RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université Kasdi Merbah Ouargla

Faculté des sciences de la nature et de la vie
Département des Sciences Biologiques

Thèse
Présentée en vue de l’obtention du diplôme de
Doctorat en Biologie
Option : Biochimie appliquée

Thème

Présenté par :

Mme NEBEG Halima

Devant le Jury composé de :

M. OULD EL HADJ Professeur (Université Kasdi Merbah, OUARGLA) Président

Mohamed DIDI
Mme. BOUDJENAH Saliha Professeur (Université Kasdi Merbah, OUARGLA) Examinatrice
M. SAIDI Mokhtar Professeur (Université Kasdi Merbah, OUARGLA) Examinateur
M. OUINTEN Mohamed Professeur (Université Amar Télidji, LAGHOUAT) Examinateur
M. YOUSFI Mohamed Professeur (Université Amar Télidji, LAGHOUAT) Directeur de thèse
Mme. BENAROUS Khadidja MCA (Université Amar Télidji, LAGHOUAT) Co-Directrice de thèse

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Année universitaire 2019-2020
Je dédie cette thèse À:
Mes très chers parents

Mon cher époux Khaled

Mes chères sœurs et mes frères

Mon adorable ange Mohamed

Mes nièces et mes neveux

À tous ceux qui m’ aiment

 Remerciements

Je remercie avant tout ALLAH tout puissant de m’avoir guidé toutes les années d’étude, et de m’avoir
donné la volonté, la patience et le courage.

Au terme de cette expérience qui représente la réalisation d’une thèse de doctorat, je tiens à remercier
les personnes qui ont rendu possible l’élaboration de ce travail.

Je tiens à remercier sincèrement mon directeur de Thèse, Monsieur Pr. YOUSFI Mohamed , Directeur
du laboratoire des sciences fondamentales, Université de Laghouat, pour l'aide qu’il m'a apporté ainsi
que pour sa disponibilité tout au long de ma thèse.J’espère être digne de la confiance que vous avez
placée en moi en me guidant dans l’élaboration et la mise au point de ce travail.Veuillez trouver dans ce
travail, l’expression de mes sentiments les plus respectueux.

Mes profonds remerciements s’adressent à ma Co-directrice de Thèse, Dr BENAROUS Khadidja qui

a régulièrement suivi mon travail et m’a fourni de nombreux conseils. Je suis infiniment reconnaissante
pour votre aide .

Mes remerciements vont également à Monsieur le Pr. Mohamed Didi OULD EL HADJ d’avoir
accepté de présider le jury de ma soutenance de thèse.

Je tiens aussi à remercier les examinateurs Monsieur le Pr. SAIDI Mokhtar, Monsieur le Pr.
OUINTEN Mohamed et Madame la Pr. BOUDJENAH Saliha d’avoir accepté de juger ce
travail et m’avoir fait l’honneur de leurs présences

Mes sincères gratitudes vont aussi à mes enseignants: Pr.Mohamed OUINTEN ,M. Hamid
GUENANE et M.Youcef BOUBRIMA ,Mme Farida ALLAL, Mme Zohra BENDAOUD, et à
tous mes enseignants auxquels je suis reconnaissante.

Je tiens à remercier spécialement mes chères amies ELHOUITI Fatiha , Djalila TAKHI, Zohra
ZOUKHREF, Nadia CHALLA, Saida Maache qui ont toujours été là pour moi. Leur soutien
inconditionnel et leurs encouragements ont été d’une grande aide

Mon remerciements vont aussi à mes amis(es) et collègues Ibrahim SIFI, Fatiha BENTAHAR,
Aicha Hamdi, Hadjer AOUISSI, Safia GACEMI, Lamia KRAZA, Salim ZEROUK, Ismahane
TALEB , Ibtisem SOUFFI ,Malika MAAMRI,
 Remerciements

Je remercie chaleureusement l’ensemble des personnes du Laboratoire des sciences fondamentales de

l’université de Laghouat particulièrement M. Mohamed HARATH, M. Nadhir GOURINE,M.
Omar DEJRIDANE et Mme Chahrazade HAMIA

J’exprime mes plus vifs remerciements au responsable des laboratoires du Département de Biologie : M.
Mustapha HADJOUDJA, et aux ingénieures de laboratoires .

Mes parents, mes frères : Ahmed , Djamel, Mohamed et Hamza,mes sœurs: Djamila et Hadda vos
valeurs, votre soutien, la joie d’être ensemble. Merci pour tout !

Un merci très spécial, à mon époux Khaled pour sa patience et surtout pour son appui
inconditionnel. Merci d’être à mes côtés dans les moments les plus difficiles de ma vie….

Un grand merci à toutes les personnes qui m’ont soutenu de près ou de loin au cours de la réalisation
de ce modeste travail.
Résumé

L'analyse par CG/SM des esters méthyliques d’acides gras (EMAG) des différentes
huiles de graines, feuilles et racines de Thapsia garganica montre qu’ils n’ont pas le même
profil en acide .Ces huiles ont des propriétés différentes , et les huiles de racines et feuilles
sont plus riches en insaponifiables.Plusieurs extractions avec des solvants à polarités
croissantes (DCM,Ac-O-Et, MeOH) sont effectuées sur les différentes parties de la
plante .Les extraits obtenus n’ont pas les mêmes teneurs en composés
phénoliques .L'étude de l'activité antioxydante de ces extraits par les deux tests DPPH et
FRAP montre que les extraits méthanoliques des graines ont une activité très importante et
que le classement des capacités antioxydantes de nos extraits selon la méthode DPPH est
totalement différent du classement obtenu par la méthode de réduction du fer. L'étude de
l'activité antioxydante des huiles et des insaponifiables de Thapsia garganica montre une
très forte activité des extraits de racines et de feuilles par rapport aux graines.L’effet
des extraits acétate d’éthyle de Thapsia garganica sur l’activité enzymatique de la lipase de
Candida rugosa semble intéressant . Ces résultats nous ont incité à effectuer une
modélisation par amarrage moléculaire afin de tester l’effet des principaux composés
bioactifs synthétisés par cette plante sur la lipase de Candida rugosa et la lipase
pancréatique humaine.Une différence importante dans les affinités de ces molécules vis-à-
vis des deux enzymes est trouvée.

Mots clés: Thapsia garganica, lipide ,insaponifiables, tocophérols, composés phénoliques,

activité antioxydante, lipase, Candida rugosa, lipase pancréatique humaine,inhibition
Abstract

Analysis by GC / MS of fatty acids methyl ester (FAME) of the seed, leaf and root oils
of Thapsia garganica shows that they have a differents fatty acid profiles. these oils have
different properties, and the oils from roots and leaves are richer in unsaponifiables.
Extractions with solvents with increasing polarities (DCM, Ac-O-Et, MeOH) are carried
out on the different plant parts. The obtained extracts do not have the same contents of
phenolic compounds, and for the different studied parts, the methanolic extracts prove to
be the most riche. The study of the antioxidant activity of these extracts by the two tests
DPPH and FRAP shows that the methanolic extracts of the seeds have a very important
activity and that the classification of the antioxidant capacities of our extracts according to
the DPPH method is totally different from the classification obtained by the FRAP method.
The study of the antioxidant activity of oils and unsaponifiables of Thapsia garganica
shows a very strong activity of extracts of roots and leaves compared to seeds extracts .
The effect of ethyl acetate extracts of Thapsia garganica on the enzymatic activity of
Candida rugosa lipase appears to be interesting. These results prompted us to carry out
molecular docking modeling to test the effect of the main bioactive compounds
synthesized by this plant on Candida rugosa lipase and human pancreatic lipase.An
important difference in the affinities of these molecules against both enzymes is found.

Key words: Thapsia garganica, lipid, unsaponifiables, tocopherols, phenolic compounds,

antioxidant activity, lipase, Candida rugosa, human pancreatic lipase, inhibition
 ‫ملـــخـــص‪:‬‬

‫أظهرت دراسة المادة الدهنية لبذور و أوراق و جذور نبتة بونافع أنها تتميز بخصائص مختلفة و ان زيوت‬
‫الجذور والوراق تحتوي على ومية معتبرة من التوووفيرولت و المواد الغير قابلة للتصوبن ‪ .‬قمنا ايضا بدراسة‬
‫و تبين انه ليس لديها نفس المحتوى من‬ ‫الفينولت التي تم سستخلصها من مختلف اجزاء النبتة بمذيبات متعددة‬
‫المروبات الفينولية ‪ ،‬بالنسبة لمختلف الجزاء التي تمت دراستها ‪ ،‬مستخلصات الميثانول اثثبت أنها الوثر ثرا ءء‪.‬‬
‫‪FRAP‬أن‬ ‫‪ DPPH‬و‬ ‫تبين من خلل دراسة النشاط المضاد للوسدة لهذه المستخلصات بواسطة اختبارين‬
‫المستخلصات الميثانولية للبذور لها نشاط مهم للغاية وأن تصنيف مستخلصاتنا وفقءا لطريقة ‪ DPPH‬مختلف تما ءما عن‬
‫التصنيف الذي تم الحصول عليه بواسطة طريقة ‪.FRAP‬تظهر دراسة النشاط المضاد للوسدة للزيوت و المواد الغير‬
‫قابلة للتصوبن نشاطءا قويءا جدءا لمستخلصات الجذور والوراق مقارنة بمستخلصات البذور ‪.‬النشاط التثبيطي‬
‫ضد انزيم الليباز ‪ ،‬وتبين أن جميع أجزاء اهذه النبتة لديها قدرة تثبيط مهمة‪ .‬هذه‬ ‫لمستخلصات أسيتات اليثيل‬
‫النتائج دفعتنا سلى تنفيذ نمذجة لختبار تأثير المروبات النشطة الرئيسية لهذه النبتة على الليباز االفطري و البشري‪ .‬تم‬
‫العثور على فرق مهم في ألفة هذه المثبطات اتجاه النزيمين ‪.‬‬

‫الكلمات المفتاحية‪ :‬زيوت ‪ ،‬توووفيرول ‪ ،‬مروبات فينولية ‪ ،‬نشاط مضاد للوسدة ‪ ،‬سنزيم الليباز ‪ ،‬ليباز‬
‫البنكرياس البشري ‪ ،‬تثبيط‬
 Table des matières

ABRÉVIATIONS ................................................................................................................................i

LISTE DES TABLEAUX ...................................................................................................................ii

LISTE DES FIGURES .......................................................................................................................iii

INTRODUCTION....................................................................................................................................2

CHAPITRE I:Étude botanique de Thapsia garganica

1. Présentation de la famille d’Apiacées....................................................................... 6

2. Présentation du genre : Thapsia.................................................................................7

3. Présentation de l’espèce : Thapsia garganica L......................................................8

3.1. Description Botanique.................................................................................... 8

3.2. Utilisations de Thapsia garganica en médecine traductionnelle

et moderne........................................................................................................... 10

3.3.Toxicité de Thapsia garganica....................................................................12

3.4. Travaux antérieurs........................................................................................ 12

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 14

CHAPITRE II : Étude de la fraction lipidique

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................................... 17

1.Lipides...................................................................................................................... 17

2. Classification .......................................................................................................... 17

2.1. Lipides vrais ................................................................................................ 17

A) Lipides simples ......................................................................................17

B) Lipides complexes ................................................................................. 18

2.2. Les composés à caractères lipidiques .......................................................... 21

3. Données générales sur les acides gras..................................................................... 21

3.1.Acides gras saturés........................................................................................ 22

3.2.Acides gras insaturés..................................................................................... 22

4. Données générales sur les tocophérols.................................................................... 22

 5. Données générales sur les stérols............................................................................ 23

MATERIEL ET METHODES............................................................................................ 25

1. Préparation de la matière végétale...........................................................................25

2. Extraction ............................................................................................................... 28

3. Décoloration............................................................................................................ 29

4. Extraction des cires................................................................................................. 29

5. Préparation des esters méthyliques des acides gras des différentes huiles de
Thapsia garganica................................................................................................30
5.1.Saponification................................................................................................30

5.2.Estérification................................................................................................. 30

5.3.Analyse des esters méthyliques par CG/SM......................................................... 31

6. Extraction des insaponifiables.................................................................................31

6.1. Protocole.......................................................................................................32

7. Étude des tocophérols..............................................................................................32

7.1.Dosage spectrophotométrique des tocophérols totaux:......................................... 32

7.1.1.Principe:......................................................................................................32

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS......................................................................................35

1. Rendement d’extraction et propriétés des huiles obtenues......................................35

2. Analyse des esters méthyliques par CG/SM........................................................... 38

3. Analyse des Tocophérols.........................................................................................43

4. Analyse des stérols.................................................................................................. 44

Conclusion:..........................................................................................................................45

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 46

CHAPITRE III : Activité antioxydante

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................................... 50

1. Métabolites secondaires.......................................................................................... 50

1.1.Généralités sur les métabolites secondaires.................................................. 50

1.2.Les composés phénoliques............................................................................ 51

 1.3. Terpénoïdes.................................................................................................. 53

1.4. Alcaloïdes..................................................................................................... 53

1.5. Stress oxydant...............................................................................................54

A.Antioxydants naturels ..................................................................................................... 56

B.Antioxydants synthétiques ..............................................................................................57

MATÉRIEL ET MÉTHODES............................................................................................ 57

1.Extraction des métabolites par un fractionnement solide -liquide........................... 57

2. Dosages et quantification de quelques métabolites secondaires............................. 58

2.1. Dosage des phénols totaux........................................................................... 58

2.2. Dosage des flavones et flavonols................................................................. 59

a) Principe....................................................................................................59

b) Protocole................................................................................................. 59

3. Étude de l’activité antioxydante des extraits........................................................... 60

3.1.Test de DPPH................................................................................................ 60

a. Principe.................................................................................................... 60

b. Protocole expérimental............................................................................60

3.2.Test de FRAP................................................................................................ 61

a. Principe.................................................................................................... 61

b. Protocole expérimental............................................................................61

4. Analyse statistique...................................................................................................62

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS......................................................................................62

1. Rendement d’extraction.......................................................................................... 62

2. Dosages et quantification des phénols totaux et des flavonoïdes............................64

3. L’activité antioxydante des différents extraits........................................................ 71

3.1. Test DPPH.................................................................................................... 71

3. 2. Test FRAP................................................................................................... 75
Conclusion...........................................................................................................................78

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................82

CHAPITRE IV : Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida

rugosa
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................................... 84

1. Lipases.....................................................................................................................84

2. Mécanismes catalytiques......................................................................................... 85

3. Intérêt de l'inhibition de la lipase............................................................................ 86

MATERIEL ET METHODES............................................................................................ 87

1.Extraction des métabolites secondaires.................................................................... 88

3. Activité enzymatique de la lipase Candida rugosa :................................................88

3.Tests d’inhibition de l’activité de la lipase...............................................................89

4.Analyse statistique....................................................................................................90

5. Docking moléculaire............................................................................................... 90

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS......................................................................................91

1.Inhibition de la réaction catalysée par la lipase........................................................91

2.Docking des inhibiteurs sur la lipase de Candida rugosa :.......................................95

Conclusion.........................................................................................................................105

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................................... 105

CONCLUSION GÉNÉRALE....................................................................................... ...111

ANNEXS...........................................................................................................................114
 Liste des Abréviations

A : Absorbance

Ac-O-Et: Acétate d’éthyle

AG : Acide Gras

AGI : Acide Gras Insaturés

AGS : Acide Gras Saturés

CG/SM : Chromatographie phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse

CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance

CPG : Chromatographie Phase Gazeuse

DCM: chlorométhane

DPPH : 1,1-Diphényl-2-Picryl –Hydrazyl

EMAG : Esters Méthyliques d'Acides Gras

F:Feuilles

G im: graines immatures

Gm:graines matures

I (%) : Pouvoir d’Inhibition

IC50 : Concentration inhibitrice

MAG : Masse moyenne des Acides Gras

MeOH : Méthanol

MTAG : Masse moléculaire des TriAcylGlycérols

R: Racines

i
 Liste des Tableaux

Tableau 1 : Quelques caractéristiques de Thapsia garganica.......................................9

Tableau 2 : Quelques travaux réalisés sur Thapsia garganica ..................................13

Tableau 3 : Teneurs en Insaponifiables , cires ,s et les propriétés des huiles de

Thapsia garganica................................................................................................35

Tableau 4 : Composition relative en acides gras des huiles de Thapsia garganica 39

Tableau 5 : Composition relative en acides gras de l’huile de fruit Thapsia

garganica............................................................................................................. 42
Tableau 6 : Quantités des tocophérols dans les huiles de Thapsia garganica......... 43

Tableau 7 : Quantité des stérols dans les huiles de Thapsia garganica......................45

Tableau 8 : Grandes classes de polyphénols chez les végétaux..............................52

Tableau 9 :Teneurs en extraits bruts (m/m %) ....................................................... 63

Tableau 10 : Teneurs en phénols totaux mg EAG/g (MS, Es )...............................66

Tableau 11 : Teneurs en flavonoïdes mg EQ /g (MS, Es )..................................... 66

Tableau 12 : Teneurs en polyphénols et flavonoïdes dans les différentes parties de

Thapsia garganica mg EQ /g MS..................................................................... 71

Tableau 13 : Les valeurs IC50 de test DPPH pour les différents extraits de
Thapsia garganica................................................................................................72

Tableau 14 : Valeurs IC50 de test FRAP pour les différents extraits de Thapsia
garganica exprimées en mg/ml............................................................................76

Tableau 15 :Rendement d’extraction et les valeurs de IC50 des extraits de Thapsia

garganica............................................................................................................. 92

Tableau 16 : Valeurs d’IC50 de quelque extraits naturels selon les références.........94

Tableau 17 : Résultats générés par Autodock Vina après l'analyse........................... 97

ii
 Liste des Figures

Figure 1 :Schéma d’un ombelle................................................................................... 6

Figure 2 : Photographie illustrant les graines de quelques Apiacées (Paloma,

2012)......................................................................................................................7

Figure 3 :Photographie illustrant le genre Thapsia garganica en pleine floraison

(Photo prise le 14 avril 2017 à Tadjmout, Laghouat ).........................................10

Figure 4 : Photographie illustrant les feuilles ,les racines(photos prises le 15 mars

2017)....................................................................................................................10

Figure 5 :La formule générale des glycérophospholipides........................................ 19

Figure 6 : Structure des différentes glycérophospholipides.................................... 19

Figure 7 :Structure des sphingolipides (Moussard, 2004).......................................20

Figure 8 :Structure des différents tocophérols et tocotriénols..................................23

Figure 9 : Structure des phytostérols (Frénot, 2001)..................................................24

Figure 10 :Photographie illustrant le champs de Thapsia.......................................... 25

Figure 11 :Photographie illustrant les feuilles, les graines et les racines de ...... 26

Figure 12 : Photographie illustrant les graines de Thapsia garganica avant et après

l’enlèvement des ailes (photos prises le 20 juillets 2017)................................ 27

Figure 13 : Photographie illustrant les racines de Thapsia garganica après nettoyage27

Figure 14 : Photographie illustrant les différentes parties de Thapsia garganica.......28

Figure 15 : Organigramme présentant la démarche expérimentale pour l’étude de la

fraction lipidique de Thapsia garganica.............................................................. 34

Figure 16 : La teneur en huiles des différentes parties de Thapsia garganica.........35

Figure 17 : Photographie illustrant les cires des feuilles ,racines et graines .......... 38

Figure 18 : L’acide pétrosélinique............................................................................. 41

Figure 19 : Courbe d'étalonnage de la vitamine E..................................................... 43

Figure 20 : Courbe d’étalonnage du cholestérol........................................................ 44

Figure 21 : Procédure d’extraction par fractionnement solide-liquide.......................58

Figure 22 : Réduction du radical libre DPPH............................................................ 60

iii
Figure 23 : Teneurs en résidus secs obtenus par les différents solvants.................... 64

Figure 24 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique................................................. 65

Figure 25 : Courbe d’étalonnage de la quercétine......................................................65

Figure 26 : Histogramme représentant les teneurs en polyphénols dans les

différents extraits................................................................................................. 67

Figure 27 : Histogramme représentant les pourcentages des flavonoïdes dans les

différents extraits................................................................................................. 68

Figure 28 : Régression linéaire entre les taux de phénols et de flavonoïdes totaux...68

Figure 29 : Valeurs IC50 de test DPPH des extraits polaires des différentes parties de73

Figure 30 : Régression linéaire entre les valeurs IC50 et les taux de phénols et de
flavonoïdes ........................................................................................................ 74

Figure 31 : Valeurs IC50 de test DPPH pour les extraits lipidiques de Thapsia
garganica............................................................................................................. 75

Figure 32 : Courbe de réduction de la Vitamine C.....................................................77

Figure 33 : Valeurs IC50 de test FRAP des différents extraits de Thapsia garganica77

Figure 34 : La réaction d’hydrolyse d’un triglycéride par la lipase (Jaeger et al.,

1994)....................................................................................................................84

Figure 35 : Représentations de la structure de la lipase extraite de Thermomyces

lanuginosus en conformations « fermé » et « ouverte ». Le « couvercle » est une
hélice α mobile, indiqué en vert sur le schéma (Ollis et al., 1992)..................... 86

Figure 36 : Schéma réactionnel de l’hydrolyse de p-NPL par la lipase microbienne

(Benarous, 2010)................................................................................................. 89

Figure 37 : Représentations graphiques I %= f (C) des différents extraits de Thapsia

garganica ............................................................................................................ 93

Figure 38 : La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction

moléculaire avec Tribolid ..............................................................................98

Figure 39 : La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction

moléculaire avec Thapsigargicin.........................................................................99

Figure 40 : La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction

moléculaire avec nortrilobolid .....................................................................100

Figure 41 : La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction

moléculaire avec Thapsigargin...................................................................101

iv
Figure 42 : La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction
moléculaire avec Thapsivillosin C............................................................. 102

Figure 43 : La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction

moléculaire avec Tribolid Tribolid............................................................103

Figure 44 : La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction

moléculaire avec Tribolid de nortribolid................................................104

v
Introduction
 Introduction

Les plantes ont été depuis longtemps une source essentielle de médicaments. Une
majorité de la population, et plus particulièrement dans les pays en voie de
développement, se soigne uniquement encore avec des remèdes traditionnels à base de
plantes ( Lavergne,1990).

