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NORME ISO
INTERNATIONALE 6888-1

Première édition
1999-02-15

Microbiologie des aliments — Méthode

R
horizontale pour le dénombrement des

O
staphylocoques à coagulase positive

N
(Staphylococcus aureus et autres

IA
espèces) —
Partie 1:
v e
Technique utilisant le milieu gélosé
si

de Baird-Parker
u
cl

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
ex

enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus

and other species) —
Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium
té
rié
op
Pr

A Numéro de référence
ISO 6888-1:1999(F)
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ISO 6888-1:1999(F)

Sommaire
1 Domaine d’application ............................................................................................................................................ 1

2 Références normatives ........................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions............................................................................................................................................... 1

4 Principe..................................................................................................................................................................... 2

5 Diluant et milieux de culture................................................................................................................................... 2

6 Appareillage et verrerie ........................................................................................................................................... 5

7 Échantillonnage ....................................................................................................................................................... 6

8 Préparation de l'échantillon pour essai................................................................................................................. 6

R
9 Mode opératoire ....................................................................................................................................................... 6

O
10 Expression des résultats ...................................................................................................................................... 8

N
11 Fidélité .................................................................................................................................................................. 10

IA
12 Rapport d'essai .................................................................................................................................................... 10
v e
Bibliographie ............................................................................................................................................................. 11
u si
cl
ex
té
rié
op
Pr

© ISO 1999
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
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Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.

Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.

R
O
La Norme internationale ISO 6888-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie.

N
Cette première édition de l’ISO 6888-1, ensemble avec l’ISO 6888-2, annule et remplace l’ISO 6888:1983 qui a fait

IA
l’objet d’une révision technique. e
L’ISO 6888 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres
v
espèces):
si
u

 Partie 1: Technique utilisant le milieu gélosé de Baird-Parker

cl

 Partie 2: Technique utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène

ex
té
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Pr

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0 Introduction

0.1 En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que cette méthode horizontale ne soit
pas applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à
ces produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons techniques justifiées.
Néanmoins, il convient que tous les efforts soient faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que
possible.

Lors du prochain réexamen périodique de la présente partie de l'ISO 6888, il sera tenu compte de toutes les
évolutions intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été
suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.

L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait, il peut déjà
exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne concordent pas avec

R
la présente méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner

O
avec les prescriptions de la présente partie de l'ISO 6888 et de ne conserver que les seules divergences justifiées
indispensables pour des raisons techniques.

N
0.2 L’ISO 6888 décrit deux méthodes horizontales (partie 1 et partie 2) pour le dénombrement des staphylocoques

IA
à coagulase positive, parmi lesquels se rencontrent les souches entérotoxinogènes. Il s'agit principalement de
Staphylococcus aureus, mais également de S. intermedius et de certaines souches de S. hyicus.
v e
Dans le cas général, utiliser la partie 1 de l'ISO 6888. Cependant, il est préférable d'utiliser le mode opératoire décrit
dans la partie 2 (voir la référence [1]) uniquement pour les denrées alimentaires (telles que les fromages au lait cru
si

et certains produits carnés crus) susceptibles d'être contaminées par

u


cl

des staphylocoques formant des colonies non caractéristiques sur milieu gélosé de Baird-Parker;
ex

 une flore annexe pouvant masquer les colonies recherchées.

0.3 Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 6888, la confirmation des staphylocoques repose sur une
té

réaction positive à la coagulase, mais il est reconnu que certaines souches de Staphylococcus aureus donnent une
réaction faiblement positive à la coagulase. Ces dernières souches peuvent être confondues avec d'autres
rié

bactéries; il est possible d'en faire la distinction par des essais complémentaires non inclus dans la présente partie
de l'ISO 6888, telles la sensibilité à la lysostaphine, la production d’hémolysine, de nucléase thermostable et d’acide
op

à partir de mannitol (voir la référence [2]).

