 Le séquençage de l’ADN, consiste à déterminer

l’ordre d’enchaînement des nucléotides d’un

fragment d’ADN donné.

 C’est aujourd'hui une technique de routine pour

les laboratoires de biologie.

 Cette technique utilise les connaissances qui ont

été acquises depuis une trentaine d'années sur les
mécanismes de la réplication de l'ADN.
 La détermination d’une séquence d’ADN est utile
aussi bien pour les recherches visant à savoir
comment vivent les organismes que pour des sujets
appliqués. Il représente le niveau de résolution le plus
élevé pour rechercher la présence de mutations
ponctuelles dans un gène.

 En médecine, elle peut être utilisée pour identifier,

diagnostiquer et potentiellement trouver des
traitements à des maladies génétiques.

 En biologie l'étude des séquences d'ADN est devenue

un outil important pour la classification des espèces.
 Le séquençage de l’ADN a été inventé dans la deuxième moitié des années
1970.

 Deux méthodes ont été développées indépendamment : l’une par l’équipe de

Walter Gilbert, (Maxam and Gilbert 1977) aux États-Unis, et l’autre par celle
de Frederick Sanger (Sanger, Nicklen et al. 1977) en Grande-Bretagne.

 Pour cette découverte, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel
de chimie en 1980.

 Par ailleurs, la première méthode non Sanger (dite aussi pyroséquençage) ayant
fait ses preuves dans le domaine de séquençage, a été introduite en 1988.

 Le début du 21 siècle est marqué par l’avènement de la nouvelle génération des

techniques de séquençage, découlant des avancées technologiques en physique,
informatique, chimie et en biotechnologie. Ces innovations technologiques
visent à réduire le coût et le temps nécessaire pour le séquençage du génome
complet .
 Les deux principales méthodes de séquençage de
l'ADN sont :

 La méthode chimique de Maxam et Gilbert dans

laquelle l'ADN dont on a marqué l'extrémité est
soumis à des réactions de clivage spécifiques de bases
avant d'être soumis à une électrophorèse.

 La méthode enzymatique de Sanger (prix Nobel de

chimie en 1980) qui repose sur l'utilisation de
nucléotides particuliers appelés didésoxynucléosides
triphosphates, qui bloquent la synthèse d'ADN après
leur incorporation.
 Cette méthode utilise des échantillons d’ADN
double brin et ne nécessite donc pas le clonage de
l’ADN dans un vecteur pour produire de l’ADN
simple brin comme c’est le cas pour la méthode de
Sanger.
 Cette méthode est basée sur une dégradation
chimique de l’ADN et utilise les réactivités
différentes des quatre bases A, T, G et C, pour
réaliser des coupures sélectives. En reconstituant
l’ordre des coupures, on peut remonter à la séquence
des nucléotides de l’ADN correspondant.
 On peut décomposer ce séquençage chimique
en six étapes successives :
1. Marquage: Les extrémités
des deux brins d’ADN à
séquencer sont marquées par
un traceur radioactif (32P).
Cette réaction se fait en
général au moyen d’ATP
radioactif et de
polynucléotide kinase.
2. Isolement du fragment
d’ADN à séquencer. Celui ci
est séparé au moyen d’une
électrophorèse sur un gel de
polyacrylamide.
Le fragment d’ADN est
découpé du gel et récupéré
par diffusion.
3. Séparation de brins:
Les deux brins de chaque
fragment d’ADN sont
séparés par dénaturation
thermique, puis purifiés
par une nouvelle
électrophorèse.
4. Modifications chimiques
spécifiques: Les ADN simple-brin
sont soumis à des réactions
chimiques spécifiques des différents
types de base. Ces réactions
spécifiques sont effectuées en
parallèle sur une fraction de chaque
brin d’ADN marqué.
5. Coupure : Après ces
réactions, l’ADN est clivé
au niveau de la modification
par réaction avec une base,
la pipéridine.
6. Analyse : Pour chaque
fragment, les produits des
différentes réactions sont
séparés par électrophorèse et
analysés pour reconstituer la
séquence de l’ADN. Cette
analyse est analogue à celle
que l’on effectue pour la
méthode de Sanger.
 Radio-marquage en 5’

P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-5’P
ATP radioactif
(marqué au 32P)
Polynucléotide kinase

ADP + 31Pi

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-5’ 32P
Purification par une PAGE et isolement du
fragment d’ADN à séquencer
Séparation des brins par thermo-dénaturation

32P5’
-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G- 5’32P

Chauffage

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

+
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-5’ 32P

Séparation par une PAGE

 Séquence d’ADN à déterminer

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
 Fractionnement de l’échantillon

ADN à séquencer

Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

 Ajout de réactif dans le tube 1

Réactif coupant spécifiquement avant G

(dans l’ordre 5’P  3’OH)

ATTENTION
La réaction d’hydrolyse est
partielle et aléatoire. Ainsi on
obtiendra tous les fragments
possibles.

