ETUDE DE FAISABILITE DE LA MISE EN PLACE

D'UN RESEAU NATIONAL D'OBSERVATION DE LA

QUALITE DES EAUX LAGUNAIRES ET MARINES
EN COTE D'IVOIRE (R.N.O.C.I.)

Rubrique V

1 PARAMETRES ET METHODES l
par

J.M. CHANTRAINE*, Ph. DUFOUR** et J.L. PESCHET***

1 - Introduction v,4
2 - Recommandations générales V,6
3 - Qualité de l'eau V,6
4 Micropolluants organiques et minéraux V,16
5 - Biologie V,17
6 - Minéralogie V,22
7 - Hydrocarbures et macrodéchets sur le littoral V,22
8 - Annexes V,25

* Chercheur ORSTOM - Centre de Recherches Océanographiques

B.P. V 18 - Abidjan - Côte d'Ivoire
** Chercheur ORSTOM - Institut de Limnologie
Avenue de Corzent - 74203 Thonon les Bains - France
*** Ingénieur biochimiste - Ministère de l'Environnement
B.P. V_2_~4 - AQidi~_~_:.C~e d'Ivoir~. _
 - V,2 -

PARAHETRES ET METHODES

1 - INTRODUCTION v,4

2 - RECOMMANDATIONS GENERALES V,6

3 - QUALITE DE L'EAU v,6

3.1 - Température V,7
3.2 - Salinité V,7
3.3 - pH v,7
3.4 - Oxygène dissous V,8
3.5 - Turbidité v,9
3.6 - Matières en suspension v,9
3.7 - Sels nutritifs V,10
3.7.1. - Prélèvement, conservation, dosage V,10
3.7.2. - Azote ammoniacal V,10
3.7.3. - Azote nitreux V,10
3.7.4. - Azote nitrique V,10
3.7.5. - Phosphate minéral dissous V,10
3.7.6. - Silice dissoute V,10
3.7.7. - Sulfates· V,l!
3.8 - Sulfures V,l!
3.9 Carbone organique particulaire V,13
3.10- Demande· chimique en oxygène V,13
3.11- Oxydabilité par le permanganate à chaud en milieu alcalin V,14
3.12- Demande biochimique en oxygène V,14
3.13- Auto-consommation en oxygène en 48 h V,15
3.14- Essai de putrescibilité V,16

4 - MICROPOLLUANTS OR~NIQUES ET MINERAUX V,16

4.1 - Détergents anioniques V,16
4.2 - Hydrocarbures dans l'eau de mer et les sédiments marins V,16
4.3 - Organochlorés V,16
4.4 - Micropolluants minéraux : Ag, Cd, Cu, Zn, Co, Cr, Fe, Mn,
Ni, Pb, Hg V,17
4.4.1 - Traces métalliques dans l'eau V,17
4.4.2 - Mercure dans l'eau et la matière vivante V,17
4.4.3 - Traces métalliques dans les sédiments V,17
4.5 - Autres V,17
5 - BIOLOGIE V,17
5.1 - Chlorophylle "a" et phéopigments V,18
5.2 - Zooplancton V,19
5.3 - Surveillance de l'ichtyofaune V,19
5.4 Bactéries et virus V,19
5.4.1 - Numération des coliformes totaux et d'Escherichia
Coli en milieu liquide V,20
5.4.2 - Numération des streptocoques et des streptocoques
fécaux en milieu liquide V,21
5.4.3 - Analyse bactériologique des coquillages V,21
5.4.4-- Clostridium perfringens V,22
5.4.5 - Germes pathogènes V,22

6 - MINERALOGIE V,22

7 - HYDROCARBURES ET MACRODECHETS SUR LE LITTORAL V,22

8 - ANNEXES
8.1 - Choix d'une technique de mesure des hydrocarbures
8.2 - Dosage des hydrocarbures dans l'eau de mer et les sédiments
marins
8.3 - Dosage des composés organochlorés et polychlorobiphényles
dans l'eau de mer, les sédiments et les organismes marins
8.4 - Protocole de minéralisation du sédiment pour l'analyse
des métaux absorbés
8.5 - Proposition pour la surveillance écologique de l'ichtyofaune
de la lagune Ebrié
8.6 - Numération des streptocoques et des streptocoques fécaux en
mi l i eu l i quide •
 - V,4 -

1 - INTRODUCTION

La présente rubrique se propose:

1°/ de dresser la liste des paramètres qui peuvent ~tre nécessaires
ou utiles de mesurer à un moment ou à un autre dans le dadre du
R. N. O. C. r.

2°/ de décrire ou citer les méthodes appropriées de prélèvement, de

conditionnement, de stockage et d'analyse.

L'objectif primordial est de fournir une méthodologie aux futurs

exécutants du R.N.O.C.I. Il ne peut s'agir d'un état définitif. En effet
la méthodologie peut Atre sujette à des modifications liées au progrès
des techli'fq1i'Eis~':Î""dli matériel d'une part, èt,i;jdT~û=tre part, à l'évolution
du milieu étudié, aux objectifs de l'étude et aussi à l'examen des pre-
miers résultats.

La liste des paramètres considérés est issue de celles du R.N.O.

et du R.N.C.* français. Elle a été amoindrie ou élargie en fonction du
contexte de l'étude: milieu marin et lagunaire tropical.

Les protocoles d'analyses ont également été empruntés à ces m3mes

réseaux lorsqu'ils semblaient adaptés aux conditions des milieux étudiés.
On notera parfois des remarques formulées de par la spécificité des
milieux. Ces méthodes sont soit les plus performantes et les plus fiables
à l'heure actuelle, soit les plus accessibles, compte tenu du matériel
disponible en Cate d'Ivoire. Enfin, ces méthodes ne sont pas développées
ici lorsqu'elles sont présentées dans des ouvrages édités et facilement
accessibles (liste ci-après) alors qu'elles sont décrites si elles ont
été adaptées ou extraites d'ouvrages difficilement accessibles. Il y aura
m3me parfois plusieurs méthodes valables proposées dont le choix pourra
par exemple être dicté par des considérations matérielles.

* Réseau National de Contrôle de la qualité des eaux littorales. C'est

une structure complémentaire au R.N.O.
 - V,5 -

Les paramètres sont regroupés en quatre classes:

- qualité de l'eau

- micropolluants organiques et minéraux (dans l'eau, la matière vivante,

les matières en suspension et les sédiments)

- biologie (sur l'eau et la matière vivante)

minéralogie (sur les matières en suspension et les sédiments).

Il va de soi que parallèlement à la collecte des échantillons

et aux analyses effectuées in si tu, devront 3tre réalisées un minimum
de mesures météorologiques (vents, température de l'air, précipitations ••
et hydrographiques (marées, nivea.u de l'ea.u, dérive superficielle, cou-
rants, vagues ~ •• ) lorsqu'on ne peut se les..c:ÎJ?~:\r.i"é'i~/j;à.Ü:prètf'.:'aé'â,,'gê'i'V'ides
nationaux compétents (ASECNA, Port ••• ).

Liste des références citées

l Manuel des méthodes de prélèvements et dt~yses.1:

caractéristiques physico-chimiques et hydrobiologiques.

Réseau National d'Observation de la qualité du milieu marin.

II Manuel des méthodes de prélèvements et d t analyses.2:

micropolluants orga.niques et minéraux. Réseau National d'Obse~

vation de la qualité du milieu marin.

III - MARCHA.ND(M.) et MARTIN(J-L.), 1983 - Etude de faisabilité du

R.N.O. eate d'Ivoire~ polluants chimiques. Centre National
pour l'EXplOitation des Océans.

IV - Manuel des méthodes, 1983 - Réseau National d'Observation de

la qualité du milieu marin. Document provisoire. Centre Natio-
nal pour ItExploitation des Océans.

V- Nonnes AFNOR - Tour Europe Cedex 7, 92080 PARIS.

VI - STRICKLAND (J.D.H.) and PARSONS (T.R.), 1968 - A practical

handbook of seawater analysis. Bulletin 167.Fisheries Research
Board of Canada, Ottawa.
 - V,6 -

VII- MAZIERES (J.), 1981 - Méthodes usuelles d'analyse bactériolo-

gique pour le contrôle sanitaire courant des eaux de mer et
des coquillages. Institut Scientifique et Technique des P3ches
Maritimes, Nantes.

VIII - BRISOU (J.F.) et DENIS (F.A.), 1980 - Techniques de surveillance

de l'environnement maritime. Masson ed., Paris, 206 p.

IX - O. M.S" 1977 - Directives applicables à la surveillance sanitaire

de la qualité des eaux littorales. Bureau régional de l'Europe,
Copenhague, 172 p.

.
2 - RECOMMANDATIO,S GENERALES~. l
.

Avant de passer en revue les méthodes préconisées pour la déter-

mination des trois classes de paramètres, il est préférable de prendre
connaissance, dans un chapitre préalable, du dénominateur commun des pro-
tocoles constitué de recommandations générales ~ant trait à:

l'équipement du navire: portique, treuil, câble, lest, poulie compteuse ••

le matériel de prélèvement: bouteilles à clapets avec supports, messa-

gers, récipients •••

des accessoires spéciaux: congélateur ou glacière, matériel de préfil-

tration, distributeurs de réactifs •••

le fla.connage selon le pa.ramètre: matéria.u (verre, plastique, polyéthy-

lène), système de fermeture, volume •••

Ces recommandations ont été formulées par A.AMINOT (Référence l,

Chapi tre 1).

3 - QUALITE DE L'EAU

Tous les paramètres de qualité de l'eau peuvent ~tre considérés

comme indicateurs de pollution lorsqu'ils dépassent des valeurs moyennes
 - V,7 -

limites à définir pour ohaque milieu.

Exemples: - élévation de température par rejet d'usine thermique,

conoentrations excessives en phosphate du fait des rejets

d'eaux domestiques,

- élévation ou baisse anormale du p.li du fait de rejets indus-

triels,
eto • • •

3.1 - ,Température

Référence IV, Chapitre; 2.

3.2 - Salinité

La salinité est un paramètre oonservatif qui sert de traoeur de

masse d'eau et intervient dans certains calculs d'hydro~amique. Seul le
premier usage est utile dans le cadre du R.N.O. Dans ces oonditions la
précision néoessaire est modeste: 0,05 g/l en mer et 0,5g/l en lagunes~

Dans ces oonditions, la salinité peut @tre mesurée au salinomè-

tre à induction en mer, au salinomètre optique en lagune.

Le salinomètre optique est un réfractomètre qui donne une leoture

directe et immédiate. Son coût est de l'ordre de 100 000 F CFA.

Pour la méthode au salinomètre à induction on adoptera le proto-

oole développé dans la référence IV, Chapitre 3.

3.3 - pH

La méthode éleotrochimique aveo électrodes de verre est la plus

pratique et suffisamment préoise dans le oadre d'un réseau de surveil-
lanoe de la pollution (Référence IV, Chapitre 4).

On notera que la valeur du pH est dépendante de l'aotivité bio-

logique, en partioulier de la photosynthèse.

Dans un milieu bien tamponné comme l'océan, les variations nyc-

th&~es du pH son~ peu importantes. Dans un milieu moins bien tamponné
 - V,B -

et plus riche biologiquement comme les lagunes, les variations nycthémé-

rales du pH peuvent devenir importantes et largement excéder les varia-
tions spatiales et à grande échelle de temps, d'où l'intér3t d'effectuer
les mesures de pH toujours à la m~me heure, ou si impossible, de tenir
compte des variations nycthémérales.

3.4 - Oxygène dissous

L'o~gène moléculaire dissous est un paramètre très important

des écosystèmes aquatiques qui influence la majorité des processus biolo-
giques et chimiques qui s'y déroulent.

La concentra tioI1",~~~,)p~J,;\~ne)9+s~Ql.lS".~l'Jt" l~. rés:ill1ïante .de.s·f'acteurs

physiques, chimiques et biologiques suivants:

- échanges à l'interface eau-atmosphère,

- diffusion et mélange au sein de la masse d'eau,

- consommation par les réactions d'oxydation chimique,

consommation par les phénomènes de photo-oxydation,

respiration des organismes aquatiques, ce qui inclut au sens

large la dégl~dation bactérienne des matières organiques, la
nitrification, la sulfo-oxydation •••

production par la photosynthèse.