Pr

iv
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NORME INTERNATIONALE © ISO ISO 6888-1:1999(F)

Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour

le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
(Staphylococcus aureus et autres espèces) —
Partie 1:
Technique utilisant le milieu gélosé de Baird-Parker

1 Domaine d’application

R
O
La présente partie de l'ISO 6888 spécifie une méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à
coagulase positive dans les produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale, par

N
comptage des colonies obtenues sur milieu solide (milieu de Baird-Parker) après incubation en aérobiose à 35 °C

IA
ou 37 °C.
e
2 Références normatives
v
si

Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui par suite de la référence qui y est faite,
u

constituent des dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 6888. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
cl

aux accords fondés sur la présente partie de l'ISO 6888 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
ex

éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur à un moment donné.
té

ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
rié

décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales.
op

ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques.
Pr

3 Termes et définitions

Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 6888, les termes et définitions suivants s'appliquent.

3.1
staphylocoques à coagulase positive
bactéries formant des colonies caractéristiques et/ou non caractéristiques à la surface d'un milieu de culture sélectif
et donnant une réaction positive à la coagulase, lorsque l'essai est effectué selon la méthode spécifiée dans la
présente partie de l'ISO 6888

3.2
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
détermination du nombre de staphylocoques à coagulase positive trouvé par millilitre ou par gramme d'échantillon,
lorsque l'essai est effectué selon la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 6888

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4 Principe

4.1 Ensemencement en surface d'un milieu gélosé sélectif coulé dans deux séries de boîtes, avec une quantité
déterminée de l'échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou de la suspension mère dans le cas
d'autres produits.

Dans les mêmes conditions, ensemencement des dilutions décimales obtenues à partir de l'échantillon pour essai
ou de la suspension mère, à raison de deux boîtes par dilution.

4.2 Incubation de ces boîtes à 35 °C ou à 37 °C 1) en aérobiose et examen après 24 h et 48 h.

4.3 Calcul du nombre de staphylocoques à coagulase positive par millilitre ou par gramme d'échantillon, à partir du
nombre de colonies caractéristiques et/ou non caractéristiques obtenues dans les boîtes retenues aux niveaux de
dilution donnant un résultat significatif, et confirmées par un résultat positif de l'essai de la coagulase.

5 Diluant et milieux de culture

R
5.1 Généralités

O
N
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218.

IA
5.2 Diluant

Voir l'ISO 6887-1 et la norme spécifique du produit à examiner.

v e
5.3 Milieu gélosé de Baird-Parker2)
u si

NOTE Des milieux commercialisés peuvent être utilisés. Dans ce cas, il convient de se conformer strictement aux
prescriptions du fabricant.
cl
ex

5.3.1 Milieu de base

5.3.1.1 Composition
té

Digestat pancréatique de caséine 10,0 g

rié

Extrait de levure 1,0 g

op

Extrait de viande 5,0 g

Pyruvate de sodium 10,0 g
Pr

L-Glycine 12,0 g
Chlorure de lithium 5,0 g
Agar-agar 12 g à 22 g a
Eau, pour obtenir un volume final de 1 000 ml
a Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.

1) La température fait l'objet d'un accord entre les parties intéressées et est indiquée dans le rapport d'essai.

2) Le milieu gélosé est celui de Baird-Parker (voir la référence [3]) avec addition de sulfamézathine (voir la référence [4]) dans
le cas où l'on suspecte la présence de Proteus.

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5.3.1.2 Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau, en portant à ébullition.

Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C.

Répartir le milieu, par quantités de 100 ml, dans des flacons ou fioles (6.5) de capacité appropriée.

Stériliser le milieu à 121 °C pendant 15 min.

5.3.2 Solutions

5.3.2.1 Solution de tellurite de potassium

5.3.2.1.1 Composition

Tellurite de potassium a (K2TeO3) 1,0 g

Eau 100 ml

R
a Il est recommandé de s'assurer au préalable que le

O
tellurite de potassium dont on dispose convient pour cet essai
(voir 5.3.2.1.2).

N
IA
5.3.2.1.2 Préparation

Dissoudre complètement le tellurite de potassium dans l'eau, en chauffant le moins possible.

v e
Il convient que la poudre soit rapidement soluble. Si un composé blanc insoluble est présent dans l’eau, ne pas
si

retenir la poudre.
u

Stériliser par filtration sur des membranes de 0,22 µm de porosité.

cl
ex

La solution peut être conservée au maximum 1 mois à +3 °C ± 2 °C.