Tube 1
Les différents fragments possibles après hydrolyse
chimique partielle avant G

32P5’-A-A ↕G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T ↕ G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables sur le gel.
Ainsi on identifiera :
32P5’-A-A-3’OH

et 32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C- 3’OH
Les fragments les plus petits migreront les plus loin
vers l’anode (+)
G
Pour ce cas on aura :
- 32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
____

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3’OH
____

32P5’-A-A-3’OH
____

+
 Ajout de réactif dans le tube 2

Réactif coupant spécifiquement avant G ou avant A

(dans l’ordre 5’P  3’OH)

ATTENTION :
La réaction d’hydrolyse est
partielle et aléatoire. Ainsi on
obtiendra toutes les fragments
de brins possibles.

Tube 2
Les différents fragments possibles après hydrolyse
chimique partielle avant G ou avant A

32P5’-A ↕ A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A ↕G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A-A-G-T-C-T-C ↕ A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T ↕ G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G ↕ A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
 On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.
Seuls les fragments radiomarqués seront visibles sur le gel.
Ainsi on identifiera :

32P5’-A-3’OH

32P5’-A-A-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3’OH
et
32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers
l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-3’OH

32P5’-A-A-3’OH
32P5’-A*-3’OH
(en pratique, ce nucléotide n’est pas identifiable, on le
notera A*)
Résultats des deux co-migrations

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-3’OH

32P5’-A*-A-3’OH

32P5’-A*-3’OH
 Ajout de réactif dans le tube 3

Réactif coupant spécifiquement avant C

(dans l’ordre 5’P  3’OH)

ATTENTION :
La réaction d’hydrolyse est
partielle et aléatoire. Ainsi
on obtiendra toutes les
fragments de brins
possibles.
Tube 3
 Les différents fragments possibles après
hydrolyse chimique partielle avant C

32P5’-A-A-G-T ↕ C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A-A-G-T-C-T ↕ C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A ↕ C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C ↕ C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A ↕ C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
 On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.
Seuls les fragments radio marqués seront visibles sur le gel.
Ainsi on identifiera :

32P5’-A-A-G-T-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3’OH
et
32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers
l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-C-T-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-3’OH
Résultats des trois co-migrations

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-3’OH

32P5’-A*-A-3’OH
32P5’-A*-3’OH
 Ajout de réactif dans le tube 4

Réactif coupant spécifiquement avant C ou avant T

(dans l’ordre 5’P  3’OH)

ATTENTION :
La réaction d’hydrolyse
est partielle et aléatoire.
Ainsi on obtiendra toutes
les fragments de brins
possibles.
Tube 4
Les différents fragments possibles après hydrolyse chimique
partielle avant C ou avant T
32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G ↕ T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A-A-G-T ↕ C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C ↕ T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T ↕ C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A ↕ C-C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C ↕ C-T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C ↕ T-G-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A ↕ C-3’OH
 On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.
Seuls les fragments radio marqués seront visibles sur le gel.
Ainsi on identifiera :

32P5’-A-A-G-T-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3’OH

32P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers
l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-3’OH

32P5’-A*-A-G-T-C-T-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-3’OH
32P5’-A*-A-G-3’OH
PAGE

Pour comparer il faut

travailler dans les
mêmes conditions.
Ainsi le gel est
composé de quatre
pistes où seront
déposés les quatre
échantillons
partiellement
hydrolysés
chimiquement
Après électrophorèse

32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-A-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-T-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-C-3’OH
32P5’-A*-A-G-T-3’OH
32P5’-A*-A-G-3’OH
32P5’-A*-A-3’OH
32P5’-A*-3’OH
Lecture