L’industrie pharmaceutique elle-même s’appuie encore largement sur la diversité des

métabolites secondaires végétaux pour trouver de nouvelles molécules aux propriétés
biologiques inédites. Cette source en plantes médicinales semble inépuisable puisque
seule une petite partie de 400000 espèces végétales ont été investiguée sur le plan
phytochimique, et que chacune d’elles peut contenir jusqu’à plusieurs milliers de
constituants différents (Waridel, 2003).

Les médecines complémentaires et traditionnelles, dont fait partie la phytothérapie, ont

été reconnues par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme très importantes,
voire incontournables dans certains pays, dans les soins de santé primaires. L’OMS
encourage donc vivement tous les pays membres à réaliser une politique d’intégration de
ces médecines dans leurs systèmes de soins de santé primaire, et elle préconise de
développer les connaissances sur ces différentes pratiques ainsi que la formation des
acteurs de santé. Elle a établi des guides de bonnes pratiques afin de réaliser des études
scientifiques sur ces médecines traditionnelles et complémentaires ( Lavergne,1990;Tiré
de Comité OMS 1996)

Dans le but de la recherche de nouvelles molécules bioactives, il est préférable de ne pas

baser le choix de plantes à étudier sur le seul hasard, mais de circonscrire ce choix selon
divers critères et considérations, le plus utilisé est celui de leur utilisation en médecine
populaire qui valorise l’expérience accumulée par les autochtones dans le monde entier.

La flore algérienne est caractérisée par sa diversité florale: méditerranéenne, saharienne

et une flore paléo tropicale, estimée à plus de 3000 espèces appartenant à plusieurs
familles botaniques. Ces espèces sont pour la plupart spontanées avec un nombre non
négligeable (15 %) d’espèces endémiques (Ozenda, 1977).

2
 Introduction

Dans le cadre de la connaissance et la valorisation des produits naturels d’origine

végétale de notre pays. Nous procéderons à l’étude de l’espèce Thapsia garganica
(famille d’Apiacées). Cette plante a fait l'objet de plusieurs études scientifiques montrant
qu'elle est une source importante de composés bioactifs (Avato et al ., 2001). Ainsi, on a
mené dans des travaux antérieurs une étude préliminaire sur l’étude de la fraction lipidique
de ses graines et les résultats obtenus sont motivants ce qui nous a encouragé de vérifier
les raisons de l’usage de cette plante en médecine traditionnelle grâce à l’étude de
quelques activités biologiques comme le pouvoir anti-radicalaire et l’activité enzymatique.

Le choix de cette plante est basé sur les critères suivants:

 Plante utilisée depuis longtemps dans la médecine traditionnelle , comme remède

contre les rhumatismes et contre les douleurs de sciatique (Makunga et al ., 2003);
 Très répandue en Algérie et notamment dans la région de Laghouat et non
investiguée sur les plans phytochimique et pharmacologique ;
 Étudier pour la première fois la composition en lipides et l’activité antioxydante de
différents extraits lipidiques et phénoliques des graines , feuilles et racines de
cette plante.
 Aucune étude n’a été entreprise sur l’évaluation du pouvoir inhibiteur de Lipase
par les extraits de Thapsia garganica.

L’objectif de notre étude est la valorisation phytochimique des graines ,feuilles et

racines de Thapsia garganica. Les principales parties de ce travail seront traitées selon
le plan suivant :

Le premier chapitre de cette thèse sera consacré à la revue bibliographique des

connaissances concernant l’espèce étudiée. Elle inclut la présentation botanique de la
famille d’ombellifère et de l’espèce Thapsia garganica, ses principaux métabolites, ses
usages traditionnels et activités biologiques,

3
 Introduction

Le deuxième chapitre sera destiné au travail expérimental. Il consiste en l’étude des

huiles fixes des différentes parties de la plante.

Le troisième chapitre portera d’une part aux dosages des polyphenols totaux et
flavonoïdes présents au niveau des différentes parties des plantes et d’autre part sur l’étude
de l’activité antioxydante des différents extraits lipidiques et des extraits polaires .

La dernière partie est consacrée à l’étude de l’activité enzymatique des extraits acétate
d’ethyle des différentes parties de Thapsia garganica en mesurant leurs pouvoirs
inhibiteurs vis-à-vis de la lipase de condida rigusa , ensuite l’étude par la baie du
Docking moliculair ,et de la capacité de leurs principales molécules bioactives à inhiber
les lipases de condida rigusa et pancréatique comme une des cibles pour le traitement de
l’obésité .

Enfin, une conclusion générale qui résumera l’ensemble des résultats obtenus

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

AVATO, Pinarosa, FANIZZI, Francesco Paolo, et ROSITO, Isabella. The genus Thapsia
as a source of petroselinic acid. Lipids, 2001, vol. 36, no 8, p. 845-850.
LAVERGNE, Roger. Le grand livre des tisaneurs et plantes médicinales de La Réunion.
Copyright Gérard Doyen et Roger Lavergne, 1990.
MAKUNGA, N. P., JÄGER, A. K., et VAN STADEN, J. Micropropagation of Thapsia
garganica—a medicinal plant. Plant Cell Reports, 2003, vol. 21, no 10, p. 967-973.
OMS. Lignes directrices concernant l’évaluation des médicaments à base de plantes. Tiré
de Comité OMS d’experts des spécifications relatives aux préparations pharmaceutiques.
Trente-quatrième rapport. Genève, 1996:188-194
OZENDA, P. Flore du Sahara: Editions CNRS. 1977.
WARIDEL, Patrice. Investigation phytochimique des plantes aquatiques Potamogeton
pectinatus L., P. lucens L., P. perfoliatus L. et P. crispus L.(Potamogetonaceae). 2003.
Thèse de doctorat. Université de Lausanne, Faculté des sciences.

4
 Chapitre I

Étude botanique de Thapsia garganica

 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

1. Présentation de la famille d’Apiacées

La famille d’Apiacées (Ombellifères) est l'une des familles des plantes les plus connues
avec des caractères botaniques propres tels que:

 L’inflorescence en ombelle typique

 Formation des fruits secs spécialisés

L’Inflorescence est se forme d’ombelle simple dans laquelle les pédoncules floraux sont
tous insérés au même point de la tige, et les fleurs sont toutes disposées sur une même
surface sphérique, ou parfois plane (Figure1). C’est la raison pour laquelle on la nomme
famille d’Ombellifères (Rasmussenet et Avato, 1998).

Figure 1:Schéma d’un ombelle

Le nombre des sépales, pétales et étamines d'une fleur individuelle est de cinq pour
chacune. Le pistil unique avec un ovaire infère composé de 2 carpelles, avec un ovule
dans chacun. Après la fécondation, l'ovaire se développe en un fruit (Rasmussenet et
Avatoa, 1998).

Dans cette famille il y a environ 300 genres et plus de 3000 espèces largement distribués
dans les régions tempérées où ils sont souvent utilisés comme des épices ou des
médicaments en raison de la présence de métabolites secondaires tels que des coumarines,
huiles essentielles et sesquiterpènes (Rasmussenet et Avato, 1998; Glimn-Lacy et
Kaufman , 2006).

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 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

Certaines plantes de cette famille sont en particulier utilisées lors de troubles digestifs
comme les ballonnements et les douleurs intestinales ; il s’agit de l’aneth (Anethum
graveolens L.), l’angélique (Angelica archangelica L.), l’anis (Pimpinella anisum L.), le
carvi (Carum carvi L.), la coriandre (Coriandrum sativum L.).Toutes ces espèces (Figure 2)
sont utilisées en Algérie et en plusieurs pays comme des épices (Paloma, 2012)

Pimpinella anisum L , Anis vert ( ‫)يانسون‬ Cuminum cyminum L ,Cumin ( ‫) كمون‬

Carum
, carvi L,le carvi ( ‫)كراوية‬ Coriandrum sativum L,la coriandre (‫)البقدونس‬
Figure 2: Photographie illustrant les graines de quelques Apiacées (Paloma, 2012)

2. Présentation du genre : Thapsia

Ce genre était bien connu par les anciens qui lui ont donné son nom propre, estimant qu'il
a été obtenu à l'origine de l'île de Thapsus (Morinet , 1809). Il s’agit d’un petit genre
d'environ huit espèces distribuées dans la région Méditerranéenne. Son centre de diversité
est situé dans la Méditerranée occidentale et se prolonge aux Côtes Atlantiques du
Portugal et du Maroc ( Pujadas-Salvaà, et Plaza-Arregui, 2003).

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 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

Thapsia est très commun dans tout le pourtour méditerranéen, surtout abondant dans Ie
Maghreb et, plus particulièrement, en Algérie où il est adapté à la sécheresse
méditerranéenne et à l' aridité des steppes et des montagnes sahariennes; tous les sols lui
conviennent, depuis les sables maritimes jusqu'aux sables sahariens.

Taxonomiquement, Thapsia est un genre complexe. Ainsi Tutin (1968) cite seulement
trois espèces (Thapsia garganica L, Thapsia maximum Mill et Thapsia villosa L)
( Pujadas-Salvaà, et Plaza-Arregui, 2003). Mais des études récentes ont ajouté, caractérisé
et différencié d'autres espèces telles que le Thapsia gymnesica rosselló (1991,
1997), Thapsia transtagana Brot (1995), Thapsia mineur Hoffmanns et Thapsia nitida
Lacaita (1996, 2000) ( Pujadas-Salvaà, et Plaza-Arregui, 2003).

3. Présentation de l’espèce : Thapsia garganica L

3.1. Description Botanique

Classification botanique (Selon la classification de Drude's 1898) (Rasmussenet et Avato,

1998).

Règne : Plantae

Famille : Umbelliferae (Ombellifères)

Sous famille : Apiodeae

Genre : Thapsia

Espèce : Thapsia garganica L

Noms habituels en Arabe : Bou nâfaa , Drias ( Youssef M Ait , 2006).

Thapsia garganica L (Figures 3 et 4) est une plante toxique, son aire de répartition est
méditerranéenne, en Algérie, au Maroc, en Tunisie, et en Libye. Il s’agit d’une plante
herbacée vivace ( Youssef M Ait , 2006):

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 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

 Sa racine possède une écorce qui se présente sous forme de fragments, sa face
externe est de couleur jaune brunâtre très claire, sa face interne est blanche, l’odeur
de l’écorce de racine est presque nulle alors que sa saveur est à la fois piquante et
caustique ;
 Sa tige est glabre et striée ;
 Les feuilles sont glabres ou à peine pubescentes en dessous, elles sont de couleur
verte, leur forme diffère selon leur place ;
 L’inflorescence est en ombelle ;
 Le fruit est de forme elliptique, comprimé à sa face dorsale, possède des marges
fortement ailées, ces ailes latérales, très développées, sont cordiformes à leurs
extrémités, et sont finement striées ; elles ont une couleur jaune brillante.
Le Tableau1 présente quelques caractéristiques de cette plante.

Tableau 1: Quelques caractéristiques botaniques de Thapsia garganica ( Pujadas, et

Plaza, 2003).

Taille de la plante (cm) 54-110

Forme de fruit elliptique

Fruit (mm) 15–22 x 10–17

Limbe (cm) 29-35 x 13-24

Forme de limbe 2 ou 3 pennatiséquées

Contour de lobe final Linéaire:oblongue ou lancéolées

Apex de lobe final Obtus spongiforme, mucroné

Face ventrale de limbe glabre

Face dorsale de limbe glabre, rarement subglabre

Couleur de la surface supérieure du limbe verte

Couleur de la surface inférieure du limbe Glauque ou verte pâle

Couleur de pétales jaune-foncé

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 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

Figure 3:Photographie illustrant le genre Thapsia garganica en pleine floraison

(Photo prise le 14 avril 2017 à Tadjmout, Laghouat )

Figure 4: Photographie illustrant les feuilles ,les racines(photos prises le 15 mars 2017)
et les graines de Thapsia garganica (Photo prise le 10 juin 2017 à Tadjmout, Laghouat )

3.2. Utilisations de Thapsia garganica en médecine traductionnelle et moderne

Thapsia garganica L est largement distribué dans tout le secteur méditerranéen et la

Péninsule Ibérique. Sa résine cause une dermatite de contact et est utilisé par les Nord-
Africains pour des raisons médicales (Makunga et al ., 2003).

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 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

Elle est connue par les Berbères et les Arabes dans le traitement des pathologies
pulmonaires. Sa préparation est particulière : pour « l’ engraissement », elle est préparée
sous forme d’une pâte absorbée. Contre les douleurs et les problèmes pulmonaires, ils
utilisent la racine qui est préparée souvent avec de l’huile pour frotter la partie malade
du corps (Schmitt UW, 2005).

Les extraits de racines de Thapsia garganica ont été utilisés dans la médecine
traditionnelle européenne et arabe pour le traitement des affections pulmonaires, rhume et
le soulagement des douleurs rhumatismales (French, 1971 ). Ses extraits contiennent des
irritants puissants de la peau, constituant une importante cause de dermatite de contact qui
se manifeste par un érythème, des démangeaisons et la formation de petites vésicules. Les
principaux composés actifs des extraits de racines, responsables de ces effets ont été
identifiés par Christensen et al. (1981) comme étant des sesquiterpènes connus sous le
nom de thapsigargine et thapsigargicine

Thapsia garganica est aussi utilisée par les Berbères contre les rhumatismes et les
douleurs de sciatique (Youssef M Ait , 2006).

Les principaux composés bioactifs synthétisés par Thapsia garganica sont :

thapsigargine , thapsigargicin, notrilobolid et thapsivillosin .Des recherches scientifiques
sur les activités biologiques de ces composés ont mené à l'identification du thapsigargin et
du thapsigargacin en tant qu'inhibiteurs sélectifs puissants de Ca2+- ATPases dans le
réticulum endo et sarco- plasmique des cellules animales. Une recherche Pharmacologique
a également prouvé que ces thapsigargins ont une capacité de stimuler sélectivement les
différentes cellules du système immunitaire (Makunga et al ., 2003)..

Hakii et autres (1986) ont identifié le thapsigargin comme non-ATP instigateur de

tumeur dû à sa capacité de favoriser le deuxième stade de carcinogenèse par
l'intermédiaire d'un mécanisme qui ne fait pas impliquer directement l'activité de la
protéine kinase C (Makunga et al ., 2003)..

Aussi des études ont montré que thapsigargin et ses analogues induisent l’apoptose
(mort cellulaire programmée) des cellules cancéreuses humaines et sont actuellement
développées comme des agents thérapeutiques pour le traitement du cancer (Makunga
et al ., 2003).

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 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

3.3.Toxicité de Thapsia garganica

Toute la plante est toxique par sa résine, jaune ou légèrement rougeâtre, rubéfiante et
vésicante, particulièrement abondante dans l' écorce de la racine. (Hammiche, 2013)

Les intoxications animales ne sont pas rares, surtout pour les troupeaux nomadisant loin
de leur aire naturelle de pâturages; ainsi, les chameaux qui confondent les jeunes pousses
de Thapsia avec une Ombellifere saharienne (Avato,2001;Perrot1943). Les intoxications
humaines sont toutes dues aux utilisations traditionnelles mal maîtrisées (Hammiche,
2013) .

3.4. Travaux antérieurs

L’importance médicinale de Thapsia garganica a donné naissance à plusieurs études

scientifiques pour l’étude des composés bioactifs synthétisés de cette plante. Les
principaux travaux sont recueillis dans le Tableau 2.

Quelques chercheurs sont intéressés par la composition lipidique des graines de

Thapsia garganica , comme Pinarosa Avatoail, qui a pu identifier l’acide pétrosélinique
C18:1ω6 un isomère de l’acide oléique C18:1ω9. Cet acide gras est une source très
intéressante pour la nourriture, cosmétique et pour l’industrie pharmaceutique (Avatoa et
al., 2001). Alors que la plupart d’ autres travaux se concentrent sur l’ étude et
l’extraction des composés actifs comme le thapsigargin , ainsi que des études botaniques
liées à la révision taxonomique de l’espèce.

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 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

Tableau 2: Quelques travaux réalisés sur Thapsia garganica

Travail réalisé Référence
Le genre Thapsia : une source d'acide pétrosélinique Avato, et al., 2001
Micro propagation de Thapsia Makunga et al., 2001
Caractérisation des chromosomes et l'étude de l'organisation du
Rasmussenet et Avato,
génome de Thapsia garganica L par localisation des gènes d'ARNr
1998
Pujadas-Salvaà et Plaza-
Des études sur l’éspèce Thapsia (Apiaceae) de l’Afrique du nord
Arregu, 2003
Lipides Cycliques de Thapsia garganica Liuet al .; 2004
Effet de la thapsigargine sur les cellules du muscle cardiaque Wrzosek et al., 1992
Nouvelles approches expérimentales pour traiter le Cancer de la
prostate Cavarrettaet al., 2005
Activité antioxydante des extraits phénoliques de certaines plantes
médicinales algériennes Djeridane et al., 2006
Flavonoïdes dans les fruits des Ombellifères Harrone et Williams, 1971
Des plantes comme source d'agents anti-cancer Cragg et Newman , 2005
L'isolement de phénylpropanoïdes cytotoxiques et un analogue
supplémentaire de thapsigargine à partir Thapsia garganica Liu et al., 2006
Identification et caractérisation d'une kunzeaol synthase provenant de
Thapsia garganica Pickel et al ., 2012

Purification à grande échelle de Thapsigargin Olivier et al ., 2013

Chimiodiversité des huiles volatiles de Thapsia garganica L. Hassen et al., 2015

La localisation et la caractérisation in vivo de Thapsia garganica
CYP76AE2 indiquant un rôle dans la biosynthèse de Thapsigargin Andersen et al., 2017

13
 Chapitre I: Étude botanique de Thapsia garganica

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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15
 Chapitre II
Étude de la fraction lipidique
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

1.Lipides

Les lipides (du grec lipos : graisse) forment un groupe de différentes molécules qui se
dissolvent facilement dans les solvants organiques mais très peu dans l’eau .Ils
comprennent les graisses, les huiles ainsi que les phospholipides et les glycolipides qui
constituent les bicouches membranaires .Les stérols et les molécules qui comportent une
grande chaîne d’hydrocarbures tels que les pigments chlorophylliennes ou les caroténoïdes,
bien qu’ils sont chimiquement différents, sont considérés comme des lipides sur la
base de leurs solubilité (Hopkins, 2003)

2. Classification

Il existe plusieurs classifications pour cette famille de molécules, dont l'une des plus
importantes est celle qui repose sur la structure; on distingue ainsi (Charpentieret al.,
2008) :

2.1. Lipides vrais

Des esters d'acides gras et d'alcool. Ils sont saponifiables, c'est-à-dire qu'ils forment des
savons lors de leur hydrolyse par une base forte en milieu alcoolique. Ils se subdivisent en
lipides simples et lipides complexes(Charpentieret a., 2008):

A) Lipides simples

Composés uniquement de carbone C, d'hydrogène H et d'oxygène O parmi ces lipides

simples, nous trouvons les glycérides, les cérides et les stérides (Charpentieret al., 2008).