Éliminer la solution si un précipité blanc se forme.

té

5.3.2.2 Émulsion de jaune d’œuf (à une concentration d'environ 20 % ou selon les instructions du fabricant)
rié

NOTE Si une préparation commerciale est disponible, il convient de l’utiliser.

op

Utiliser des œufs frais de poule à coquille intacte. Nettoyer les œufs avec une brosse à l'aide d'un détergent liquide.
Les rincer à l'eau courante puis désinfecter les coquilles, soit en les plongeant dans l'éthanol à 70 % (fraction
Pr

volumique) pendant 30 s et les laissant sécher à l’air, soit en les pulvérisant d'alcool suivi de flambage.

En opérant de façon aseptique, casser chaque œuf et séparer le jaune du blanc par transferts répétés du jaune
d'une demi-coquille dans l'autre. Placer les jaunes dans un flacon stérile (6.5) et ajouter quatre fois leur volume
d'eau stérile. Mélanger vigoureusement. Chauffer le mélange dans le bain d'eau (6.4) réglé à 47 °C pendant 2 h et
entreposer à +3 °C ± 2 °C pendant 18 h à 24 h pour laisser se former un précipité. Recueillir aseptiquement le
liquide surnageant dans un flacon récemment stérilisé pour l’utilisation.

L'émulsion peut être conservée 72 h au maximum à +3 °C ± 2 °C.

5.3.2.3 Solution de sulfamézathine (sulfaméthazine, sulfadimidine)

NOTE À être utilisée seulement dans le cas où l'on suspecte la présence d’espèces de Proteus dans l’échantillon pour
essai.

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5.3.2.3.1 Composition

Sulfamézathine 0,2 g
Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 0,1 mol/l 10 ml
Eau 90 ml

5.3.2.3.2 Préparation

Dissoudre la sulfamézathine dans la solution d'hydroxyde de sodium.

Compléter à 100 ml avec de l'eau.

Stériliser par filtration sur des membranes de 0,22 µm de porosité.

La solution peut être conservée au maximum 1 mois à +3 °C ± 2 °C.

5.3.3 Milieu complet

R
O
5.3.3.1 Composition

N
Milieu de base (5.3.1) 100 ml

IA
Solution de tellurite de potassium (5.3.2.1) 1,0 ml
Émulsion de jaune d'œuf (5.3.2.2) 5,0 ml
v e
Solution de sulfamézathine (5.3.2.3) (si nécessaire) 2,5 ml
si

5.3.3.2 Préparation
u
cl

Faire fondre le milieu de base, puis le refroidir à environ 47 °C au moyen du bain d'eau (6.4).
ex

Ajouter, de façon aseptique, les deux autres solutions (5.3.2.1 et 5.3.2.2) et, si nécessaire (si l’on suspecte la
présence d’espèces de Proteus dans l’échantillon pour essai), la solution de sulfamézathine (5.3.2.3), chaque
té

solution étant préalablement réchauffée au bain d’eau à 47 °C, en mélangeant soigneusement après chaque
addition.
rié

5.3.4 Préparation des boîtes de milieu gélosé

op

Couler la quantité nécessaire du milieu complet (5.3.3), dans des boîtes de Petri stériles de façon à obtenir une
épaisseur de gélose d'environ 4 mm, et laisser se solidifier.
Pr

Les boîtes peuvent être conservées, avant séchage, 24 h au maximum à +3 °C ± 2 °C.

NOTE Pour la durée de conservation de boîtes préparées industriellement, il convient de suivre les instructions du fabricant.

Avant utilisation, sécher les boîtes, de préférence avec le couvercle enlevé, et avec la surface de la gélose tournée
vers le bas, dans une étuve réglée entre 25 °C et 50 °C, jusqu’à disparition des gouttelettes à la surface du milieu.

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5.4 Bouillon cœur-cervelle

5.4.1 Composition

Digestat enzymatique de tissus animaux 10,0 g

Extrait déshydraté de cervelle de veau 12,5 g
Extrait déshydraté de cœur de bœuf 5,0 g
Glucose 2,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Hydrogénorthophosphate disodique anhydre (Na2HPO4) 2,5 g
Eau 1 000 ml

5.4.2 Préparation

R
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau, en chauffant si nécessaire.