La séquence du brin d’ADN se

lie horizontalement:
- de l’anode (+)
(correspondant au côté 5’P)
- vers la cathode (-)
(correspondant au côté 3’OH)

32P5’-X*-A-G-T-C-T-

C-A-C-C-T-G-A-C-3’OH
 Cette méthode est basée sur l’interruption de la synthèse
enzymatique d’un brin d’ADN complémentaire à la séquence
d’intérêt.
 Cet arrêt d’élongation revient à l’utilisation de nucléotides
particuliers appelés didésoxyribonucléotides, qui bloquent la
synthèse d’ADN par les ADN polymérases après leur
incorporation.
 Ce blocage est dû à l'impossibilité qu'ont ces nucléotides de
former une liaison phosphodiester avec un autre nucléotide en
raison de l'absence du groupement hydroxyle sur le carbone 3'.
Deux types de nucléotides triphosphates
Étapes du séquençage par la méthode de Sanger
Préparation de l’ADN double brin et Purification
sur gel:

 L'ADN à séquencer est cloné dans un

vecteur : M13 ou pUC ; puis purifié par une
électrophorèse sur gel de polyacrylamide
afin d’isoler le fragment d’intérêt.
Séparation des brins par thermo-dénaturation

Chauffage

Séparation par une PAGE

 Séquence d’ADN à déterminer

Domaine déjà connu

3’OH
5’P

Domaine à séquencer
 Hybridation par une amorce
marquée (fluorescence, radioactivité)

Domaine déjà connu

3’OH
5’P 5’32P

Ex :Amorce
Domaine à séquencer radiomarquée
par du 32P en 5’
 Néo-synthèse du brin complémentaire
au brin à séquencer
Par le jeu de la complémentarité stérique Domaine déjà connu
et chimique, le brin à séquencer sera
Complété par un brin néosynthétisé 3’OH
5’32P
5’P 3’OH

Amorce
Domaine à séquencer
radiomarquée
par du 32P en 5’
 Substrats nécessaires
L’enzyme (l’ADN polymérase ADN dépendante)
polymérise le brin complémentaire à partir du brin à
séquencer.
Pour se faire, elle utilise comme substrats les quatre
nucléotides triphosphates :
dATP NH2
dTTP
N
O N
O O
HO P O P O P O N N
O
OH OH OH

dGTP dATP
OH
dCTP
Ils assurent également l’apport d’énergie nécessaire à la synthèse
 Conditions opératoires supplémentaires

On ajoute un pseudo-substrat qui bloquera

l’élongation de cette polymérisation :
ddATP NH2
ddTTP
N
O N
O O
HO P O P O P O N N
O
OH OH OH
ddGTP ddATP
ddCTP
Le 3’OH n’existe plus. Il est donc impossible de créer une
liaison nucléotidique.
Les didésoxyribonucléotides s’insèrent à la place de leur
homologue naturel ce qui bloque la synthèse du brin néoformé.
 Justification des conditions opératoires
supplémentaires

 Pour séquencer, on place le système de

synthèse en présence de l’un des quatre pseudo-
substrats inhibiteurs.

On confronte les résultats dans ces quatre

conditions opératoires.
 Fractionnement de l’échantillon
ADN + amorce + enzyme
+ dATP + dGTP + dCTP + dTTP

Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

+ ddATP + ddGTP + ddCTP + ddTTP

 ATTENTION :

Le pseudo-substrat est ajouté en très faible

quantité pour inhiber la synthèse d’une
façon aléatoire.

Ainsi, statistiquement, on obtiendra toutes

les fragments de brins complémentaires
possibles.
Pour simplifier la notation, nous noterons :

A, G, C, T,

pour les désoxyribonucléotides (naturels)

et

dA, dG, dC, dT,

pour les didésoxyribonucléotides (inhibiteurs)

 Exemple pour le tube 1 (ddATP)
sans inhibition

P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaine connu- 3’OH

HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P

Fragment synthétisé :
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
 Exemple pour le tube 1 (ddATP)
avec inhibition

L’enzyme utilise de façon aléatoire le dATP ou le

ddATP.
Ainsi la synthèse peut être bloquée ...
P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaine connu- 3’OH
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P

là là là
On obtient :

H3’-dA-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P

H3’-dA-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dA-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
 Exemple pour le tube 1 (ddATP)
bilan des synthèses possibles

32P5’-G-T-C-dA-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G- dA-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G- dA-3’H

et
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse normale)

