Matière: Biochimie Dr.
Ridha Aichour, TP 3 : Dosage des protéines totales dans un
blanc d’œuf par la méthode du biuret
TP 3 : Dosage des protéines totales dans un blanc d’œuf par
la méthode du biuret
Principe
La technique de biuret tire son nom de la molécule de biuret NH2-CO-NH-CO-NH2
(obtenu par condensation de 2 molécules d’urée NH2-CO-NH2 avec départ
d’ammoniac)
Le but de la manipulation est de déterminer la concentration en protéines du blanc
d'œuf par la méthode de biuret qui met en évidence la présence des liaisons
peptidiques.
En milieu alcalin, à froid, les ions cuivriques (Cu2+) forment avec les liaisons
peptidiques un complexe de coordination coloré en rose, qui ajouté à la teinte bleue
du réactif donne finalement une coloration pourpre (bleu-violet). Cette réaction est
positive dès que la molécule possède 3 à 4 liaisons peptidiques, elle est donc utilisable
pour les protéines et les polypeptides. La mesure de l’absorbance se fait à 540 nm
après avoir laissé la coloration se développer 30 min. L’intensité de la coloration est
proportionnelle à la concentration des protéines.
Complexe entre Cu et liaison peptidique (Wikipédia)
Matériel et réactifs
- Spectrophotomètre.
- Eau physiologique : solution contenant 9g de chlorure de sodium (NaCl) dans 1L
d’eau distillée.
- Solution (BSA) à 10 g/L dans de l'eau physiologique.
- Solution (s) inconnue (s) d’albumine (nous utiliserons le blanc d’œuf).
Réactif de Gornall :
-Sulfate de cuivre qui donne la coloration bleu du réactif due aux ions cuivre CuSO4,
5H2O (1,5g)
-NaOH qui rend le milieu basique (30g)
-Tartrate double de sodium et de potassium, qui « chelate » (piège) le ions Cu2+ et
évite leur précipitation en milieu basique sous forme d'hydroxyde de cuivre Cu (OH)2
insoluble (6g)
-Iodure de potassium (KI), pour éviter la réduction du cuivre et assurer ainsi la
stabilité du réactif (1g)
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Matière: Biochimie Dr. Ridha Aichour, TP 3 : Dosage des protéines totales dans un
blanc d’œuf par la méthode du biuret
Préparation de la gamme étalon
A partir de la solution étalon de BSA à 10 g/L, réaliser une gamme de 5
tubes (tubes n° 1-5) contenant de 2 à 10 mg de BSA par tube. Le tube 0 étant le
témoin.
Préparation de la solution de blanc d'œuf
- Peser un blanc d'œuf.
- Mettre en solution dans un litre d'eau physiologique (solution S).
- Dans deux tubes à essais, numérotés 6 et 7, introduire 1 ml de la solution S (dans le
but d'effectuer le dosage en double).
- Ajouter simultanément dans les 8 tubes (les 6 tubes de la gamme étalon de 0 à 5 et
les deux tubes de dosage 6 et 7) 4 ml de réactif de Gornall.
- Homogénéiser et laisser reposer 30 min à l’obscurité et à température ambiante.
- Lire l’absorbance de tous les tubes à A=540 nm contre le témoin de la gamme en réglant
le zéro optique avec le tube n° 0 (tube blanc ne contenant pas de protéines).
Tubes à essais (N°) 0 1 2 3 4 5 6 7
Solution BSA 10 g/l en 0 _ _
(ml)
Solution S en (ml) _ _ _ _ _ _ 1 1
Eau physiologique (ml) 1 _ _
Réactif de Gornall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4
DO à540 nm
Quantité de protéines
par tube (mg)
1- Sur papier millimétré, tracer la courbe d'étalonnage : DO= f ([BSA]).
2- Déduire la concentration en protéines (exprimée en g/L) dans la solution S puis en
déduire la teneur en protéines pour 100 g de blanc d’œuf.
3- Conclure.
4- Pourquoi on n’a pas fait de dilution en ce qui concerne la solution S.
Données: Composition moyenne du blanc d'œuf:
- eau: 85 %, glucides 0,8 %, protéines: 12,9 %, sels minéraux: 1,0 %, lipides: 0,3 %.