O
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C.

N
Répartir le milieu de culture, par quantités de 5 ml à 10 ml, dans des tubes ou fioles (6.5) de capacité appropriée.

IA
Stériliser le milieu à 121 °C pendant 15 min. e
5.5 Plasma de lapin
v
si

Utiliser un plasma déshydraté de lapin, disponible dans le commerce, et le réhydrater en se conformant aux
instructions du fabricant.
u
cl

Si l'on ne peut se procurer du plasma de lapin déshydraté, diluer un plasma de lapin frais et stérile à 1 volume pour
3 volumes d'eau stérile.
ex

Si du citrate de potassium ou du citrate de sodium a été utilisé comme anticoagulant du plasma, ajouter une
solution d'EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) de manière à avoir 0,1 % d'EDTA dans le plasma réhydraté
té

ou dilué.3)
rié

À défaut d'instructions du fabricant, le plasma réhydraté ou dilué doit être utilisé extemporanément.
op

Avant utilisation, contrôler chaque lot de plasma avec des souches de staphylocoques à coagulase positive ainsi
qu'avec des souches de staphylocoques à coagulase négative.
Pr

6 Appareillage et verrerie
NOTE Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient convenables.

Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.

6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave)

Voir l'ISO 7218.

6.2 Étuve, permettant de maintenir les milieux inoculés, les boîtes et les flacons à l'intérieur d’une plage de
températures de 35 °C ± 1 °C ou 37 °C ± 1 °C.

3) Le plasma oxalaté ou hépariné ne demande pas d'EDTA (voir la référence [5]).

5
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6.3 Enceinte de séchage ou étuve, pouvant être maintenue à une température entre 25 °C ± 1 °C et
50 °C ± 1 °C.

6.4 Bain d'eau, ou dispositif similaire, réglable à 47 °C ± 2 °C.

6.5 Tubes à essai, flacons ou fioles avec des bouchons à vis, de capacités appropriées, pour la stérilisation et
la conservation des milieux de culture et l'incubation des milieux liquides; en particulier, tubes stériles à hémolyse,
ou flacons à fond rond de dimensions 10 mm ¥ 75 mm environ.

6.6 Boîtes de Petri, stériles, en verre ou en matière plastique.

6.7 Fil droit (voir l'ISO 7218) et pipette Pasteur.

6.8 Pipettes graduées à écoulement total, de 1 ml, 2 ml et 10 ml de capacité nominale, graduées

respectivement en 0,1 ml, 0,1 ml et 0,5 ml.

6.9 Étaleurs, stériles, en verre ou en matière plastique.

6.10 pH-mètre, ayant une précision de lecture de ± 0,01 unité pH à 25 °C, permettant de réaliser des mesures

R
précises à ± 0,1 unité pH.

O
N
7 Échantillonnage

IA
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 6888. S'il n'existe pas
de Norme internationale spécifique à l'échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties
e
concernées se mettent d'accord à ce sujet.
v
si

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, non endommagé ou modifié lors du transport
et de l'entreposage.
u
cl
ex

8 Préparation de l'échantillon pour essai

Préparer l'échantillon pour essai conformément à la Norme internationale du produit concerné. S'il n'existe pas de
té

Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
rié

9 Mode opératoire
op

9.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions

Pr

Voir l'ISO 6887-1 et la norme spécifique du produit concerné.

9.2 Ensemencement

9.2.1 Transférer, à l’aide d’une pipette stérile (6.8), 0,1 ml de l'échantillon pour essai s'il est liquide ou 0,1 ml de
suspension mère (dilution 10–1) pour les autres produits, à la surface de chacune de deux boîtes de milieu gélosé
(5.3.4). Répéter l'opération avec la dilution 10–2 et les dilutions suivantes si nécessaire.

9.2.2 S'il est nécessaire, pour certains produits, de procéder à l’estimation de petits nombres de staphylocoques à
coagulase positive, les limites du dénombrement peuvent être augmentées d'une puissance de 10 en ensemençant
1,0 ml de l'échantillon pour essai s'il est liquide, ou 1,0 ml de la suspension mère pour les autres produits, soit à la
surface d'une grande boîte (140 mm) de milieu gélosé, soit à la surface de trois petites boîtes (90 mm) de milieu
gélosé. Dans les deux cas, effectuer ces opérations en double, de façon à avoir deux grandes boîtes ou six petites
boîtes.

