N° d’ordre: 12/2008 – D/ S.

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE
Université des Sciences et de la Technologie H O U A RI B O U M E DI E N E

Faculté des Sciences Biologiques

T H ESE

Présentée pour l’obtention du diplô me de D O C T O R A T

E N: S CIE N C E S D E LA N A T U R E

Spécialité Microbiologie

Par

M me B E N M A L E K Ya mina

Sujet

Etude de la résistance aux agents anti microbiens (métaux lourds et antibiotiques)

Et évaluation du pouvoir dépolluant chez un nouveau taxon de la fa mille des
Flavobacteriaceae

Soutenue le 20/12/2008, devant le jury co m posé de

M m e L A R A B A -DJ E B A RI Fati ma Professeur (FS B/US T H B Alger) Présidente

M r H A C E N E Hocine Professeur (FS B/US T H B Alger) Directeur de thèse

M m e T O UI L B O U K O F F A Chafia Professeur (FS B/US T H B Alger) Exa minatrice

M r B A K O U R Rabah Professeur (FS B/US T H B Alger) Exa minateur

M r B E N S O L T A N E Ahm e d Professeur (Univ. O R A N) Exa minateur

 Résu mé

R ES U M E

Dans cette étude, nous avons isolé 17 souches bactériennes de différentes niches écologiques
polluées principale ment par des hydrocarbures. Elles sont à Gra m positif, aérobies strictes,
im mobiles, non sporulées, pig mentées surtout en jaune avec une morphologie variable. Une
d’entre elles, provenant du sol de la ville de M EF T A H en 2006 est à Gra m négatif
(1Y B- R12 T). Elle est psychrotolérante (4°C) avec une température optim ale de croissance
située entre 28°C et 30°C et Halotolérante (tolère une [Na Cl] allant de 1 % – 6 % avec un
optimu m à 4 %). Son pH optimu m de croissance est de 7.3, avec un intervalle allant de (3-11).
Elle est caractérisée surtout par un cycle morphogénétique très variable en fonction de l’âge
de la culture. Le séquençage de l’A R Nr-16S de cette bactérie a montré que c’est une
nouvelle espèce du genre Chryseobacterium appartenant à la famille des Flavobacteriaceae.
T
Le taux de similitude de la souche 1Y B- R12T avec les espèces phylo génétique ment
proches est de 96.5 % avec Chryseobacterium haifense souche H38 isolée en 2007 d’un
échantillon de lait à H AIF A en Palestine. Le contenu de son D N A chro m oso mique en (G+ C)
T
est de 40.9 moles %. Les acides gras cellulaires prédo minants chez la souche 1Y B- R12 T
obtenus de la chimio - taxono mie sont: anteiso-C 1 5:0 (41.4 %) et iso-C15: 0 (14 .4 %). Deux
acides gras sous forme de traces sont mis en évidence; anteiso- C15: 1 A et C 1 8: 0 2 D M A.
T
Le nu méro d’accession de Gen-Bank pour la séquence géno mique de la souche 1Y B- R12 T
est: E U 516352. Le no m latin attribué à ce nouveau taxon est Chryseobacterium solincola
T T T
souche 1Y B- R12 T (= D S M 1183 = C C U G 55604 ).
-Cette nouvelle bactérie tolère des concentrations non négligeables de trois ions métalliques
2+ 2+ 2+
testés soit ; 500 ug/ ml pour le Pb , 300 ug/ ml pour le zn et 150 ug/ ml pour le cd . Les
concentrations résiduelles de chaque métal évalués par le dosage en utilisant la méthode
spectroscopique sont faibles dans l’ense mble et varient en fonction du pH et du métal testé.
2+
La [Cd ] r déterminée à pH acide et neutre (5, 5.5, 7.3) est respectivem ent de 13.26 mg/l,
9 mg/l et 15 mg/l. Les concentrations obtenues à pH basique sont faibles et fluctuent entre
2+
0.198 mg/l et 1.800 mg/l. Pour le zinc à pH=5 et à pH=7.3, la [Zn ] r est de l’ordre de 4.40
m g/l et 5 mg/l. Par contre à pH basique (8.5 et 9) elle est de 5.672 mg/l et 4.14 mg/l. La
2+
[Pb ] r est de 7.1 mg/l à pH neutre, 5.7 mg/l et 5.4 mg/l à pH acide (5 et 5.5). Pour des
p H élevés (basiques) elle fluctue entre 0.76 mg/l et 1.83 mg/l. Sur la base de ces résultats, on
peut considérer cette bactérie psychrotolérante, isolée d’un environne ment très pollué
co m me un germe à pouvoir dépolluant remarquable puisque le taux de captation des ions
m étalliques est supérieur à 80 %.
T
-Sur 45 antibiotiques testés, la souche 1Y B- R 12T a montré une résistance totale pour
l’imipénè me, la cefuroxime, la tétracycline, l’acide nalidixique, l’acide pipé midique, la
fosfo mycine, les furanes et les nitrofurantoines et une résistance intermédiaire pour la
céfalotine, la dibékacine et l’acide fusidique.
T
-Le transfert génétique réalisé par conjugaison entre la souche 1Y B- R 12T et la souche
receptrice d’E coli B M 21, montre que le caractère de résistance à l’imipénè me, la céfalotine
et la tétracycline n’a pas été transféré, ce qui indique que le support génétique n’est pas
d’origine extra chro mosomique (plasmides). Le profil plasmidique obtenu après extraction de
l’A D N plas midique et co mparaison avec un témoin confirme l’absence des élé ments
T
génétiques autres que le chro moso me. Donc, la souche 1Y B- R12 T est naturellement
résistante aux différents agents antimicrobiens.