On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables
sur le gel. Ainsi on identifiera :
 Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers
l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

Néobrin complet 32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-dA-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-dA-3’H

32P5’-G-T-C-dA-3’H
 Exemple pour le tube 2 (ddGTP)
L’enzyme utilise de façon aléatoire le dGTP ou
le ddGTP.
Ainsi la synthèse peut être bloquée ...
P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaine connu- 3’OH
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P

là là là là là On obtient :
H3’-dG-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dG-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dG-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dG-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dG-amorce radio marquée-5’32P
 Exemple pour le tube 2 (ddGTP)
bilan des synthèses possibles
32P5’-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-dG-3’H

et
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse normale)
On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.
Seuls les fragments radio marqués seront localisables sur
le gel. Ainsi on identifiera :
Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers
l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

Néobrin complet 32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-dG-3’H

32P5’-dG-3’H
 Bilan des deux co-migrations :
tubes 1 (ddATP) et 2 (ddGTP)

Les deux électrophorèses sont faites en

parallèle.
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-dA-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-dA-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-dG-3’H
32P5’-G-T-C-dA-3’H

32P5’-dG-3’H
 Exemple pour le tube 3 (ddCTP)
L’enzyme utilise de façon aléatoire le dCTP ou
le ddCTP.
Ainsi la synthèse peut être bloquée ...
P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaine connu- 3’OH
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P

On obtient :
là là

H3’-dC-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P

H3’-dC-T-G-amorce radio marquée-5’32P
 Exemple pour le tube 3 (ddCTP)
bilan des synthèses possibles
32P5’-G-T-dC-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-dC-3’H

et
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse normale)

On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables
sur le gel. Ainsi on identifiera :
 Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers
l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

Néobrin complet 32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’(O)H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-dC-3’H

32P5’-G-T-dC-3’H
 Bilan des trois co-migrations :
tubes 1 (ddATP), 2 (ddGTP) et 3 (ddCTP)

Les trois électrophorèses sont faites

en parallèle.
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-dC-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-dA-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-dA-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-dG-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-dG-3’H
32P5’-G-T-C-dA-3’H
32P5’-G-T-dC-3’H

32P5’-dG-
 Exemple pour le tube 4 (ddTTP)

L’enzyme utilise de façon aléatoire le dTTP ou le

ddTTP.
Ainsi la synthèse peut être bloquée ...
P5’-A-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-G-A-C-domaine connu- 3’OH
HO3’-T-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P

On obtient :
là là là là
H3’-dT-T-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dT-C-A-G-A-G-T-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dT-G-G-A-C-T-G-amorce radio marquée-5’32P
H3’-dT-G-amorce radio marquée-5’32P
 Exemple pour le tube 4 (ddTTP)
bilan des synthèses possibles

32P5’-G-dT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-dT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-dT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-dT-3’H

et
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-T-3’OH (synthèse normale)

On réalise une PAGE suivie d’une autoradiographie.

Seuls les fragments radio marqués seront localisables
sur le gel. Ainsi on identifiera :
Les fragments les plus petits migreront les plus loin vers
l’anode (+)

Pour ce cas on aura :

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-(d)T-3’(O)H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-dT-3’H

32P5’-G-T-C-A-G-G-dT-3’H

32P5’-G-dT-3’H Ce nucléotide n’est pas

déterminable
 Autoradiographie des quatre pistes de la PAGE

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-T-X-3’(O)H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-C-dT-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-dC-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-dA-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-dA-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-T-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-G-dT-3’H
32P5’-G-T-C-A-G-dG-3’H
32P5’-G-T-C-A-dG-3’H
32P5’-G-T-C-dA-3’H
32P5’-G-T-dC-3’H
32P5’-G-dT-3’H
32P5’-dG-3’H
Lecture
La séquence du brin
néoformé d’ADN se lie
horizontalement :
- de l’anode (+)
(correspondant au côté 5’P)
- vers la cathode (-)
(correspondant au côté 3’OH)

32P5’-G-T-C-A-G-G-T-G-A-G-A-

C-T-X-3’OH

Le brin à séquencer est donc:

P5’-X-A-G-T-C-T-C-A-C-C-T-
G-A-C-3’OH
 La très grande majorité
des séquences réalisées et
publiées aujourd'hui sont
réalisées sur des
séquenceurs automatiques.
Ceux-ci sont capables de
réaliser les réactions de
séquence, puis de les lire.