 Glycérides

Des graisses neutres hydrophobes, insolubles dans l'eau, et dont le point de fusion est
d'autant plus élevé que le taux d'acides gras insaturés entrant dans leur composition est
plus faible, leurs principales propriétés chimiques sont dues aux fonctions esters, à la
chaîne aliphatique de l'acide gras et, surtout, aux doubles liaisons.

17
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Les glycérides sont donc des esters du glycérol et des acides gras. Ils sont présents dans
la quasi-totalité des tissus de tous les êtres vivants. Ils sont particulièrement abondants
dans le tissu adipeux, où ils constituent la principale forme de stockage des lipides
(Charpentieret al., 2008;Hopkins, 2003) .

 Cérides

Les cérides sont les principaux constituants des cires animales ou végétales. L'alcool
estérifiant l'acide gras n'est plus de glycérol mais un alcool à longue chaîne. Les
acides gras présents sont en général saturés, rarement insaturés et très rarement
hydroxylés (Charpentier et al., 2008; Alaiset al ., 2003).
Céride= acide gras + alcool à longue chaîne

 Stérides

Les stérides sont des esters d'acide gras et de stérol, ils se rattachent à l’enchainement
biochimique ayant pour base l’isoprène actif (Charpentieret al,. 2008; Alaiset al ,. 2003).
Stéride= acide gras + stérol

B) Lipides complexes

Les lipides complexes sont également dénommés hétérolipides, composés non seulement
de carbone C, de l'oxygène O et de l'hydrogène H, mais aussi de l'azote N et du
phosphore P. Ils comprennent essentiellement deux familles : les glycérophospholipides et
les sphingolipides (Charpentieret al., 2008).

 Glycérophospholipides

Les glycérophospholipides (Figure5), encore appelés phospholipides ou

phosphoglycérides , résultent de l'association des acides gras et de l’acide phosphatidique
(Charpentieret al., 2008).

Glycérophospholipide = acide gras + acide phosphatique

18
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Leur formule générale sera donc

Figure 5:La formule générale des glycérophospholipides

Les glycérophospholipides sont des 1,2-diacylglycérols avec en position 3, un résidu

phosphorique, lui-même lié à un hydroxyaminoacide (sérine), à une amine hydroxylée
(choline, éthanolamine) ou un polyol (inositole) (Figure6)

Figure 6: Structure des différentes glycérophospholipides

19
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Par opposition aux triacylglycérols, les glycérophospholipides sont des corps polaires
leurs propriétés originales sont l’amphiphilie, miscibles à l’eau et solubles dans les lipides
ils servent de lien physique entre les lipides et les constituants hydrosolubles comme les
protéines (Frénot et Vierling, 2001).

 Sphingolipides

Les Sphingolipides sont des esters d’acide gras et de sphingosine qui est un alcool aminé
à long chaine. Ils sont également dénommés céramides e(Charpentieret al., 2008).

Sphingolipide = acide gras + sphingosine

La sphingosine est unie à un acide gras par une liaison amide pour former une céramide
(Figure 7). La céramide est unie :

- Par une liaison ester à la phosphorylcholine (quelque fois la

phosphoryléthanolamine) pour former les sphingomyèlines ;
- par une liaison O-glycosidique à un ou plusieurs sucres pour former les
sphingoglycolipides :
 Les cérébrosides dont le monosaccharide est souvent le galactose,
 Les gongliosides dont l’oligosaccharide est caractérisé par la présence d’acides
sialiques (acide neuraminique N-acétylé ou N-glycosilé) (Moussard, 2004).

Figure 7:Structure des sphingolipides (Moussard, 2004).

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 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

2.2. Les composés à caractères lipidiques

Ce sont les composés naturels qui ne font pas partie des lipides vrais (liaison avec des
acides gras, saponification) mais qui en possèdent la plus part des propriétés des lipides
(physiques et chimiques), tout particulièrement la solubilité : insolubles dans l’eau et
solubles dans les solvants organiques. Ils se divisent en icosanoïdes et isoprénoïdes
(Charpentieret al., 2008).

 Icosanoïdes

Dérivés d'un acide gras à 20 atomes de carbone: prostaglandines, leucotriènes,

thromboxanes, ils jouent un rôle de médiateurs chimiques (Charpentieret al., 2008).

 Isoprénoïdes

Appelés aussi lipides isopréniques, avec les terpènes (vitamines liposolubles, composés
aromatiques d'huiles essentielles, hormones d'insectes) et les stéroïdes (le cholestérol, les
acides biliaires, la vitamine D, les hormones stéroïdes). Ils sont synthétisés à partir de
l’isoprène . (Charpentieret al., 2008).

3. Données générales sur les acides gras

Ce sont des acides carboxyliques à nombre pair de carbone, à longue chaîne carbonée.
Saturée ou non, la longueur de chaîne dépend du nombre d’atomes de carbone qui la
constituent. On distingue les acides gras à chaîne courte (4 à 6 C), moyenne (8 à 12 C) et
longue (plus de 20 C). La fonction acide réagit avec les alcools et les amines( Voet et al.,
2005). Ils sont rarement à l’état libre dans la nature, et se trouvent essentiellement sous
forme estérifiée comme constituant majeur de lipides ( Cuvelier et al ., 2004)

Parmi les acides gras saturés, ceux en C12, C16 et C18 sont les plus largement distribués,
alors que parmi les acides gras insaturés, ceux en C18 pourvus de 1, 2 ou 3 doubles
liaisons sont les plus importants au sein du monde végétal et animal terrestre. Les acides
gras à 4 ou plus de 4 doubles liaisons et 20 à 24 atomes de carbone sont quant à eux
majoritaires dans le monde marin.

21
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

3.1.Acides gras saturés

La formule chimique générale des acides gras saturés est la suivante :CH3 – (CH2) n –
COOH, leurs points de fusion augmentent avec la masse moléculaire ( Cuvelier et al .,
2004).
3.2.Acides gras insaturés

Les acides gras insaturés peuvent contenir entre 1 et 6 doubles liaisons et sont dits, selon
le cas, mono insaturés ou polyinsaturé, les acides gras insaturés diffèrent donc entre eux
non seulement par la longueur de la chaîne carbonée, mais aussi par le nombre, la position
et la structure spatiale (cis, trans) des doubles liaisons ( Cuvelier et al ., 2004; Brisson,
1982.)

4. Données générales sur les tocophérols

Le nom tocophérols a été proposé pour la première fois en 1936 par Evans et ces
collaborateurs. Ce nom provient du grec tokos pour progéniture et pherein pour porter.
Cette famille comprend 4 substances : l’  -tocophérol, qui est la vitamine E proprement
dite, le -tocophérol, le -tocophérol et le -tocophérol.

Ces composés ont, par ailleurs, beaucoup de similitudes structurelles avec 4 autres
molécules appartenant aux tocotriénols : l’-tocotriénol, le -tocotriénol, le -tocotriénolet
le -tocotriénol.

Les tocophérols diffèrent entre eux par le nombre et les positions des groupes méthyles
dans le cycle aromatique. Ils possèdent tous, en position 2, un groupe méthyle et une
chaîne carbonée saturée ou insaturée .Si cette chaîne présente trois insaturations avec des
configurations trans, les composés correspondants sont des tocotriénols (Figure 8)
(Milcent et Chau, 2003; Cuveliet et al ., 2003)

22
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

R1

OH 5 4
a
6 10 3
CH 3 R
7
1
R2 9 O 2
8
R
b
CH 3

Structure
R1 R2 a b
CH3 CH3 -tocophérol -tocotriénol

H CH3 -tocophérol - tocotriénol

CH3 H -tocophérol - tocotriénol

H H -tocophérol - tocotriénol

Figure 8:Structure des différents tocophérols et tocotriénols

Les tocophérols sont largement distribués dans les plantes, ce sont des produits huileux à
température ordinaire, stables à l’action d’acide et au chauffage modéré .En revanche ils
sont facilement oxydables. Les principaux rôles de tocophérols sont (Bourre, 2004 ):

 Ils neutralisent les formes actives et toxiques de l’oxygène ;

 Ils inhibent les radicaux libres ;
 Ils contribuent à maintenir l’intégrité et la stabilité des structures cellulaires.

5. Données générales sur les stérols

Composés tétracycliques, avec 27 à 29 carbones, ils sont représentés uniquement par le

cholestérol dans le règne animal, et par de très nombreuses variétés dans le règne végétal
ils représentent environ 30 à 60 % des insaponifiables.

Les stérols végétaux (phytostérols) sont présents dans les lipides des plantes notamment
dans les huiles de noix, de graines, de céréales et de fruits. Ils empêchent l’absorption de
cholestérol présent dans les aliments en formant des précipités insolubles, non absorbés
dans l’intestin (Frénot, 2001; Jacotot, 2003).

23
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Le stérol le plus abondant dans le règne végétal est sans conteste le sitostérol suivi du
campestérol, puis le stégmastérol (Figure 9) (yousfi, 2005).

Le cholestérol longtemps considéré comme exclusivement animal a été mise en

évidence chez de nombreux végétaux cependant en petite quantité par apport aux autres
stérols (Behrman, 2005)

Cholestérol Stigmastérol

Campésterol Β-sitostérol

Figure 9: Structure des phytostérols (Frénot, 2001).

24
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

MATERIEL ET METHODES

1. Préparation de la matière végétale

Dans le but d’étudier la fraction lipidique des graines,feuilles et racines de Thapsia

garganica, nous avons réalisé la récolte à partir d'un champ spontané riche en cette plante
situé dans la région de Tadjmout, wilaya de Laghouat (Figure10) . Pendant cette période
nous avons suivi la croissance de la plante ,elle est caractérisée par un cycle végétatif court
qui débute le mois de janvier et se termine le mois de juillet . Durant cette
période ,Thapsia garganica reste intact parce qu’elle n’est pas touchée par les animaux qui
passent par cette région .

Pour ce travail , la cueillette est réalisée le mois de mars pour les racines et les feuilles, et
le mois de mai et Juin pour les graines immatures et matures respectivement. Cette
opération doit être effectuée en prenant des précautions surtout pendant l’enlèvement des
racines pour éviter toute dermatite de contact .

Figure 10:Photographie illustrant le champs de Thapsia

(photos prises entre Mars et Juin 2017 à Tadjmout , Laghouat )

25
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Indépendamment de la méthode utilisée, l’extraction des huiles comporte généralement

diverses opérations préliminaires, telles que; le séchage, le nettoyage ,le décorticage et le
broyage(Karleskind, 1992).

La matière végétale a été préparée de cette manière :

 Séchage à l’air, à l’ombre et à température ambiante pendant 2 mois (Figure11 );

 Séparation des graines des ombelles et enlèvement des impuretés ;
 Les ailes ont été séparées manuellement des graines (Figure 12) ;
 Les racines sont bien nettoyées et nous avons enlevé écorce (Figure13 );
 Les différentes parties sont finement broyées après séchage (Figure14) .

Figure 11:Photographie illustrant les feuilles, les graines et les racines de

Thapsia garganica après séchage (photos prises le 20 juillets 2017)

26
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Figure 12:Photographie illustrant les graines de Thapsia garganica avant et après

l’enlèvement des ailes (photos prises le 20 juillets 2017)

Figure 13:Photographie illustrant les racines de Thapsia garganica après nettoyage

(photo prise le 20 juillets 2017)

27
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Graines im Graines m

Racines Feuille

Figure 14: Photographie illustrant les différentes parties de Thapsia garganica

après broyage

2. Extraction

L’extraction doit être totale et ne doit pas modifier la nature de la matière grasse. Elle a
le plus souvent un double objectif :

 L’analyse de la matière grasse

 L’étude de l’activité antioxydante des huiles obtenues

28
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

L’extraction par solvant est la méthode la plus largement répandue pour l’obtention des
huiles. Il s’agit d’une opération de transfert de matière engendrée par le contact entre un
solide qui contient le soluté, et un solvant qui le solubilise (Karleskind, 1992). La
solubilité des lipides est un critère important pour leurs extractions, elle dépend
essentiellement de la nature du lipide, la proportion des lipides apolaires (principalement
les triglycérides) et lipides polaires (phospholipides et glycolipides). Donc plusieurs
solvants peuvent être employés en fonction de la nature et la composition de
l’échantillon (Wrolstad et al ., 2005)

Dans le but d’étudier la fraction lipidique des graines de Thapsia garganica, nous avons
adopté la méthode de l’extraction par Soxhlet avec l’utilisation de l’hexane comme
solvan.L’extraction est réalisée pendant 24 h, et après filtration, le solvant est évaporé
sous pression réduite à 45°C. Les extraits obtenus sont pesés et la teneur en huile a été
calculée par la relation suivante :

Teneur en huiles = ( m de l'huile extraite / m poudre végétale )x 100

3. Décoloration

La décoloration est une opération qui vise à éliminer les pigments colorés . Elle fait
intervenir un phénomène physique : l’adsorption sur des terres décolorantes, du charbon
actif, des silices spéciales ou des combinaisons de ces substances(Karleskind,1992)

4. Extraction des cires

Parmi les propriétés des cires est l’insolubilité dans l’alcool à froid (Fryer et
weston,.1918).Les cires des différentes parties de Thapsia garganica sont extraites par
solubilisation de toute la quantité obtenue dans un volume approprié d’éthanol et on laisse
le mélange au réfrigérateur à 40℃ pendant 24 heures , le mélange est ensuite filtré pour
récupérer les cires .

29
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

5. Préparation des esters méthyliques des acides gras des différentes huiles de
Thapsia garganica

Les acides gras sont des constituants essentiels des triglycérides, c’est par leur
connaissance qu’on peut déterminer les caractéristiques d’identité des corps gras.Leurs
analyses par CPG doivent être faites à l’état libre, donc ils sont préalablement
transformés en dérivés, généralement des esters méthyliques (EMAGs) grâce à leurs
polarités moyennes et à leurs volatilités. Cette technique permet de séparer les EMAGs en
fonction de leur nombre d’atomes de carbone mais aussi en fonction du nombre et de la
position des doubles liaisons, ainsi que d’éventuels groupes fonctionnels (Guingnard et al.,
1985).
Dans ce travail, nous avons préparé les EMAG par la méthode recommandée par ‹‹
International Union of Pure and Applied Chemestry ››, en présence d’un catalyseur acide,
le trifluorure de bore (BF3) (Cocallemen et al., 1988). Le corps gras est dans un
premier temps saponifié en présence de potasse méthanolique, l’estérification est ensuite
réalisée en présence de BF3/ Méthanol (réactif prêt à l’emploi). Après addition d’eau, les
esters sont récupérés à l’aide d’un solvant(Olle, 1996).

5.1.Saponification

Dans un ballon on pèse 2 g d’huile, on ajoute 20 ml de solution méthanolique de potasse

(0,5N), celui-ci est adapté au réfrigérant, et porté à reflux pendant 1h30 . puis on
ajoute 20 ml d’eau distillée. La phase aqueuse basique contenant les acides gras, sous
forme de sels de potassium est extraite 3 fois par 50 ml de diéthyl éther pour obtenir les
insaponifiables.

5.2.Estérification

Le trifluorure de bore BF3 est l'un des catalyseurs les plus couramment utilisés pour la
préparation des EMAG en raison de sa haute puissance d’estérification, bien que celà ne
signifie pas nécessairement que ce réactif est le meilleur. En fait, le BF3 méthanolique est
toxique, coûteux et relativement instables, et l'utilisation des solutions trop concentrées
peut entraîner la perte de grandes quantités d'acides gras polyinsaturés (Carrapiso et
García, 2000)

30
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Les acides gras, dissous dans la phase aqueuse sous forme de sels de potassium, sont
régénérés par addition d’une solution d’acide chlorhydrique à 10%. Ils sont ensuite
extraits par trois lavages avec 50 ml de dichlorométhane . La phase organique obtenue est
lavée à l’eau distillée, séchée par le sulfate de sodium anhydre et évaporée sous pression
réduite. Ensuite, les acides gras obtenus sont mis en solution dans 10 ml d’une solution
méthanolique de trifluorure de bore à 10 %, et portés à reflux pendant 10 min. Après
refroidissement ( presque 5 minutes), on ajoute 20 ml d’eau distillée. Les esters
méthyliques sont extraits par trois lavage par 20 ml de diéthyléther . La phase obtenue est
lavée plusieurs fois à l’eau distillée, séchée par sulfate de sodium anhydre puis évaporée
sous pression réduite. Les esters méthyliques (EMAGs) ainsi obtenus sont conservées au
réfrigérateur à 4°C.

5.3.Analyse des esters méthyliques par CG/SM

La chromatographie en phase gaseuse (CPG) est une technique très répandue, dont les
premières applications sont maintenant vieilles plus de 60 ans ,sur des composés qui
doivent être à l’état gazeux , l’échantillon est injecté en tête de la colonne, l’ élution est
assurée par un flux de gaz inerte qui sert de phase mobile, contrairement à la plupart des
autres types de chromatographie, il n’y a pas interaction entre les molécules analysées
et la phase mobile (Rouessac et al., 2004).
L’analyse des acides gras après estérification a été effectuée par un couplage
Chromatographie en Phase Gazeuse/Spectrométrie de Masse (CG/SM). Lors de cette
analyse, nous avons utilisé un chromatographe: 1 HP 5890 série II, La séparation a été
faite sur une colonne capillaire de silice de 60 m de longueur et 0.25 mm de diamètre,
sur laquelle est greffée une phase stationnaire DB-Wax avec 0.2µm d’épaisseur. L’analyse
a été faite en programmation de température et par l’utilisation d’hydrogène comme
gaz vecteur .

6. Extraction des insaponifiables

Les insaponifiables sont un mélange complexe qui contient des composés non
glycéridiques extractibles par les solvants peu polaires après une hydrolyse alcaline des
huiles, ils sont connus par leurs activités biologiques importantes comme les pigments et
les vitamines solubles (vitamine A, vitamine E).

31
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

6.1. Protocole

Dans un ballon on pèse 2 g d’huile, on ajoute 20 ml de solution méthanolique de potasse

(0,5N), celui-ci est adapté au réfrigérant, et porté à reflux pendant 1h30 . puis on
ajoute 20 ml d’eau distillée. La phase aqueuse basique contenant les acides gras, sous
forme de sels de potassium est extraite 3 fois par 50 ml de diéthyl éther pour obtenir les
insaponifiables.