Le pourcentage d'oxygène dans l'eau par rapport à son niveau

d'équilibre avec l'atmosphère sus-jacente (100% de saturation) est un
élément à considérer, aussi important que sa concentration.

En lagune Ebrié, dans certains secteurs eutrophisés par des

apports organiques exogènes, le pourcentage de saturation peut dépasser
200% en fin d'après-midi en surface et ~tre nul en fin de nuit en surface
ou en pennanence en profondeur. Ces valeurs extr~mes et ces fortes varia-
tions ne sont pas sans influencer la vie aquatique. Les milieux totalement
désoxygénés peuvent aussi ~tre une nuisance olfactive pour les riverains
(dégagement d'hydrogène sulfuré).
 - V,9 -

Protocoles d'échantillonnage, de conservation, d'analyse et de

calcul (Référence IV, Chapitre 5).

La méthode d'analyse préconisée est celle de WINKLER améliorée.

Notons ici que le développement des électrodes à oxygène permet

des mesures rapides et qui, utilisées dans de bonnes conditions, sont
aussi sensibles et précises que les mesures chimiques. Le maniement et
surtou.t l'étalonnage des sondes à oxygène est cependant délicat et destiné
à un personnel hautement qualifié. Ce qui les rend inutilisables dans le
cadre d'un réseau de routine où la priorité doit être accordée à la simpli-
cité de mise en oeuvre et à la fiabilité.

Notons enfin que la concentration en oxygène est coDiÎi1é~ i~'~aieu~ ,',

du pH très dépendante de l'activité biologique, en particulier des
rythmes nycthéméraux de la photosynthèse. D'où les mêmes remarques concer-
nant l'heure des prélèvements que celles formulées au paragraphe précédent.

3.5 - Turbidi té

Référence IV, Chapitre 13.

~~if!~~.!~!~e: Une simple mesure de la profondeur de disparition du

disque de Secchi (disque métallique blanc ou à 4 secteurs noirs
et blancs S ,de 25 à 30 om de diamètre) peut suffire pour
cette mesure. Elle est plus adaptée à des eaux: lagunaires où elle
peut varier d'un facteur 10, et elle est beaucoup plus simple
bien quI elle présente 1'inconvénient d'Itre subjeotive puisqu'elle
dépend de l'observateur et aussi de Ilheure de la journée (éviter
de faire cette mesure à des moments trop proches du lever et du
coucher de saleiV. Elle présente l'inconvénient de nI intégrer la
turbidité qu'entre la surface et la profondeur de disparition du
disque de Secchi, inconvénient limité en lagune par la faible
profondeur et la faible hétérogénéité verticale.

3.6 - Mati~res en suspension (M.E.S.)

C'est la méthode par filtration sur filtre en fibre de verre qui

a été choisie pour son caractère rapide et universel (Référence V, NF,
T 90-105).
 ... V,lO ...

3.7 - Sels nutritifs

Les paragraphes 3.7.1 à 3.7.7. concernent les sels nutritifs du p~

toplancton. Ils se présentent sous plusieurs formes minérales en solution.

Pour l'azote on distingue selon le degré d'o~dation: nitrates

(N03-), nitrites( N02-) et azote ammoniacal (RH et surtout NH +).
3 4

Pour le phosphore on utilise le terme de phosphate qui englobe en

fait toutes les formes d'orthophosphates présentes.

Le terme de silice englobe les formes Si(OH)4 et Si 0(OH)3-.

En mer aussi bien qu'en lagune les concentrations peuvent dans

certaines conditions devenir inférieures à la limite de détection, d'où des
précautions nécessaires de prélèvement, conservation et dosages.

3.7.1. - Prélèvement, conservation, dosages (généralités).

Référence IV, Chapitre 6 -

3.7.2. - Azote ammoniacal.

Référence IV, Chapitre 7 -

3.7.3. - Azote nitreux.

Référence IV, Chapitre 8 -

3.7.4. - Azote nitrique.

Référence IV, Chapitre 9 -

3.7.5.- Phosphore minéral dissous.

Référence IV, Chapitre 10 -

3.7.6.- Silice dissoute.

Référence I, Chapitre 3-E.

En lagune, l'inté~t de ce paramètre est limité. D'une part, la

silice n'y est jamais un âlément nutritif limitant. D'autre part, sa
 - V,l1 -

concentration est approximativement inversement proportionnelle à la

salinité.

3.7.7. - Sulfates.

En mer la concentration varie peu; en lagune elle peut ~tre

déduite de la salinité.

3.8 - Sulfures

Ils sont issus de la réduction des sulfates dans les eaux anoxi-
que s, mais on peut aussi les doser en petite quan~é aux faibles concen-
trations,.p.' o:xygè~~.:q~ sOAt .tqxiques pour les organismes aérobies et
abondants dans les eaux de fond de certaines zones de la lagune.

La méthode préconisée est celle au bleu de méthylène. Elle dose

les espèces H2S, HS- et S--

Prélèvement et conservation

H2S étant volatil et oxydable par l'oxygène, l'exposition à l'air

et les manipulations seront réduites au minimum. Dans une fiole jaugée de
100 ml contenant de l'acétate de zinc à 2%, on,verse l'eau à analyser juste
à la surface de la solution d'acétate, de 0,1 à 50 ml de manière à obtenir
une coloration convenable au moment de la colorimétrie. Cette opération fixe
les sulfures et permet de conserver l'échantillon à 4°C quelques jours au
maximum.

Réactifs

11 Acétate de zinc 2%. Dans une fiole jaugée de 1000 ml, verser
20g d'acétate de zinc, 1 ml d'acide acétique pur et compléter
à 1000 ml par de l'eau distillée;

~ Sulfate de diméthyl-p-phénylène diamine 0,2%. On verse 2g de

ce produit dans une fiole jaugée de 1000 ml contenant 200 ml
d'eau distillée. Puis on ajoute 200 ml d'H2S04 concentré, et l'on complète
jusqu'à 1000 ml avec de l'eau distillée.
 - V, 12 -

11 Sulfate de fer et d'ammoniu~ 10~. A préparer extemporanément

5,7g de sulfate ferrique + 4,3g de sulfate d'ammonium + 2ml
de H2S04 concentré + H20 distillée (q.s.p. 100 ml).

N.B.- Pour les réactifs 2) et 3) l'eau distillée doit être fraîchement

bouillie et refroidie.

Technique

Dans la fiole où le prélèvement a été fixé, on complète par de

l'eau distillée de manière à avoir environ 80ml. On ajoute a.lors 10ml de
la solution 2). On bouche la fiole immédiatement et on l'agite une fois.
On verse alors 0,5 ml de la solution 3) en ouvrant et refermant la fiole
très rapidement. On agit1t"'ê'1!"1j'R·'1"1:~iEfsé fêpè5s'èr/'fOnin.·dh'·c6'mp lèteàÜ,,:ts par
de l'eau distillée jusqu'à 100 ml et on agite à nouveau.

Moins de 4 heures après, on mesure l'intensité de la coloration au

spectrocolorimètre à 670 nm (cuve de 1 cm). On compare le résultat à une
courbe d'étalonnage établie à partir de sulfure de sodium hydraté Na2S,9 H20
préalablement séché sur papier filtre.

Préoision

~ dans l'intervalle de confia.nce de 95%.

Sensibilité

0,15 pmole/l.

Référence

CLINE (J.D.), 1969 - Spectrophotometric determination of hydrogen

sulphide in natural waters. Limnology.and Oceanography,14 (3): 454-458.

N.B.- Si l'on peut se contenter d'un dosage grossier des sulfures, une
simple mesure du potentiel redox de l'eau suffit. H2S est présent
au-dessous de - 250 mV et est approximativement proportionnel au
potentiel redox.
 - V, 13 -

Les paramètres qui suivent: earbone organique partioulaire (c.a.p.),

oarbone organique total (C.a.T.), demande chimique en oxygène (D.C.a.),
demande biochimique en oxygène (D.B.a.), putrescibilité sont des indica-
teurs de la teneur en matière organique globale du milieu et de son poten-
tiel de dégradabilité.

3.9 - Carbone organique particulaire {c.a.p.)

Le carbone est l'élément de base de la matière organique. Chez les

3tres vivants il représente environ 50% de leur poids sec.

Le carbone organique total se répartit en deux fractions séparêes

arbitrairement par filtration.

Le carbone organique particulaire (c.a.p.) est la fraction retenue

sur un filtre de porosité 0,45 J'lm.

Le carbone organique dissous est la fraction qui passe au travers

de ce filtre.

c.a.p. Méthode recommandée: chimique

oxydation par le mélange sulfochromique
(Référence IV, Chapitre 17).

Des méthodes plus précises sont basées sur la combustion de la

matière organique dans l'oxygène suivie d'un dosage du gaz carbonique.
Elles nécessitent un matériel sophistiqué: ana.lyseur CliN, analyseur infra-
rouge actuellement non disponiblooà Abidjan.

Méthodes alternatives en cas d'acquisition de ce matériel-

Combustion dans l'oxygène (fortes concentra.tions)

(Référence VI, Chapitre 4,4, II).
Combustion dans l'oxygène (faibles concentrations) .
(Référence VI, Chapitre 4,4, III).

3.10 - Demande chimique en oxygène (D.C.a.)

Cette analyse normalisée sous le numéro AFNOR NF T 90 - 101

(Référence V) est couramment utilisée pour déterminer la pollution. Elle
 - V, 14 -

consiste à oxyder énergiquement, en présence d'un catalyseur, et de façon

totale (mélange sulfo-chromique à chaud pendant 2 heures ) la matière organique.
C'est donc le reflet de la quantité totale de matières oxydables, biodégrada-
bles ou non. Elle s'exprime en milhgrammes d'oxygène par litre.

Malheureusement, son emploi est limité à des échantillons dont la

teneur en chlorures est inférieure à 3 g/l. En effet, les chlorures réagissent
eux aussi avec le bichromate.

Quelques essais effectués en laboratoire ont montré que les chlorures

augmentaient la D.C.O., mais jamais de façon similaire, malgré une complexa-
tion des ions chlorures par le sulfate de mercure dans un rapport 1 à 10 en
poids. Etant donné que la concentration des chlorures varie de 0 à 20 gll au
cours de l'année dans le milieu lagunaire, il serait impossible d'exploiter
un résultat de D.C.O., l'augmentation de cette dernière pouvant être aussi
bien due aux chlorures qu'à la pollution.

Cette analyse n'a donc pas à être prise en compte dans le R.N.O.C.I.

3.11 - Oxydabilité par le permanganate à chaud en milieu alcalin

Cette analyse normahsée sous le numéro AFNOR T 90 - 018 (Référence V:

est couramment uti lisée pour le dosage des matières organiques oxydables essen-
tiellement dans les eaux d'alimentation. C'est une méthode conventionnelle
qu'il est important de suivre rigoureusement pour assurer la constance des
résultats.

Cette réaction est perturbée par la présence des chlorures, des

sulfures, du fer ferreux, de l'azote ammoniacal et nitreux et de matières
en suspension.

Cette analyse n'a donc pas à âtre prise en compte dans le R.N.O.C.I.

3.12 - Demande biochimique en oxygène (D.B.O.)

Cette analyse normalisée sous le numéro AFNOR T 90 - 103 (Référence V:

est cour~~ent utilisée pour déterminer la quantité de matières biodégradables
présentes ~ans une eau. Dans les eaux très polluées il est nécessaire de rajou-
ter des quantités connues d'oxygène à l'échantillon, ou d'effectuer une gamme
de dilutions. Dans la plupart des eaux naturelles on peut utiliser l'échantil-
lon brut 5 jours plus tard, l'oxygène restant est dosé, la différence entre
le taux d'oxygène de départ et celui du 5ème jour donnant la consommation
d'oxygène en 5 jours à la température normalisée de 20°C.
 Cette méthode par dilution dans les eaux très chargées en matière
organique présente plusieurs inconvénients 1 plusieurs sous échantillons à
traiter, reproductibilité faible.

Si la D.E.O. devait être prise en compte dans le R.N.O.C.I, il

serait préférable de choisir la D.E.O. manométrique. Celle-ci consiste à
introduire une quanüté connue d'échantillon, sans dilution, dans un flacon.
L'échantillon est agité pendant 2 heures, flacon ouvert. Le liquide se
sature en oxygène. Au bout de ces 2 heures, le flacon est bouché et mis en
relation avec un manomètre à mercure. L'oxygène est consommé et la pression
baisse (le C02 produit est absorbé sur du KOR placé dans une nacelle dispo-
sée dans le flacon au-dessus du liquide agi té,). Au bout de 5 jours, la lec-
ture du manomètre permet de calculer directement la D.E.O.

