Université Sultan Moulay Slimane

Faculté des Sciences et Techniques

Filière : BCG-S4, Groupe1 Module : Microbiologie Générale

RAPPORT DES TRAVAUX PRATIQUES MICROBIOLOGIQUES

Préparé par :

 Hmidouch Bouchra
 Imzilan oumayma

Encadré par :

 Professeur HAMDALI

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 Sommaire

INTRODUCTION

TP1 : notions et techniques de base en microbiologie.

1. Introduction :
a. Milieux de cultures
b. stérilisations

2. objective de TP

3. méthodologie

a. Réalisation du poste de travail

b. préparation de la dilution

c. Préparation des milieux de culture

4. L’ensemencement

a. l’ensemencement en profondeur

b. l’ensemencement par stries transversale

c. étude de quelque source de contamination

TP2 : examen macroscopique et microscopique des cultures

coloration simple et différentielle

1. Introduction

2. Objectif

3. Méthodologie

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 4. Résultats

VI.TP 3 : dénombrement bactérien

1. introduction

2. objectif

3. Dénombrement sur milieu solide

a. Principe

b. méthodologie

C .résultats

4. dénombrement bactérien sur milieu liquide

a. Principe

b. méthodologie

C .résultats

V. Conclusion générale

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 I. INTRODUCTION
La microbiologie est le domaine d’études scientifiques qui
s’intéressent aux organismes de taille microscopique, en
particulier aux Bactéries,
aux protozoaires, aux
virus ainsi qu’à certains
champignons (levures),
et algues unicellulaires
de petite taille.
Photo : nature.com

La microbiologie est née

avec l’invention du
microscope en 1673 par
ANTONIE VAN LEEWENHOEK

A partir de la moitié du XIX siècle, la microbiologie a connu un

grand essor avec louis pasteur.

L’un des intérêts des analyses microbiologiques est l’étude et

l’identification de certains micro-organismes à l’aide de plusieurs
techniques tel que : la stérilisation, travail aseptique, culture et
isolement de souche et milieux de cultures.

Dans laboratoire microbiologie est trouvé plusieurs déférent

matériels demande dans les analyses de certaine matière vivant
et devoir pour chaque utilisateur en suivre les déférentes
conditions au cours de leur travail.

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Photo : matériels utilisés
dans laboratoire de
microbiologie.

L’objectif de cet TP est

familiarise l’étudiant
avec un laboratoire de microbiologie ; son équipement et son
fonctionnement.

II. TP1 : notions et techniques de base en

microbiologie.
1. Introduction :
a. milieux de cultures :
Il est important de pouvoir cultiver des micro-organismes.

Les buts de la culture sont divers :

 Maintien des souches

Multiplication
 Isolement
 Identification
 Tests microbiologiques
 Utilisation industrielle

Pour ce faire, il faut disposer de milieux de culture convenables

pour chaque type de micro-organisme.il faut que le milieu puisse
satisfaire les besoins nutritifs du microbe cultivé.

Alors c’est quoi un milieu de culture ?

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En bactériologie le milieu de culture est un support matériel de la
culture et son pourvoyeur en nutriments nécessaires (énergie,
l’eau, oxygène, pH, température et pression osmotique) au
développement et à la croissance des germes en présence des
facteurs physico-chimique favorable.

On distingue trois types des milieux de cultures : Milieu liquide,

milieu solide et semi solide.

Le passage de milieu solide vers milieu liquide on utilise Agar agar

qu’est une substance inerte et polysaccaridique extraite d’algues
marine qui se liquéfie à partir d’une température ≥60◦c.

b. stérilisations :

C’est une destruction totale de tous les germes présents dans un

milieu avec le maintien de l’état stérile.

En pratique, la stérilisation est basée sur des facteurs physiques et

chimiques :

 Facteur thermique (stérilisation à la chaleur) : la chaleur

détruit les bactéries et les spores, on distingue les
procédés à la chaleur :
Sèche : on utilise bec bunsen, four pasteur
Humide : on utilise autoclave à T◦=120◦ pendant 15min.
 Facteur mécanique : on stérilise le milieu par la filtration qui
est une technique consiste à faire passer un liquide à travers
un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2µm ou
0,45µm.
 Facteur physique : est une stérilisation par des rayons ultras
violets.
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  Facteur chimique : on stérilise le milieu de travail par des
produits chimiques comme l’eau de javel.
REMARQUE : la désinfection permet d’éliminer (80%-90%)
des germes par contre la stérilisation élimine 100%.
2. objective de TP :
Mise en évidence de différentes sources de contamination
microbiennes. Par préparation des milieux de culture stériliser ;
couler dans des boites de pétri stériles.
3. méthodologie :
a. réalisation du poste de travail :
On lave le poste de travail avec l’eau
de javel pour stériliser puis on allume
le bec benzène pour rend la zone
stérile et on met les pipetes et l’anse à
la main droite dans la zone stérile et le
panier des tubes à la main gauche et
on met une boite dans laquelle on
met l’eau de javel pour jeter les
pipettes et le matériel contaminer.