La fraction organique obtenue après saponification est séchée par sulfate de sodium
anhydre, filtrée puis évaporée sous pression réduite. On obtient ainsi la fraction
insaponifiable. Le rendement en composés insaponifiables est obtenu par pesée du contenu
du ballon après évaporation sous pression réduite

7. Étude des tocophérols

L’activité en vitamine E est la résultante naturelle de 8 molécules dont les structures

dérivent de celles des tocophérols et les tocotriénols. Chaque vitamère a une activité
vitaminique différente, comparée à celle de l’α-tocophérol qui est considérée comme la
forme primaire la plus active ( Greenfield et Southgate, 2007)

La méthode d’analyse préférée est par conséquent celle qui sépare et mesure les
différents vitamères. Les méthodes colorimétriques s’appuyant sur la réaction
d'Emmerie Engel et la réduction du chlorure ferrique mais aussi sur la réaction avec 4,7-
dipyridine ou 4,7-diphennanthroline. Les complexes formés sont plutôt instables et
donnent une valeur des tocophérols totaux .La méthode colorimétrique a été remplacée
d’abord par le CPG, puis par la CLHP qui est maintenant la méthode préférée ( Greenfield
et Southgate, 2007).

7.1.Dosage spectrophotométrique des tocophérols totaux:

7.1.1.Principe:

La méthode adoptée pour ce dosage est celle d’Emmerie-Engel (Emmerie et Engel,

1939). Cette méthode colorimétrique est basée sur la réaction d’oxydoréduction entre les
tocophérols et le fer ferrique (Fe3+) qui est réduit en fer ferreux (Fe2+). Ce dernier, en
présence phénantroline forme un complexe rouge-orangé stable dont le coefficient
d’extinction molaire à 510 nm est très élevé.

32
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

7.1.2.Protocole:
Une droite d'étalonnage est tracée à partir du tocophérol commercial, permet de relier
la densité optique et la concentration de tocophérol exprimée en g/l . À partir d'une
solution commerciale de la vitamine E (0.6 g/l) , nous avons préparé dans l’hexane
différentes dilutions . Par la suite, 1ml de réactif phénantroline et 0.5ml FeCl3 (solutions
éthanoliques) sont ajoutés à 1 ml de chaque solution fille . Après 3min on mesure
l’absorbance à 510 nm.
Le contenu en tocophérols totaux dans les huiles de Thapsia garganica est déterminé de
la même façon en répétant ce test trois fois pour chaque échantillon .La concentration en
tocophérols est obtenue à partir de la courbe d’étalonnage, en équivalant de vitamine E par
100 d’huile .

8. Dosage des stérols

Nous avons utilisé une méthode colorimétrique basée sur l’absorption
spectrophotométrique suivant le test de Liebermann-Burchard (Naudet, 1986; Barreto et
Carma, 2005), basé sur une réaction colorée spécifique des 3 β-hydroxystéroïdes
possédants une double liaison en position 5-6. Les stérols forment un complexe stable
avec l’anhydride acétique en milieu acide qui absorbe dans le visible à une longueur
d’onde de 550 nm.

À partir d’une solution chloroformique de cholestérol de différentes concentrations,

nous avons tracé une courbe d’étalonnage du cholestérol . On prend 1ml de chaque
solution et on lui ajoute 2 ml du réactif de Liebermann, puis on laisse la coloration se
développer et se stabiliser pendant 25 minutes à l'obscurité.

Le travail réalisé dans ce chapitre est résumé dans la Figure ci dessous.

33
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Poudre végétale

Extraction par soxhlet ( 24

Tourteaux délipidés

Huiles brutes
Étude de AAO (Chapitre III)
Décoloration par le charbon active

cires
Extraction des cires
Huile raffinée

Analyse de AAO (Chapitre III) Saponification

Phase organique Phase aqueuse

HCl 10%

Acides gras Préparation des

Insaponifiables
EMAG

Estérification

Dosage des tocophérols

EMAG
Dosage des stérols

Analyse de AAO (Chapitre III)

Analyse par CPG

Figure 15: Organigramme présentant la démarche expérimentale pour l’étude de la

fraction lipidique de Thapsia garganica

34
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

1. Rendement d’extraction et propriétés des huiles obtenues

Les teneurs en huile dans les différentes parties de Thapsia garganica sont représentées
dans la figure ci dessous.

Figure 16: La teneur en huiles des différentes parties de Thapsia garganica

Tableau 3: Teneurs en Insaponifiables , cires et les propriétés des huiles de Thapsia

garganica
Feuilles Racines Graines matures Graines immatures

5,32 2,70 16,90 6 ,81

Teneur (%)

Vert foncé Vert olive Verte Vert clair

Couleur

piquante boisée piquante piquante

Odeur

Liquide
moelleux visqueux Liquide Liquide
Aspect

4,6 0,93 2,25 1,2

Cires(%)

21,65 44,13 6,43 10,86

Insaponifiables (%)

35
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Il est clair qu’il y a une grande différence entre les teneurs en huile des différentes
parties de Thapsia garganica (Figure 16 et Tableau 3) ,ainsi le meilleur rendement est
obtenu pour les graines matures, avec une teneur en huile qui est supérieure au double
à celle des graines immatures et au triple à celle des feuilles , alors que les racines ont le
rendement le plus faible .Ceci revient principalement à la différence entre les fonctions des
différentes parties au sein de la plante , car les graines sont connues comme source
principale de stockage des huiles végétales .

La quantité d’ huile trouvée dans les graines matures de Thapsia garganica (16,9 %) est
supérieure à celle de la région de Sidi Makhlouf récoltées en 2009 et obtenue par une
macération à froid avec l’ éther de pétrole( 9,45%) .Cette différence peut être due à
plusieurs facteurs comme la région, la polarité de solvant et à la méthode d’extraction
utilisée . De même, on remarque à partir de cette étude que la teneur en huile des graines
étudiées est faible par rapport aux autres graines oléagineuses, comme le tournesol (30-
35%) soya (18-22%) et l’olive (15-50%) (FAO, 1993). La teneur en huile des graines de
Thapsia garganica est aussi faible par rapport à d’autres graines oléagineuses et fruits
locaux étudiés dans notre laboratoire, comme les fruits de Pistacia atlantica (33.67 %)
(Bentireche et al., 2018), et l’arganier (39,5%) (Yousfi et al..,2009).

Comparons nos résultats avec ceux obtenus pour d’autres espèces de la même
famille , on peut dire que les graines de Thapsia garganica sont plus riches en huile
que plusieurs autres graines de la même famille à savoir Cuminum cyminum L.,Carum
carvi L.Foeniculum vulgare,Pimpinella anisum Linn, et similaire à d’autres comme
Anethum graveolens L. et Coriandrum sativum L (Sayed-Ahmad et al., 2017).

Dans cette étude , les différences observées entre les propriétés des huiles des feuilles,
racines et graines de Thapsia garganica (Tableau 3) , indiquent fortement une différence
dans la composition de ces huiles ,ainsi les huiles des feuilles ont un aspect mou avec
une coloration vert foncé et une odeur piquante ,les huiles des graines sont liquide ,de
coloration verte et avec une odeur piquante ,alors que l’huile de racine est visqueuse avec
une odeur spéciale qui ressemble à l’ odeur de bois .

36
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

La teneur en insaponifiables dans les huiles des graines de Thapsia garganica est de
6,43% à 10,86% pour les graines matures et immatures respectivement . Ces valeurs sont
plus importantes que celles des huiles de plusieurs graines oléagineuses comme le

palme, le tournesol et l’arganier (Yousfi et al., 2009), mais ils appartiennent à

l’intervalle des plantes connues par leurs richesses en insaponifiables comme l’avocat et
la Karité, c’est pour ça, une ’analyse approfondie et détaillée de la composition des
insaponifiables de ces huiles sera intéressante.

Généralement, les insaponifiables forment une fraction minoritaire dans les huiles des
graines et fruits, mais nous n’avons pas trouvé des études concernant les teneurs en
insaponifiables dans les huiles des feuilles et des racines des plantes . Dans cette étude,
nous avons trouvé des quantités très importantes dans les feuilles et les racines de Thapsia
garganica (21,65% et 44,13%) respectivement , mais vu le nombre faible des échantillons,
on ne peut pas tirer des conclusions sur l’origine de ces concentrations élevées.

L’un des résultats obtenus dans ce travail et qui confirme aussi la diversité de la
composition en matière grasse des différentes parties de Thapsia garganica, est la nature et
la teneur en cire dans les différentes huiles étudiées, ainsi les feuilles ont donné une
poudre blanche alors que les cires des racines et graines sont moelleuses et vertes
(Figure17). Les cires végétales sont généralement produites et localisées à la surface des
parties aériennes des plantes, au niveau de leur cuticule. Cette dernière constitue une
véritable interface entre les plantes et leur environnement et remplit diverses fonctions
physiologiques et écologiques (Shepherd et Wynne ,. 2006), ceci explique peut-être la
richesse en cire de la partie aérienne de Thapsia garganica par rapport aux racines .

R F G

37
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Figure 17: Photographie illustrant les cires des feuilles ,racines et graines
de Thapsia garganica

2. Analyse des esters méthyliques par CG/SM

La préparation et les analyses des EMAG par CG/SM sont réalisées de la même façon
pour les quatre échantillons . Les temps de rétention sont en fonction de la masse
moléculaire (longueur de chaîne), le nombre et la localisation des doubles liaisons. Les
résultats de ces analyses sont représentés dans les chromatogrammes ci-dessous. Chaque
EMAG d'huile a été identifiée par comparaison de son temps de rétention et son
spectre de masse avec celui des standards.

À partir de ces chromatogrammes (Annexe1), nous avons dressé le Tableau 4 qui

indique les proportions relatives des divers acides gras des huiles brutes des différentes
parties étudiées

38
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Tableau 4: Composition relative en acides gras des huiles de Thapsia garganica

Acide gras LF LR LG im LGm

C12:0 1,07 / 1,01

C14 :0 1,09/ / /

C16 : 0 6,36 11,45 9,85 3,70

C16 : 1 / 2,62 0,95 /

C18 : 0 / 1,2 1,69 /

C18 : 1 3,9 11,13 30,15 84,01

C18 : 2 15,01 31,52 28,67 10,53

C18 :3ῳ 3 15,81 3,51 9,43 /

C20 :0 35,85 1,26 0,73 /

C20 :1 / 0,54 0,67 /

C22:0 / 2.28 / /

C22 :2 / 4,90 1,40 /

ΣAGS 16,19 12,27 4,71

53,30
Σ AGI 54,22 71,27 94,54
34,72

AGI/AGS 5,81 20,07

0,65 3,34

39
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

D’après ces résultats, les huiles des graines et des racines de Thapsia garganica sont
caractérisées par une teneur élevée en acides gras insaturés avec des rapports AGI/AGS de
5.81 et 3.34 successivement , alors que les feuilles .sont caractérisées par une teneur
importante d’acides gras saturés .Cette différence entre les proportions des acides gras
insaturés explique bien les différences entre les propriétés des trois huiles , ainsi les
huiles des graines avec le rapport AGI/AGS le plus élevé, sont sous forme liquide
(Tableau 3)

On remarque aussi qu’il n’y a pas de similitude entre les profils en acide gras des trois
organes,les racines contiennent un grand pourcentage d’acide C18:2 suivi par les acides
C18:1 et C16: en quantités proches et des valeurs importantes en acides gras C20:0,C22:0
C22:2 , C16:1. Alors que les feuilles contiennent majoritairement l’acide C20:0 ,suivi par
des valeurs proches en acides C18:3 et C18:2 et un pourcentage important de l’acide
C12:0, mais d’un faible contenu en acide C18:1 et C16:0. Thapsia garganica contient en
plus des acides gras habituels, l’acide C17:1 , identifié seulement dans les feuilles.

A la différence des graines, les feuilles sont riches en lipides chloroplastiques en raison
de leur teneur élevée en pigments, représentant environ un tiers de l’extrait , et en lipides
complexes (glycolipides et phospholipides ) ( Hudson, 1977 ),alors que les TAG
représentent moins de 1% des glycérolipides totaux dans les feuilles en situation optimale
de croissance (Tjellström et al., 2015). Les racines contiennent en grande majorité (à plus de
86 %) des phosphoglycérolipides, qui participent fortement à l’élaboration des membranes
lipidiques des organites tels que les mitochondries (Caiveau et al., 2001 ; Jouhet et al., 2004) .

Afin de faire une comparaison avec des études déjà réalisées sur la composition en acides
gras des huiles des racines et feuilles, nous avons fait des recherches mais
malheureusement , la plupart des études sur les huiles végétales sont liées aux huiles des
graines. .Les analyses des huiles des racines et feuilles de Thapsia garganica montrent
que ces huiles ont des profils spécifiques et différents à ceux rencontrés habituellement
dans les huiles végétales( contiennent majoritairement des acides C18:1,C18:2 et C16:0)

À l’issue de plusieurs travaux réalisés sur les huiles de la famille d’ Apiacées, les
résultats montrent la présence de l’acide pétrosélinique (Figure19) isomère de l’acide
oléique en grande quantité (supérieur à l’acide oléique) dans les membres de cette famille.

40
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Cet acide gras est une source très intéressante pour la nourriture, cosmétique et de
l’industrie pharmaceutique (Ngo-Duy1, 2008; Avato et al., 2001).

Figure 18:L’acide pétrosélinique

Pinarosa Avato et al ., 2001 montrent dans leur étude réalisée sur plusieurs espèces
issues de genre Thapsia , qu’il existe deux isomères de l’acide oléique dans cette huile le
C18:1ω12 C18:1ω7 et que Thapsia garganica contient 82.8 % de l’acide pétrosélinique
et 4,4 % de l’acide oléique . La séparation entre les deux acides oléique et pétrosélinique
par CPG indique que dans une phase stationnaire polaire, ces deux isomères possèdent
des longueurs de chaîne équivalente LCE qui diffèrent entre 0,04 à 0,06 unité de carbone,
théoriquement cette différence conduit à certaines séparations entre les deux acides gras,
mais cette résolution est en fonction des conditions opératoires (Sébédio et al.,
1995) .Ainsi Wolff et Vandamman ont séparé partiellement entre ces deux acides gras
par l’utilisation d’une colonne capillaire CP Sil 88 (100% cyanopropyl polysiloxane,
50m x 0,25 mm et 0,2 µm d’épaisseur) (Sébédio et al., 1995)

Plusieurs donnés bibliographiques confirment la présence de l’acide pétrosélinique en

grande quantité dans les huiles des plantes issues de la famille d’Apiacées,de genre
Thapsia et de l’espèce Thapsia garganica. Dans notre travail, nous avons constaté la
présence des deux isomères oléique et pétrosélinique dans l’huile des graines matures sous
forme de deux pics adjacents. (Figure 21) , et le pourcentage en acide gras C18 : 1 dans
cette huile est déterminé par la somme des pourcentages des deux pics, correspondants aux
deux isomères:. Pour les huiles des racines et des feuilles , cet acide gras, est représenté
par un seul pic combinant les deux acides gras oléique (C18:1ω9) et pétrosélinique
(C18:1ω12) sans savoir le pourcentage de chaque acide gras .

41
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

À notre connaissance il n y a que deux études publiées sur la composition de l’huile des
gaines de Thapsia garganica; celle de Pinarosa Avato et al., 2001 et celle de Tlili et al .,
2015). Le Tableau5 regroupe les résultats obtenus par les deux travaux ainsi que nos
résultats.

Tableau 5 : Composition relative en acides gras de l’huile de fruit Thapsia garganica

Acide gras C16 : 0 C16 :1 C18 : 0 C18:1ω12 C18:1ω9 C18 : 2 C18 : 3

Graines im 9,85 0,95 1,69 30,15 28,67 9,43

Graines m 3,70 / / 63,91 20,11 10,53 /

Tlili et al., 2015 7,5 0,75 2,07 76,4 11,98 0,82

Avatoa et al ., 2001 4,9 / traces 82,8 4,4 7,9 /

D’ après ce Tableau, il y a une variation notable dans la composition en acides gras entre
les huiles des graines immatures et matures de Thapsia garganica .Ainsi le taux de l’acide
C 18:1 est presque doublé, l’acide linoléique et l’acide palmitique ont diminué plus de la
moitié avec une disparition des deux acides palmitoléique et linolénique. Ces résultats
sont étayés par plusieurs autres études, ainsi une étude réalisée sur l’évolution saisonnière
de la composition de Stipa tenacissima L en acides gras réalisée par Zoheir Mehdadi et
al montre qu’ entre le printemps et l’été on peut remarquer une diminution dans le taux
de l’acide linolénique de 4,9 % jusqu’à 0%( Mehdadi et al,. 2006), aussi Trabelsi et
al .,2012 ont rapporté un taux relativement élevé, lors des stades précoces de la maturation
de l’acide linoléique et linolénique

En comparant nos résultats avec celles trouvés par les deux autres travaux, on peut dire
que la composition en huiles trouvée dans notre étude est proche a celle trouvé par
Pinarosa Avato . Cependant, dans les trois études, les acides gras insaturés occupent
toujours une grande proportion .

42
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

3. Analyse des Tocophérols

Nous avons effectué le dosage des tocophérols à partir des insaponifiables, et le taux en
tocophérols totaux est déterminé à partir de la courbe d’étalonnage de la vitamine E
(Figure 23). Pour les échantillons d’huiles, le contenu en tocophérols est calculé par
l’utilisation de rendement en insaponifiables et exprimé en g équivalents Vit E par 100g
d’huile (Tableau 6).

Figure 19:Courbe d'étalonnage de la vitamine E

Tableau 6: Quantités des tocophérols dans les huiles de Thapsia garganica

Tocophérols totaux (g/100g d’insapo) Tocophérols totaux (g/100g d’huile)

Feuilles 1,12 ±0;02 0,24 ±0,00

Racines 1,19 ±0;04 0.52 ±0,02

Graines m 2,19 ±0;04 0.14 ±0,00

Graines im 0,84 ±0;05 0.09 ±0,00

43
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Comme le montre le Tableau 6, les huiles des graines de Thapsia garganica ont un niveau
élevé de tocophérols totaux surtout dans les graines matures , ce qui leurs confère une bonne
stabilité oxydative.

La teneur totale en tocophérols dans l'huile des graines matures de Thapsia garganica (1400
mg/kg et l’huile) est relativement plus élevée que celles rapportées dans la littérature pour
d'autres graines oléagineuses comme ; le coton (380-1200 mg / kg d'huile) ,maïs (330-3720
mg / kg d'huile) , l'olive (114 mg / kg d'huile), noix de coco (moins de 50 mg / kg d'huile),
l’arachide (170-1300 mg/kg ), l’huile de palme (150-1500mg / kg d'huile)( Codex stan 210,
1999) et de l’arganier 1027,8 mg/kg (Yousfi et al., 2009)

Les quantités des tocophérols trouvées dans les feuilles et les racines ,qui sont les plus riches
en insaponifiables, étaient supérieures à celles trouvées dans les graines. Ces résultats
peuvent être utiles pour des applications pharmaceutiques et thérapeutiques de ces huiles . Les
différences observées entre les quantités totales des tocophérols des huiles des différentes
parties peut-être liées aux différences morphologiques et fonctionnelles .

4. Analyse des stérols

Nous avons effectué le dosage des stérols à partir des insaponifiables, et le taux en stérols
totaux est déterminé à partir de la courbe d’étalonnage de cholestérol (Figure 20). Pour les
échantillons d’huiles, le contenu en stérols est calculé par l’utilisation de rendement en
insaponifiables et exprimé en g équivalent de cholestérol par kg d’huile.Les résultats
obtenus sont mentionnés dans le tableau 7 (Chaque dosage a fait l’objet de 3 répétitions)

Figure 20:Courbe d’étalonnage du cholestérol

44
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

Tableau 7: Quantité des stérols dans les huiles de Thapsia garganica

Stérols totaux (g/Kg d’insapo) Stérols totaux (g/Kg d’huile)

Feuilles 42,98±5.5 9,31±1.2

Racines 21,99±5.0 9,70±2.2

Graines m 6,43±4.4 6,84±0.3

Graines im 10,86 ±3.2 6,80±0.2

D’après ces résultats on remarque que les huiles des feuilles et des racines de Thapsia
garganica ont des taux similaires en stérols . Les graines matures et immatures ont aussi
des taux très proches et inférieurs à ceux notés dans les feuilles et les racines.
Comparons ces résultats avec les concentration en stérols dans les huiles de plusieurs
cultures végétales comme le maïs (7000-22100 mg / kg d'huile) , noix de coco (400-1200 mg
/ kg d'huile), l’arachide (900-2900 mg/kg d’huile),le palme (300-700mg / kg d'huile) ( Codex
stan 210, 1999), on constate que les huiles des différentes parties de Thapsia garganica
contiennent des quantités assez importantes des stérols, mais les valeurs obtenues sont
toujours dans la gamme des huiles végétales.