Cette méthode est simple, précise et ne met pas en jeu des manipu-
lations compliquées. Le laboratoire de la D.E.I. va posséder prochainement
un appareil à 10 postes qui permettra de pouvoir réaliser cette analyse.

Un point reste à définir: c'est celui de la température d'incuba-

tion. Elle est classiquement de 20°C en Europe. L'adapter davantage aux
conditions locales (soit 30°C par exemple) permettrait de se rapprocher
davantage des phénomènes réels de biodégradation dans les milieux.

3.13 - Auto-consommation d'oxygène en 48 heures

Cette méthode n'est pas normalisée par L'AFNOR. Elle est citée
dans le Deutsche Einhei tsverfahren zur W'asser sous le numéro H ~ C'est
5
en quelque sorte une D.E.O. simplifiée.

L'échantillon est introduit dans 3 flacons à oxygène type AFNOR

120 ml. L'oxygène est dosé immédiatement dans le premier flacon (méthode
WINCKLER AFNOR NF T 90 - 106 (Référence V). Les 2 autres flacons sont
mis à incuber 48 heures. L'oxygène est dosé après ce laps de temps •

•soit T1 la teneur en 02 en mg/l dans le premier flacon (t = 0 heur

.soient T? et T3 . les teneurs en 02 en mg!l dans les 2 autres

flacons lt = 48 heures).

L'auto-consommation en mg/l en 02 en 48 heures est donnée par:

T2 + T3
A.C. 02 / 48 h = T1 - 2
 ~ V,16 -

Cette méthode ne nécessite que 3 flacons par échantillon, 48heures

d'incubation. Elle permet de se faire une idée de la consommation d'oxygène
dans le milieu. Il reste à déterminer la température d'incubation qui, comme
pour la D.B.O., pourrait ~tre celle du milieu naturel échantillonné.

3.14 - Essai de putrescibilité

Cette analyse simple permet de mettre en évidence l'état réducteur

du milieu et sa capacité à rendre putride les eaux. Elle n'est appropriée
qu'aux eaux très chargées en matière organique, donc plutôt dans les lagunes
qu'en mer (Référence V, NF, T 90 - 104).

Ils existent pour certains à l'état de trace dans les milieux natu-
rels non pollués.

Ils peuvent être dosés dans l'eau, les sédiments et la matière

vivante. Lorsqu'il existe des particularités ~s à chacun de ces supports,
elles sont signalées dans les protocoles qui suivent.

4.1 - Détere;ents anioniques

Référence II, 1ère partie, Chapitre 1.

4.2 - Hydrocarbures dans l'eau de mer et les sédiments marins

Choix d'une technique, voir Annexe V.1 (M.MARCHAND).

- Technique par spectrophotométrie infra-rouge

Voir Annexe V.2 (.r.C.ROUSSEL).

- Technique par spectrofluorescence ultraviolette.

Un protocole d'analyse est en cours de rédaction au C.O.B. (France).

4.3 - Organochlorés

Cette classe de composés englobe simultanément les pesticides

chlorés (DDT, lindane, heptachlore, aldrine,dieldrine, et les résidus
 - V,17 -

industriels:polychlorobiphényles (PCB).
Voir Annexe V.3 (M.MARCHAND).

4.4 - MicrOpolluants minéraux: Ag, Cd, Cu, Zn, Co, Cr, Fe, Mn, Ni, Pb, Hg.

4.4.1 - Traces métalliques dans l'eau:

- Méthode par absorption atomique avec flamme après extraction

- Méthode ~'polarographie impulsionnelle à redissolution anodique

Référence II, 2ème partie, Chapitre 1.

4.4.2 - Mercure dans l'eau et la matière vivante

Référence II, 2ème partie, Chapitre 2•

. "h j." -

4.4.3 - Traces métalliques dans les sédiments:

- Analyse de la fraction mobilisable

- Analyse totale de l'échantillon
- Mercure.

Référence II, 2ème partie, Chapitre 3.

Remarque: L'Annexe V.4 (J .L.MARTIN) expose le protocole de minérali-

sation du sédiment qui a été utilisé dans le cadre de
l'exercice d'intercalibration de l'opération test (Cf.
rubrique VII ).

4.5 - Autres

- Plastifiants: inutile et abandonné dans le R.N.O. français.

- Phénols: utile seulement si pétrochimie complexe.

5 - BIOLOGIE

Les paramètres liés à la biomasse ou à l'activité des organismes

vivants sont, comme les paramètres hydrologiques et hydrochimiques des
indicateurs de la qualité du milieu aquatique.

Leur valeur excessive ou insuffisante (par rapport à des normes

à définir pour chaque milieu) est souvent le signe d'un apport polluant.
 - V,18 -

Par exemple, un excès de sels nutritifs d'origine industrielle ou domesti-

que entraîne une prolifération algale manifestée par des concentrations en
chlorophylle"a" supérieures à ilIa normale"; un excès de matière organique
entraîne une prolifération "anormale" ete bactéries hétél~otl'Ol'hes.

Certains par~nètres biologiques intègrent les effets de pollutions

diverses. D'autres sont plus spécifiques; ils sont susceptibles d'indiquer
la nature, l'importance et l'origine du polluant. Par exemple, les salmo-
nelles sont indicateurs d'une pollution fécale; la présence de Salmonella
typhi indique le rejet d'un porteur (sain ou malade) du vecteur de la
fièvre typhoïde; la présence du m~me germe en quantité est manifeste d'un
foyer épidémique sur le proche bassin versant.
~

5.1 Chlorophylle lia" et phéopigments

La chlorophylle "a est un pigment commun à tous les végétaux.

En pleine eau, elle est spécifique des microalgues (phytoplancton) ou des
macrophytes issues des berges et du fond, ou du bassin versant. On consi-
dère qu'elle est proportionnelle à la biomasse végétale. Les méthodes pro-
posées pemettent de distinguer la. chlorophylle "a" de ses produits de
dégra.dation, les phéopigments.

Deux méthodes sont proposées:

Méthode par spectrophotométrie

Référence IV, Chapitre 15.

Méthode par fluorimétrie

Référence IV, C~api tre 16.

L'une et l'autre sont envisageables à Abidjan, compte tenu du

matériel existant (Cf. rubrique II).

La signification des deux méthodes est différente. La première

permet une évaluation des concentrations de chlorophylle et de phéopig-
ments; la seconde une propriété des chlorophylles et phéopigments: la fluo-
rescence qui n'est qu'approximativement proportionnelle à leurs concentra-
tions.
 - V,19 -

La première méthode est précise et son interprétation (biomasse)

aisée; la seconde est moins précise, moins facilement interprétable et
nécessi te des étalonnages fréquents. Par contre elle est très sensible,
ce qui pennet de travailler sur des volumes réduits: de l'ordre du litre
en mer, du décilitre en lagune. Elle est également plus rapide à mettre
en oeuvre.

De ce fait nous 1& conseillons pour le R.N.O., où il n'est utile

que de détecter les grandes variations de biomasse végétale.

5.2 - Zooplancton

A l'image des autres paramètres et en particulier de la chloro-

phylle, la bi~;-~~~~zoopl~nctoniquequi mesure ~ indice de la richesse
du milieu aquatique, peut ~tre considérée comme un indicateur de pollution
si sa valeur se situe hors des limites habituellement rencontrée~.

La méthode décrite ci-dessous expose un protocole standard de

mesure de la biomasse.

Prélèvement du zooplancton et mesure de la biomasse

Les échantillons sont prélevés par tractions verticales (fond-

surface) de filets de 40cm de diamètre d' ouve:1'ture et de 60 rm de vide
de maille. Deux ou trois traits sont effectués pour chaque échantillonnage
et le produit des p~ches est ensuite mélangé puis fractionné en deux par-
ties égales. Une moitié de l'échantillon est fixée au formol à 5% et sert
à effectuer les détenninations et les comptages de chaque groupe faunisti-
que. L'autre moitié est recueillie par aspiration sur filtre (oF/e p 47 )
prépesé (de poids P1), rincée au fonniate d'ammonium isotonique (pour
éliminer le sel sans altérer les organismes), puis desséchée à l'étuve
(60 0 e) pendant au moins 24 heures. Le filtre est ensuite pesé (P 2 ), calciné
au four (550°C) pendant 1h30, puis pesé à nouveau. (P3).

Le poids sec (P.S.) ..est donné par P.S. = P 2 - Ph et le poids orga-

nique (P.O.) du poids sec sans cendre (p.s.s.e.) par P.O. = P 3 - P2.

5·3 - Surveillance de l'ichtyofaune

Tout comme les maillons inférieurs de la cha1ne alimentaire (phyto-

 - V,20 -

plancton, zooplancton ••• ) les paramètres ichtyologiques devraient égalemen

~tre soumis à une surveillance dans le cadre d'un R.N.O. Cette remarque a
été formulée par un chercheur du Centre de Recherches Océanographiques
d'Abidjan, qui propose outre le suivi physio-pathologique des espèces (en
particulier le dosage des substances toxiques au sein des différents tissu
et/ou organes des poissons), une surveillance écologique systématique de
l'ichtyofaune (peuplements, fécondité, croissance ••• ) notamment dans les
lagunes. Le contenu de cette proposition est reporté en annexe V.5 (J.J.
ALBARET) •

5.4 - Bactéries et virus

Les bactéries et les virus sont des composants normaux des milieux
naturels. Nous no 'US intéressons dans leca-ril:r€k1Gl'un réseaudesuTVceislla.nce
certaines espèces ou certains groupes dont la présence et/ou l'abondance
est indicatrice d'un état de pollution, en particulier fécale, et est
susceptible de fournir des indications sur l'origine et l'importance de
cette pollution.

Les germes tests les plus couramment utilisés sont les coliformes
fécaux, les streptocoques fécaux et accessoirement Clostridium perfringens

De nombreuses méthodes sont disponibles et développées dans la

référence VII. Le choix s'est porté sur les suivantes:

5.4.1 - Numération des coliformes totaux et d'Escherichia Coli en milieu

liquide

Cette analyse permet le dénombrement des coliformes totaux et des

coliformes spécialement fécaux comme E.Coli. Ce dernier germe est un germe
test de contamination fécale récente. Il est en effet aSsez fragile et dis
paraît rapidement.

La méthode en milieu liquide a été choisie pour son universalité

d'emploi, en particulier pour les milieux turbides et fortement chargés en
matières en suspension. C'est une méthode normalisée: Béférence V, Norme
AFNOR T 90 - 413.

Remarque sur le paragraphe 6.3.1 de cette norme: On peut utiliser égalemen

- - - - - - - - - - - - - - .- - - -
le bouillon au pourpre de bxomocrésol, qui a la m§me composition
 - V,21 -

que le bouillon lactosé, mais qui contient en plus un indicateur

de pH, le pourpre de bromocrésol, qui vire du violet au jaune à
pH 5,2 - 6,8.

5.4.2 - Numération des streptocoques et des streptocoques fécaux en milieu

liquide

Cette analyse permet le dénombrement des sreptocoques totaux et des

streptocoques fécaux. Ces derniers germes sont des germes-tests de contami-
nation fécale relativement ancienne. En effet, les streptocoques sont plus
résistants que les, coliformes.

La méthode par dilution en milieu liquide a été choisie pour son

universalité d'emploi, en particulier dans les milieux turbides et. chargés
en matières en suspension.

Voir annexe V.6.

5.4.3 - Ana~se bactériologique des coquillages

Les coquillages peuvent @tre un bon indioateur de pollution. En

effet, pour respirer, ils font transiter un volume important d'eau qui tra-
verse leur organisme. Ils peuvent donc concentrer fortement la pollution
d'origine microbienne.

Seuls les coliformes totaux, E.Coli, les streptocoques et les strep-

tocoques fécaux seront recherchés. La recherche des bactéries pathogènes
(vibrions, salmonelles, shigelles) ne se fait pas de manière routinière.
Cependant, une recherche spécifique peut @tre faite de ces germes dans des
cas bien précis (au droit d'un émissaire, en cas d'épidémie, d'endémie ••• ).