Séquenceur automatique relié à un

ordinateur
 Pour cela, on marque les fragments d'ADN grâce à des
marqueurs fluorescents spécifiques (ddNTP marqués).

 Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des

fragments obtenus est déterminée par une chromatographie.
Le séquenceur détecte la florescence sortant des colonnes de
chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et leur
taille précise. Les systèmes les plus modernes permettent même
de lire les quatre nucléotides à partir d'une seule colonne de
chromatographie.

 Le résultat est présenté par la machine sous forme de courbes

présentant la fluorescence détectée, et l'interprétation qui en
faite en terme de nucléotides.
Un "pic" correspond à la détection d'un nucléotide
donné dans la séquence : l'interprétation est donnée
sous les courbes.

En bleu : Adénine. En vert : Thymine. En jaune : Guanine. En rouge :

Cytosine.
 Avantages :
 l'automatisation et l'utilisation d'une
chromatographie au lieu d'une électrophorèse
permet un gain de temps appréciable.
 Le coût de revient est bien moindre.
 Ils permettent de lire plusieurs centaines de
nucléotides avec une très bonne qualité,
jusqu'à 1000 pour les appareils les plus
performants !

Inconvénients :
 leur coût d'achat est élevé, ce qui impose
concrètement, la mise en place de services
communs de séquençage dans les instituts de
recherche.
 Cette technique de séquençage d’ADN introduite depuis 1988, par Hyman
et al., et améliorée par un groupe suédois 1998 par introduction de la PCR.
 Il s’agit d’un séquençage par synthèse et qui se caractérise par la
révélation en temps réel de l’activité de l’ADN polymérase qui ajoute un
seul nucléotide non fluorescent à la fois.
 Le pyroséquençage se déroule en 5 étapes:
Le pyroséquençage se déroule en 5 étapes:
 Etape 1: Consiste à préparer le mélange réactionnel qui contient:
une amorce de séquençage est hybridée à la matrice d’ADN simple
brin obtenu par PCR en présence des enzymes suivantes (ADN
polymérase, ATP sylfurylase , luciférase et apyrase) des substrats;
adenosine5’ phosphosulfate (APS) et lucéférine.
 Etape 2 : Ici, les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble
comme dans une réaction de séquençage normale mais l’un après
l’autre. Si le Nucléotide ajouté dans le milieu réactionnel
correspond à celui attendu par la Polymérase, il est incorporé dans
le brin en cours de synthèse (d’élongation) et libère un
Pyrophosphate.
 Etape 3 : L’ATPsulfurylase vient alors transformer ce
Pyrophosphate (PPi) en ATP qui est alors utilisé, couplé à une
Luciférine, par une Luciférase. On a alors production
d’Oxyluciférine et d’un signal Lumineux.

•Etape 4: L’Apyrase dégrade les nucléotides qui sont pas

incorporées
 Etape 5 : Le signale lumineux est capté par un capteur CCD
(Charge-Coupled Device) puis reproduit sous forme d’un pic sur le
Pyrogramme. La hauteur de ce pic est fonction de l’intensité du
signal lumineux, elle-même proportionnelle au nombre de
nucléotides incorporés en même temps. On peut donc déduire la
séquence à partir de la taille des pics obtenus. Par ailleurs, la taille
des pics permet d’avoir une quantification de la proportion de brins
porteurs de l’un ou l’autre des nucléotides.
 Le pyroséquençage est une technique qui permet d’effectuer un
séquençage rapide et à moindre coût qu’un séquençage par la
méthode de Sanger. En effet, cette technique ne nécessite pas de
clonage (donc gain de temps et d’argent), et permet une lecture
directe de la séquence obtenue après le séquençage. Cependant,
malgré sa conception élégante, le pyroséquençage présente par
ailleurs des limitations dont la principale est liée à son utilisation
pour le séquençage des génomes complets, puisque la longueur de la
séquence lue ne dépasse pas les 100 pb.