Conclusion:

L’ étude des huiles des graines, feuilles et racines de Thapsia garganica a permis de
détecter la présence de l’acide pétrosélinique, un isomère de l’acide oléique largement
présent dans les huiles de ce genre. Ces huiles sont caractérisées par différents profils en
acides gras, ainsi les huiles des feuilles sont plus riches en acide arachidique (C:20) et
linolénique, les huiles des racines contiennent majoritairement l’acide linoléique, alors que
les graines sont riches en acides pétrosélinique et linolénique. Toutes les huiles étudiées
sont caractérisées par des proportions importantes en acides gras insaturés.

Le dosage des tocophérols et des stérols dans les insaponifiables des différentes huiles
étudiées, révèle que les huiles de Thapsia garganica sont riches en tocophérols, ce qui leur
confère une aptitude longue à la conservation et une action vitaminique indéniable,
comme elles peuvent constituer une source privilégiée de phytostérols, notamment pour
les huiles des feuilles et des racines.

45
 Chapitre II : Étude de la fraction lipidique

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48
 Chapitre III
Activité antioxydante
 Chapitre III: Activité antioxydante

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

1. Métabolites secondaires

1.1.Généralités sur les métabolites secondaires

Les plantes possèdent des métabolites dits « secondaires » par opposition aux métabolites
primaires qui sont les protéines, les glucides et les lipides. Ces composés diffèrent en
fonction des espèces et, bien que leurs rôles soient encore mal connus, il est cependant
clair qu'ils interviennent dans les relations qu'entretient la plante avec son environnement .
(Kutchan et al., 2015).

Les métabolites secondaires ne sont pas produits sous toutes les conditions. Dans la
plupart des cas, leurs fonctions et intérêts pour l’organisme ne sont pas encore connues.
Certaines de ces substances sont produites, pour des raisons défensives, contre les
prédateurs, d’autres comme des agents volatils attracteurs pour la même espèce ou une
espèce différente, ou bien comme des agents colorés pour attirer ou avertir les autres
espèces (Dewick, 2009).

Si leur rôle écologique reste encore à préciser, leur utilisation par l’homme dans de
nombreuses préparations thérapeutiques est très largement répandue. La pharmacognosie
est étymologiquement la connaissance (gnosis) des poisons (pharmacon) d'origine
naturelle. Ces substances toxiques possèdent, parfois à faible dose, des propriétés
médicamenteuses et peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques ( Krief ,2003).

La diversité des espèces utilisées et des métabolites secondaires déjà isolés laisse
présager de l'ampleur de ce qui reste à découvrir. On considère effectivement que, jusqu’à
ce jour, moins de 10 % des espèces de végétaux supérieurs qui peuplent actuellement la
planète ont été explorées pour leurs propriétés chimiques et biologiques. On peut classer
les métabolites secondaires en plusieurs grands groupes : parmi ceux ci, les alcaloïdes, les
terpenoïdes, et les composés phénoliques (Salim et al., 2008).

Trois principales catégories de molécules sont regroupées sous ce terme de métabolites

spécialisés : les terpénoïdes, les alcaloïdes et les composés phénoliques (Salim et al.,
2008).

50
 Chapitre III: Activité antioxydante

1.2.Les composés phénoliques

L'expression de composés phénoliques est utilisée pour toute substance chimique

possédant dans sa structure un noyau aromatique, portant un ou plusieurs groupements
hydroxyles et qui ne contient aucun atome d'azote et qui dérive de la biogénèse d'acide
shikimique et/ou d'acétate (Bloor, 2001 ; Hennebelle et al., 2004).

Il s'agit d'une classe de métabolites secondaires synthétisés par les plantes lors des
différents stades de leur développement. On les trouve, d'une manière générale, dans
toutes les plantes vasculaires, où ils peuvent être localisés dans divers organes : racines,
tiges, bois, feuilles, fleurs et fruit (Crozier et al., 2006 ).

D’après Macheix et al (2005), les composés phénoliques sont regroupées en

nombreuses classes qui se différencient par :

 La complexité du squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très

polymérisées).
 Le degré de modifications de ce squelette (degré d’oxydation, d’hydroxylation, de
méthylation….).
 Les liaisons possibles de ces molécules de bases avec d’autres molécules (glucides,
lipides, protéines, autres métabolites secondaires pouvant être ou non des
composés phénoliques…).

51
 Chapitre III: Activité antioxydante

La plupart des grande classes de polyphénols sont végétaux énumérés dans le Tableau 8 ,
en fonction de nombre d’atome de carbone de squelette de base.

Tableau 8: Grandes classes de polyphénols chez les végétaux

Nombre d’atome Squelette

de carbone de base Classe Exemple

6 C6 Phénols simples catéchole

7 C6-C1 Acides phénoliques Acide gallique

3-acétyle-6-
8 C6-C2 Acétophénone méthoxybenzaldehyde

Acides
hydroxicinnamiques Acide caféique

9 C6-C3 Coumarines scopolétol

10 C6-C4 Naphtoquinones Juglone

13 C6-C1-C6 Xanthones Mangiférine

14 C6-C2-C6 Stilbènes Resvératrol

Flavonoides Quercétol

Isoflavonoides Daidzeine

15 C6-C3-C6 Anthocyanes Malvidine

Oligomères
procyanidoliques
N
tanins

52
 Chapitre III: Activité antioxydante

1.3. Terpénoïdes

Les terpènoïdes (ou terpènes) regroupent un ensemble de molécules très différentes tant
d’un point de vue structurel que fonctionnel. Avec plus de 40 000 molécules connues, ils
constituent probablement la classe la plus vaste et la plus diversifiée de composés
organiques végétaux (Aharoni et al., 2005). Les terpénoïdes sont également connus sous le
nom d’isoprénoïdes car leur dégradation thermique libère un gaz, l’isoprène. Les
terpénoïdes sont répartis dans différentes classes selon le nombre d'atomes de carbone
qu’ils contiennent : hémiterpénoïdes (C5), monoterpénoïdes (C10), sesquiterpénoïdes
(C15), diterpénoïdes (C20) triterpénoïdes (C30), tetraterpénoïdes (C40) et polyterpénoïdes
(>C40) .

Chez les plantes, l’isopentényl diphosphate (IPP ) est le précurseur de tous les terpènes
produit par deux voies métaboliques aux localisations subcellulaires différentes : la voie du
mévalonate (cytosolique) et la voie du MEP/DOXP (plastidique) (Vranová et al., 2013)

1.4. Alcaloïdes

Plusieurs définitions du terme alcaloïde ont pu être données depuis son apparition en 1819,
où W. Meissner a défini les alcaloïdes comme étant des substances dérivées de plantes
qui réagissent comme des alcalis. Au cours des années et des découvertes de nouveaux
alcaloïdes, la définition a évolué. En 1896, I. Guareschi écrit que le terme alcaloïde est
applicable à tous composés organiques basiques obtenus à partir du règne animal ou de
plantes, ou préparé artificiellement. Au 20ème siècle, des tournures différentes sont
utilisées, la plus récente étant celle de S. W. Pelletier en 1983 : un alcaloïde est un composé
organique cyclique contenant un atome d’azote dans un degré d’oxydation négatif qui a une
distribution limitée à certains organismes vivants. Dans son livre, M. Hesse définit les
alcaloïdes comme étant des substances organiques d’origine naturelle contenant un ou
plusieurs atomes d’azote avec un caractère basique de degré plus ou moins fort.

Malgré leur structure variée, les alcaloïdes proviennent d’un petit nombre de précurseurs
simples. La plupart d’entre eux sont synthétisés à partir d’acides aminés tels que la
tyrosine, le tryptophane, l’ornithine. On attribue généralement aux alcaloïdes un rôle de
défense pour le végétal. La plupart d’entre eux ont un goût amer, si bien qu’ils sont
caractérisés comme composés répulsifs vis-à-vis des animaux et insectes (Hartmann,
1991).

53
 Chapitre III: Activité antioxydante

Certains alcaloïdes sont fortement toxiques. La nicotine, par exemple, est un poison
violent pour les insectes et a été l’un des premiers insecticides utilisés par l’Homme.
Beaucoup d’alcaloïdes possèdent des propriétés antibiotiques et sont actifs contre les
infections microbiennes (Yang et al., 2010 ; Hu et al., 2014).

1.5. Stress oxydant

1.5.2. Stress oxydatif

Les espèces réactives d'oxygène sont produites au cours du métabolisme cellulaire et sont
impliqués dans les réactions enzymatiques, le transport d'électrons mitochondrial, la
transduction du signal, l'activation des facteurs de transcription nucléaires, l'expression des
gènes et l'action antimicrobienne des neutrophiles et des macrophages (Baydar, 2004).
Comme il existe aussi des sources exogènes de ces espèces, tels que l’exposition au
rayonnement, le tabagisme, les polluants et les pesticides, les solvants organiques, les
anesthésies. Certains de ces composés ainsi que quelques médicaments peuvent se
transformer en produits intermédiaires de radicaux libres qui vont endommager les tissus
cibles (Machlin et Bendich, 1987). Dans les circonstances normales, on dit que la balance
antioxydants/ pro-oxydants est en équilibre. Si tel n’est pas le cas, que ce soit par déficit
en antioxydants ou par suite d’une surproduction énorme de radicaux libres, l’excès de ces
radicaux est appelé stress oxydant (Favier, 2003).
La perturbation de l’équilibre endogène entre radicaux libres et antioxydants de courte ou
longue durée, provoque des effets délétères dus, soit à une défense antioxydante
défaillante, soit à un état pro-oxydatif accru, nommé stress oxydant (Biesalski et al., 97).

1.5.3. Conséquences moléculaires du stress oxydatif

Le stresse oxydatif est impliqué dans de très nombreuses pathologies comme facteur
déclenchant ou associé à des complications (Favier, 2003). Il peut être associé à
l’athérosclérose, l’asthme, l’arthrite, la cataractogénèse, l’hyperoxie, l’hépatite, l’attaque
cardiaque, les vasospasmes, les traumatismes, les accidents vasculaires cérébraux, les
pigments d’âge, les dermatites, les dommages de la rétine, les parodontites et les cancers
(SAKIHAMA et al., 2002). Néanmoins, la plupart des maladies induites par le stress oxydant
apparaissent avec l'âge car le vieillissement diminue les défenses antioxydantes et augmente la
production mitochondriale des radicaux (Favier, 2003)

54
 Chapitre III: Activité antioxydante

A. Oxydation de l’ADN

Le dommage oxydatif aux acides nucléiques inclue l’addition des bases et des groupes de
sucres, cassures au niveau de la simple et double hélice ainsi que la formation des liaisons
croisées avec d’autres molécules (Beckman et Ames, 1998).

B. Oxydation des glucides

Le glucose peut s'oxyder en présence des ions métalliques conduisant à la libération des
cétoaldéhydes, H2O2 et OH. qui peuvent entrainer la coupure des protéines ou leur glycation
par attachement du cétoaldéhyde. Ce phénomène de glycosoxydation est très important chez
les diabétiques et contribue à la fragilité de leurs parois vasculaires et de leur rétine (Favier,
2003)

C. Oxydation des protéines

Les structures (primaire, secondaire et tertiaire) et les fonctions des protéines sont aussi
altérées par les ERO. Les protéines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout
celles qui comportent un groupement sulfhydryle (SH). C'est le cas de nombreuses enzymes
cellulaires et protéines de transport qui vont ainsi être oxydées et inactivées.

L’oxydation protéique catalysée par les ions métalliques conduit à l’addition de groupes
carbonyles, la formation des liaisons croisées et la fragmentation des chaines peptidiques.
(Ahsan et al., 2003). Le dommage oxydatif des protéines peut affecter la fonction des
récepteurs, des enzymes et des protéines de transport, et peut même générer de nouveaux
antigènes qui provoquent des réponses immunitaires (PHD, Okezie, 1999; Favier, 2003).

D. Oxydation des lipides

Les acides gras polyinsaturés (AGPI), un des principaux constituants lipidiques des
membranes cellulaires et des lipoprotéines, sont la cible privilégiée des EOR. Leurs produits
d’oxydation peuvent participer en tant que second messager à la régulation de fonctions
métaboliques, de l’expression des gènes et de la prolifération cellulaire. Ils peuvent aussi, et
surtout, se comporter comme des substances toxiques responsables des dysfonctionnements et
d’altérations cellulaires (perte d’acides gras polyinsaturés, diminution de la fluidité
membranaire, modification de l’activité des enzymes et des récepteurs membranaires)
(Beckman et Ames, 1998 ; Lehucher-Michel, 2001)

55
 Chapitre III: Activité antioxydante

1.5.4. Antioxydants

Les antioxydants sont des composés très divers qui regroupent des protéines à activité
enzymatique (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase) et non enzymatique
(séquestrant des métaux) et des petites molécules liposolubles (vitamine E, β−carotène) ou
hydrosolubles (vitamine C, acide urique). Une définition large du terme antioxydant donnée
par B. Halliwell est « toute substance qui, présente à faible concentration comparée à celle
du substrat oxydable, retarde ou prévient de manière significative l’oxydation de ce substrat»
(Cillard et al., 2006)
Ce sont des molécules d’origine naturelle ou le plus souvent synthétique, pourvues d’un ou
plusieurs radicaux hydroxyles qui leur confèrent un pouvoir réducteur et les rendent capables
d’interrompre la réaction en chaîne conduisant à la formation des hydroperoxydes ou bien des
peroxydes (Revuz. 2006).

1.5.5.Principaux antioxydants
L’antioxydant alimentaire idéal est facilement incorporable, efficace à faible dose, non
toxique, n’entraîne ni coloration, ni odeur, ni saveur indésirable, résistant aux processus
technologiques, et stable dans le produit fini.
Un bon antioxydant doit respecter quelques critères (Valko et al., 2004) :
 Capable de piéger directement et spécifiquement les radicaux libres.
 Chélater des ions de métaux de transition (Fe2+, Cu+).
 Interagir avec d’autres antioxydants.
 Avoir un effet positif sur l’expression génique.
 Être rapidement absorbé .
 Avoir une concentration qualifiée de « physiologique » dans les tissus et les fluides
biologiques.
 Être efficace en milieu aqueux et/ou dans le milieu membranaire.

A.Antioxydants naturels

La plupart des substances alimentaires issues de plantes qui contiennent des inhibiteurs
naturels de l’oxydation. Les plus connues parmi celles-ci on trouve : Les protéines, les
acides aminés, phospholipides, caroténoïdes, tocophérols, composés phénoliques, acides
polycarboxyliques, acide ascorbique, huiles essentiels (Graille, 2003).

56
 Chapitre III: Activité antioxydante

B.Antioxydants synthétiques

Les antioxydants naturels ne sont pas toujours suffisants pour stabiliser les lipides et les
denrées alimentaires, dans tel cas une addition d’antioxydants synthétiques est possible,
les plus répandus sont : Dibutyldihydroxytoluène (BHT), Butyldihydroxyanisol (BHA),
Acide nordihydrogaiarétique (NDGA), éthylène diamine tetracetique acide (EDTA)
(Revuz, 2006).

MATÉRIEL ET MÉTHODES

1.Extraction des métabolites par un fractionnement solide -liquide

Les techniques classiques d’extraction de composés chimiques végétales présentent

souvent des contraintes telles que le faible rendement, le temps d’extraction très long et
l’utilisation de grandes quantité de solvants. De nombreuses techniques alternatives
ayant pour but de pallier à ces problèmes se sont développées. Parmi elles émergent les
micro-ondes, les fluides supercritiques et les ultrasons.

L’extraction par ultrason est une technique fréquemment utilisée pour l’extraction des
composés bioactifs à partir des matières végétales. Les ultrasons de puissance sont
maintenant bien connus pour avoir des effets significatifs sur la cinétique de certaines
réactions chimiques ou encore sur la réduction du temps des procédés industriels. En effet
la cavitation induite par les ultrasons dans les milieux liquides se traduit entre autres par
des accélérations de cinétique et/ou des améliorations du rendement, notamment dans le
cas de l’extraction solide-liquide ( Shen Jinchao et Xueguang, 2005 ; Arceusz et al.,
2013)

Au cours de cette étude, et afin de solubiliser un maximum de composés, trois solvants

de polarités différentes ( dichlorométhane , acétate d’éthyle et méthanol) sont employés.
L’extraction était réalisé par sonication, en macérant 20g d’échantillon délipidé dans
100 ml de solvant pendant une heure et à la température de 35 C0 .

Avant l’utilisation d’un nouveau solvant, le matériel végétal doit être séché du solvant
précédent. Après la filtration les trois extraits organiques ont été concentrés sous vide au
températures de 45 C°. Après la concentration, ces extraits ont été séchés à l’air libre. on
a obtenu pour chaque partie de plante trois extraits bruts : graines immatures (DCM Gim,
Ac-O-Et Gim, MeOH Gim ),graines matures (DCM Gm, Ac-O-Et Gm , MeOH Gm ),

57
 Chapitre III: Activité antioxydante

feuilles (DCM F, Ac-O-Et F, MeOH F ),racines (DCMR,Ac-O-Et R, MeOH R ).Les étapes

suivies sont schématisées dans la Figure 21 .

Extrait lipidique 100 g de poudre végétale est épuisée avec l’hexane pendant 24
heures

Extrait DCM Une extraction par sonication sur 20 g de poudre résiduelle, est
réalisée avec le dichlorométhane

Extrait Ac-O-Et Une extraction par sonication sur la poudre résiduelle, est
réalisée avec l’acétate d’éthyle

Extrait MeOH Une extraction par sonication sur la poudre résiduelle, est
réalisée avec le méthanol

Figure 21: Procédure d’extraction par fractionnement solide-liquide

2. Dosages et quantification de quelques métabolites secondaires

2.1. Dosage des phénols totaux

a) Principe

Le principe de ce dosage est adapté par Singleton et Ross (en 1965) avec le réactif de
Folin –Ciocalteu (Giner-Chavez, 1997). Le réactif de Folin-Ciocalteu est un acide de
couleur jaune, constitué de polyhétérocycles acides contenant l’acide phosphotungestique
H3PMo12O40 et l’acide phosphomolybdique H3PW12O40 qui sont réduits lors de
l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O23)
formant un complexe stable bleu qui absorbe fortement à une longueur d’onde de l’ordre
de 760 nm. Le phénol standard utilisé pour établir la courbe d’étalonnage est l’acide
gallique.

58
 Chapitre III: Activité antioxydante

b) Protocole
Pour établir la courbe d’étalonnage de l’acide gallique, une gamme des solutions diluées
d’acide gallique a été préparée à partir d’une solution étalon.Deux cents cinquante
microlitres de réactif de Folin-Ciocalteu (dilué 10 fois) ont été ajoutés à 50 μl de chaque
solution diluée de l’acide gallique ou de l’extrait végétal dilué, après 2 minutes, 1 ml de
carbonate de sodium Na2CO3 à 4% (m/v) ont été ajoutés, ces solutions ont été maintenues
à l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. La lecture de l'absorbance de
chaque solution est effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre de Shimadzu 1601 à une
longueur d'onde de 760 nm contre un blanc (ce qui nous a permet de tracer la courbe
d’étalonnage de l’acide gallique et de doser les phénols totaux dans les extraits végétaux).