La bactériologie des coquillai$s demande une préparation, c'est-à-

dire un broyage des mollusques et une dilution dans un liquide stérile. La
méthode décrite ci-dessous est celle employée par l'I.S.T.P.M. de Nantes

(Référence VII, pages 6, 8 et 9).

5.4.4 - Clostridium perfringens

Clostridium perfringens est un germe anaérobie de grande longévité

dans la nature. Répertorié dans l'échantillon en l'absence de coliformes et
 - V,22 -

de streptoco~ue8 fécaux, il apporte la preuve d'une pollution ancienne.

La référence VIII propose plusieurs méthodes de dénombrement.

5.4.5 - Germes pathogènes

Dans le cas d'une contamination du milieu naturel par les coliformes

et les streptoco~ues fécaux, d'une endémie et d'une épidémie, il est suggéré
de rechercher les agents pathogènes particuliers:

- les salmonelles, en particulier S.typhi et S. paratyphi, agents

des fièvres typhordes et paratyphordes;

- le vibrion du choléra;

- le Vibrio parahaemolyticus vecteur d'une entérite;

- Shigella à l'origine des ~senteries bacillaires

...
Toutes les techni~ues disponibles sont développées dans la référence
VIII et le choix de celles ~ui sont le plus adaptées à une surveillance
sanitaire de routine est fait dans la référence IX.

6 - MINERALOGIE

Il s'agit là de déterminer les espèces minéralogi~ues argileuses

(montmorillonite, kaolinite, chlorite) ou non argileuses (~uartz, calcite,
dolomite ••• ), présentes dans les matières en suspension et dans les sédiments
par analyse aux r83"0ns X. Il est évident ~ue la. ,granulométrie et la nature
du sédiment tient un rôle fondamental dans l'interprétation des résultats
d'analyse des micropolluants minéraux étant donné la méthodologie utilisée
(atta~ue sélective de surface des grains). Cela étant, l'expérience des
artisans du R.N.O. français nous enseigne ~ue cette classe de paramètres
n'est pas indispensable dans un premier temps étant donné l'information
recueillie bien modeste en face de l'effort financier exigé.

7 - HYDROCARBURES ET MACRODECHETS SUR LE LITTOR.lL

Les hydrocarbures et macrodéchets flottants sont finalement rejetés

sur le littoral (plages océani~ues et berges basses des lagunes) par le jeu
 - V, 23 -

des vents et des courants. Leur quantité intègre la pollution du milieu

aquatique de la période précédente.

La méthodologie suivante est adaptée de celle suggérée par

M.BODENNEC du C.O.B. (France) qui a effectué une campagne d'évaluation
des hydrocarbures et macrodéchets sur les plages ivoiriennes pour le compte
de la Compagnie ESSO.

Prospection d'ensemble

Al' aide d'un film aérien de l'ememble du littoral, déterminer

(estimation visuelle) des zones selon leur degré de pollution en 4 ou 5
classes. Evaluer le linéaire correspondant à chaque classe.

N.B.-·""J.ai~;P'awe:pectionaérienne
n'est pas.applieable aux lagunes où les
---- berges sont souvent recouvertes de végétaux et où la pollution
par hydrocarbures n'est importante ~utaocidentellement.Pourla
prospection on fera une estimation visuelle à partir d'une embar-
cation longeant les berges.

A l'intérieur de chaque classe sélectionner au hasard une dizaine

de bandes de 1m de largeur parallèlement à la ligne des eaux et de profon-
deur égale à la zone de balancement maximale des marées.

- Sur le terrain

• A l'intérieur de chaque bande, compter, peser (ou estimer le poids)

de tous les macrodéchets classés par cat'gorie: bois travaillé et non
"tft,va.illé, verre, caoutchouo, plastiques, méta.ux, papiers, v@tements,
oadavres, bouteilles, médicaments ••• Noter le maximum de détails qui per-
mettront éventuellement de retrouver l'origine du polluant; par exemple
noter les indications portées sur les emball&ge~

• Sur l'ensemble de la bande ramasser les boulettes de goudron, les

peser; ramasser le sable souillé sur 1cm d'épaisseur environ, mélanger et
prélever un éohantillon.

- Au laboratoire

• Peser l' éohantillon de sable souillé, extrair~ les hydrocarbures

au chloroforme, évaporer, peser à nouveau; la différenoe de poids évalue
 - V,24 -

le contenu des sables en hydrocarbures •

• Une analyse plus fine des hydrocarbures pourra éventuellement être

réalisée sur les boulettes de goudron et le sable souillé par les
méthodes précèdernrnent recommandées •

• Evaluer à partir des résultats des comptages, pesées et analyses

des bandes échantillonnées et de la prospection aérienne, la pollution par
macrodéchets et hydrocarbures du littoral ou de portions de littoral.

Un protocole analytique de l'analyse chimique d'un sable pollué est

indiqué ~ur la figure suivante. Des précisions sur la méthodologie pourront
être obtenues aùprès de G. BODENNEC au CÔi1'aê':B'rwl-~t":lFraiic~):c:
 FIGURE 1 PROTOCOLE ANALYTIQUE DE 'L'ANALYSE CHIMIQUE D'UN SABLE POLLUE .
• l ,

SABLE MAZOUTE

S~ch.ge par 1loPhi1isation (16 hl

Extraction au Soxh1et CHCl (Sh)
3

1 SABLE r' - ~

~
.esure de dens i té
_na lyse par Infra-Rouge
:;étermination de la teneur en
métaux (Ni, V).

désu1furisation sur
l'amalgame Cu/Zn
(élimination. du S libre)

EXTRAIT ORGANIQUE TOTAL Dosage du soufr e lié

~
,.
\
(analyseur LECO ~
Hydrocarbures et Produits lourds

Fractionnement par chromatogra )hie liquide sur colonne (Si0 + Al 0 )

2 3
2
r l

Hydrocarbures saturés Hydrocarbures aromatiques Produits lourds

Pèsée Pesée Pesee

Analyse par chromatographie en
phase gafeuse

Répartition des n.alcanes

et des isoalcanes.
 8.1 Annexe V.l

CHOIX D'UNE TECHNIQUE DE MESURE DES HYDROCARBURES

'""' ~- '''','). .' Que ce.sp~,~ pour l'e~u, l~ sédiment ou la matière vivante, l'analysE
,,;,'>','0,'0,", • . .'

proc~de en première étape par une extraction par un solvant organique, suivie

d'une phase de purification de l'extrait organique. Deux techniques de mesure

sont disponibles pour apprécier ce que l'on appelle des "hydrocarbures totaux"
- la spectrophotométrie infra rouge (I.R.)
- la spectrofluorescence ultraviolette (SFUV).
La première technique de mesure (IR) répond à la vibration de la
liaison C-H. Les hydrocarbures extraits sont donc dissous avant la mesure dans
un solvant ne possédant pas ce type de liaison ; on utilise le tétrachlorure
de carbone (CC1
4).
La seconde technique (SFUV) mesure la fluorescence .des hydro-
carbures aromatiques; l'extrait est dissous dans un solvant non fluorescent,
par exemple l'hexane.

Quelle technique choisir ?

La technique IR est la meilleure approche pour l'estimation des
hydrocarbures totaux, elle possède en outre une gamme de réponse linéaire grande
par rapport à la technique SFUV. Elle souffre toutefois d'une faible limite de
détectabilité. ce qui constitue un inconvénient très réel pour les mesures dans
l'eau.

On admet un seuil de 2 ~ag/l d' hydrocarbures totaux dans l'eau

comme critère de pollution. La mesure IR ne permet pas de descendre en dessous
de 20 ~g/l, tandis que la mesure par SFUV permet de déceler des teneurs inférieurE
~ 1 ~g/l. La technique par SFUV est également recommandée pour les dosages dans

la matière vivante~
 v.z

En effet, la phase de purification de l'extrait ne permet

généralement pas d'éliminer tous les lipides co-extraits avec les hydrocarbures
Ces substances, par la présence de liaison C-H, interférent si l'on utilise la
mesure IR. Les inconvénients de la technique IR indiqués pour l'eau (seuil de
détectabilité) et pour la matière vivante (lipides co-extraits) n'existent pas
pour le sédiment. Ce Bera par conséquent la méthode recommandée pour ce type
d'analyse. Le tableau ci-dessous récapitule ces quelques remarques.
D'un point de vue strictement analytique, la mesure des hydro-
carbures totaux (extraction, purification, mesure IR ou SFUV) ne présente pas
de difficultés majeures. Un soin doit être apporté à la propreté de la verrerie
utilisée et des réactifs. Les solvants doivent être très purs. Un soin plus par-
ticulier doit être pris pour éviter toute contamination accidentelle si l'on
analyse des échantillons d'eau, compte tenu des niveaux très faibles rencontrés.

Technigues de mesures Avantages Inconvénients

1
- Répond à la liaison Limite de détectabilité
C-H faible
- Meilleure approche pour (pour l'eau 20 ~g/l)
i Spectrophotométrie IR. la mesure des hydrocar-
bures totaux.
- Gamme linéaire de répon-
se : importante.

- Sensible aux hydrocar- Gamme de réponse linéaire

bures aromatiques. faible (effet quenching)
Spectrofluorescence UV. (représentatifs d'une
pollution pétrolière
dans l'environnement)
- Méthode très'··sensible
(pour l'eau 1 rg/l)
Choix d'une technique

Caractéristiques Niveaux rencontrés

Eau S r uV Senaible aux hydrocarburea aro- Eau non polluée ~ 1 ~g/l

matiques, bona indicateurs de
pollution pétrolière, méthode Seuil de pollution.> 2 ~g/l
très sensible. Eaux polluées 10-100 rg/l

Matière vivante S r uV Sensible aux hydrocarbures aro- Mollusques non contaminés :~1-2 ppm
(mollusque) matiques, absence de risque (poids frais) <:
d'interférence par la présence •w
de lipides co-extraits non to- Pollution significative : 10-100
talement éliminés (poids frais)

Sédiment 1 R Meilleure approche des hydro- Absence de pollution (*)

carbures totaux <50 ppm
Gamme linéaire de réponse Pollution significative (*)
importante >100 ppm
f:;

i (*) Il faut tenir compte de la nature

~~"~
..
du sédiment: sable; vase •••
:li.'
!;"c<

,'-,
,.
;,-~.

~,I.
:,~

~;
 8.2. Annexe V,2

DOSAGE DES HYDROCARBURES DANS L'EAU DE MER

ET LES SEDIMENTS ~~RrNS

(J.C. ROUSSEL)

Cette méthode en ce qui concerne l'eau est ~ortement inspirée de la

norme AFNOR 90 203. elle en diffère p.ssentiellement par le protocole utilisé
en chromatographie liquide. Pour les sédiments l'étape concernant l'extrac-
tion est également modifiée.

1. PRINCIPE

Las hydrocarbures sont extraits du substrat à étudier par le tétrachlo-

rure de carbone. l'extrait est percolé sur un adsorbant afin de retenir les
composés polaires. l'éluat analysé par spectrométrie infrarouge. La méthode
s'applique à tous les hydrocarbures extractibles au tétrachlorure de carbone
et susceptibles d'absorber le rayonnement infrarouge dans la région comprise
antre 3000 et 2800 cm- 1 correspondant aux différentes vibrations de valence
C-H des groupes: -CH]. -CH2- et -~-H.

La limite de détection est de 0.1 mg/l pour un spectromètre ordin~ire.

Si l'appareil possède une expansion d'échelle en ordonnée üt à condition d'opé-

rer avec un solvant extr~m8ment pur cett8 limite peut Gtre abdissée à 0.020 mg/l.
 8.2 - v.3

2. PRELEVEMENT

Il doit se faire dans des flacons de verre, rigoureusement propres

(nett6yage au détergent puis è l'acide sulfochromique et plusieurs rinçages
à l'eau distillée ~).

L'idéal serait d'utiliser des bouchons de verre rodé sans graisse mais
ce moyen est peu commode dans le cas de transport iJrolongé. On peut utiliser
soit le bouchon de liège classique entourô de h~LJilJ8S d'eJ1uminium rincées au
tétrachlorure de carbone, soit le bouchon vissé avec disque d'étanchéité en
téflon. tout autre polymère. tout caoutchouc est à proscrire.

Afin d'éviter au maximum l'oxydation on ne laisse au haut du flacon

qu'une garde très faible.

