TP6 TP CONTRÔLE
BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR BIOANALYSES ET CONTROLES
Durée : 4 h
L'ordre de déroulement des manipulations sera indiqué aux candidats en début d'épreuve
Au cours de l'épreuve, le jury appréciera les qualités d'organisation, la précision des gestes techniques,
le respect des règles d'hygiène et de sécurité en laboratoire.
ANALYSE ET CONTROLE DE SOLUTIONS DE NETTOYAGE ET D'ENTRETIEN DE LENTILLES DE
CONTACT.
On se propose de déterminer :
• l'activité protéasique d'une solution de déprotéinisation des lentilles de contact (solution A) ;
• la teneur en peroxyde d'hydrogène d'une solution de décontamination des lentilles (solution B).
1. Détermination de l'activité protéasique spécifique (solution A). (50 points)
1.1. Réactifs
Solution L-BAPNA-DMSO à 0,025 mol.L-1
DMSO
Tampon Tris 10X
Tampon Tris dilué DMSO
Solution A : échantillon A1
Solution A : échantillon A2
Réactif Rc (en distributeur)
Solution de SAB à 1,6 [Link]-1
Eau physiologique
Prés du spectro :
1 bain marie à 30°C avec flotteurs pour cuves, une pipette réglée à 50µL et cônes
parafilm, papier Joseph
1.2. Mesure de la concentration d'activité catalytique de la solution A (20 points)
La solution A est obtenue en dissolvant un comprimé de protéase dans 10 mL d'une solution tamponnée.
On opère sur l'échantillon A1, partie aliquote de la solution A.
1.2.1. Principe
La mesure est faite par méthode cinétique. Le substrat utilisé est le L-BAPNA (N-benzoyl-arginyl-L-
paranitroanilide). Ce substrat, solubilisé par addition de diméthyl-surfoxyde (DMSO), est hydrolyse en
présence de protéase suivant la réaction :
L-BAPNA + H2O → L-BA(N-benzoyl-L-arginine) + PNA(paranitroanilide)
Le PNA est coloré en jaune : on peut suivre son apparition par spectrophotométrie à 405 nm.
1.2.2. Mode opératoire
- Préparation de la solution de travail « ST ». Au moment de l'emploi, introduire dans une fiole jaugée de
10 mL :
• L-BAPNA-DMSO à 0,025 mol.L-1 0,5mL
• DMSO 1,5mL
• Tampon Tris 10 X 1 mL
Compléter au trait de jauge avec de l'eau distillée.
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- Dosage (2 essais). Dans une cuve de 1 cm de trajet optique, introduire successivement :
• Solution de travail « ST » 1,5mL
• Tampon Tris dilué DMSO 0,5 mL
Vérifier que la longueur d'onde et la température programmées sont conformes.
Préincuber au bain-marie à 30°C pendant 5 minutes, le zéro est déjà réglé sur ce spectrophotomètre.
Déclencher la réaction en ajoutant 0,05 mL d'échantillon A1 puis placer la cuve dans son compartiment
thermostaté à 30°C. Appuyer sur « run » puis à l'invite sur « enter ».
Faire une mesure d'absorbance toutes les 5 secondes pendant 1 minutes.
A la fin de la mesure, appuyer sur « print »; sortir la cuve du bloc thermostaté et après disparition de la
fenêtre d'impression, mettre en place le deuxième essai et recommencer.
Replacer la feuille imprimée face écrite vers le haut et à la fin de la deuxième mesure, appuyer sur «
print ».
1.2.3. Compte rendu et résultats
Noter la vitesse initiale en unités d'absorbance par minute.
Établir la formule littérale donnant la concentration d'activité catalytique en [Link] -1 et faire
l'application numérique.
Donnée : absorbance linéique molaire du PNA : ε405nm = 11000 [Link]-1.
1.3. Dosage des protéines de la solution A (30 points)
On opère sur l'échantillon A2, partie aliquote de la solution A.
La méthode proposée utilise le bleu de Coomassie d'un réactif commercial prêt à l'emploi (réactif «Rc»).
1.3.1. Mode opératoire
- Gamme d'étalonnage
A partir d'une solution de SAB à 1,6 [Link] -1, préparer une solution fille à 16 µ[Link] -1 dans une fiole
jaugée de 10 mL (diluant = eau physiologique).
Dans 6 cuves de spectrophotomètre, verser respectivement des volumes de solution fille croissants de 0
mL à 1 mL. Compléter chaque cuve à 1 mL avec de l'eau physiologique.
Puis ajouter 1 mL de réactif « Rc» dans chaque cuve. Attendre 10 minutes et lire à 595 nm contre le
blanc-réactif.
- Essais : 2 essais seront préparés comme suit :
• échantillon A2 dilué au 1/5 1 mL
• réactif « Rc » 1 mL
Traiter dans les mêmes conditions que la gamme.
1.3.2. Compte rendu et résultats
Dresser un tableau de relevés des valeurs expérimentales.
A l'aide de l'ordinateur, donner l'équation de la droite de régression ainsi que le coefficient de corrélation.