2.2. Dosage des flavones et flavonols

a) Principe

La quantification des flavonoïdes a été effectuée par une méthode adaptée par Lamaison
et Carnat (1991) en utilisant le trichlorure d’aluminium comme réactif (Quettier-Deleu ,
2000). Le trichlorure d’aluminium forme un complexe acide stable avec le groupement
carbonyle C-4 et aussi les groupements hydroxyles C-3 et C-5 des flavones et flavonols,
en plus il forme des complexes acides labiles avec les groupements dihydroxyles en ortho
du cycle A ou B des flavonoïdes (Mabry et al., 1970), ce complexe est de coloration jaune
absorbe fortement à une longueur d’onde de 430 nm. Le flavonol standard utilisé pour
établir la courbe d’étalonnage est la quercétine.

b) Protocole

A partir d’une solution méthanolique de la quercétine, une gamme des solutions diluées a
été préparée en milieu aqueux pour établir la courbe d’étalonnage.

Cinq cents μl de chaque solution diluée ou de l’extrait végétal dilué est mélangé avec 0,5
ml du trichlorure d’aluminium 2 % (m/v), ces solutions ont été maintenues à l’obscurité
pendant 15 minutes à température ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution
a été effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre de Shimadzu 1601 à une longueur d'onde
de 430 nm contre un blanc (ce qui nous permet de tracer la courbe d’étalonnage de la
quercétine et de doser les flavones et les flavonols dans nos extraits ).

59
 Chapitre III: Activité antioxydante

3. Étude de l’activité antioxydante des extraits

3.1.Test de DPPH

a. Principe

De nombreuses méthodes sont utilisées actuellement pour évaluer cette activité. Le

radical DPPH a été largement utilisé pour l’étude de l’activité antiradicalaire des différents
extraits végétaux. Le composé chimique 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle fut l’un des
premiers radicaux libres utilisés pour étudier la relation structure–activité antioxydante des
composés phénoliques (Brand-Williams et al.,1995).

Le DPPH ou bien 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl est un radical libre stable, à

température ordinaire il présente une couleur violette caractéristique. Les antioxydants
présents dans l'échantillon le réduisent (Figure 26), ce qui entraîne une décoloration
facilement mesurable par spectrophotométrie à 514–518 nm. Plus la diminution de
l’absorbance du DPPH est importante plus le pouvoir antioxydant des extraits est élevé
(Molyneux, 2004) .

NO2 NO2

. Antioxydant
O2N N N O2N NH N

NO2 NO2

Figure 22: Réduction du radical libre DPPH

b. Protocole expérimental

Une quantité de 0,5 ml d’une solution méthanolique de DPPH˙ de concentration 100 μM

a été ajoutée à 0,5 ml d’extrait phénolique de concentrations croissantes. Après une
incubation de 30 minutes, nous avons effectué la lecture à l’aide du spectrophotomètre
Shimadzu 1601 à 517 nm.

60
 Chapitre III: Activité antioxydante

Nous avons calculé le pourcentage d’inhibition I % suivant l’équation :

I (%) = [1 - (A /A 0)] 100

Sachant que:

I (%) : le pourcentage d'inhibition en %.

A: absorbance de la solution de DPPH en présence de l'extrait.
A 0: absorbance de la solution de DPPH en absence de l'extrait.

3.2.Test de FRAP

a. Principe

Ce test est basé sur la réduction du complexe Fe3+-TPTZ (tripyridyltriazine) en sa forme

ferreuse (Fe2+-TPTZ) par un agent réducteur à un pH acide . Ceci engendre l’apparition d’une
couleur bleue avec une absorbance maximale à λ = 593nm. (Benzie et Strain, 1996)

b. Protocole expérimental

Le milieu réactionnel est constitué de 100μl de la dilution des extraits dans le méthanol et 1
ml du réactif FRAP. Ce dernier est préparé comme suit : 10ml d’une solution tampon
d’acétate de sodium (pH = 3,6) et mélangé avec 1 ml d’une solution de TPTZ (10mM )
préparée dans une solution HCl 40mM, et 1 ml d’une solution FeCl3 (20mM). Le mélange
réactionnel est ensuite incubé pendant 7min, et les absorbances ont été déterminées contre un
blanc à une longueur d’onde λ = 593nm.

Le pourcentage d’inhibition I % est calculé suivant l’équation :

I (%) = [(Ae)/Af]× 100

Sachant que I (%) : le pourcentage d'inhibition en %.

Ae: absorbance de l’extrait.
A f : l'absorption correspond à 100% de réduction des ions ferriques dans 1 ml de réactif
FRAP.

61
 Chapitre III: Activité antioxydante

4. Analyse statistique

Les résultats ont été exprimés par la moyenne et son écart type, toutes les expériences ont été
reproduites trois fois. L’analyse des résultats a été effectuée à l’aide de Office Writer et
SPSS

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

1. Rendement d’extraction

A notre connaissance, il n'existe pas de travaux publiés sur l'étude de l'activité

antioxydante des différentes parties de Thapsia garganica, et faute d'informations
suffisantes sur sa composition chimique, nous n'avons pu prédire la meilleure méthode
d'extraction des métabolites secondaires qui repose sur plusieurs paramètres tels que le
type de solvant , la durée et la température d'extraction et la composition chimique de la
partie à étudier.

Dans ce travail, nous avons effectué des extractions successives pour chaque partie de plante
en utilisant des solvants aux polarités croissantes. Cette technique permet d'extraire le
maximum de composés chimiques présents, le Tableau 9 contient le contenu ainsi que l'aspect
et la couleur des extraits secs obtenus.

62
 Chapitre III: Activité antioxydante

Tableau 9:Teneurs en extraits bruts (m/m %)

Organe Solvant d’extraction La teneur (%)

feuilles Dichlorométhane 0,69

Acétate d’éthyle 0,18

Méthanol 10,08

Racines Dichlorométhane 0,74

Acétate d’éthyle 0,21

Méthanol 4,27

Graines immatures Dichlorométhane 1,98

Acétate d’éthyle 0,32

Méthanol 16,34

Graines matures Dichlorométhane 2,24

Acétate d’éthyle 0,69

Méthanol 5,40

En général, les rendements d'extraction obtenus par les solvants utilisés varient de 0,18% à
16,34%, l'analyse des résultats du Tableau 9 par le test ANOVA montre une différence
significative entre les rendements obtenus par les différents solvants (p=0,009) avec une forte
différence entre les rendements de chaque solvant pour les différentes parties étudiées.

Il ressort de l'observation des rendements d'extraction de la Figure 23 que le classement des

teneurs en extrait brut des différents solvants était la même pour les quatre parties de la plante,
de sorte que le meilleur rendement est enregistré pour le méthanol dont les teneurs varient de
0,25% pour les racines à 16,34 pour les graines immatures, suivi du dichlorométhane, avec
lequel les graines immatures et matures ont donné le meilleur rendement , l'acétate d'éthyle
ayant le moins bon rendement.

63
 Chapitre III: Activité antioxydante

La différence remarquable entre les rendements de l'extraction obtenues dans cette

étude est due à la plante elle-même (la partie de la plante utilisée, la période de récolte de
chaque partie, les conditions extérieures), et le solvant d'extraction, ainsi le
dichlorométhane est un solvant avec une polarité de 2,8, donc il a un pouvoir important
dans l'extraction des composés modérément polaires, notamment les flavonoids aglycones
(Soczewinski et al., 2004).

L'acétate d'éthyle est un solvant connu pour sa meilleure capacité à extraire les composés
phénoliques, les flavonoïdes et les lactones sesquiterpéniques (Balboul et al., 1997), ces
deux solvants ont des polarités similaires et peuvent extraire les mêmes structures, c'est
pourquoi nous avons obtenu un faible rendement par l’ acétate d'éthyle. Le rendement
élevé obtenu par le méthanol montre la richesse de Thapsia garganica en métabolites
polaires.

Figure 23: Teneurs en résidus secs obtenus par les différents solvants

2. Dosages et quantification des phénols totaux et des flavonoïdes

La teneur en phénols et en flavonoïdes de chaque extrait végétal a été calculée à partir des
courbes d'étalonnage (Figures 24 et 25) et est exprimée en milligrammes équivalent acide
gallique et en milligrammes équivalent quercitrine par gramme de matière végétale sèche ou
par gramme d'extrait sec, respectivement, et les résultats de ce dosage colorimétrique sont
indiqués dans les Tableaux 10 et 11.

64
 Chapitre III: Activité antioxydante

Figure 24:Courbe d’étalonnage de l’acide gallique

Figure 25: Courbe d’étalonnage de la quercétine

65
 Chapitre III: Activité antioxydante

Tableau 10: Teneurs en phénols totaux mg EAG/g (MS, Es )

Dichlorométhane Acétate d’éthyle Méthanol

Organe
( mg/g Ms) ( mg/g Es) ( mg/g Ms) ( mg/g Es) ( mg/g Ms) ( mg/g Es)

Feuilles 0,18±0,02 26,46±4,00 0,06±0,00 30,76±1,7 4,16±0,10 41,28±1,42

Racines 0,24±0,00 31,73±1,7 0,05±0,00 24,06±1,07 2,05±0,05 47,19±1,8

Graines m 0,68±0,02 30,45±1,23 0,28±0,00 40,12±0,67 4,15±0,03 76,86±0,92

Graines im 0,76±0,02 38,45±1.56 0,100±0,00 31,65±0,57 8,53±0,23 52,23±2.05

Tableau 11: Teneurs en flavonoïdes mg EQ /g (MS, Es )

Dichlorométhane Acétate d’éthyle Méthanol

Organe
( mg/g Ms) ( mg/g Es) ( mg/g Ms) ( mg/g Es) ( mg/g Ms) ( mg/g Es)

Feuilles 0,029±0,0 4,28±0,11 0,007±0,00 3,83±021 0,38±0,03 3,73±0,32

Racines 0,008±0.0 1,21±0,00 0,001±0.00 0,64±0,02 0,18 ±0,00 4,15±0,11

Graines m 0,05±0,0 2,27±0,09 0,048±0,00 6,89±0,28 0,58±0,016 10,76±0,4

Graines im 0,045±0,0 2,25±1,26 0,014±0,00 4,48±0,08 0,59±0,02 3,61±0,18

Les teneurs polyphénols totaux obtenues par les trois solvants sont exprimées en
milligrammes équivalents d'acide gallique par gramme d’extrait sec et varient de 24,06 à
76,86 mg EAG/g Es. L'analyse de variance (ANOVA) pour comparer les teneurs obtenues
par les trois solvants (Figure30) révèle une différence significative (p<0.05) entre les
solvants utilisés. Toutefois, le méthanol donne le meilleur rendement en polyphénols avec
une concentration de 54,39 ± 15,63 (mg EAG/g Es) en moyenne mais avec un écart type
élevé entre les différentes parties de la plante, les rendements obtenus par le
dichlorométhane et l'acétate d'éthyle sont très similaires (p>0,05), soit en moyenne
31,77±4,99 et 31,67 ±6,59 (mg EAG/g Es) respectivement.

66
 Chapitre III: Activité antioxydante

Figure 26: Histogramme représentant les teneurs en polyphénols dans les différents
extraits

Pour les flavonoïdes, les teneurs étaient de 0,64±0,02 (mg EQ/g Es) pour l'extrait
d'acétate d'éthyle de racines et de 10,76±0,4 (mg EQ /g Es) pour l'extrait méthanolique de
graines (Figure 27).L'analyse de variance (ANOVA) des résultats obtenus ne montre pas
de différence significative entre les moyennes des teneurs obtenues par les trois solvants, à
savoir 2,5 ± 1,29 pour le dichlorométhane, 3,97 ± 2,57 pour l'acétate d'éthyle et 5,56 ±
3,47 pour le méthanol mais avec une différence remarquable entre les différentes parties
de la plante (écarts types élevés).

67
 Chapitre III: Activité antioxydante

Figure 27: Histogramme représentant les pourcentages des flavonoïdes dans les différents
extraits

Une forte corrélation est enregistrée entre les taux de phénols totaux et de flavonoïdes
des différents extraits (Figure 28). Et ceci avec un coefficient de Pearson de 0,780 ** qui
indique que les teneurs en flavonoïdes et en polyphénols sont étroitement liées.

Figure 28: Régression linéaire entre les taux de phénols et de flavonoïdes totaux

La solubilité des polyphénols dépend principalement du nombre de groupes hydroxyle,

du poids moléculaire et de la longueur de la chaîne carbonée du squelette de base
(Mohammedi et al., 2011). Les résultats obtenus dans le cadre de nos travaux confirment
les conclusions du paravent qui confirme que le rendement en polyphénols augmente avec
la polarité du solvant de l'extraction et préfère, pour améliorer cette dernière, l’utilisation
des alcools et notamment du méthanol et de l’éthanol (Sripad et al., 1982 ; Ignat et al.,
2011).

Il est à noter que le pouvoir extractif des trois solvants ne peut être jugé tant qu'ils sont
utilisés successivement et non séparément, mais on peut avoir une idée de la composition
des extraits en fonction de la polarité des solvants utilisés, ainsi le dichlorométhane et
l'acétate d'éthyle avec une polarité moyenne ont un pouvoir extracteur significatif des
molécules à polarité moyenne comme les flavonoïdes aglycones (Soczewinski et al.,
2004; Scholz et Rimpler, 1989). Le méthanol, qui est le solvant le plus polaire du système
utilisé, permet d’obtenir des structures plus polaires.

68
 Chapitre III: Activité antioxydante

Pour avoir une idée de la variation de la teneur en polyphénols et flavonoïdes totaux

selon la partie de la plante, nous avons calculé leurs concentrations en mg EAG/g Ms et
mg EQ /g Ms respectivement. ( Tableaux 10 et 11 ) et les résultats obtenus montrent que
les extraits de méthanol ont des concentrations très élevées par rapport au dichlorométhane
et acétate d'éthyle, cela indique la richesse des différentes parties du Thapsia garganica
en composés polaires .

La somme des trois rendements obtenus par le dichlorométhane, l'acétate d'éthyle et le

méthanol donne la concentration en polyphénols pour chaque organe (Tableau 12). Les
teneurs en composés phénoliques de nos extraits sont inférieures à celles obtenues par
Neffati pour l'extrait éthanolique de la partie aérienne de Thapsia garganica d'origine
tunisienne (156,5 mg EAG/g Ms), mais selon la même étude, les valeurs obtenues pour les
graines et feuilles sont proches de celles de l'extrait aqueux de Thapsia garganica (10,75
mg EAG/g Ms) (Neffati et al., 2017).

Djridane et al.,2006 ont obtenu une teneur en composés phénoliques de 7,63±0,61 mg

EAG/g Ms, pour la partie aérienne de Thapsia garganica . Sachant qu'ils ont récolté la
plante en juin dans la ville de Laghouat, et ayant utilisé 70% d'éthanol comme solvant
d'extraction. Ce résultat est inférieur à celui obtenu dans notre étude.

Les différences observées pour le contenu en polyphénols d'une même espèce peuvent
être liées aux différences de climat, de type de sol, de situation géographique, de saison de
récolte et des méthodes d'extraction utilisées.

Les teneurs en composés phénoliques des extraits de graines de Thapsia garganica

matures et immatures, obtenues par le système solvant utilisé, sont supérieures à celles de
plusieurs autres graines de la même famille tels que les extraits éthanoliques de cumin,
coriandre et de ajwain (Saleem et al., 2017).

Une des caractéristiques des polyphénols qu'ils partagent avec les métabolites
secondaires est qu'ils sont très inégalement répartis au niveau cellulaire ou tissulaire d'une
plante, il existe même des polyphénols qui ne s'accumulent que dans des organes bien
définis (Macheix et al., 2005).
La différence entre les teneurs totales en polyphénols des différents organes de Thapsia
garganica est très importante (p<0,01), les graines immatures donnant les teneurs les plus
élevées (9,39±0,25). Cette teneur est environ deux fois plus élevée que celle enregistrée

69
 Chapitre III: Activité antioxydante

pour les feuilles (4,4±0,12) et quatre fois plus élevée que celle enregistrée pour les racines
(2,34±0,05). Ces dernières semblent être les plus pauvres en polyphénols alors que les
graines matures ont une valeur moyenne de 5,11±0,05.

En ce qui concerne la teneur en flavonoïdes, les valeurs trouvées pour les feuilles, les
racines, les graines matures et les gaines immatures, sont significativement différentes (p
0,05). Les graines matures et immatures sont les plus riches en flavonoïdes et ont atteint
des valeurs proches de 0,68±0,016 et 0,65±0,02 (mg EQ/g Ms), suivies des feuilles avec
0,42 ±0,03 (mg EQ/g Ms) et des racines avec la teneur la plus basse par rapport aux autres
organes avec une concentration de 0,42 ±0,03 (mg EQ/g Ms).

Les composés phénoliques sont produits au cours du processus de réponse contre les
agents pathogènes et ils sont naturellement sous forme conjuguée (esters ou glycosides) et
non libres. Par conséquent, les graines, qui contiennent généralement plus de glucose, sont
plus riches en composés phénoliques (Li Zhiling et al., 2017). Dans cette étude, les graines
(matures et immatures), qui ont généralement plus de réserves , ont des concentrations de
polyphénols et de flavonoïdes plus élevées que les feuilles et les racines.

La richesse en polyphénols et flavonoïdes de la partie aérienne (graines et feuilles) par

rapport à la partie souterraine (racines) pourrait s'expliquer par le fait qu'elle est plus
exposée au soleil. En effet, les flavonoïdes protègent les tissus de la plante des effets
nocifs du rayonnement solaire (Gehin et al., 2006).

En calculant les pourcentages en flavonoïdes par rapport aux phénols totaux pour les
différentes parties de Thapsia garganica nous avons constaté une différence considérable
entre les proportions des flavonoïdes dans les phénols totaux entres les différentes
parties de plante , et spécialement entre les graines matures et immatures, ce qui
indique la variation de la composition en polyphénols pendant la maturation .

70
 Chapitre III: Activité antioxydante

Tableau 12 : Teneurs en polyphénols et flavonoïdes dans les différentes parties

de Thapsia garganica mg EQ /g MS
Phe Tot ( mg/g Ms) Fv Tot ( mg/g Ms) Rapport: Fv/Phe

Feuilles 4,40±0,12 0,42 ±0,03 9,55

Racines 2,34±0,05 0,19 ±0,00 8,11

Graines m 5,11±0,05 0,68±0,016 13,31

Graines im 9,39±0,25 0,65±0.02 6,92

3. L’activité antioxydante des différents extraits

3.1. Test DPPH

Le paramètre IC50 " efficient concentration " (également appelé valeur EC50) qui est
défini comme la concentration effective du substrat, provoque la perte de 50% de l'activité
DPPH. La valeur d’IC50 de chaque extrait est déduite graphiquement des courbes de
variation du pourcentage d'inhibition I% (Annexe 1) en fonction de la concentration de
chaque extrait. L’IC50 et l'activité antioxydante de l'extrait testé sont inversement
proportionnelles. Les valeurs du IC50 trouvées pour tous les extraits testés ainsi que les
valeurs du IC50 de certains antioxydants de référence sont présentées dans le Tableau13.

Les valeurs IC50 des différents extraits varient de (0,05±0,00 mg/ml) pour les extraits de
méthanol provenant de feuilles et de graines immatures et (2,93±0,03 mg/ml) pour les
extraits de dichlorométhane des feuilles. Les extraits d’acétate éthyle et méthanoliques
des graines matures,graines immatures et ceux des feuilles ont des activités anti-
radicalaires similaires et sont généralement plus actifs que les extraits de racines ,alors
pour les extraits dichlorométhane ce sont les graines qui ont donnés les meilleures
activités.