,,",:'i'i'~'." Dan,;; le,casde,l'eau afin de diITl;inuer l'activité microbi.enne; l'échantil-

lon est acidifié après le prélèvement. (Le porter à pH inférieur è 3 en ajou-
tant. par exemple, 0,1 ml d'HCl 12 N à 1 litre d'échantillonJ.Cette précaution
n'~st à prendre que si l'extraction ne se fait pas immédiatement.

Les sédiments seront congelés ou au moins acheminés dans une enceinte

réfrigérée (glaCière portative par exemple).

3. APPAREILLAGE

- Balance de précision.
- Ampoules à décanter de deux litres.
Broyeur avec bol de 1 litre sans matériau organique (élastomère, polymère.
etc ••• à proscrire).
- Soxhlets.
- Papier filtre (1).
- Colonne de chromatographie (décrite plus bas).
- Spectromètre infrarouge dispersif.
- Deux paires de cellules infrarouge (une de 1 cm, l'autre de 5 cm), en quartz (2).
- Eprouvettes graduees.

:t Eau distit Zée et non eau perrmltée.

(1) l)urieux nO 111 "vert" sans grœisse.

(2) La qualité infrasif de chez HeUma convient.
 8.2 - V.4

Toute la vorrerie sera soigneusement lclVée (dC:tcf'f';c;nt. dcido sulfochro-

mique) et abondamment rincée à l'eau distillée et au tétrachlorure de carbone.

4. REACTIFS

Acide chlorhydrique qualité analytique.

- Sulfate de sodium anhydre pour analyse.

_ Tétrachlorure de carbone pour spect,oscopie (3). Cette qualité est indispen-

sable pour atteindre le seuil de 0,1 mgll ; au-dessus la qualité "pour ana-
lyse W suffit (4).

- Agent adsorbant silice adsorbante modifiée par la présence de magnésie

(MgO: 15,5 % - S102 : 84 % - Na S2~~< 1 %) de granulométrie comprise entre
0,025 et 0,250 mm (100-60 mesh) (5).

5. EXTRACTION

5.1 Eau de mer

Dans une ampoule à décanter verser M grammes d'eau à analyser (il est
recommandé de travailler sur 1 kg d'eau).

Porter à pH acide si l'échantillon n'a pas été acidifié auparavant

(pour l'extraction, le pH 5 est suffisant).

Prendre un volume V (~50 ml pour 1 litre d'eau) de tétrachlorure de

o
carbone dont la pureté aura été vérifiée par spectrométrie infrarouge : il ne
doit pas présenter de signal à 2925 cm- l (voir figure 1). S'en servir pour laver
le flacon de prélèvement et les ajouter ensuite au contenu de l'ampoule à dé-
canter. Agiter, soit manuellement, soit par agitateur mécanique pendant 1S min.

Laisser reposer 10 min. et soutirer l'extrait (qui constitue la phase

inférieure).

Filtrer cet excès sur du sulfate de sodium anhydre déposé sur un filtre
sans graisse préalablement rincé au tétrachlorure de carbone.

(3) Le produit 2209 vendu par Merk convient.

(4) Le produit 2222 vendu par Merk convient.
(5) Le produit "FZorisiZ" verulu par 8crZabo convient.
Le produit "Florigi l " vendu paI' Touzart et Matignon convient.
 8.2 - V.5

S.2 S~dimeYl.t8

On prélève aux environs de 300 grammes do sédiment qu'on sèche à

l'étuve è 60 0 • Si le sédiment contient beaucoup d'eau on fait précéder le
chauffage d'une centrifu~ation, on recueille l'edu et on l'analyse comme il
est indiqué au paragraphe 5.1.

On place le sédiment sec dans le broyeur pour le réduire en poudre

fine et l'homogénéiser.

On mélange M grammes (environ 100 g) de la poudre obtenue èvec 20 g

de sulfate de sodium anhydre, le tout est placé dans un soxhlet dont la car-
touche a été soigneusement nettoyée par une opération· à blanc avec du tétra-
chlorure de carbone.
Le sédiment est extrait au soxhlet pendant huit heures par le tétrachlo~

l'ure de carbone, _le volume de tétrachlorure étant fixé par celuitle:':sol<"hi'et.

A la fin de l'opération, mesurer le voluille V de l'extrait receuilli

o
et le filtrer sur sulfate de sodium anhydre pour éli~iner l'eau éventuellement
entralnée.

6. CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

Elle est destinée à se débarrasser de composés polaires extraits en

même temps que les hydrocarbures.

On prépare une colonne de verre de 25 cm de longueur et 0.5 cm de dia-

mètre intérieur munie d'un réservoir d'une cinquantaine de millitres à l'ex-
trémité supérieure et d'un robinet téflon (toute graisse est à proscrire) à
l'extrémité inférieure. Cette colonne est remplie de florisil (de 1,5 è 2 g).

Laver le florisil en faisant percoler sur la ccilonne 20 ml au moins de

tétrachlorure de carbone, écarter le CC1 4 recueilli.

Verser dans le réservoir surmontant la colonne 20 ml de l'extrait, le

laisser entièrement pénétrer le florisil. recueillir le liquide élué da~s une
éprouvette graduée, puis rajouter en tête de colonne 4 ml de CC14 pur. (Ce
-volume correspond à peu près à deux fois le volume mort de la colonne) et
recueillir dans la même éprouvette. Mesurer le volume collecté soit Vl ml.

7. MESURE
Elle se fait par spectrométrie infrarouge différentielle.
 8.2 - V.6

Dans le faisceau échantillon. placer une cellule de quortz remplie de

l'extrait percolé sur florisil.

Dans le faisceau de référence. placer une cellule identique mais remplie

de tétrachlorure pur également percolé sur une deuxième colonne de florisil
préalablement rincée.

Enregistrer le spectre. mesurer l'absorbance à 2G25 cm- 1 (3.42 ~) et dé-

terminer la concentration d'hydrocarbures dans l'extrait par comparaison avec
une courbe d'étalonnage.

Les spectromètres infrarouge donnent 8ft g~lléral la transmission. l'absor-

bance A est déterminée (voir figurs 2) par la méthode des tangentes.

Mesurer 1 et I sur le spectre.

0 t
l
o
A = log --
I
t

8. ETALONNAGE

Dans la mesure où le polluant est connu et disponible. préparer plusieurs

J~eutLo~de concentrations connues dE ce polluant dans le tétrachlorure de car~
bone. (Exprimer les concentrations en mg d'hydrocarbures par litre de CCl~).

Déterminer comme ci-dessus les densités optiques à 2925 cm- 1 (dans les
mêmes cellules que pour l'extrait) et tracer la courbe donnant l'absorbance
en fonction de la concentration. (Choisir des dilutions entre 10 et 200 mg/l).

Si le polluant est inconnu. prendre pour référence le mélange API (en %

en poids)
benzène 25
1sooctane 37,5
hexadécane 37.5
que l'on diluera comme précédemment dans le CC1 4 •

9. RESULTATS

L'absorbance A de l'extrait correspond sur la co~rbe d'étalonnage è une

concentration de C mg/litre (hydrocarbures dans le CC1 4 ).

La concentration d'hydrocarbures dans l'échantillon d'oau est

 8.2 - V.7

C VIV
o
w =: 20 M en mg/kg

Avec 1"1 poids de 1'6chantillon de substrat (en g)

V volume de CCl4 ajouté à l'eau ou recueilli après extraction
o
soxhlet (ml)
volume de l'extrait après passage sur florisil (en ml)
concentration lue sur la courbe {en li,g/litr8J.

10. COMMENTAIRES

Cette méthode. telle qu'elle est décrite. en utilisant des cellules de

1 cm et un appareil infrarouge de routine. permet d'atteindre sans problème des
teneurs en hydrocarbures de 10 mg par litre de tétrachlorure. soit de l'ordre
~'f·ot,,. .' '{i ..... · _'::-..... ;i:;~·- __
,.,,:
de 0.5 mg pa~ kilogramm~ ~'eau "(se1onle rapport eau/tétrachlorure).

En utilisant des cellules de 5 cm. du tétrachlorure de grande pureté et

un spectromère de haut de gamme (muni d'une 8xtension'du signal en ordonnée)
cette limite peut être repoussée à 0.02 mg/kg.

Pour de telles concentrations les subst~n~n~ n~turnlles présentes dans

la milieu (lipides ou autres) peuvent fiJU ssnr consirJérablemrmt l'analyse et 11
est recommandé de vérifier l'absence de produits polaires dans l'extrait. Cette
recherche qualitative peut être effectuée en laissant évaporer goutte à goutte
l'extrait sur une plaque de chlorure de sodium et enregistrer le spectre
complet de cette plaque. On ne doit pas observer de signaux entre 1800 et
1650 cm-l. Si dans ce spectre la bande carbonyle vers 1730 cm- 1 est d'intensité
comparable à celle des CH2 le dosage n'a aucun sens. La cause en est une mau-
vaise séparation des composés polaires qui peut se produire. Le sédiment (c'est
rarement le cas pour l'eaU) est très chargé en ester et peu en hydrocarbures.
Il convient alors de recommencer la chromatographie en tenant compte dans le
calcul des dilutions éventuelles.
,.
BIBLIOGRAPHIE

- Nonne AFNOR T90 203. Effluents aqueux des raffineries de pétrole. Dosage
des hydrocarbures totaux (Tour Europe Cédex 92DAD Paris La Défense).

- Norme AFNOR T90 114. Dosage des hydrocarbures totaux (méthode par spectro-
métrie infrarouge).

Conversion for the prevention of marine pollution from land based sources.
Third meeting of the working group on oi1 pollution. London 14-16 Fev. 1979.

Annex IV Method of samping and anhydre. Di1 Industry International Explo-

ration and production. Forum 37 Duke Street St James's London SW1 y GDH.
 8.3. Annexe V,3

DQSAGE DES COMPOSES ORGANOCHLORES, PESTICIDES ET POLYCHLOROBIPHENYLES

DANS L'EAU DE MER, LES SEDIMENTS ET LES ORGANISMES MARINS

(M. MARCHAND)

1. INTRODUCTION

Les hydroc~rbures halogénés à haut poids molécul.aire les plus souvent

identifiés dans l'environnement marin correspondent aux résidus de polychloro-
biphényles (PCB) et d'insecticides chlorés: lindane, heptachlore, aldrine,
dieldrine, DDT et ses deux principaux métabolites (DDD, DDE). Les polychloro-
biphényles sont des composés aromatiques qui tels qu'ils sont identifiés dans
l'environnement contiennent en moyenne le plus souvent 50 à 60 % de chlore par
molécule.
La détection de ces différents composés par séparation chromatogra-
phique sur colonnes remplies se heurte à de sérieuses difficultés du fait des
interférences entre les pics chromatographiques de plusieurs insecticides
chlorés (aldrine, dieldrine, DDT, ODE, DDD) et ceux des résidus de PCB. L'ana-
lyse quantitative nécessite alors des traitements chimiques appropriés afin de
surmonter les faiblesses inhérentes àla technique de chromatographie en phase
gazeuse à faible résolution (colonnes remplies). Les principaux traitements
chimiques utilisés et décrits dans le précédent manuel RNO (1977) sont:
- la séparation des insecticides chlorés des résidus de PCB par chro-
matographie d'adsorption (florisil, silica gel) par élution sélec-
tive avec des solvants de polarité croissante,
- des tests chimiques destructifs tels que l'attaque acide (destruc-
tion de la dieldrine) et la saponification (destruction des isomères
de l'HCH, transformation du DDT et du 000 en leurs dérivés éthyléni-
ques correspondants, respectivement DDE et DDMU).
L'utilisation des colonnes capillaires en verre ou en silice fondue
pour identifier les organochlorés par chromatographie en phase gazeuse, amé-
liore considérablement le pouvoir de résolution par rapport aux colonnes rem-
plies. Cette technique à haute résolution permet d'une part de séparer les
insecticides chlorés des résidus de pes, d'autre part de mieux différencier
les différents homologues et isomères des PCB.
Des exemples dp séparation chromatographique sur colonnes remplies
et capillaires sont illustrés sur les figures 1 à 4 (Caprais et Marchand 1978).
 8.3 - V.4

Nous ne pouvons que conseiller à l'analyste de s'engager, s'il ne lia

déjà fait, vers la technique de chromatographie en phase gazeuse à haute réso-
lution. L'état actuel des procédés de préparation des colonnes capillaires de
verre est décrit par 8erthou (1981). .
Les gammes de concentrations habituelles d'hydrocarbures halogénés
rencontrées dans l'environnement marin varient selon la nature des échantillons
analysés
eau de mer < 1 100 ng/l (ppt),
sédiment (poids sec) < 1 1. 000 ng/g (ppb),
moules (poids sec) 0,01 - 10 ~g/g (ppm) .