9.2.3 Étaler soigneusement l'inoculum le plus rapidement possible à la surface du milieu gélosé en évitant de
toucher les bords de la boîte avec l'étaleur (6.9). Laisser sécher les boîtes, avec leur couvercle en place, pendant
environ 15 min à la température ambiante.

6
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9.3 Incubation

Retourner les boîtes préparées selon 9.2.3, les incuber pendant 24 h ± 2 h, puis les réincuber pendant 24 h ± 2 h
supplémentaires dans l'étuve (6.2) à 35 °C ou à 37 °C.4)

9.4 Sélection des boîtes et interprétation

9.4.1 Après 24 h ± 2 h d'incubation, marquer sur le fond des boîtes les positions des colonies caractéristiques
éventuellement présentes (voir note 1).

Incuber à nouveau toutes les boîtes à 35 °C ou à 37 °C 4) durant 24 h ± 2 h supplémentaires, et marquer les

nouvelles colonies caractéristiques. Marquer également les colonies non caractéristiques éventuellement présentes
(voir note 1).

Ne retenir pour le dénombrement que les boîtes (voir note 2) renfermant au maximum 300 colonies dont
150 colonies caractéristiques et/ou non caractéristiques au niveau de deux dilutions successives. Il faut qu'une des
boîtes renferme au moins 15 colonies. Choisir, en vue de la confirmation (9.5), un nombre déterminé A (en général
5 colonies caractéristiques s’il n’y a que des colonies caractéristiques, ou 5 colonies non caractéristiques s’il n’y a

R
que des colonies non caractéristiques, ou 5 colonies caractéristiques et 5 colonies non caractéristiques si les deux

O
types sont présents, à partir de chaque boîte).

N
S'il y a moins de 15 colonies caractéristiques et/ou non caractéristiques sur les boîtes ensemencées avec un
produit liquide non dilué ou avec la dilution la plus faible pour les autres produits, il est possible de faire une

IA
estimation comme décrit en 9.4.3 et en 10.2. e
NOTE 1 Les colonies caractéristiques sont noires ou grises, brillantes et convexes (1 mm à 1,5 mm de diamètre après 24 h
d'incubation et 1,5 mm à 2,5 mm de diamètre après 48 h d'incubation) et entourées d'une auréole d'éclaircissement. Après au
v
moins 24 h d'incubation, peut apparaître dans cette zone claire un anneau opalescent immédiatement au contact des colonies.
si

Les colonies non caractéristiques peuvent présenter l'une des morphologies suivantes:
u
cl

a) colonies noires et brillantes avec ou sans bord blanc étroit; la zone claire est absente ou à peine visible et l'anneau
opalescent est absent ou à peine visible;
ex

b) colonies grises dépourvues de zone claire.

té

Les colonies non caractéristiques sont surtout formées par des souches de staphylocoques à coagulase positive contaminant,
par exemple, les produits laitiers, les crevettes et les abats. Elles sont moins souvent produites par les souches de
rié

staphylocoques à coagulase positive qui contaminent les autres produits.

NOTE 2 Des bactéries appartenant à des genres autres que les staphylocoques peuvent former des colonies d'aspect
op

similaire à celui des staphylocoques. Un examen microscopique d’une coloration de Gram et une recherche de catalase, avant
confirmation, permettront de distinguer les autres genres des staphylocoques. Les staphylocoques sont des coques à gram
Pr

positive et possédant une catalase.

9.4.2 Si 1,0 ml d'inoculum a été réparti sur trois boîtes (voir 9.2.2), effectuer les opérations de dénombrement et de
confirmation sur l'ensemble de ces boîtes comme s'il s'agissait d'une seule boîte.

9.4.3 Pour faire une estimation de petits nombres de staphylocoques à coagulase positive, retenir toutes les boîtes
qui contiennent des colonies caractéristiques et non caractéristiques. Retenir toutes ces colonies en vue de la
confirmation sans sortir des limites fixées ci-dessus.