71
 Chapitre III: Activité antioxydante

Tableau 13: Les valeurs IC50 de test DPPH pour les différents extraits de Thapsia
garganica
Insaponifiables Hexane Dichlorométhane Acétate d’éthyle Méthanol

Feuilles 0,68±0,01 1,33±0,02 2,93±0,03 0,31±0,000 0,05±0,000

Racines 0.94±0,03 1,14±0,02 1,37±0,03 0,74±0,01 0,3±0,009

Graine m 1,14± 0,04 32,96 ±1.78 0,51±0,003 0,39±0,015 0,06±0,000

Graine im 4,16±0,05 28,58± 0,15 0,48±0,006 0,38±0,002 0,05±0,000

Les standards

Vitamine E 0,021±0,0004

Vitamine C 0,0075±0,000

Selon les résultats présentés dans l'histogramme de la Figure 29, les activités anti-
radicalaire des différents extraits de Thapsia garganica sont classés dans cet ordre
croissant ; dichlorométhane, éthyle acétate et méthanol, ce résultat confirme celui obtenu
par Kang et al., qui suggèrent que les molécules polaires présentes dans les extraits
végétaux contribuent à la montée en activité antiradicalaire.

Si nous comparons l'activité antioxydante de nos extraits avec celles obtenues avec les
standards (vitamines C et E), nous pouvons conclure que les différentes parties de Thapsia
garganica ont des activités importantes, notamment les extraits méthanoliques des feuilles
et graines qui sont presque sept fois moins actifs que la vitamine C et deux fois mois actifs
que la vitamine E.

Les valeurs des IC50 des différents extraits étudiés dans ce travail sont supérieures à
celles des extraits éthanoliques (0,024 mg/ml) et aqueux (0,02mg/ml) de la partie aérienne
de Thapsia garganica étudiés par Naffati et al. Les extraits méthanoliques de graines et
feuilles ont des valeurs du IC50 proches de celles des extraits méthanoliques de graines
de Thapsia garganica étudiés par TLILI Nizar et al. (2015) avec une valeur de 0,046 ± 0,0
mg/ml

72
 Chapitre III: Activité antioxydante

Comparons nos résultats avec ceux des autres espèces de la même famille d'Apiaceae, les
extraits des graines de Thapsia garganica ont des activités plus importantes que celles de
graines d’anis et de coriandre (espèces majeures de cette famille), avec des IC50 de 0,
687 ± 0,028mg/ml et 1,930 ± 0,024 mg/ml respectivement (Martin ,2016).

Figure 29:Valeurs IC50 de test DPPH des extraits polaires des différentes parties de
Thapsia garganica

De nombreuses études ont suggéré que la capacité antioxydante des extraits de plantes
est corrélée avec la teneur en composés phénoliques (Wojdylo et al., 2007). En évaluant le
potentiel antioxydant de cinq extraits de plantes appartenant à la famille des Apiaceae,
Christova-Bagdassarian et al., (2013) ont conclu que le potentiel antioxydant le plus
important était celui de l'extrait de plantes le plus élevé en polyphénols.

Dans cette étude, une forte corrélation négative est observée entre la composition en
polyphénols et celles des IC50 de nos extraits avec un coefficient de Pearson de -0,737* ( p
0,015), indiquant la contribution des composés phénoliques au pouvoir de capture des
radicaux libres DPPH de nos extraits (Figure30).

La corrélation entre le pouvoir réducteur de nos extraits et celui de la composition en

flavonoïde semble être moins importante avec un coefficient de Pearson de -0,591
(Figure 35) et une valeur P égale à 0,072, cela montre que cette corrélation n'est pas
statistiquement significative et peut être due au hasard.

73
 Chapitre III: Activité antioxydante

Il est à noter que cette étude de corrélation ne permet pas de tirer des conclusions
définitives sur l'effet de la teneur en composés phénoliques. En effet, la détermination
colorimétrique des composés phénoliques et flavonoïdes intègre plusieurs structures même
celles qui ne contribuent pas à l'activité antioxydante. De plus, l'activité antioxydante
dépend non seulement de la concentration, mais aussi de la structure des antioxydants.

Figure 30: Régression linéaire entre les valeurs IC50 et les taux de phénols et de flavonoïdes

Pour les extraits lipidiques, nous avons obtenu des variations très importantes entre les
valeurs IC50 des extraits hexaniques de Thapsia garganica (Figure31), en particulier entre
les graines (mûres et immatures) et celles des feuilles et des racines, de sorte que l'huile
des graines matures est 24 fois plus faible que l'huile des feuilles et 29 fois plus faible que
l'huile des racines alors que les graines immatures ont une activité antiradicalaire
légèrement plus puissante que les graines matures.

74
 Chapitre III: Activité antioxydante

Figure 31: Valeurs IC50 de test DPPH pour les extraits lipidiques de Thapsia garganica

En comparant les IC50 des différents extraits hexaniques et insaponifiables de Thapsia

garganica avec celle de la vitamine E, on constate que l'activité antiradicalaire de tous nos
extraits est inférieure à la capacité de rétention du radical DPPH. de la substance de
référence. Cette capacité est plus importante pour les insaponifiables avec des IC50 qui
varient entre (0,68±0,01 mg/ml) pour les feuilles et (4,16±0,05 mg/ml) pour les graines
immatures.

Nous avons remarqué dans cette étude, que les insaponifiables des graines matures et
immatures sont trop actives par apport à leurs huiles (de 6 à 29 fois) alors que les
insaponifiables des racines et feuilles ont une IC50 proche de leurs huiles (de 1,2 à 1,9
fois plus active). Ceci s'explique peut être par la forte teneur en insaponifiables dans les
huiles de feuilles et de racines par apport aux graines (mentionné auparavant dans le
Chapitre 2).

3. 2. Test FRAP

Le test du FRAP semble être un test prometteur et potentiellement utile. Les réactifs sont
peu coûteux, la procédure est rapide et simple, les résultats sont très reproductibles sur une
large gamme de concentrations et l'équipement requis est d'un type couramment utilisé
dans les laboratoires de biochimie (Benzie et Strain, 1996). Ce test mesure le pouvoir
réducteur en milieu acide.

75
 Chapitre III: Activité antioxydante

C'est une méthode de mesure de la puissance des substances contenues dans nos extraits
pour réduire le fer ferrique Fe3+ en fer ferreux Fe2+ qui est un des mécanismes
antioxydants. La capacité réductrice d'un composé peut servir d'indicateur significatif de
son activité antioxydante potentielle. De nombreuses publications actuelles ont indiqué
qu'il existe une relation directe entre les activités antioxydantes et le pouvoir réducteur des
composants de certaines plantes.

Les résultats de ce test peuvent être exprimés de plusieurs manières : soit en équivalent
acide ascorbique en utilisant la courbe de variation de l'absorbance de la vitamine C en
fonction de la concentration, en comparant les courbes de variation de l'absorbance en
fonction de la concentration des extraits avec celles des références ou en calculant le
paramètre IC50.

Dans notre travail, nous avons testé les différents extraits polaires de Thapsia garganica selon
la méthode FRAP, et les résultats obtenus nous ont permis de tracer des courbes de variation
de l'inhibition en fonction de la concentration de chaque extrait(Annexe 2 ). Sur la base de ces
résultats, nous avons calculé le paramètre IC50 pour chaque extrait et les résultats sont
présentés dans le Tableau 14.

Tableau 14: Valeurs IC50 de test FRAP pour les différents extraits de Thapsia
garganica exprimées en mg/ml

Dichlorométhane Acétate d’éthyle Méthanol

Feuilles 0,2± 0,0188 0,12±0.004 0,18±0,01

Racines 1,4±0,014 0,033±0,000 0,5±0,009

Graine m 0.27±0,04 0,17±0,003 0,016±0,00

Graine im 0,32±0,009 0,17±0,005 0,0072±0,000

Vit C 0.003±0.00

Le Tableau 14 montre que tous nos extraits ont des activités antioxydantes significativement
plus faibles que la référence (acide ascorbique), pour cette dernière la réduction est presque
totale à partir d'une concentration de 0,1 mg/ml (Figure 32).

76
 Chapitre III: Activité antioxydante

Cette réduction est beaucoup plus importante dans les extraits méthanoliques de graines et
l'extrait d'acétate d'éthyle de racines.Si nous classons nos extraits selon la puissance de
réduction de fer par rapport à l’acide ascorbique, nous obtiendrons l’ordre suivant : acide
ascorbique > MeOH Gim >MeOH Gm > Ac-o-Et R> Ac-o-Et F> Ac-o-Et (Gm, Gim) >
MeOH F > MeOH R > DCM F >DCM Gm >DCM Gim >DCM R. généralement, les
extraits méthanoliques et les extraits d’ acétate éthyle sont de bons réducteurs comparés à la
vitamine C qui est considérée comme un antioxydant pur.

Figure 32: Courbe de réduction de la Vitamine C

Figure 33: Valeurs IC50 de test FRAP des différents extraits de Thapsia garganica

77
 Chapitre III: Activité antioxydante

L'histogramme de la Figure 33 montre que les différents extraits de graines matures et

immatures ont des capacités similaires de réduction du fer ferrique Fe3, et que cette activité est
proportionnelle à la polarité du solvant. cette corrélation entre la polarité et l’activité
antioxydante a été remarquée dans le test DPPH pour différentes parties de la plante et non pas
seulement pour les graines.

Après l’analyse de ces résultats, nous n'avons pas trouvé de corrélation (r=0,11) entre le
pouvoir antioxydant de la IC50 et la teneur totale en phénol et en flavonoïdes. Ce résultat
s'explique par le fait que la capacité de réduction du fer ferrique Fe3 de nos extraits ne
dépend pas nécessairement de la teneur en composés phénoliques mais de leurs structures
chimiques, ou d'autres composés qui ne sont pas phénoliques, à savoir les alcaloïdes et
terpénoïdes

Conclusion

En conclusion, les extraits polaires de Thapsia garganica ont montré une richesse en
composés phénoliques et flavonoïdes, avec une différence significative entre les
différentes parties étudiées. Les résultats obtenus montrent que le méthanol peut être un
bon extracteurs des composés phénoliques à partir cette plante.

L'étude de l'activité antioxydante des différents extraits par les deux tests DPPH et FRAP
montre activité importante des extraits méthanoliques surtout ceux des graines,

L'étude de l'activité antioxydante des huiles et des insaponifiables de Thapsia garganica

par le test DPPH montre une très forte activité des huiles de racines et de feuilles par
rapport aux graines, ainsi qu'une forte activité des insaponifiables par rapport à leurs
huiles pour toutes les parties étudiées mais avec une différence plus significative entre
l'activité des huiles de graines et celle de leurs insaponifiables.

Une corrélation significative est obtenue entre la capacité de piégeage du radical DPPH.
et celle de la composition en polyphénols, tandis qu'aucune corrélation n'est trouvée entre
les résultats des tests FRAP et ceux des compositions en polyphénols ou flavonoïdes.

78
 Chapitre III: Activité antioxydante

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82
 Chapitre IV

Inhibition de la réaction enzymatique de la

lipase de Candida rugosa
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

1. Lipases

Les lipases (E. C.3.1.1.3) forment une famille hétérogène d'enzymes capables d'hydrolyser
les triglycérides en glycérol et en acides gras correspondants(Figure 34). Elles ont été mises
en évidence dès 1901, chez des bactéries telles que Bacillus prodigiosus, Bacillus pyocyaneus
et Bacillus fluorescens (dénommées respectivement Serratia marcescens,
Pseudomonas aeruginasa et Pseudomonas fluorescens) (Eijkmann et al., 1901)

Chez l’homme, ainsi que chez d’autres vertébrés, les lipases interviennent dans le contrôle de
la digestion, de l’absorption et de la reconstitution des graisses. Les lipases de mammifères
peuvent être classées en trois groupes. Le premier est constitué par les lipases associées à la
digestion, telles que les lipases linguale, pharyngale, gastrique et pancréatique. Le second
groupe correspond aux lipases présentes dans le cerveau, les muscles, les artères, les reins, la
rate, la langue, le foie et les tissus adipeux. Le troisième groupe correspond aux lipases
produites par les glandes galactogènes produisant le lait maternel (Baba et al., 1991 ; Fickers
et al., 2008).

Les enzymes des bactéries et des mycètes ont le plus grand potentiel en tant que
biocatalyseurs industriels puisqu'elles sont habituellement résistantes, faciles à produire par la
fermentation et facile à récupérer le bouillon de culture. Par conséquent, un grand nombre
d'enzymes microbiennes peut être obtenu à partir des producteurs commerciaux (Müller et
Petry, 2004).

Figure 34: La réaction d’hydrolyse d’un triglycéride par la lipase (Jaeger et al., 1994).

84
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

2. Mécanismes catalytiques

Les lipases, dont la fonction biologique première est d’assurer le catabolisme des
triacylglycérols, également appelés triglycérides (~ 90% des lipides alimentaires), en
acides gras et en glycérol, présentent la particularité de reconnaître une large gamme de
substrats distincts. En outre, les lipases peuvent être extraites de différentes souches,
animales, végétales ou microbiennes (Jaeger et Manfred ,1998 ;Jaeger et Thorsten,
2002).Néanmoins, en dépit d’une certaine hétérogénéité des séquences peptidiques
recensées, les lipases, au sens strict, présentent une structure tridimensionnelle commune,
caractérisée par un repliement dit α/β (alternance d’hélices α et de feuillets β) ( Ollis et
al,1992), une triade catalytique Sérine-Aspartate/Glutamate-Histidine typique, et la
présence d’une hélice α mobile, appelé « couvercle » ou « volet », pouvant recouvrir le
site actif (Figure35).

En effet, dans un milieu aqueux homogène (les lipases sont hydrosolubles), le site actif
est préférentiellement isolé par une boucle polypeptidique amphiphile hélicoïdale.
L’enzyme est alors en conformation dite «fermée», ou plus précisément, dans un état
d’équilibre déplacé vers la conformation « fermée ». Cependant, en présence d’une
interface hydrophobe (Reis et al.,2006), induite par une goutte d’huile (triglycéride)
(Miled et al,2001), un solvant organique, un support solide ( Reetz et al., 1996) ou une
protéine appropriée( Palomo et al., 2003), l’ouverture du « couvercle » est favorisée. Ainsi,
en conformation dite « ouverte » ou «active » (ou plus précisément, dans un état
d’équilibre déplacé vers la conformation «ouverte»; (Figure 39), la face hydrophobe de la
boucle polypeptidique, initialement orientée vers l’intérieur du site actif, interagit
préférentiellement avec l’interface et expose les groupements catalytiques de l’enzyme au
milieu réactionnel. Ce mécanisme complexe, nommé «activation interfaciale», a été très
largement étudié (Brzozowski et al., 1991)

85
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Conformation
Conformation
fermée
Couvercle ouvert

Résidu
histidine de site

Figure 35 : Représentations de la structure de la lipase extraite de Thermomyces

lanuginosus en conformations « fermé » et « ouverte ». Le « couvercle » est une hélice α
mobile, indiqué en vert sur le schéma (Ollis et al., 1992).

3. Intérêt de l'inhibition de la lipase

Les triacylglycérols acyl-hydrolases, ou lipases (E. C.3.1.1.3), sont des enzymes

atypiques par leur mécanisme d’action et leur spécificité de substrats. En fonction du
micro-environnement de l’enzyme, elles peuvent agir en tant qu’hydrolases en milieu
aqueux ou comme catalyseurs en synthèse organique. En tant qu’hydrolases, elles sont
responsables du catabolisme des triglycérides, leurs substrats préférentiels, en acide gras et
en glycérol [ Klibanov, 2001 et A M Klibanov;1985).

Une perturbation du métabolisme des lipides dans le corps humain peut entraîner le
développement de nombreuses maladies, telles que le diabète et les maladies
cardiovasculaires, deux des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays
industrialisés ( Stitziel,2017). L’inhibition des lipases est l’un des mécanismes les plus
utilisés pour réduire l’adsorption des graisses par inhibition de l’hydrolyse des
triacylglycérols chez les personnes en surpoids souffrant d’hypertension, de diabète, de
cholestérol élevé et de maladies cardiaques (Hauptman,1992; Drent et Van der ,1993).

86
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Une autre direction d'utilisation de l'inhibition de la lipase consiste à bloquer l'effet

pathogène de certains microorganismes qui produisent des lipases extracellulaires pour
coloniser la peau et les muqueuses de l'homme et des animaux (Grippa et al., 1999).Par
conséquent, l'étude de nouveaux inhibiteurs naturels de la lipase a suscité un grand intérê

Plusieurs composés utiles dans la thérapie de ces maladies ont démontré une activité
antilipase élevée : le tétracycline et autres médicaments anti-acné pour l’inhibition de la
lipase de P. acnes (Higaki, 2003), le sucralfate et autres médicaments antiulcère pour
l’inhibition de l’activité lipolytique de H. pylori (Slomiany et al., 1 1994), l’orlistat
(Xenical), le tetrahydro-derivé de lipstatine, est utilisé couramment dans le traitement de
l’obésité sévère (Eisenreich et al., 2003)

Les métabolites secondaires des plantes ont montré qu’ils sont très utiles dans la
prévention et le traitement de nombreuses maladies (Singh et al., 2003). Ils sont une
source prometteuse d’inhibiteurs de lipases car ils sont présents à des concentrations
élevées dans les extraits végétaux et capables d’inhiber la lipase pancréatique porcine
(Shimura et al., 1992). En outre, ces composés sont également présents dans plusieurs
extraits de plantes utilisées en médecine traditionnelle pour le traitement de maladies liées
à la présence de lipase telles que l'ulcère gastrique (Borrelli et Izzo, 2000) ou de l'acné
(Higaki, 2003).

MATERIEL ET METHODES

Pour notre étude, le choix de la lipase a été motivé principalement pour les raisons
suivantes:

- Une enzyme facilement disponible chez plusieurs fournisseurs et elle est utilisée dans
différentes applications industrielles ou de laboratoire,

- Il existe des substrats synthétiques couramment commercialisés permettant une mesure

simple et précise de son activité enzymatique à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible.

87
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

1.Extraction des métabolites secondaires

Les feuilles et les racines de Thapsia garganica ont été collectées en mars 2016 , alors
que les graines ont été collectées en juin de la même année. Les trois parties de la plante
ont été séchées à l'air ensuite broyées en une poudre fine. Une quantité de 50 g de poudre
végétale des différentes parties (racines, feuilles, graines) est macérée dans un volume
approprié (200 ml) d’hexane pendant 24 h à température ambiante et à l’obscurité afin
d’éliminer les lipides et les pigments. Après filtration, le résidu obtenu est macéré avec
un volume de 300 ml d’acétate d’éthyle pendant 48 h à température ambiante et à
l’obscurité. Les fractions d'acétate d'éthyle ont été séchées par addition d'une quantité
suffisante de sulfate de sodium anhydre, puis évaporées sous vide à 40 °C. Les résidus
secs recueillis sont stockés à + 4 °C jusqu'à leur utilisation .

3. Activité enzymatique de la lipase Candida rugosa :

La lipase de Candida rugosa et tous les autres réactifs ont été achetées à partir Sigma-
Aldrich. Tous les autres produits chimiques et solvants utilisés étaient de qualité
analytique.

La technique physico-chimique utilisée pour étudier la cinétique de l’hydrolyse de l’ester

par la lipase microbienne est la spectrophotométrie UV-Visible (405nm). Dans cette étude,
nous nous s’ intéressons à l’apparition du produit d’une coloration jaune le para-
nitrophénol (p-NP) en suivant l’évolution de sa densité optique. Le p-NP se produit de
l’hydrolyse de para-nitrophényllaurate (p-NPL) en présence de la lipase microbienne
selon l’équation de la réaction suivante(Figure 36):

88
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 36: Schéma réactionnel de l’hydrolyse de p-NPL par la lipase microbienne

(Benarous, 2010)

3.Tests d’inhibition de l’activité de la lipase.

Dans le but d’étudier l’effet de Thapsia garganica sur la lipase de Candida rugosa (LCR)
et de déterminer le paramètre d’inhibition IC50 (la concentration nécessaire de l’inhibiteur
pour inhiber 50 % de l’enzyme ou diminuer 50 % de l’activité enzymatique), nous avons
procédé à la méthode décrite par Benarous et al (2013). Après avoir testé l’activité
inhibitrice des extraits de Thapsia garganica qui ont donné une inhibition importante (>
50%) nous avons procédé à la détermination de leurs paramètres IC50 .