2. METHODE

L'analyse des résidus d'hydrocarbures ha1ogénés, quelque soit le type

d'échantillon, comprend quatre étapes successives:
". ,- .. ~: .
- une p~ase d'extraction des substances recherchées par un solvant
organique, suivie alUne pré-concentration de l'extrait organique,
- une phase de purification pour séparer ou détruire les composés
organiques co-extraits qui interféreraient durant l'analyse chroma-
tographique,
- l' analys~. chromatographigue en phase gazeuse proprement dite,
des tests de confirmation.

3. PRECAUTIONS PARTICULIERES - ELIMINATION DES ARTEFACTS

Les facteurs limitant la sensibilité et l'exactitude des analyses

résiduelles sont liés essentièllement aux problèmes de contamination des réactifs
chimiques et de l'équipement. Tous les matériaux et produits chimiques utilisés
pour l'analyse résiduelle doivent être suspectés en ce qui concerne leur propreté.
Les matières plastiques (à proscrire) ainsi que nombre de produits manufacturés
contiennent des substances interférentes qui produisent des pics au cours de
l'analyse chromatographique. Plusieurs hydrocarbures halogénés sont fortement
adsorbés sur le verre, ainsi la verrerie peut se trouver contaminée par les
composés résiduels qui se trouvent sous forme de vapeurs dans le laboratoire.
Il est essentiel que tous les solvants et matériaux employés pour l'analyse
soient préalablement lavés et testés.

3.1. Verreri e

La verrerie est lavée dans de l'eau chaude contenant un détergent

puissant, puis rincée successivement à l'eau, l'acétone et l 'hexane et enfin
séchée au four pendant une nuit à 300°C (à l'exception de la verrerie volumé-
tri que).
 8.3 - V.5

3.2. Solvants organiques

Les solvants organiques de qualité RP ne sont pas directement utili-

sables pour l'analyse résiduelle des hydrocarbures halogénés ; ces solvants
doivent être redistillés dans un équipement en verre avant utilisation. Il est
préférable d'employer des solvants de qualité Inan09rade" ou "pes tipur", actuel-
lement disponibles sur le marché (SOS, MERCK, MALLINKROOT, BURDICK & JACKSON, ... ).
Chaque lot de solvant doit être testé. Après injection de 5 ~l d'une
fraction de solvant pré-concentré 100 fois, il ne devra pas être observé de pic
chromatographique (en dehors de celui du solvant) ou tout au moins, il ne devra
pas être observé de pic dépassant 10 % de l'échelle de l'enregistreur dans les
conditions habituelles de sensibilité de l'appareil.

3.3. Matériaux divers

Les matériaux non combustibles, tels le sulfate de sodium anhydre. la

laine de ver.re, les feuilles d'aluminium sont passés au four à 450°C durant une
.nui;t",,,-,ite&7;;broyeurs sont lavés et ri ncéspa r'}es· sol vants d' extracti on . Les
papiers filtre, sources de contamination, les adsorbants chromatographiques
(florisil, alumine, silica gel) sont extraits par un solvant (hexane) avant
utilisation et séchés au four à 450°C.

4. ECHANTILLONNAGE ET CONSERVATION

Il est absolument essentiel que la verrerie et les récipients utilisés

pour conserver les échanti 11 ons soi ent dépourvus de toutes substances qui puissent
produire des pics d'interférence au cours de l'analyse par chromatographie en
phase gazeuse (cf. § 3). Les plastiques sont à oroscrire car nombre d'entre eux
contiennent des PCB ou autres substances que Jes solvants peuvent extraire.
Le matériel solide (biologique ou sédimentaire) peut être conservé
dans des feuilles d1aluminium ·et congelé à - 20°C avant analyse. Il conviendra
de vérifier préalablement que les feuilles d'aluminium ne contiennent pas de
substances contaminantes.
Les échantillons d'eau doivent être transferrés dans des récipients
en verre. Le délai entre le prélèvement d'eau et la prise d'essai pour l'analyse
doit être le plus court possible pour éviter l'adsorption sur les 'parois. Sauf
température excessive dans un véhicule de transport, le prélèvement peut être
transporté à température ordinaire. La conservation doit se faire au réfrigé-
rateur à 4°C. Pour éviter toute action bactérienne, certains auteurs recommandent
d'ajouter quelques gouttes de chloroforme.

5. EAU DE ~~ER

La principale difficulté dans la recherche des hydrocarbures halogénés

dans l'eau de mer est liée aux faibles concentrations résiduelles trouvées dans
ce milieu (de 1 'ordre du n9/l à quelques dizaines de n9/1). Le choix de la li-
mite de détection détermine la quantité d'eau à extraire, l'importance de la
concentration de 1 'extrait organique avant l'analyse chromatographique ainsi
que le niveau de pureté des réactifs, solvants et verrerie. On conviendra dans
le protocole exposé de considérer l'échantillon d'eau brute. La méthode manuelle
 8.3- V.6

d'extraction directe au moyen d'ampoules à décanter est la plus simple à mettre

en oeuvre et permet compte tenu de certaines précautions opératoires de recher-
cher les résidus organochlorés au niveau du ng/l.

5.1. Matériel et réactifs

Flacons en verre pyrex de deux litres ou bouteilles à vis avec

joints téflon~
- Ampoules à décanter de deux litres~ robinets téflon~

- Pipettes Pasteur,
- Tubes de centrifugation en verre~ gradués, de 15 ml ~

Solvants hexane, éther éthylique~ benzène~

- F1 ori sil,

5.2. Mode opératoire

L'échantillon d'eau de mer (1 à 4 litres) est conservé dans un réci-

pient en verre à 4°C. L'idéal est d'utiliser un flacon de volume égal à celui
de 1'échantillon ana1ysé~ soit deux litres~ de manière à pouvoir utiliser la
totalité du contenu et laver ensuite le flacon vide avec le solvant d'extraction
pour récupérer la fraction résiduelle adsorbée sur les parois.
L'échantillon d'eau est introduit dans une ampoule â dêcanter de deux
litres. Une seconde ampoule permettra de récupérer l'eau partiellement extraite.
Vextraction est réalisée manuellement ou mécaniquement par trois fois 80 ml
d'un mélange hexane / éther éthylique (85 : 15, v/v). Les extraits successifs
sont recueillis et concentrés, avant de procéder à la phase de purification.
Il convient au cours de l 'opération de concentration de prendre cer-
taines précautions pour éviter d'éventuelles pertes résiduelles par distillation.
Les recommandations sont les suivantes :
- L'extrait organique doit être séché sur du sulfate de sodium anhydre.
- La température durant l'évaporation, par exemple dans un évaporateur
rotatif, ne doit pas excéder 50°C. Certains auteurs recommandent
l'utilisation de l'évaporateur du type KUDERNA DANISH.
- L'évaporation à sec n'est pas conseillée.
- Toute condensation d'eau qui contaminerait l'échantillon durant
l'évaporation doit être évitée.
Pratiquement l'extrait est séché sur du sulfate de sodium anhydre,
concentré à 5 ml à l'évaporateur rotatif, puis à 1 ml sous jet d'air ou d'azote
purifiés.
 8.3 - V. 7

La purification de l'extrait concentré est réalisée sur du florisil

activé (450°C, durant une nuit), introduit dans une pipette Pasteur sur une
hauteur de 5 cm. Après fixation de l'extrait au sommet de la colonne, les
résidus organochlorés sont élués pat' 8 ml de benzène. L'éluat est recueilli
dans un tube de centrifugation et concentré à nouveau sous jet d'air ou d'azote
à 0,5 ml. L'extrait organique purifié et concentré est prêt pour l'analyse
chromatographique.

6. SEDIMENT

6.1. Matériel et réactifs

- Bocaux en verre, tamis inox,

- Appareil Soxhlet, agitateur magnétique, appareil à ultra-sons, êtuve,
- Florisil, mercure, laine de verre, erlenmeyer, colonne, petits
tubes gradués,
',",,,,""""'id~"-<_ Solvants : qual Hé pes t i pur (5 bS'-'otJMERCK) .

6.2. Prélèvement et conditionnement

Les prélèvements sont effectués à l'aide d'une benne SHYPECK (fond

> 15 m) ou d'une benne ECKMAN ou WILCO (fond < 15 m). Pour les prélèvements
côtiers, on utilise directement une cuillère en écrémant la surface.
Les échantillons sont stockés dans des bocaux en verre à large col
(type bocaux à conserves), préalablement lavés à l'acétone et l'hexane ; une
feuille d'aluminium lavée à l'hexane est placée entre le col du bocal et le
couvercle. Les échantillons sont congelés à - 20°C dans les meilleurs délais
possibles après le prélèvement.

6.3. Mode oprratoire

6.3.1. ~~~~~9~ (élimination de l'eau interstitielle)

Deux possibilités sont utilisées:
- un séchage à l'étuve (60°C) pendant 48 h,
- une lyophilisation pendant 24 h.
Le séchage à l'étuve peut être recommandé, le risque de contamination
étant beaucoup moins grand que par lyophilisation (retour d'huile a. la pompe, , .. ).
6.3.2. Extraction
Différentes possibilités.
On peut adopter comme méthode de référence celle décrite dans le manuel
RNO: extraction du sédiment sec (ou non) par de l'acétonitrile pendant 16 h (ou
plus), dilution de la phase acétonitrile par cinq volumes d'eau et extraction de
 8.3 - V.8

la phase aqueuse par de l 'hexane. Cette méthode donne un rendement d'extraction

supérieur à une extraction directe dans le Soxhlet par de 1 'hexane~ Il y a
néanmoins un certain nombre de désavnntages particulièrement dans l'utilisation
d'une cartouche d'extraction qui peut être une source de contamination non
négligeable.
Nous avons donc développé un procédé d'extraction quelque peu diffé-
rent : 30 à 40 g de sédiment sec broyé et tamisé (tamis en inox de 1 mm, pour
éviter une trop grande hétérogénéité de l'échantillon) sont introduits dans un
erlenmeyer de 250 ml. On y ajoute 100 ml d'hexane pestipur et un barreau magné-
tique. L'extraction des pesticides s'effectue à l'aide d'une sonde à ultra-sons
plongeant dans 1'hexane et sous agitation magnétique pendant 20 minutes. Cette
opération est répétée une deuxième fois. Les deux extraits sont centrifugés et
concentrés à l'évaporateur rotatif puis sous jet d'air purifié à 1 ml. La puri-
fication s'effectue sur du florisil désactivé avec 5 % d/eau (colonne de
0i = 6 mm, L = la cm). On élue avec 6 à 8 ml d'hexane, puis on concentre à 2 ml.
A cet extrait final on ajoute 0,5 à 1 ml de mercure pour précipiter les composés
soufrés co-extraits. L'extrait purifié est prêt pour l'analyse chromatographique.

7. MATIERE VIVANTE

7.1. Matériel et réactifs

- Lyophilisateur, étuve, homogénéiseur (VIRTIS), centrifugeuse, évapo-

rateur rotatif,
- Papier aluminium, tubes de centrifugation,
- Hexane, acétone (qualité pestipur) , acide sulfurique, alumine.

7.2. Prélèvement et conditionnement

Le matériel biologique est conservé dans des feuilles d'aluminium et

congelé à - 20°C avant analyse.
Dans le cas de mollusques, les parties molles des échantillons sont
séparées de la coquille et soumises à une déshydratation par lyophilisation
pendant 48 heures. Si l'on ne possède pas de lyophilisateur, l'échantillon peut
être séché dans une étuve à 60°C ou par un mélange de sulfate de sodium anhydre.
L'échantillon est ensuite broyé et homogénéisé dans un mortier.