b. préparation de la
dilution :
On prélève à l’aide de l’anse un
échantillon de sol dans le
premier tube qui contient l’eau
physiologique, puis on met ce
tube au vortex, on obtient donc
une dilution de 10¯¹. On prend

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1ml de tube1, et on met dans le tube2 →dilution 10¯². On répète
jusqu'à dilution 10⁻⁶.

c. Préparation des milieux de culture :

On chauffe la gélose qui déjà préparer jusqu'à l’ébullition ; après
on le met
dans les
boite de
pétri
stérilisées
et laisser
refroidir à
coté de bec bunsen.

4. L’ensemencement :
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu de culture
neuf des germes prélevés dans un milieu de culture mère, le
transport est en général effectué avec une anse.
a. l’ensemencement en profondeur :
Dans la boite de pétri vide, stérile, et constituer de gélose on
verse 1ml de la dilution (pour notre paillasse on utilise la dilution
10 ⁻⁶).
b. l’ensemencement par stries transversale :
 Flamber l’anse et laisse refroidir.
 Prélever un échantillon du sol.
 Etaler à nouveau le prélèvement
par stries serrées dans la moitié
de boite.

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  Flamber l’anse et laisser refroidir.
 Répéter l’étalement par stries serrées.

c. étude de quelque source de contamination :

La contamination c’est toute présence d’un germe dans un milieu
qui ce développe sans l’avoir l’ensemencer.
La contamination bactérienne vient soit de l’environnement (air),
ou du manipulateur.
Pour notre manipulation on a étudié trois sources

Situation Sources des Manipulations

contaminations
A Air Laisser la boite ouverte
pendant 15 min loin de bec
bunsen
B Mains Partager la boite de pétri en
deux :
-sur une moitié : mettre les
empreintes des doigts sans
les laver.
-sur l’autre moitié : mettre
les empreintes des doigts
lavés à l’eau de javel.

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On met les boite de pétri préparer dans l’incubateur à 37°c
pendant une semaine.

III. TP2 : examen macroscopique et microscopique des

cultures : coloration simple et différentielle :
1. Introduction :

Pour identifier les bactéries en basant sur plusieurs caractères tel

que : le caractère morphologie (taille, forme…), caractère
biochimie, caractère physiologie (oxygène, température..),
caractère moléculaire (transfert d’ADN). Ces caractères
permettent de donner une fiche significative aux bactéries.
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 2. Objectif :

Faire la lecture des résultats du TP1 par :

 Observation macroscopique (œil nu) : permet d’examiner les

bactéries on basant sur les caractères morphologiques tel
que : la taille, la couleur, la forme, odeur, viscosité.
 Observation microscopique : on utilise la coloration de gram
3. Méthodologie :

Pour l’observation macroscopique : remarque à l’aide de l’œil nu.

Pour l’observation microscopique : coloration de gram est une

méthode de coloration différentielle qui permet de donner les
propriétés de la paroi bactérienne.

Etape de coloration de gram :

 Réalisation d’un frottis

bactérienne : sur une
lame déposer une goutte
d’eau stérile et ajouter à
l’anse de platine
stériliser une goutte de
la colonie isolée.

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 Fixation du frottis : chauffer la
lame jusqu’à la fixation du frottis.

 Application de la coloration de
gram : ajouter le cristal violet et
laisser pendant 1 min et rincer
avec l’eau, puis faire la fixation
avec le lugol laisser 1min et
rincer, ensuite faire la
décoloration avec
l’alcool (acétone) en
ajoutant (1-2 gouttes)
laisser durant (1-2
seconds),après on fait la
recoloration avec la
fuschine et attendre 1min puis rincer
avec l’eau .
 En passe à l’observation en
microscope (Gx4) →(GX10) → (GX100).

4. Résultats :
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 A l’aspect macroscopique : dans notre boites de pétris on
observe des colonies (l’ensemble des cellules bactériennes issues
de la même cellule mère par la division binaire), qui son de
différente forme (ronds…) et différente taille (petite, moyenne et
grande) et de couleur presque orange. Dans certaines boites on a
trouvé des mouches.

A l’aspect microscopique : on observe des bactéries de gram

positif de forme bacillus en chaine et de couleur violet.

IV. TP 3 : dénombrement bactérien

1. introduction :

La dénombrement c’est le comptage des cellules bactériennes

dans une échantillon donné par rapport à une volume bien
déterminé .on distingue deux type de dénombrement :

 Dénombrement direct : la numération cellulaire

peut être réalisée par comptage au microscope, à
l’aide d’une lame de comptage spéciale ou cellule
de numération ou hématimètre.
 Dénombrement indirect : consiste à deux milieux
solides et liquides.
2. objectif :

Le but de cette manipulation consiste à compter le nombre des

cellules bactériennes dans le milieu solide et liquide.