Le milieu réactionnel contient 100 μl de l’extrait dilué et 100 μl de la LCR de 0,5 mg/ml
a été pré-incubé dans un bain marie à 37°C pendant 15 min, la réaction a été déclenchée
par l’ajout de 900 μl de p-NPL (préparé dans un tampon phosphate pH7) pendant 15
min . La lecture de l’absorbance des échantillons est effectuée immédiatement à l’aide
d’un spectrophotomètre modèle SP_3000 nano, à une longueur d’onde de 405 nm contre
un blanc.

89
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Une unité d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui libère 1
µmol de p-NP par minute dans les conditions de dosage décrites ci-dessus. La cinétique
d'inhibition a été réalisée en utilisant différentes concentrations d'extraits. Toutes les
expériences ont été effectuées au moins trois fois.Les valeurs des IC50 ont été déterminées
de la représentation graphique I % = f (I) tel que I % est déterminée suivant cette
relation :
 Aextrait 
I %  1   *100
 Acontrol 

Avec : I % : le pourcentage d’inhibition.

Aextrait : l’absorbance de l’activité lipolytique en présence de l’extrait végétal.

A control : l’absorbance de l’activité lipolytique en absence de l’extrait végétal

4.Analyse statistique

Les résultats sont présentés par la moyenne avec son écart type (n=3) pour chaque cas.

5. Docking moléculaire

La bio-informatique est constituée par l'ensemble des concepts et des techniques

nécessaires à l'interprétation de l'information génétique (séquences) et structurale
(repliement 3D). C'est le décryptage de la bio-information. Son but, comme tout volet
théorique d'une discipline, est d'effectuer la synthèse des données disponibles et d'énoncer
des hypothèses généralisées .
Les structures de thapsigargine, thapsigargicine, tribolid, notrilobolid et la
thapsivillosine C ont été obtenues de la base de données Pub Chem compound et leurs
charges de gasteiger ont été ajoutées à l'aide du logiciel d' Autodock tools. La structure 3D
de la lipase de C. rugosa (PDB ID: 1CRL) et de la lipase pancréatique humaine
(LPA)(PDB ID: 1LPA) ont été obtenues à partir de la banque de données protéiniques
(PDB:Protein Data Bank ). Pour les études d'amarrage, la protéine initiale a été préparée
en éliminant toutes les molécules d'eau et les ligands. Il est bien connu que les fichiers
PDB ne contiennent pas d’hydrogènes. Par conséquent, les hydrogènes polaires et les
charges partielles ont été ajoutés à la structure. Le nombre d’analyses effectuées est 50
avec 20 solutions pour chaque analyse pour la LCR , ce qui nous donne 1 000 solutions ,

90
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

et 50 analyses avec une solution pour chaque analyse pour la LPA. Toutes ces solutions
sont bien traitées et nous n’avons accepté que des conformations avec des liaisons à faible
énergie . Les paramètres de docking utilisés sont les mêmes que ceux publiés par
Benarous et al ., 2015 pour la CRL

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

1.Inhibition de la réaction catalysée par la lipase

Les rendements en extrait pour les trois parties étudies dans ce travail sont montrés
dans le Tableau 15. Le classement des rendements obtenus, qui varient de 0,58 % pour
les racines à 7,1 % pour les graines ,est similaire à celui obtenu dans le troisième chapitre
malgré la modification des conditions d’extraction (solvant, temps d’extraction ,
méthode d’extraction et l’année de récolte de la plante ..ect).

Les produits phytochimiques identifiés à partir des plantes médicinales traditionnelles

représentent une opportunité intéressante pour le développement de nouveaux traitements
inhibiteurs de lipases, mais très peu d'études sont concentrées sur les lipases microbiennes
et végétales. Cependant, ces lipases sont également impliquées dans plusieurs altérations
alimentaires.

À partir de l’étude bibliographique sur la fonction physiologique de la lipase et le rôle de

ses inhibiteurs dans le traitement de plusieurs maladies. Nous avons évalué le pouvoir
inhibiteur des extraits acétate d’éthyle de notre plante sur l’activité de cette enzyme dans
le but de trouver de nouveaux inhibiteurs . Cette étude est la première à évaluer l’effet
inhibiteur des extraits de Thapsia garganica sur la lipase de Candida rugosa .Nous avons
tracé les courbes représentant la variation de l’inhibition en fonction des concentrations de
nos extraits exprimées en mg/ml pour une seule concentration de substrat , les courbes
sont présentées dans la Figure 37. Les valeurs des IC50 (Tableau 15) sont déterminées en
mg/ml à partir des représentations graphiques et calculées aussi en mM en tenant compte
que la masse molaire moyenne des composés phénoliques égale à 500g/mol.
Les résultats obtenus ont révélé une activité puissante de nos extraits avec une
différence entre les activités des feuilles, racines et graines. Ce qui révèle une différence

dans la nature et le nombre des groupements fonctionnels entre les différentes

parties de la plante .Ainsi les graines qui présentaient les quantités les plus élevées en
composés phénoliques et l'activité antioxydante la plus importante ,ont donné l’activité

91
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

inhibitrice la plus élevée vis-à-vis de la lipase de Condida rugosa avec une IC50 de
1,19 mg / ml, alors que les feuilles ont donné l’activité la plus faible avec une IC50 de 1,96
mg / ml, et les racines ont une IC50 de 1,87 mg / ml.

Tableau 15:Rendement d’extraction et les valeurs de IC50 des extraits de Thapsia garganica

Partie Rendement (%) IC50 (mg/ml) IC50 (mM)a

Feuilles 2,40 1,96±0.12 3,92
Graines 7,10 1,19±0.11 2,389
Racines 0,58 1,87±0.10 3,74

Afin d’estimer l’efficacité de T. garganica à inhiber l’activité de lipase, nous avons

regroupé dans le Tableau 16 plusieurs résultats obtenus des études récentes portant sur
l’inhibition de la lipase par différentes sources avec leur CI50 et le type d’enzyme étudié.

Selon ces études, la valeur de la IC50 est influencée par plusieurs paramètres tels que le
type de solvant, la source d'enzyme et la pureté de l'extrait étudié. Généralement , les
extraits d'acétate d'éthyle de Thapsia garganica sont de bons inhibiteurs de la lipase par
rapport aux autres extraits issus d’autres plantes publiés dans la littérature, tels que les
extraits de dichlorométhane de Peganum harmala (Benarous et al., 2015), les extraits au
butanol de Zizyphus lotus (Benarous et al., 2013), les extraits au méthanol de Mentha
viridis et d'Eucalyptus globulus ( Belfeki et al., 2016) Cependant, ils sont moins puissants
que d’ autres extraits , tels que les extraits éthanoliques de Chamomilla recutita (Franco et
al., 2016), Bauhinia forficata (Franco et al., 2016), Kedrostis africana (Unuofin et
Otunola, 2018) et des molécules pures comme la saponine, la stéphalagine (alcaloïde) et
l’orlistat.

Plusieurs études réalisées sur l'étude de l'inhibition de la réaction enzymatique de la

lipase par des terpénoïdes isolés à partir de plantes médicinales , ont montré que leur
influence était prometteuse.

92
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Dans cette étude, les activités inhibitrices des lipases testées d'extraits bruts de Thapsia
garganica, une source importante de nombreux sesquiterpénoïdes (Makunga et al,.2003),
sont largement inférieures à celles des terpénoïdes isolés des plantes comme Calotropis
procera (Moon et kiim, 2018) et Ginkgo bilobathese (Ercan, 2016) qui sont 100 à 1000
fois plus actives que nos extraits(Tableau16)

Figure 37: Représentations graphiques I %= f (C) des différents extraits de Thapsia

garganica .

93
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Tableau 16: Valeurs d’IC50 de quelque extraits naturels selon les références.

Solvant/
plant Molécule IC50 (mg/ml) Lipase source Référence
Candida
Peganum harmala CH2Cl2 1,74 rugosa Benarous et al., 2015
Candida
Peganum harmala Éthanol 0,83 rugosa Benarous et al., 2015
Aspergillus
Eucalyptus globulus Méthanol 0,69 niger Belfeki et al., 2016
Eucalyptus globulus Méthanol 1,29 Olive Belfeki et al., 2016
Aspergillus
Mentha viridis Méthanol 0,43 niger Belfeki et al., 2016
Mentha viridis Méthanol 1,44 Olive Belfeki et al., 2016
Candida
Achillea santolina Et-O-Ac 0,37 rugosa Benarous et al., 2013
Candida
Achillea santolina Et -O- Ac 4,83 rugosa Benarous et al., 2013
Candida
Zizyphus lotus Et -O- Ac 0,45 rugosa Benarous et al., 2013
Candida
Zizyphus lotus Bu-OH 8,27 rugosa Benarous et al., 2013
Chamomilla recutita Ethanol 0,26 Pancreas Franco et al., 2016
Bauhinia forficata Ethanol 0,059 Pancreas Franco et al., 2016
Unuofin et Otunola ,
Kedrostis africana Ethanol 0,38 Pancreas 2018
Camellia japonica Ethanol 0,39 Pancreas Moon et kiim,.2018
Tribulus terrestris Saponin 0,01 Pancreas Ercan,. 2016
Annona crassiflora Stephalagine 8,35 .10-3 Pancreas Pereira et al., 2017
Calotropis procera Di-terpenoide 0,01 Pancreas Patil et al .,2015
Ginkgo biloba Ginkgolide A 0,02 Pancreas Bustanji et al,.2011
Ginkgo biloba Ginkgolide B 0,09 Pancreas Bustanji et al., 2011
Ginkgo biloba Bilobalide 0,06 Pancreas Bustanji et al., 2011
Synthetic Candida
Orlistat antiobesity drug 0,06 rugosa Benarous et al., 2015

94
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

2. Docking des inhibiteurs sur la lipase de Candida rugosa :

Le Docking ou amarrage est l’insertion d’un ligand au niveau d’un site récepteur d’une
macromolécule en utilisant des logiciels bio-informatique en collaboration avec
l’algorithme génétique, ce phénomène est utilisé pour l’étude des réactions de
complexation généralement dans le domaine pharmacologique afin de déterminer les
différents paramètres de cette fixation ainsi que son mécanisme catalytique (Seal et al.,
2011).

Notre objectif de recherche est d’étudier l’inhibition de la lipase pancréatique humaine et

de la lipase de Candida rugosa par les méthodes de modélisation moléculaire,et nous
intéressons à déterminer le mode d’interaction du complexe (lipase- inhibiteur) pour la
fixation de l’inhibiteur à l’enzyme, avec une meilleure complémentarité et en calculant
l’énergie d’interaction du complexe formé. Le complexe qui aura l’énergie d’interaction la
plus faible est celui qui présentera la meilleure activité et par la suite une meilleure
inhibition

Les sesquiterpènes lactones sont des métabolites secondaires d'origine végétale trouvés
dans plus de 15 familles avec plus de 4 000 structures connues. Ils influencent plusieurs
molécules et enzymes comme l'acide phosphatase, l'arylsulfatase, la cyclooxygénase,
l'ADN polymérase, le glycogène synthase, la 5-lipoxygénase, la phosphofructokinase, la
phosphofructokinase, la phospholipase et thymidylate synthétase (Drew et al,.2009). La
bioactivité de certains sesquiterpènes lactones de Thapsia garganica (Makunga et al., 2003)
et les résultats obtenus dans cette étude nous ont encouragé à étudier certains constituants
bioactifs de T. garganica qui pourraient être responsables de l'inhibition de la lipase.

Des expériences d’amarrage ont été menées pour prédire les orientations des liaisons de
la thapsigarine, de la thapsigargicine, du tribolid, du notrilobolid et de la thapsivillosine C
dans le site actif des deux lipases. Le Tableau17 montre les résultats générés par Autodock
Vina après l'analyse. Les liaisons générales entre les composés et les deux lipases (Lipase
de Candida rugosa : CRL et lipase pancréatique humaine: LPA) sont illustrées aux
Figures 38 à 44. Les distances des interactions ont été calculées à l'aide de LigPlot +.

95
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

La liaison hydrogène (liaison H) fournit une contribution très importante à l'affinité de

liaison pour les ligands. ainsi quatre composés parmi les cinq composés étudiés présentent
une interaction de type hydrogène avec Gly128, Ser 450 ou Val 454 des CRL, et seuls
deux des cinq composés étudiés présentent une interaction hydrogène avec Arg 252 de
LPA.

En plus des interactions hydrophobes observées dans toutes les solutions, Tribolid a
formé deux liaisons H avec les résidus Gly 128 et Ser 450 à une distance de 2,85 Å. La
thapsigargicine et le nortribolid montrent deux liaisons H avec la Ser 450 de CRL à des
distances de 2,97 et 2,91 Å, respectivement, la Thapsigargin montre également une
liaison H, mais avec le résidu Val 454 des CRL. Cependant, la thapsivillosine C n’a formé
aucune liaison H, elle ne montre que des interactions hydrophobes avec les résidus Val
127, Phe 296, Phe 344, Phe 345, Phe 448, His 449 et Val 454. Les autres interactions
hydrophobes formées par quatre premiers composés sont: avec Val 127, Phe 296, Phe 344,
Phe 345 et His 449.

96
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Tableau 17: Résultats générés par Autodock Vina après l'analyse

Molécule Lipase de Candida rugosa Lipase pancréatique humain

H- H- Affinity
Hydrogen Hydrophobic Hydrogen Hydrophobic
Bond Bond Binding
interactions interactions interactions interactions
length length Kcal/Mole

Ile 78, Phe

77(3), Ala
Ser 450, Val 127, Phe 259, Ala
Tribolid 2.85 Arg 256 2.86 -6.558
Gly 128 296 260; His
263(2), Phe
215(2)

Phe 345, Phe

Thapsigargicin Ser 450 2.97 - - - -
344, His 449

Ile 78, Phe

77(3), Ala
Val 127, Phe 259, Ala
Nortribolid Ser 450 2.91 Arg 256 2.86 -6.618
296 260; His
263(2), Phe
215(2)

Phe 344, His

Thapsigargin Val 454 - - - - -
449

Phe 448, Val

454, Phe
Thapsivillosin 296, Val
- - - - - -
C 127, Phe
345, Phe
344, His 344

97
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 38: La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction moléculaire

avec Tribolid .

98
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 39: La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction moléculaire

avec Thapsigargicin.

99
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 40:La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction moléculaire

avec nortrilobolid .

100
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 41: La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction moléculaire

avec Thapsigargin.

101
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 42:La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction moléculaire avec

Thapsivillosin C.

102
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 43: La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction moléculaire

avec Tribolid

103
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Figure 44: La meilleure solution obtenue d’amarrage de l’interaction moléculaire

avec nortribolid.

104
 Chapitre IV: Inhibition de la réaction enzymatique de la lipase de Candida rugosa

Conclusion:

Les résultats obtenus dans ce chapitre montrent que les extraits des différentes parties
de Thapsia garganica ont un pouvoir inhibiteur important de l’activité enzymatique de la
lipase, avec un effet inhibiteur plus important pour les racines .À partir de ces résultats et
par rapport aux résultats de docking moléculaire , nous suggérons que nortribolid et
Tribolid puissent se lier fortement au site actif, ce qui leur permet de former des liaisons
covalentes entre:
 NH2 d’Arg 256 et CO . Le mécanisme proposé de cette liaison est le
suivant: NH2 + CO ⇄ NH2CO H + NHCO
 OH de Ser450 et CO . Le mécanisme de réaction proposé est le suivant:
C-OH + C-OH ⇄ H2O + C = O- C

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107
Conclusion générale
 Conclusion générale

Thapsia garganica L. (Apiaceae) est l’une des plantes médicinales importantes , elle a
fait l’objet de plusieurs recherches scientifiques en raison de ses caractéristiques
biologiques telles que ses propriétés antioxydantes, antifongiques, anti-inflammatoires,
cytotoxiques, anticancéreuses .
Le présent travail a pour objectif de caractériser les graines , les feuilles et les racines de
Thapsia garganica provenant de la région de Tadjmoute (wilaya de Laghouat) à travers
l’étude de quelques activités de ses extraits polaires et apolaires (lipidiques)

L’ étude des huiles de Thapsia garganica a permis de détecter la présence de l’acide

pétrosélinique, un isomère de l’acide oléique.Ces huiles sont caractérisées par différents
profils en acides gras avec des proportions importantes en acides gras insaturés.

L’étude des huiles des différentes parties de Thapsia garganica montre la richesse en
insaponifiables ( tocophérols et en stérols) dans les huiles des feuilles et des racines par
rapport aux graines.

Une évaluation de l’effet de la polarité des solvants sur la teneur en composés

phénoliques est étudiée en réalisant des extractions successives par DCM, Ac-O-Et, et
le MeOH .Les résultats trouvés montrent une différence significative entre le pouvoir
extracteur de ces solvants ainsi qu’une différence entre les teneurs en composés
phénoliques entre les différentes parties de la plante.

Sur la base de cette étude, nous pouvons conclure que le système d'extraction utilisé dans
ce travail nous a permis de déterminer le méthanol comme un bon solvant pour extraire
les métabolites secondaires des graines, racines et feuilles de Thapsia garganica, de sorte
que les extraits obtenus par ce solvant ont les meilleurs rendements et les meilleures
activités antioxydantes comparativement aux autres solvants.

L'étude de l'activité antioxydante des huiles et des insaponifiables de Thapsia garganica

montre une très forte activité des huiles et des insaponifiables de racines et de feuilles
par rapport aux graines.

109
 Conclusion générale

L'activité inhibitrice des extraits d’acétate d'éthyle des graines, feuilles et racines,
de Thapsia garganica contre la lipase de Candida rugosa a été étudiée et les valeurs de
IC 50 obtenus sont: 1,19 mg / ml, 1,96 mg / ml et 1,87 mg / ml, respectivement.Ce qui
révèle une activité puissante de ces extraits spécialement les racines.

Pour découvrir les composants actifs responsables de cette activité anti-lipase, des
recherches supplémentaires ont été effectuées en utilisant des simulations d'amarrage, en
utilisant le programme AutoDock Vina pour discuter la nature des interactions et le
mécanisme d'inhibition par les principaux composés bioactifs synthétisés par cette plante.
Les résultats montrent que le nortribolid et le tribolid sont les meilleurs inhibiteurs des
deux lipases (Candida rugosa et lipases pancréatiques humaines).

À notre connaissance, c’est pour la première fois qu’une étude phytochimique concernant
la composition en acide gras, tocophérols ,l’activité antioxydante, inhibition de lipase a
été menée sur les graines ,les feuilles et les racines de Thapsia garganica. Les résultats
obtenus servent donc à mieux connaître cette espèce, et nous encouragent à la choisir
comme une source pour d’autres études plus approfondies.

A l’issue de ces travaux menés tout au long de cette thèse, un certain nombre de pistes de
recherche sont à notre portée et méritent d’être expérimentées. En voici quelques-unes :

 L’ analyse approfondie et détaillée des insaponifiables des huiles de Thapsia

garganica sera intéressante

 Analyser la composition des extraits polaires.

 Valorisation des extraits obtenus par d’autres tests biologiques telles que l’activité
anticancéreuse et antibactériennes.

 Approfondir l'analyse des tests enzymatiques afin de prouver les mécanismes

suggérés.

110
Annexes
 Annexes

Annexe1:Chromatogramme des EMAG des lipides

Chromatogramme des EMAG des lipides des racines de Thapsia garganica

Chromatogramme des EMAG des lipides des feuilles de Thapsia garganica

112
 Annexes

Chromatogramme des EMAG des lipides des graines immaturesde Thapsia garganica

Chromatogramme des EMAG des lipides des graines maturesde Thapsia garganica

113
 Annexes

Annexe2: Les courbes de variation du pourcentage d'inhibition (I% ) en fonction de la

concentration de chaque extrait.(Test DPPH)

114
Annexes

115
Annexes

116
 Annexes

Annexe3: Les courbes de variation du pourcentage d'inhibition (I% ) en fonction de la

concentration de chaque extrait (Test FRAP)

117
Annexes

118
Annexes

119