République Algérienne Démocratique et Populaire

Université des Sciences et de la Technologie d’Oran Mohamed BOUDIAF

Département de Génétique Moléculaire et Appliquée

COURS 7:
LES BANQUES D’ADN ET SEQUENÇAGE

Dr ABDI Meriem
Génie génétique, Licence 3 Biochimie
 DÉFINITION D’UNE BANQUE D’ADN

• Une banque d’ADN est un ensemble de larges fragments d’ADN d’un génome

d’intérêt qui sont clonés dans un vecteur réplicatif (type plasmide) et introduit

dans une cellule hôte facile à répliquer.

Fragments d’ADN

Collection declones
Vecteur
 TYPES DE BANQUE D’ADN
On distingue deux type de banque ADN :

1. Les banques d'ADN génomique :

Collection de clones représentant la totalité du génome d’un organisme d’intérêt

obtenue par digestion partielle, à l'aide d'une ou plusieurs enzymes de restriction,

de l'ADN génomique.

1. Les banques d’ADN complémentaire ou ADNc:

Collection de clones représentant l’ensemble des ARNm présent à un moment

donné dans un tissu ou dans un organe donné.

 BANQUE D’ADN GÉNOMIQUE
• Dans une banque d’ADN génomique, l’ADN cloné est l’ADN chromosomique.

• L’ADN est obtenu à partir de lignées cellulaires, de tissus ou d’organismes entiers

en fonction de la taille de l’organisme.

• Les banques créées à partir de l’ADN génomique purifié des différents types

cellulaires sont strictement identiques.

Cellule souche

Cellule musculaire

Cellule neurale ADN génomique

Purification de l’ADN génomique

CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNG

BamH1

BamH1

Vecteur ADN génomique

(plasmide)

Digestion

G G-A-T- C-C
C-C-T-A-G G

Ligation

ADN recombinant
 CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNG

• Insertion des molécules

Transformation
recombinantes dans les bactéries

hôtes par transformation.

ADN ADN
recombinant 1 recombinant 2

Sélection
…
• Sélection et identification des

clones ayant récupérés une

molécule d’ADN recombinante

Antibiotique + X-gal
(ex. screen blanc/bleu ).
 CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNG
Chaque colonie contient le même fragment ADN et chaque colonie contient un
seul type d’ADN recombinant
 Que trouve-t-on dans l’ADN cloné d’une banque d’ADN
génomique

- Les banques d’ADN génomique contiennent tous les gènes Gene A Gene B
présents dans l’organisme.
ex in ex ex in ex
ADN
- Pour un organisme donné qu’elle que soit la cellule de in: intro non transcrit
ex: exon
départ, la banque génomique sera toujours la même.
Digestion par une enzyme de
- On retrouve dans les fragments d’ADN clonés. restriction
-Les gènes morcelés (introns+exons).
-Les régions de régulation des gènes.
(promoteur, sites activateurs et répresseurs)
-L’ADN intergénique (non codant et non régulateur).
-Les séquences répétées Clonage de l’ADN

- Chaque gène est représenté dans les mêmes proportions

au sein de la banque.

- Les gènes présents dans ces banques sont souvent

interrompus. Clones d’ADN génomique
 Origine de l’ADN d’une banque d’ADN complémentaire

• l’ADN cloné est l’ADN complémentaire issus de la retro-transcription de l’ARNm.

• L’ARN est obtenu à partir de lignées cellulaires, de tissus ou d’organismes entiers.

• Chaque type cellulaire exprime un lot donné de gènes donc pour un organisme l’ARN

est différent pour chaque type cellulaire.

Cellule souche ADN complémentaire

cellule souche

Cellule musculaire Purification de l’ADN

+ ADN complémentaire
Retro-trancription cellule musculaire

Cellule neurale
ADN complémentaire
cellule neurale
 ADN COMPLÉMENTAIRE

• L’ADN complémentaire est un ADN synthétisé à partir d’une molécule d’ARN

ARN ARN
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
Retro-transcription ADNc

• L’ADN obtenu par retro-transcripton ou reverse transcription est

complémentaire à l’ARN matrice: c’est l’ADN complémentaire ADNc

• L’enzyme qui assure la retro-transcription de l’ARN en ADNc est la reverse

transcriptase
 ORIGINE DE LA TRANSCRIPTASE INVERSE

• Cette enzyme est présente chez les rétrovirus (virus à ARN).

• Elle intervient dans la conversion de leur génome ARN en génome ADN

 LA TRANSCRIPTASE INVERSE

C’est une enzyme qui possède les propriétés suivantes:

1. Une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à 3’

2. Une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à 3’

3. La transcriptase inverse est une ADN polymérase ARN-dépendante

4. Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à 5’ (pas de correction sur

épreuve)

5. Comme toutes les ADN polymérase elle nécessite une amorce pour initier la

transcription
 CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNC

Extraction
ARNm

Cellule souche

- L’ARN messager est extrait de la cellule, retro-

transcript en ADNc double brin par l’action
successive de la reverse transcriptase et de
l’ADN polymérase.
- A la fin de cette étape, on obtient un
ensemble de macromolécule d’ADN double
brin.
 CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNC

Cellulesouche ARN ADNc

Extraction Reverse
ARNm Transcription

CCCC AAAAA
GGGG TTTT

Comment cloner ces fragmentsd’ADNc?

 CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNC

Il existe deux grandes méthodes pour cloner les fragments d’ADNc dans un

vecteur de clonage

- La méthode des bords francs

- La méthode d’ajout d’un linker

 MÉTHODE BORD FRANC
SmaI

• Le vecteur est digéré par une enzyme de Vecteur

(plasmide)

restriction générant de bord franc (ex: Digestion

Par SmaI

smaI)

• L’ADN complémentaire n’a pas besoin C CCCC AAAA

G GGGG TTTT

d’être coupé car il a deux bords francs à Ligation

C CCCC AAAA
chacune de ces extrémités G GGGG TTTT

ADN recombinant
 LINKER DE CLONAGE

On va ajouter aux extrémités de l’ADNc des petites séquences ADN contenant un

site de restriction
Synthèse de l’ADNc

Ajout des séquences linker

Clonage classique
Digestion par l’enzyme de dans un vecteur
restriction présent dans le linker
 CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNC

Insertion des molécules recombinantes

Transformation
dans les bactéries hôtes par
transformation.

ADN ADN
Sélection et identification des clones recombinant 1 recombinant 2
Sélection
…
ayant récupérés une molécule d’ADN
recombinante et d’éliminer les clones
ayant récupérés un vecteur « vide »
(ex screen blanc/bleu )

Antibiotique + X-gal
 Que trouve-t-on dans l’ADNc cloné
-Pour un organisme donné (l’homme) l’ADN
contenu la banque d’ADNc sera dépendant du GeneA Gene B
choix de la cellule d’origine (ex musculaire ou ex in ex ex in ex
nerveuse). ADN
non transcrit

-Les banques d’ADN complémentaire ne Transcription

contiennent que les gènes exprimés dans la
cellule choisie pour la construction de la banque.
-On retrouve dans les fragments d’ADN clonés.
-Les gènes non morcelés (exons seulement). Epissage
-Les régions régulatrices et intergéniques de l’ARN
sont absentes de ce type de banque.
-Chaque gène de la banque n’est pas représenté
de la même façon, c-à-d plus un gène est Transcription inverse et clonage
transcrit plus il est représenté dans la banque.
-Les gènes présents dans ces banques sont
ininterrompus.

Clones d’ADN complémentaire

Comparaison entre les banques d’ADN génomique et
ADN complémentaire

Clones d’ADN génomiques Clones d’ADN complémentaires

 LE SÉQUENÇAGE DE L’ADN

• Le séquençage de l’ADN est la détermination de la succession des nucléotides

le composant.

• C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie.

• Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une

trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN.

 LE SÉQUENÇAGE SELON LA TECHNIQUE DE SANGER
Synthèse d’un Brin ADN par une ADN polymèrase.
Pour le séquençage des nucléotides légèrement différents sont utilisés: les
didésoxyribonucléotides (ddNTP) au lieu des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP).
Les ddNTP diffèrents des dNTP par l'absence d'un groupement OH en position 3’.
Ainsi lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP, elle n'est plus capable de rajouter le
moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'ADN s'arrête.
5’ 5’
CH2-groupement phosphate CH2-groupement phosphate
O O
1’ base 1’ base

3’ 3’
OH H
OH présent en 3’: OH absent en 3’:
dNTP ddNTP
 PROTOCOLE

Il faut préparer 4 mélanges:

-Le fragment qui doit être séquencé
-Un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à
l'extrémité 3' du fragment à séquencer (oligonucléotides)
-Les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)
-L'ADN polymérase
 PROTOCOLE
Préparation de 4 mélanges contenant:

-Le fragment qui doit être séquencé

-Un petit fragment d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3'
du fragment à séquencer (oligonucléotides ou amorces)

-Les 4 dNTP s (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)

-L'ADN polymérase
-Dans chaque tube, de petites quantités d'un ddNTP fluorescent ou radioactif
 PROTOCOLE
On obtient à la fin des réactions un ensemble de brins
d'ADN de tailles variées, selon l'endroit où un ddNTP se
sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée.

NB:Synthèse du brin complémentaire,

donc si arrêt par un ddGTP, c’est qu’il
s’agit d’une cytosine sur la séquence.
 LECTURE DES BRINS
Migration électrophorétique (4colonnes)

ADN à séquencer
28 GTAGGCAT 5’-ATGCCTAC-3’
27 GTAGGCA
Longueur du fragment

26 GTAGGC

25 GTAGG

24 GTAG

23 GTA
Exemple d’auto-
22 GT radiographie
(marquage 32P)
21 G d’un gel
d’électrophorèse
 L'AUTOMATISATION DU SÉQUENÇAGE

Séquenceurs automatiques

• Capables de réaliser les réactions de séquence puis de les lire.

• Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des fragments obtenus

est déterminée par une chromatographie.

• Le séquenceur détecte la fluorescence sortant des colonnes de

chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et leur taille précise.

 Exemple d’enregistrement obtenu à partir d’un séquenceur
automatique

Les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une

très bonne qualité jusqu'à 1000 pour les appareils les plus performants.