3. dénombrement bactérien sur milieu solide :

a. Principe :

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 C’est une méthode quantitative de comptage des cellules
bactérienne contenues dans un échantillon donné dans un
milieu gélosé par rapport à un volume bien définie.

b. méthodologie :
i. la préparation de la dilution :
On prélève à l’aide de l’anse un échantillon de sol dans le premier
tube qui contient l’eau physiologique, puis on met ce tube au
vortex, on obtient donc une dilution de 10¯¹. On prend 1ml de
tube1, et on met dans le tube2 →dilution 10¯². On répète jusqu'à
dilution 10⁻⁶.
ii. l’ensemencement en masse :
Verser 0,5 ml de la dilution 10⁻⁶ pour notre paillasse dans les
trois boites de pétri qui contienne la gélose nutritive puis on les
mettre à l’incubateur à 37°c pendant une semaine.

c. résultats :

La dilution 10¯¹ 10¯² 10¯ᶟ 10¯⁴ 10¯⁵ 10⁻⁶

Nombre
moyen de ˃300 ˃300 ˃300 20 200 20
la colonie

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  calcul le nombre des cellules bactérienne :

On a : N= n×Fd/Ve avec n=nombre moyen de colonie /dx

Fd= facteur de dilution tel que Fd= 1/dx

Alors : N₁= (300×10) / 0,5= 6.10ᶟ µFC/ml

N₂= (300×10²)/0,5=6. 10⁴µFC/ml

N₃= (300×10ᶟ)/0,5=6. 10⁵µFC/ml

N₄= (20 ×10⁴) /0,5=4. 10⁵µFC/ml

N₅= (200×10⁵)/0,5=40. 10⁶ µFC/ml

N₆= (20×10⁶)/0,5= 40. 10⁶ µFC/ml

D’après la loi de bactériologie :

Chiffre non significatif ← 30≤ boite comptable <300 → chiffre

incomptable

Alors R₁→N= 40. 10⁶ µFC/ml

On compare notre résultat avec l’autre rangée et on trouve :

R₂→N= 40. 10⁶ µFC/ml

i. Interprétation :

On obtient le même résultat pour les deux rangées donc les

résultats sont logiques et la manipulation se fait dans les
conditions bien stériles.

ii. Remarque :

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Si on trouve des résultats défirent c’est à cause de plusieurs
effets tel que : la dilution ; condition du travail et l’effet de
manipulateur lui-même.

4. Dénombrement bactérien sur milieu liquide :

a. Principe :

En utilise la méthode de mac crady qui est une méthode

statistique d’estimation du nombre le plus probable (NPP) dans un
échantillon donné par unité de volume.

Le nombre caractéristique NC est constituée de trois chiffres : le

première chiffre correspond à la dernière dilution qui a donnée le
max des tubes(+), la deuxième et la troisième chiffres correspond
à la deuxième dilution qui suivre.

b. La méthodologie :
i. la préparation de la dilution :
On prélève à l’aide de l’anse un échantillon de sol dans le premier
tube qui contient l’eau physiologique
On met ce tube au vortex, on obtient donc une dilution de 10¯¹.
On prend 1ml de tube1
On met dans le tube2 →dilution 10¯²
On répète jusqu'à dilution 10⁻⁶.
ii. l’ensemencement en masse :
Verser 0,1 ml de la dilution 10⁻⁶ pour notre
paillasse dans les trois tubes qui contienne le
bouillon nutritive puis on les mettre à
l’incubateur à 37°c pendant une semaine.

c. Résultats :
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Pour les tubes trouble on note(+), et les tubes clair on note (-)

dilution 10¯¹. 10¯² 10¯ᶟ 10¯⁴ 10¯⁵ 10⁻⁶.

Rangée +++ +++ +++ +−− ++− −−−

On a : NC= 312

Et NPP=11,5 D’après la table de Mac Crady

N= (NPP×Fd)/Ve avec Fd=1/10¯ᶟ= 10ᶟ et Ve= 0,1 ml

Donc N₁= (11,5 ×10ᶟ)/0,1=11.5 ×10⁴ µFC/ml

i. Interprétation :

Le résultat de l’autre rangée est : N₂=9.5×10⁵ × µFC/ml

Donc la valeur de N est déférent ce qui signifie que il ya des

erreurs au cours de préparation des milieux des cultures.

V. conclusion générale :

Pendant ces trois travaux pratiques de microbiologie générale

nous avons pu d’identifier, cultiver et dénombrer les bactéries en
utilisant plusieurs techniques régulièrement.

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