 La limitation du nombre de bases séquencées est liée à l ’inhibition

progressive de l’apyrase par l’accumulation de
déoxymononucléotide phosphate (dNMP) et de son produit
intermédiaire le déoxydinucléotide phosphate (dNDP) .
 Au cours des derniers années, plus d’une dizaine
d’entreprises et d’institutions académiques sont
inscrites dans la course dont un bon nombre en
Californie (comme Applied Biosystems Group,
l’Université de Stanford, etc) pour le développement
de nouvelles technologies de séquençage de génome
complet qui intègre haut débit et rapidité avec un
coût moindre. les techniques les plus élégantes qui
sont actuellement disponibles sur le marché, et qui
sont représentatives de la nouvelle génération des
séquenceurs à haut débit: la tehnologie 454 et la
technologie CRT Solexa/illumina.
 La compagnie 454 life science, basée à
Branford aux États-Unis , spécialisée dans la
fabrication de séquenceur de gènes à haut
débit. a développé une technologie de
séquençage innovante (four five four: pour
facile functional findings ) par la mise en
œuvre de la nanotechnologie pour le
séquençage. Cette technique permet de traiter
avec un seul instrument le GS20, plus de 20
millions de bases nucléotidiques par cycle de
quatre heures , ce qui correspond à plus de 100
fois la capacité des instruments reposant sur les
techniques actuelles à l’échelle macroscopique.
En effet, cette technique ne nécessite pas de
clonage(donc gain de temps et d’argent), et
permet une lecture directe de la séquence
obtenue après le séquençage. Une seule
machine (GS20) génère en faite, avec plus de
99% d’exactitude, autant de données que 100
séquenceurs capillaires à haut débit.
 Etape1: Préparation d’une banque ADN simple brin(ADN sb) avec
deux adaptateurs :
L’ADN génomique est fragmenté par nébulisation, deux
adaptateurs (A et B) sont fixés par ligation aux deux extrémités.
 Etape 2 : Amplification clonale des molécules d’ADN simple brin:
Des microbilles avec en surface des amorces
complémentaires à un des adaptateurs permettent de fixer une
molécule d’ADN sb à la fois. Les microbilles porteuses des
brins d’ADN sb sont mises en émulsion en présence des
réactifs pour PCR. Chaque goûte(microréacteurs) englobe une
microbille et donc une molécule d’ADN, ce qui permet une
amplification de chaque fragments.
 Etape 3 : Séquençage dans
des plaques picotitrées:
Après amplification les
microgouttelettes (microréacteurs)
dissociées, et les microbilles
porteuses de l’ADN simple brin
largement amplifié sont pipetés
dans une plaque en fibre optique
contenant 1,4 millions de puits.
Les puits possèdent un diamètre
qui assure le dépôt d’une
microbille par puits. Avec ce
système, 400000 réactions de
séquençage peuvent se faire en
parallèle. Le séquençage se fait
selon le principe de
pyroséquençage décris
précédemment Un caméra CCD
permet de capturer les images
après addition de chaque
nucléotide.
 Etape 4 : Analyse des images et détermination de la
séquence d’ADN:
Connaissant l’ordre dans lequel les 4 nucléotides sont
Ajoutés automatiquement, l’analyse des différentes images
capturées permet la déduction de la séquence des différents
morceaux d’ADN (illustré par pyrogramme). Des logiciels
bioinformatiques sont ensuite utilisés pour reconstituer la
séquence initiale grâce aux groupages des contigs.
 La Avec la plateforme GS Junior, Roche s'inscrit dans une
démarche de développement de tests diagnostic basés sur le
séquençage haut débit pour la médecine personnalisée. Trois
applications sont aujourd'hui en cours de développement dans
trois domaines différents.
Virologie : utilisation de la puissance du haut
débit et des longueurs de lectures pour la
détection de variants minoritaires HIV chez un
patient.

Immunologie : utilisation des longues

lectures pour le typage HLA utile dans les
greffes d'organes et greffes de moelle.

