.212 mg 0.5 g de m.s.
X 0.6023 g de m.s. (Poids de la partie aérienne du plant)
X= 2.665 mg
(2)
La quantité de Phosphore comprise dans la partie aérienne est supérieure à celle comprise
dans la partie racinaire des mêmes plantes, ainsi cette étape de calcul ne figure pas dans celle
de la partie racinaire.
* Pour la plante (Partie racinaire):
D’après la gamme étalon du P et à partir de la courbe de tendance qui en résulte :
Y=0.4787x+0.0021
D.O. (R2LSA) =0.116
X P2LSA = 0.116-0.0021 = 0.238 mg/l
0.4787
0.238 mg 1000 ml
X 10 ml (Volume de la solution contenue dans le tube à essai)
X=2.38 10-3 mg
2.38 10-3 mg 1 ml (Prise d’essai à partir de la solution d’extraction)
X 100 ml (volume de la solution « fiole »)
X=0.238 mg de P/ 0.5 g de matière sèche (Poids de la prise d’essai)
0.238 mg 0.5 g de m.s.
X 0.149 g de m.s. (Poids de la partie racinaire du plant)
X= 0.071 mg
Pour la totalité du plant (Partie aérienne + Partie racinaire)
P2LSA = 2.665 + 0.071 mg = 2.736 mg de P/Pot
Dosage de P total
Principe
La méthode d’analyse utilisée consiste en un dosage colorimétrique du phosphore total extrait
par l’acide nitrique concentré.
Les différentes formes du phosphore existent dans le sol sont attaquées par l’acide nitrique,
puis hydrolysées par H2SO4. On obtient des ortho-phosphates (PO43-).
Après extraction, le P est dosé par colorimètre en se basant sur sa propriété de pouvoir se
complexer en présence de molybdate, et sur le fait que ce complexe une fois réduit avec
l’acide ascorbique développe une couleur bleue.
Matériel
- Bain marie
- Bain de sable
Réactifs
Acide nitrique concentré (HNO3)
Acide sulfurique (1N) H2SO4
Solution d’acide ascorbique C6H8O6
6 g d’acide ascorbique par litre d’eau distillé
- Réactifs sulfomolybdique
a) 25 g de molybdate d’ammonium [(NH4)2 Mn7O24)] dans 100 ml d’eau distillée.
b) 280 ml de H2SO4 concentré dans 300 ml d’eau distillé.
Refroidir, verser a dans b et compléter à 1 l avec l’eau distillé.
- Solution étalon de phosphore :
231,1 mg de Na2HPO412 H2O / l d’eau
Procédure
Peser 1 g du sol dans un becher, ajouter 10 ml de HNO3, recouvrir avec un verre de montre.
Attaquer pendant 5 heure dans un bain de sable. Après ces 5 heures, ramener à sec en
augmentant la température. Reprendre le résidu avec H2SO4 1N. Receuillir le filtrat dans une
fiole jaugée de 100 ml. Rincer le becher et compléter à 100 ml avec H 2SO4.
Placer dans des tubes à essais 1 ml de filtrat, ajouter 1 ml de réactif sulfomolybdique, puis
compléter à 15 avec la solution d’acide ascorbique, homogénéiser, puis placer pendant 10
minutes dans un bain marie (80°C).
Fixer la longueur d’onde à 630 nm et régler le zéro optique avec un blanc (1 ml de réactif
sulfomolybdique + 14 ml d’acide ascorbique) puis mesurer l’absorbance des échantillons.
Procéder de la même manière pour la gamme étalonnage.
Gamme étalon
On la prépare avec Na2HPO412 H2, on met 231,1 mg/l, nous avons une mole de Na2HPO412
H2O égale 358g
358g de Na2HPO412 H2O 31 g de P
231,1 mg x= 20 mg de P
1 ml de la solution étalon contient 231,1 x10 -3 mg de Na2HPO412 H2O, ce qui correspond à
20x 10 -3 mg de P.
Pour avoir la gamme d’étalonnage, prendre ; 0,1 ; 0.2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5 ; 0,6 et 1 ml de la
solution étalon.
ml de la solution étalon concentration en P (ppm) équivalent en ppm du sol
0,1 2 200
0,2 4 400
0,3 6 600
0,4 8 800
0,5 10 1000
0,6 12 1200
1 20 2000
La teneur du sol en phosphore doit être divisé par V (volume de la prise d’essai en ml) (V
dans ce cas = 1 ml).
Méthode de calcul
Tracer la courbe d’étalonnage : A= f (c) connaissant l’absorbance de chaque échantillon, on
peut estimer sa concentration, en utilisant la méthode des moindres carrées.
Pour avoir le résultat en termes de P2O5 :
P2O5 142/2 = 71 g
P 31 g
Donc P2O5 (ppm) = P (ppm) 71/31
P2O5 = P x 2,29