9.5 Confirmation (recherche de la coagulase)

À l'aide d'un fil stérile (6.7), prélever une partie de chaque colonie sélectionnée (9.4) et l'ensemencer dans un tube
ou dans un flacon de bouillon cœur-cervelle (5.4).

Incuber à 35 °C ou 37 °C 4) pendant 24 h ± 2 h.

4) La température fait l'objet d'un accord entre les parties intéressées et est indiquée dans le rapport d'essai.

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Ajouter aseptiquement 0,1 ml de chaque culture à 0,3 ml de plasma de lapin (5.5) (à moins que d'autres quantités
soient spécifiées par le fabricant) dans des tubes stériles à hémolyse ou flacons (spécifiés en 6.5) et incuber à
35 °C ou à 37 °C.5)

En inclinant le tube, examiner la coagulation du plasma après 4 h à 6 h d'incubation et, si le test est négatif,
réexaminer après 24 h d'incubation, ou examiner après les temps d'incubation préconisés par le fabricant.

Considérer que la réaction à la coagulase est positive quand le coagulum occupe plus de la moitié du volume
initialement occupé par le liquide.

À titre de contrôle négatif, ajouter, pour chaque lot de plasma, 0,1 ml de bouillon cœur-cervelle stérile (5.4) à la
quantité recommandée de plasma de lapin (5.5) et faire incuber sans ensemencement. Pour que la réaction soit
valable, le plasma du tube témoin ne devra pas montrer de signes de coagulation.

10 Expression des résultats

10.1 Cas général

R
O
10.1.1 Calcul du nombre a de staphylocoques à coagulase positive identifiés pour chaque boîte retenue

N
Calculer, pour chacune des boîtes, le nombre a de staphylocoques à coagulase positive identifiés, selon l'équation
suivante:

a=
bc
× cc +
b nc
× c nc IA
e
Ac A nc
v
si

où
u
cl

Ac est le nombre de colonies caractéristiques soumises au test de la coagulase (9.5);

ex

Anc est le nombre de colonies non caractéristiques soumises au test de la coagulase (9.5);

bc est le nombre de colonies caractéristiques qui ont répondu positivement au test de la coagulase;
té

bnc est le nombre de colonies non caractéristiques qui ont répondu positivement au test de la coagulase;
rié

cc est le nombre total de colonies caractéristiques repérées sur la boîte (9.4);

op

cnc est le nombre total de colonies non caractéristiques repérées sur la boîte (9.4).
Pr

Arrondir a à un nombre entier (voir l'ISO 7218).

10.1.2 Calcul du nombre N de staphylocoques à coagulase positive identifiés présents dans la prise
d'essai

Pour celles des boîtes qui contiennent 300 colonies au maximum, dont 150 colonies caractéristiques et/ou non
caractéristiques pour deux dilutions successives, calculer le nombre de staphylocoques à coagulase positive pour
chaque boîte tel qu'il est indiqué en 10.1.1 et calculer le nombre N de staphylocoques à coagulase positive
identifiés présents dans l'échantillon pour essai, en tant que moyenne pondérée à partir des deux dilutions
successives à l'aide de l'équation suivante:

N=
∑a
V ( n1 + 0,1 n2 )d

5) La température fait l'objet d'un accord entre les parties intéressées et est indiquée dans le rapport d'essai.

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où

∑a est la somme des colonies de staphylocoques à coagulase positive identifiées sur l'ensemble des boîtes
retenues;

V est le volume de l'inoculum appliqué à chaque boîte, en millilitres;

n1 est le nombre de boîtes retenues à la première dilution;

n2 est le nombre de boîtes retenues à la seconde dilution;

d est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue (la suspension mère est une dilution).

Arrondir à deux chiffres significatifs les résultats obtenus (voir l'ISO 7218).

Noter le résultat comme étant le nombre de staphylocoques à coagulase positive par millilitre (produit liquide) ou
par gramme (autre produit), exprimé par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x, où x est la puissance
appropriée de 10.