Oncohématologie : utilisation de la puissance du

haut débit et des longues lectures pour la
détection et la caractérisation de cellules
cancéreuses dans différents types de leucémies.
 La société Solexa a développé une
technologie de séquençage sur puce,
fondée sur l’intégration de plusieurs
techniques : les biopuces à ADN, la
nanotechnologies, une variante de la
technique de Sanger appelé CRT (cyclic
reversible termination), ainsi que des
technologies informatiques de pointe pour
l’acquisition, le traitement et l’analyse des
images. Les coûts de séquençage sont
réduits de façon drastique en supprimant
l’étape lente d’amplification de l’ADN, en
travaillant dans un volume de réaction très
réduit et avec une préparation minimale de
l’échantillon et en éliminant l’étape
d’électrophorèse.
 Le principe séquençage est basé sur l’incorporation réversible de nucléotides
fluorescents (CRT : cyclic reversible termination) et par lecture optique de la
[Link] s’agit d’une terminaison de synthèse basée sur l’utilisation d’un
terminateur réversible contenant un groupement de protection attaché au
nucléotide qui termine la synthèse d’ADN. L’élimination du groupement de
protection par photoclivage utilisant la lumière ultraviolette(> 300nm) permet
la restauration du groupement fonctionnel du nucléotide incorporé, ce qui
permet à l’ADN polymérase d’incorporer le prochain nucléotide et ainsi de
suite. Il s’agit là également, d’un séquençage en temps réel, basé sur la
détection de la fluorescence mais en présence des 4 nucléotides marqués (ce
qui constitue un avantage par rapport à la technologie 454)
 Les différentes étapes de processus de
séquençage sont :
 Etape 1: Préparation de la banque d’ADN Génomique:
L’ADN génomique est fragmenté par nébulisation; les extrémités sont
réparées et des adaptateurs sont fixés sur chaque extrémité par ligation.
 Etapes 2 -6 :
L’ADN est coulé dans des cellules spécialement conçues pour assurer la
fixation de chaque molécule d’ADN obtenu après amplification en phase
solide de la première molécule d’ADN fixé grâce aux adaptateurs. La
formation des ponts d’amplifications permet d’avoir une haute densité de
brins d’ADN ce qui facilite et augmente le débit de séquençage.
Etapes 7-11 :
Le Séquençage des fragments amplifiés se fait par synthèse
utilisant l’approche(CRT : cyclic reversible termination) décrite ci
dessus. La technologie est basée sur la lecture de courts fragments
d’environ 25 à 30 pb.
Etape 12 :
Analyse des donnés à l’aide d’un logiciel approprié.
Quelques étapes importantes démontrant l’évolution des progrès du séquençage
 Connaître le génome humain dans son intégralité permet donc
d'envisager la connaissance des allèles des gènes responsables de
maladies génétiques. Ceci pourra faciliter la mise au point de test
diagnostics à partir de l'ADN. La connaissance des gènes est en
effet une étape indispensable à la compréhension des phénomènes
biologiques à l’échelle moléculaire et cellulaire. Dans les années à
venir, les applications seront de plus en plus nombreuses dans les
domaines de la médecine et des industries pharmaceutiques,
biotechnologiques, agro-alimentaires, ainsi que dans d’autres
domaines en relation avec la biologie (agriculture, environnement).
Pour toutes ces applications, le séquençage est un point de départ.
 1- bien que tout type d’échantillon biologique
puisse être utilisé, le séquençage d’un sujet est
essentiellement réalisé à partir du sang total. Du
sang est prélevé dans un tube contenant
l’anticoagulant EDTA (anticoagulant qui n’inhibe
pas l’ADN polymérase utilisée pour la PCR). De
nombreux kits d’extraction d’ADN sont
disponibles et permettent une extraction rapide de
l’ADN. Lorsque le laboratoire extrait de
nombreux échantillons, il peut aussi utiliser un
automate d’extraction.
L’extraction :
 2- pour séquencer l’ADN, ce dernier doit d’abord être amplifié. La
polymerase chain reaction (PCR) est la principale technique
d’amplification utilisée. La taille des échantillons amplifiés est variable.
Selon la zone à amplifier, elle peut aller de 250 pb à 500 pb en moyenne.
À titre d’exemple, dans le cas de gènes, il est habituel de séquencer les
exons avec leurs jonctions exon/intron, la partie 3 non codante (NC) du
gène ainsi que le promoteur. Le nombre de PCR pour un gène varie donc
en fonction de la taille de ce dernier. Ainsi, un gène possédant cinq exons
pourra avoir au minimum sept PCR (une pour le promoteur, une pour
chaque exon [et jonctions exon/intron] et une pour la partie 3NC).
 -3- après PCR, il est le plus souvent nécessaire de purifier le produit
d’amplification. La réaction de séquençage est ensuite réalisée ( la méthode par
exemple de Sanger). Les recommandations internationales préconisent de
séquencer chaque produit amplifié à l’aide d’amorces de séquence . Ces amorces
peuvent être les mêmes ou différentes de celles utilisées pour la PCR. Ces réactions
ont lieu en général en microplaques (de 96 puits, par exemple).
 -4- la microplaque contenant les réactions de séquences est alors déposé dans
• d'un un automate
système de séquence pour
d'électrophorèse pilotépermettre la migration des échantillons (par
par ordinateur,
exemple, par électrophorèse capillaire), la lecture se faisant après excitation
• des marqueurs fluorescents de différentes couleurs qui sont révélés après
par unparlaser.
excitation Les àsignaux
un laser sontcaméra
l'aide d'une transmisCCDà un ordinateur qui permet leur
•
interprétation à l’aide d’un logiciel spécifique. Ainsi, avec un séquenceur 16
Des logicielles permettant l'analyse des signaux sortant de l'appareil et leur
misecapillaires,
en forme souspourforme
des defragments
résultatsde 350 pb, le temps etnécessaire
(électrophorégramme séquence)pour
. la
•
migration d’une plaque de 96 échantillons et son analyse est d’environ 3
d'un robot passeur d'échantillon permettant d'enchaîner les échantillons les
uns àheures.
la suite des autres (notamment passage de plaques de réaction à 96
puits (12x8)).
-5-La lecture des séquences est effectuée soit manuellement et
visuellement, séquence par séquence, soit à l’aide de
logiciel(s) permettant automatiquement la détection de
variant(s) (mutation ou polymorphisme) au sein de la
séquence. Ces logiciels ne sont pas fiables à 100 %. Il est donc
souvent nécessaire de contrôler visuellement les séquences.
 Deux stratégies de séquençage sont
actuellement utilisées :