7.3. Mode opératoire

L'extraction est réalisée sur environ la g de poids sec, dans un

homogénéiseur (type VIRTIS) par 50 ml d'hexane pendant 15 minutes. L'opération
est renouvelée une seconde fois. Les deux extraits organiques sont recueillis
et centrifugés à 2 000 - 3 000 tours/minute pour se débarrasser du matériel
particulaire. La phase organique est ensuite concentrée à environ 5 ml à
l'aide d'un évaporateur rotatif.
_ •. ,._ _ ."""'.'""-~_.. -~--~".,~~.,,•. _ '
- -~----"'''-----~'
' - " ~._~"",~"""-,--,,--,,-,,,,----~~,,"~'-"-'
,
""->'''''''"'''-

8.3 - V.9

La phase de purification consiste à éliminer les lipides et autres

matières organiques co-extraites de l'échantillon. La méthode employée est une
méthode destructive qui consiste à précipiter les graisses par addition d'acide
sulfurique concentré (1 à 2 ml). Après agitation~ les deux phases sont séparées
par centrifugation à 3 000 tours/minute rendant la minutes.
L'extrait d'hexane purifié est prêt pour l'analyse chromatographique.
Cette méthode est rapide mais n'est applicable uniquement que pour la recherche
des résidus de l 'HCH~ du DDT et de ses métabolites~ et Qes pea ; par contre, ce
traitement acide détruit la dieldrine et l'endrine.
Si l'on souhaite une recherche des composés de la dieldrine et de
l'endrine, une purification par chromatographie d'adsorption sur alumine selon
la méthode décrite par Holden et Marsden (1969) est conseillée. Une fraction
aliquote de l'extrait or9anique ne contenant pas plus de 200 mg de lipides est
évaporée à 1 ml dans un tube qradué sous courant d'air purifié. L'alumine
basique est activée à 800°C pendant 4 heures~ refroidie dans un dessicateur
et partiellement désactivée par addition de 5 %d'eau distillée après agitation
pendant 30 mn. L'adsorbant est conservé dans un récioient en verre fermé.
Placer 2 g d'alumine ainsi préparée dans une colonne chromatographique
de 0,6 cm de diamètre. Transférer .à·,;,l~i'«~od,'ft:me pipette'i,graduée 1 mldèl"léxtfait
concentré au sommet de la colonne. Eluer par de l 'hexane jusqu'à ce que 20 ml
d'éluat soit recueilli au bas de la colonne. Si la purification n'est pas satis-
faisante, l'opération peut être répétée sur une deuxième colonne d'alumine après
concentration de l 'éluat à 1 ml.

8. ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE

L'identification des hydrocarbures halogénés est réalisée par chroma-

tographie en phase gazeuse à haute résolution. Le chromatographe est équipé dlun
injecteur "split-splitless" ou d'un injecteur solide type de ROS et dlun détec-
teur à capture d'électrons (Ni 53 ). La colonne capillaire de verre (30 m x 0,4 mm)
est imprégnée dlun film silicone non polaire (SE-30). Les conditions opératoires
sont les suivantes :
- Températures :
* injecteur 240°C,
* détecteur 3000e~
* four
température initiale Hmoc~
température finale 240°C~
programmation 2°C/mn.
- Gaz vecteur :
* débit colonne: 2 ml/mn~
* débit purge (injecteur R0S) : 50 ml/mn.
Le pouvoir de résolution de l'analyse chromatographique est donné par
le nombre de plateaux théoriques évalué environ à 50 000 alors qu'il n'est que
de 3 000 sur colonnes remplies.
 8.3 - V.10

L'identification des substances recherchées est réalisée par rapport

à l in ject ion de solutions étalons d'insecticides chlorés et de PCB (les deux
1

types de profils DP-S et DP-6 sont les plus fréquemment rencontrés dans l'en-
vironnement). L'analyse quantitative des insecticides chlorés identifiés est
effectuée en considérant la hauteur de leurs pics chromatographiques caracté-
ristiques. Pour ce qui concerne les PCB, les hauteurs des cinq principaux pics
chromatograohiques seront additionnées (profil DP-S : pics 5 + 8 + 13 + 14 + 19
profil DP-6 : pics 9 + 10 + 12 + 20 + 21 -figures 3 et 4-).

9. METHODE DE CALCUL. LIMITES DE DETECTION

Soit :
- v : volume de l'extrait final purifié (ml),
- v' : volume injecté (~l),
- X : quantité détectée dans le volume injecté (pg).
La quantité résiduelle présente dans le volume de l'extrait final
purifié est, donc de
v
X- (ng)
Vi

La concentration résiduelle dans l'échantillon analysé sera

"

Echantillon Quantité Concentration

analysée rés i duelle
v 1
Eau de mer V (litres) X- - (ng/l)
Vi V

v 1
Sédiment (*) P (grammes) X- - (ng/9)
v' P
v 1
Matière vivante (*) P (grammes) - - (n9/9)
Vi P

(*) : échantillon sec.

Les limites de détection pour le lindane, le DDT et les PCB sont
données à titre indicatif sur la base des quantités minimales détectables par
chromatographie (lindane : 10 pg ; DDT: 20 pg ; PCB : 100 pg) et des condi~
tians opératoires d'analyse.
 8.3 - V.ll

r---. r-----
Volume de Volume
l'extrait final injecté Limites de détection
Echantillon purifié
V (ml)
v' (111 ) Lindane DDT PCB
Eau de mer 0,5 ml 5 1J1 0,5 ng/1 1 ng/1 5 ng/1
(V : 2 litres)
Sédiment (sec) 1 ml 5 111 0,05 ng/g 0,1 ng/9 0,5 ng/g
(P : 40 g)
Matière vivante (sèche) \
5 ml 5 IJ 1 1 ng/g 2 ng/g
(P : la g) 10 ng/9

10. TESTS DE CONFIRMATION

L'attaque acide et la saponification a chaud de l'extrait final

_purifié sont les deux tests de copfirmation chil11ique les plus couramment
utilisés.

10.1. Test: attaque acide (H 2 S0 4 )

Résidus concernés: dieldrine, endrine.

Principe: L'attaque acide détruit les résidus de dieldrineet
d'endrine. Cette méthode qui est utilisée comme procédé de purification est
décrite dans le chapitre "Matière vivante".

10.2. Jest : saponification a chaud

Résidus concernés: DDT, 000 et les isomères de l'HCH.

Principe: Le DDT et le 000 sont transformés en leurs dérivés éthy-
léniques correspondants (ODE, DDMU). Les isomères de l'HCH sont détruits.
A 2 ml d'extrait d'hexane concentré, contenu dans un tube de centri-
fugation de 10 ml, sont ajoutés 2 ml d'éthanol (96 %) et 2 pastilles de potasse
(KOH). L'ensemble est porté à 50°C pendant 1/?. heure sous reflux puis refroidi.
La phase hexane/éthanol est ensuite "cassée" par addition de 4 ml d'eau distil-
lée. Après agitation et centrifugation la phase d'hexane peut être injectée
dans le chromatographe.

Il. PREPARATION DES SOLUTIONS ETALONS

Un schéma de préparation de solutions étalons d'hydrocarbures halogê-

nés est proposé ci-après. Ces solutions doivent être conservées dans des fioles
volumétriques, à basse température dans un réfrigérateur.
 8.3 - V.12

Opération préliminaire: dissoudre 50 mg de résidus organochlorés

dans 50 ml d'hexane (concentration: 1 000 ~g/ml).

Solution
D;eldr;ne ~ sm_l ~ dieldr;ne
(500 ml)

a-HCH
Solution Solution
y-HCH seconda ire 5ml étalon
Premi ère A A
dilution (500 ml) (20 ml)
Al dri ne (50 ml)

Solution
commune
(500 ml)

DDE
Solution Solution
secondaire Sml êtalon
DDD B B
(500 ml) (20 ml)
DDT
Solution Solution
5ml secondaire Sml étalon
PCB (DP-5)
PCB PCB (*)
(500 ml) (100 ml)

(*) : Mêmes opérations avec DP-4 et DP-6.

Les solutions étalons A et B contiennent les concentrations suivantes
(pg/~l) : a-HCH = 10, y-HCH = 10, aldrine = 20. heptachlore époxyde = 20.
DDE = 50. dieldrine = 50 (solution A). DDD = 50, DDT = 50. La solution étalon
de PCB contient 500 pg/~l.
 8.3 - V.13

w
z
g; ECHANTILLON 1
.J
W
ëi 1 OC -A
[pcs:DP~ w
o
( 1,3 ng) o
-0.
0.

.
w
z
o
Z
.J
lU
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o
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J:
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1" , IpCB.DP~ 1 1 ECHAN.TILLON : OC-D
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( 1,26ngl
1
pee: DP-5 + lindone ,
'l' 16 1
, Heptochlore,'Aldrine,
,,
1
: le ,
5 :: la pp' ODE, pp' 000,
l' pp' DOT
l'
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Il Il
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1 PCB. DP-=-G] 1:1, 1 1
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1 l , "'-~"'I- - - - - -
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'1

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'1 ECHANTILLON:
, 14 OC-B
112 17 IY
1 PCB:OP-5
;""-'~--..J
23
,
1
"
1
Il

v \J VJ ~_,J- _
FIG. 1. - Analyse chromafOgraphiquc sur colonne remplie FIG. 2. - Analyse chroma/Ographique sur colonne remplie
(9 % aV-lOI sur chromosorb \V). (9070 aV-lOI sur chromosorb W).

FIG. l, - Chrolllu(ogruphic i/nolysis on l'od.ed ('o/tll/I!/s FI(;. 2. - Chromatographie analysis on paeked eolumns
(9 % UV-lOI on chrolllusllrb W). (9 % aV-loI on chromosorb W).
 8.3 -V.14

8
PCBCDP-S) '"
Lindi'+ne
Heptachlore
Lindane Aldrine
lJ
Heptach lore ppDDE
Aldrine PCBCDP-S) 1
ppDDD
lJ
ppDDE ppDDT
ppDDD
ppDDT
ï "
a
,.
1 o
o

,.
o

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Fil,. ·k - ChrulflullIgruphic aflulyses 011 S/::;·30 WCOT glass capi/lary column.
 8.3 - V. 15

BIBLIOGRJI.PHIE

BERTHOU, F. 1981. Etat actuel des procédés de préparation des colonnes capillaires
de verre. Spectra 2 000, .64 (9) et 65 (9), 17 pp.
CAPRAIS, J.Cl., MARCHAND M. 1981. Identification des organochlorés à haut poids
moléculaire par chromatographie en phase gazeuse sur colonnes capillaires.
Analusis, ~ (4), 140-144.
HOLDEN, A.V., K. MARSDEN. 1969. Single-stage clean-up of animal tissue extracts
for organochlorine residue analysis. J. Chromatogr., 44, 4RI-492.
RNO. 1977. Manuel des méthodes de prélèvements et d'analyses, tome ?- : Micropol-
luants organiques et minéraux. Ministère de la Qualité de la Vie - CNEXO, 19-52.
 8.4. Annexe v,4

PROTOCOLE DE MINERALISATION DU SEDIMENT

POUR L'ANALYSE DES METAUX ADSORBES
(Fe, Mn, Cu, Zn, Cd, Pb, Co, Cr, Ni)

- 0,5 g à 1 g de fraction de sédiment < '3 ~m dans un creuset en silice ou dans

un bécher:: .. pyrex" {)l.I ~"'/~...,. . , ) .
- ,.,.."",J,/" 1't"{i'-klllJ4't (./-2u d.I,I/" ,
1110

- Ajouter 2 cc HCl (la qualité "pour analyse" est suffisante pour l'analyse des
métaux liés au sédiment). Si l'échantillon est de nature calcaire, ces 2 cc
doivent être ajoutés petit à petit (risques de bouillonnement et débordement
de l'échantillon).
- Ajouter 4 cc HN0 3 (la qualité "pour analyse" est suffisante).
- Recouvrir le creuset d'un verre de montre.
- Chauffer.à !:: aO-90°C jusqu'à évaporation de HCl (= 1-2 heures) sur une plaque
chauffante ';+., F~rmti on de vapeurs rousses.
- Porter la température à 120-130°C ; HN0 3 doit bouillonner doucement.
- Poursuivre ce chauffage jusqu'à la disparition totale ou presque totale des
vapeurs rousses (2-3 heures selon la quantité de matière organique contenue
par le sédiment).
- Ajouter 3 cc HN0 3 •
- Chauffer à 120-130°C pendant!:: 1-2 heures.
- Enlever le verre de montre.
Evaporer à sec à 120-130°C (ceci peut constituer, selon la nature du sédiment,
la phase la plus délicate de l'opération. En effet, au cours de l'évaporation,
la solution de minéralisati'on s'épaissît, et peut former une pellicule à sa
surface empêchant l'évaporation des vapeurs nitreuses sous-jacentes. Lorsque
la pression de ces vapeurs augmente, des projections peuvent se produire
entraînant des erreurs d'analyse par défaut. Ceci peut être évité en agitant
manuellement les creusets lors de la phase d'épaissement.
- Lorsque tout HN0 3 est évaporé, et que le creuset a refroidi: ajouter 1 cc HC1.
Laisser s'imprégner le résidu de minéralisation (au besoin, aider avec une
fine tige de verre).
- Ajouter 9 cc H;O distillée. Homogénéiser avec une fine tige de verre.
- Centrifuger dans des tubes coniques pendant 5-10 minutes à 3000-4000 tr/min.
Selon la nature du sédiment, la filtration est possible.
- Surnageant limpide ~ Solution mère pour analyse directe ou pour dilutions
adéquates en fonction des métaux à analyser.