R
O
10.1.3 Exemple

N
Un dénombrement d'un produit après ensemencement avec 0,1 ml de produit a donné les résultats suivants:

IA
 à la première dilution retenue (10–2): 65 colonies caractéristiques et 85 colonies caractéristiques (aucune
colonie non caractéristique);
e
 à la deuxième dilution retenue (10–3): 3 colonies caractéristiques et 7 colonies caractéristiques (aucune colonie
v
non caractéristique).
u si

Ont été repiquées:

cl

 parmi les 65 colonies, 5 colonies dont toutes les 5 se sont révélées être à coagulase positive; d'où a = 65;
ex

 parmi les 85 colonies, 5 colonies dont 3 se sont révélées être à coagulase positive; d'où a = 51;
té

 parmi les 3 colonies, 3 colonies dont toutes les 3 se sont révélées être à coagulase positive; d'où a = 3;
rié

 parmi les 7 colonies, 5 colonies dont toutes les 5 se sont révélées être à coagulase positive; d'où a = 7.
op

65 + 51 + 3 + 7
N= = 57 272
0,22 × 10 −2
Pr

Le résultat, après arrondissement, est 5,7 ¥ 104.

10.2 Estimation de petits nombres

10.2.1 Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension mère
(autres produits), contiennent chacune moins de 15 colonies identifiées, exprimer le résultat comme suit.

a) Pour les produits liquides, nombre estimé de staphylocoques à coagulase positive par millilitre:

Ne =
∑a
V×2

où

∑a est la somme des colonies de staphylocoques à coagulase positive identifiées (10.1.1) sur les deux
boîtes retenues;
V est le volume étalé sur chaque boîte.

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b) Pour les autres produits, nombre estimé de staphylocoques à coagulase positive par gramme:

Ne =
∑a
V ×2×d

où

∑a est la somme des colonies de staphylocoques à coagulase positive identifiées (10.1.1) sur les deux
boîtes retenues;

d est le taux de dilution de la suspension mère;

V est le volume étalé sur chaque boîte.

10.2.2 Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension mère
(autres produits), ne contiennent aucune colonie de staphylocoques à coagulase positive et si l’ensemencement a
été effectué avec 0,1 ml d’échantillon, exprimer le résultat comme suit (cas général d’un inoculum de 0,1 ml):

R
O
 moins de 10 staphylocoques à coagulase positive par millilitre (produits liquides);

N
 moins de 10/d staphylocoques à coagulase positive par gramme (autres produits), où d est le taux de dilution

IA
de la suspension mère.

Si l’ensemencement a été effectué avec 1 ml d’échantillon, exprimer le résultat comme suit:

e

v
moins de 1 staphylocoque à coagulase positive par millilitre (produits liquides);
si

 moins de 1/d staphylocoque à coagulase positive par gramme (autres produits).

u
cl

11 Fidélité
ex

Voir l'ISO 7218.

té
rié

12 Rapport d'essai
op

Le rapport d’essai doit indiquer:

 tous les renseignements nécessaires à l'identification complète de l'échantillon;

Pr

 la méthode d'échantillonnage utilisée, si elle est connue;

 la méthode d'essai utilisée, avec la référence à la présente partie de l’ISO 6888;

 la température d’incubation utilisée;

 tous les détails opératoires non prévus dans la présente partie de l’ISO 6888, ou considérés comme facultatifs,
ainsi que les détails sur les incidents éventuels susceptibles d'avoir agi sur le(les) résultat(s) d'essai;

 le(les) résultat(s) obtenu(s).

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Bibliographie

[1] ISO 6888-2, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à
coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces) — Partie 2: Technique utilisant le milieu gélosé
au plasma de lapin et au fibrinogène.

[2] KLOOS, W.E. Systematics and the natural history of staphylococci. In: Staphylococci, J. Appl. Bacteriol. Symp.
Suppl., 69, 1990, pp. 25 s – 37 s; et Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9ème édition, 1994.

[3] BAIRD-PARKER, A.C. J. Appl. Bacteriol., 25 (1), 1962, pp. 12-19.

[4] SMITH, B.A. et BAIRD-PARKER, A.C. J. Appl. Bacteriol., 27 (1), 1964, pp. 78-82.

[5] BAIRD-PARKER, A.C. The Staphylococci (ed. Cohen, J.O.), Wiley-Interscience, New York, London, 1972, p. 11.

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