 la stratégie du séquençage aléatoire

global ("whole genome shotgun") .

 la stratégie "clone par clone", ou du

shotgun hiérarchique.
 La technique "shotgun" repose sur un principe
simple : découper un génome en un grand
nombre de fragments de petite taille. Les
extrémités d'une partie de ces fragments sont
ensuite séquencées, puis ces séquences sont
assemblées sur la base de leurs chevauchements
grâce à des programmes informatiques pour
essayer de produire une séquence complète.
 Les difficultés d'une telle
technique sont à deux niveaux :
 (1) avoir assez de fragments pour
couvrir le génome dans son entier,
 (2) réussir l'assemblage.
 Le shotgun hiérarchique ou "clone par clone"
implique de générer un jeu de clones de grande taille
(100-200kb) couvrant le génome puis de soumettre
au shotgun uniquement des clones bien choisis. Ceci
élimine les risques d'erreur "longue distance".
Extraction de L’ADN humain
1ère étape : banque de grands clones.

 - l’ADN extrait est coupé en fragments de grande taille (150000

bases)
 - chacun de ces « morceaux » est inséré dans des chromosomes
artificiels bactériens
 -enfin le couple (fragment + chromosome artificiel) est intégré
dans une cellule bactérienne
 =>Ces bactéries vont former alors une collection de clones
cellulaires. nommée « banque d'ADN génomique ».
2ème étape : carte physique
-la recherche des « marqueurs » dans les grands
clones pour les ordonner, c'est-à-dire des zones
où les séquences sont homologues entre les
clones mais aussi au chromosome génomique.
 les positionner les uns par rapport aux autres,
et le long des chromosomes humains.

une carte physique des chromosomes (et donc du

génome dans son entier), c'est-à-dire une carte
présentant l’emplacement des grands clones le long du
génome.
3ème étape : le séquençage final

 -chaque grand clone est fractionné en

petits clones* (1000 bases).

 -chaque petit clone est séquencé

individuellement à partir des séquences
communes : on peut alors reconstituer la
séquence complète du grand clone.
 Le séquençage d’ADN est devenu un outil essentiel en
biologie moléculaire tant en médecine que dans de
nombreuses autres disciplines des sciences de la vie.
Le séquençage a été décrit il y a environ 30 ans et n’a
cessé d’évoluer depuis cette période. Cette méthode est
devenue une technique courante dans les laboratoires
de biologie moléculaire. Les connaissances acquises
grâce à cette méthode et la possibilité de séquencer des
génomes de grande taille, tel que le génome humain,
ont amené les chercheurs à développer des techniques
de séquençage de plus en plus sophistiquées.