Calculer la concentration massique en protéines de l'échantillon A2 (la précision du dosage est évaluée
à 3 %).
1.4. Conclusion
Calculer l'activité spécifique de la solution A en [Link]-1 de protéines.
Calculer la teneur en protéines d'un comprimé et en déduire le nombre d'unités protéasiques par
comprimé.
2. Dosage du peroxyde d'hydrogène (solution B) (25 points)
2.1. Réactifs
Solution de thiosulfate de sodium à 0,1 mol.L-1
Solution d'iodure de potassium à 100 g.L-1
lodate de potassium (au dessicateur)
Acide suifurique dilué au 1/5 (dans un distributeur)
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Empois d'amidon
Solution de molybdate d'ammonium à 50 g.L-1
Solution B
2.2. Étalonnage de la solution de thiosulfate de concentration voisine de 0.1 mol.L-1
2.2.1. Principe
En milieu acide, l'iodate de potassium oxyde les ions iodure I- en diiode suivant la réaction :
IO3- + 6 H+ + 5 I- → 3 l2 + 3 H2O
Le diiode libéré est dosé par la solution de thiosulfate suivant la réaction :
I2 + 2 S2O32- → 2 I- + S4O62-
2.2.2. Mode opératoire
- Préparation de la solution étalon d'iodate de potassium
Faire une pesée exacte voisine de 0,25 g d'iodate de potassium pur. Dissoudre dans de l'eau distillée et
transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 50 mL..
Compléter au trait de jauge avec de l'eau distillée.
- Dosage (2 essais). Dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 mL introduire :
• solution d'iodate 10mL
• eau distillée 10mL
• solution de Kl à 100 g.L-1 10mL
• H2SO4 dilué au 1/5 5 mL
Agiter et laisser reposer 5 minutes.
Doser par la solution de thiosulfate jusqu'à virage à l'incolore (possibilité d'utiliser l'empois d'amidon pour
apprécier le virage).
2.3. Dosage du peroxyde d'hydrogène
2.3.1. Principe
En milieu acide, le peroxyde d'hydrogène oxyde les ions iodure I- en diiode I2. Le diiode libéré est dosé
par la solution de thiosulfate précédemment étalonnée :
2I- + 6H2O2 + 2H+ → I2 + 2H2O
I2 + 2 S2O3- → 2I- + S4O6
2.3.2. Mode opératoire (2 essais)
Dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 mL, verser successivement :
• eau distillée 100mL
-1
• solution de Kl à 100g.L 10mL
• H2SO4 au1/5 5mL
• solution de molybdate d'ammonium à 50g.L-1 1 mL
• solutions B 0,5 mL
Agiter, puis laisser reposer 5 minutes.
Doser par la solution de thiosulfate jusqu'à virage à l'incolore (possibilité d'utiliser l'empois d'amidon pour
apprécier le virage).
2.4. Compte rendu et résultats
Établir la formule littérale permettant de calculer la concentration molaire de la solution de thiosulfate,
puis effectuer l'application numérique.
Établir la formule littérale permettant de calculer la concentration molaire de la solution B en peroxyde
d'hydrogène (mol.L-1). Faire l'application numérique.
Exprimer ce résultat en volume de dioxygène que peut dégager un litre de solution B par auto oxydo-
réduction, sachant qu'une mole de H2O2 libère 11,2 litres d'O2 (H2O2 → H2O + 1/2 O2).
Données :
K I O
-1
M([Link] ) 39,1 127 16
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Solution nettoyage lentilles de contact
Listes des réactifs et matériels individuels
Réactifs :
Remarque : (t) = en tube à hémolyse : se munir d'un portoir et se servir...
1.1. Mesure de l'activité catalytique de la solution A
Solution de L-BAPNA-DMSO 1 mL (t)
DMSO 2,5 mL (t)
TamponTris 10X 2 mL (t)
Tampon Tris dilué DMSP 2 mL (t)
Échantillon A1 0,5 mL (t)
1.3. Dosage des protéines de la solution A
Réactif Rc en distributeur réglé à 1 mL
Solution de SAB à 1,6 mg/mL 2 mL (t)
Eau physiologique 50 mL
Echantillon A2 3 mL (t)
2.3. Dosage du peroxyde d'hydrogène dans la solution B
Solution B 2 mL (t)
Thiosulfate de sodium à 0,1 mol/L 100 mL
lodure de potassium à 100 g/L 60 mL
lodate de potassium 0,6 g (au dessicateur près des balances)
Acide sulfurique dilué au 1/5 en distributeur réglé à 5 mL
Solution de molybdate d'ammonium à 50 g/L 5 mL
Empois d'amidon 5 mL
Matériel individuel :
1 burette de 25 mL pour 2
4 erlens bouchant émeri de 250 mL
1 capsule de pesée
1 fiole jaugée de 5 mL
2 fioles jaugées de 10 mL
1 fiole jaugée de 50 mL
1 pipette jaugée de 10 mL
1 P100 et 1 P1000 + cônes
cuves de spectrophotomètre + portoir
1 pissette d'eau
1 bêcher poubelle
3 béchers de 25 ou 50 mL
1 éprouvette de 10 mL et 1mL
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