J.}... \of AR.'ti N'

8.5. Annexe V,5

PROPOSITION POUR LA SURVEILLANCE ËCOLOGIQUE

DE L'ICHTYOFAUNE DE LA LAGUNE EBRIË

La !~u~iillance écologique de l 'ichtyofaune d'un milieu peut

être envisagée à trOis niveaux différents et complémentaires
Le peupl~mènt , on s'efforcera de mettre en évidence les modifications
pouvant$qtvenir dans la composition, la structure et la biomasse des
peuplements.
2°) Les populations, on évaluera les modific!1tjons,p.Ol./vantsurvenirdans
............' - - _ - . . , . _ . .. -'." - -. .:;.,/t.~r.-i::~:·":"--L:.~~~:,-"~-:-~~-' - -. - -" .". .

la valeur des principaux paramètres biologigues caractéristiques de

certaines populations (croissance, fécondité ... ).
Enfin on effectuera une surveillance physio-pathologique des individus
(en particulier dosage des substances toxiques au sein des différents
tissus et/ou organes de poissons appartenant aux principales espèces
commercialisées) ..

Les trois points (mais en particulier les 2 premiers) nécessi-

tent une connaissance approfondie des conditions "normales" de fonctionne-
ment de l'écosystème.

aO) En ce qui concerne la composition et la structure des peuplements

ichtyologiques, une étude synécologique actuellement en voie d'achève-
ment constitue une bonne base de référence. Elle montre en particulier
que le milieu lagunaire Ebrié est, en ce qui concerne l'ichtyocoenose,
d'une grande complexité de fonctionnement liée à une diversité et une
variabilité spatio-temporelle extrême et qu'il convient de distinguer
- très schématiquement - le secteur abidjanais sous forte influence
.
marine (grossièrement. de la digue de Jacqueville à l'extrémité est de
Petit Bassam) du reste de la lagune.
Outre une bonne connaissance "initiale" du milieu il faut pour réaliser
une bonne surveillance des peuplements. disposer d'un protocole adapté
fondé sur la réalisation de pêches expérimentales au moyen d'une tech-
nique peu sélective et d'une reproductibilité satisfaisante.
 - 2 -

La senne tournante, qui a fourni l'essentiel des' données de l'étude

de référence, parait bien adaptée. Cependant, son uti 1i sation s'es t
révélée logistiquement fort lourde et une couverture lien routinellde
l'ensemble du réseau lagunaire semble difficilement envisageable.
Par contre, le choix de quelques stations représentatives semble pos-
sible. Il convient en particulier de suivre le secteur abidjanais
dont l'importance écologique et économique a déjà été soulignée
(ALBARET 1980, projet UNESCO) de même que sa complexité liée à
une très forte variabilité (crues, saisons marines, marées ... ).
En conséquence seules pourront être appréhendées des modifications
drastiques de la nature et/ou de la structure des peuplements liés à
une péjoration grave des conditions de ce milieu soumisà de nombreuses
agre~sions.

Nous disposons d'une bonne série de données relatives à la baie de

Cocody (suivie mensuellement, pendant 18 mois à raison de 5 stations
par moi s) qu' i 1 convi ent de prolonger au même rythme. De plus, 1a ba i e
de Biétri siège d'une pollution importante (et objet d'une attention
toute particulière des chimistes, devrait être suivie au même rythme
ainsi que le chenal central ou la région portuaire.
En ce qui concerne le reste de la lagune quelques stations environ
·unedizaine pourraient être suivies bimestrie11ement.

bO) L'étude de 1lévo1ution de certains paramètres biologiques (de crois-

sance et de reproduction notamment) peut dans URe certaine mesure,
permettre d'évaluer l'impact des pollutions sur les populations ichty-
alogiques. Cependant, et compte tenu de variations importantes (saison-
nières et individuelles surtout), une connaissance très fine"de la
biologie des espèces choisie s'avère nécessaire afin de pouvoir diffé-
rencier ce qui relève de la variabilité roca1e, saisonnière ou indivi-
duelle de ce qui est (éventuellement) imputable à une dégradàtion des
conditions de milieu. De plus, il est inconcevable d'isoler un quelconque
paramètre et clest en termes de stratégie que doit être posé le problème .

. . ./ ...
 l
~'
ik . -3 -

En effet/et par exemple/l'évaluation même très preclse de la fécondité

unitaire individuelle ne sert de rien pour l'évaluation de la fécondité
d'une population, si l'on ignore les modifications quant au nombre de
pontes annuelles, à la taille de première maturité ou encore au sex-
ratio.
On aura donc soin de choisir quelques espèces dont certains aspects de
l'écologie et la biologie seront bien et précisément connues. A titre
d'exemple une étude fine de la reproduction des deux espèces de Tilapia
lagunaires est en cours, appréhendant les variations locales et saison-
nières de fécondité,. la taille de première maturité (dans la nature et
en élevage), les variations de sex-ratio, etc ...
• "t; . :.. -,'C",' .c .. ,~ ."

cOlle troisième volet concerne la recherche des zones d'accumulation et

le dosage de substances toxiques (métaux lourds, pesticides ... ) au sein
des organismes de poissons appartenant à des espèces se situant à
différents niveaux de la pyramide trophique (ou en bout de chatnes
trophiques différentes).
Il semble le plus facile à réaliser pratiquement et fournir les résultats
les plus immédiatement utilisables.
En fonction de ce que l'on sait de la biologie et l'écologie (régime
alimentaire, relations trophiques en particulier) on sélectionnera 4
à 5 espèces sur lesquelles seront prélevés les organes (foie, gonades,
muscles) destinés aux dosages.

1 Prédateur ichtyophage (Sphyraena ou Epinephalus

ou Elops par exemple).

1 Malacophage (C~rysichthys ou Tylochrom~s).

1 Filtreur (Ethmalosa).

1 Mangeur benthique détritivore (Gerres).

J.J. ALBARET
 Mode opératoire

Test présomptif
Ensemencer le nombre choisi de tubes de milieu de Rothe (constituant
Principe les tubes « primaires »), en utilisant soit du milieu à double concentration
00
(pour les ensemencements de 10 ou 50 ml) soit du milieu à simple concen· •0\
Les principes généraux de cette méthode sont ceux décrits dans l'exposé tration (pour les ensemencements de 1 ml d'eau ou de dilution de l'eau). •
de la colimétrie en milieux liquides. Cependant, alors que le tube primaire Veiller à ce qu'aucune évaporation ne se soit produite dans le milieu depuis P>
:;j
contient déjà une certaine quantité d'azide de sodium, le repiquage des sa préparation, car celle-ci entraînerait une concentration des produits :;j
(Il
tubes « positifs» sur un milieu nettement plus inhibiteur (plus forte concen- inhibiteurs. Homogénéiser soigneusement, par agitation, le contenu des ~
(Il
tration en azide de sodium et présence d'éthyl violet), ne laisse se déve- tubes; s'assurer, une fois cel,le-ci terminée, que la teinte du bouillon est
lopper que les streptocoques fécaux. uniforme en haut et en bas dil tube, de façon à ce que la concentration en Z ..<
~
0\
inhibiteur soit identique en tous points.
t'1
Incuber les tubes à 37°C et l*s examiner après 24 et 48 heures. Les tubes
~
Milieux de culture
présentant un trouble micr~bien pendant cette période sont présumés ~
H
- Milieu de Rothe normal. con.tenir un streptocoque féc\il et sont soumis au test confirmatif. 0
Z
Dans 1 litre d'eau distillée, dissoudre par chauffage doux
Test confirmatif 0
peptone. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 20 g t'1
CIl
glucose '" . .. . . .. .. .. .. 5 g Après agitation des tubes positifs, prélever sur chacun d'eux successivement
chlorure de sodium......... .. . . .. . .. .. . .. .. .. . . .. .. .. .
phosphate dipotassique... .. ..... .. .. . .. .. ... .. . .. . .. .. ..
5
2,7
g
g
3 oses bouclées (de 3 mm de diamètre) ou quelques gouttes de pipette t'1
Z
CIl
~
:::a
phosphate monopotassique.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,7 g Pasteur, et les reporter dans ties tubes de milieu de Litsky A l'éthyl violet t'1
~
azothydrate de sodium................................. 0,2 g tA
et azide de sodium. Incuber 37°C pendant 24-48 heures. H
l":' 0
"tl
~

H C)
Ajuster le pH à 6,8-7. Répartir (l0 ml exactement) dans des tubes de 160x 16 mm. t'1 0
L'apparition d'un trouble mitrobien confirme la présence d'un strepto- c::.o
Stériliser 20 minutes à l'autoclave à 120"C.
- Milieu de Rothe double concentration.
coque fécal. Parfois la culture s'agglomère au fond du tube en fixant le t"' ~
colorant et en formant une pastille violette de signification identique A H CIl
Procéder de la même manière, mais en doublant la masse des réactifs. Le pH doit être '8t'1
compris entre 6,8 et 7. Répartir en tubes de 220x22mm (lOml) ou en tubes de celle du trouble. H ~
Avec un milieu parfaitement préparé il n'y a pratiquement pas de fausses 0
330 x 33 mm (50 ml). Stériliser 20 minutes à l'autoclave à 1200c. t'1 0
Ces deux milieux doivent être mis à l'abri de toute évaporation; ne pas utiliser de bouchon réactions. Éventuellement c0l1-trôler le diagnostic bactériologique par un t'1
CIl
de coton. Ils existent commercialement sous forme déshydratée ou prêts à l'emploi. simple examen microscopique/; (direct ou après coloration de Gram) qui CIl
doit faire apparaitre la présence de Cocci à Gram positif, en courtes ~
- Milieu de Litsky.
Dans 1 litre d'eau distillée, dissoudre par chauffaae doux : chaînettes ou en diplocoques: et l'absence de bacilles A Gram positif, ~
"tl
qui pourrait faire soupçonneria présence de Boeil/us, germes responsables ~
peptone. •. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 20 'g 0
C)
des fausses réactions les plus fréquentes. 0
glucose , . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 5 g
.0
chlorure de sodium... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g c::
phosphate dipotassique , 2,7 g Expression des résultats. Choix des prises d'essai t'1
CIl
phosphate monopotassique... . . .. .. .. .. .. . .. . . 2,7 g
l'%:l
azothydrate de sodium....... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0, 3 g Les résultats de dénombrement des streptocoques fécaux sont exprimés t'1
solution d'éthyl violet. " 5 ml environ
comme ceux d' Escherichia coli en nombre de germes par 100 ml. &;
Répartir (10 ml) dans des tubes de J60xI6mm. Stériliser à l'autoclave à 1200C. n est souhaitable de préciser « nombre le plus probable» avant le nombre ~
Existe commercialement sous forme déshydratée ou prêt à l'emploi. La teneur en éthyl
violet doit être déterminée en préparant des milieux de teneur variable (3,5-4-4,5-5- représentant le résultat et d'indiquer à la suite les résultats extrêmes dans
5,5-6-6,5 mlfl) et en les ensemençant d'un Bacillus subtilis, d'un Streptococcus fecalis la limite de confiance de 95 % donnée par les tables.
ou d'un Streptococcus havis. La teneur à retenir est celle pour laquelle la culture de Bacil/us Le même type d'ensemencement utilisé pour E. coli peut être employé,
est inhibée, alors que les Streptocaccus sc développent. pour un même type d'eau, pour les streptocoques fécaux.