M ots clés :
Résistance, métaux lourds, antibiotiques, Flavobacteriaceae
Dédicaces

- Je dédie ce modeste travail:

- A la mémoire de mon chèr papa que DIEU lui accorde sa

Miséricorde

- A ma mère que je lui souhaite une longue et heureuse vie

- A mes frères et sœurs avec ma tendre affection

- A toute ma famille

- A la mémoire de toutes les personnes de la science et du

savoir
Remerciements

- Le présent travail a été réalisé dans le laboratoire de

microbiologie de la Faculté des Sciences Biologiques
(FSB/USTHB) sous la direction du défunt le Professeur Ali
CHIKHI à qui je suis très reconnaissante aujourd’hui que DIEU
lui accorde sa miséricorde.

- Tout d’abord je remercie DIEU le tout puissant de m’avoir

guidé dans le bon chemin et de m’avoir aidé à finir ce travail.

- Je tiens à exprimer ma gratitude au Professeur Hacene HOCINE,

responsable du laboratoire de microbiologie de la FSB/USTHB
qui a accepté d’être notre directeur de thèse et pour ces
motivations qui m’ont aidé à terminer ce travail.

- Madame Fatima LARABA, Professeur en Biochimie, Responsable

du laboratoire de Biochimie et Doyenne de la FSB/USTHB, je
vous remercie pour l’honneur que vous me faites en
acceptant de présider ce jury et aussi pour votre soutien
moral et votre témoignage que je n’oublierais jamais.

- Madame Chafia TOUIL BOUKOFFA, Professeur en Immunologie,

Responsable de l’équipe de recherche sur les cytokines et
Directrice du grand laboratoire de la Biologie Cellulaire et
Moléculaire de la FSB/USTHB, je vous remercie beaucoup pour
votre gentillesse et surtout pour votre soutien moral. Votre
présence dans ce jury est un honneur pour moi.

- Je tiens à remercier également Monsieur Rabah BAKOUR,

Professeur en génétique, Responsable du laboratoire de
génétique de la FSB/USTHB et Directeur de l’ISMAL d’Alger
d’avoir accepter de faire partie de ce jury et examiner
ce travail malgré vos nombreuses tâches.

- Je remercie Monsieur Ahmed BENSOLTANE, Professeur en

Microbiologie, Responsable du laboratoire de microbiologie
de l’Université d’ORAN qui nous a honoré par sa présence en
acceptant de faire partie de ce jury et d’examiner ce
modeste travail.

- Je remercie tout les chercheurs du laboratoire de

microbiologie de l’IRD de l’Université de la MEDITERANNEE
en France en particulier le Docteur Marie Laure FARDEAU
pour sa gentillesse et son aide, sans qui je n’aurais jamais
pu terminer ce travail.
Remerciements

- Je tiens aussi à remercier les membres du laboratoire

d’écologie microbienne de la rhizosphère et des
environnements extrêmes CNRS- CEA Cadarache de l’Université
de la MEDITERANNEE/France surtout Wafa ACHOUAK grâce à elle
j’ai pu faire un grand pas dans ma recherche scientifique.

- Je remercie également les membres du laboratoire de

génétique de la FSB/USTHB pour leur aide et leur collaboration
en particulier Mlle Yamina MESSAI. Merci beaucoup Yamina.

- Je voudrais aussi remercier Mlle Djouher AIT- IDIR

d’avoir accepté de nous recevoir dans le laboratoire de
la biologie moléculaire de l’Université de BOUMERDES
pendant les grandes vacances.

- Je remercie aussi le Professeur AMIROUCHE de la

FSB/USTHB qui nous a autorisé à prendre des photos dans son
laboratoire.

- Mes remerciements s’adressent aussi aux membres du

laboratoire de la police scientifique d’Alger et également
ceux du laboratoire de chimie de l’ORGM de BOUMERDES.

- Mes remerciements les plus sincères s’adressent à mon

amie Amel BOUANANE, qui a toujours été présente à mes côtés
dans les moments les plus difficiles.

- Je tiens aussi à remercier vivement :

- tous les membres du laboratoire de Microbiologie de la
FSB/USTHB.
- tous mes collègues de la FSB/USTHB.
 Table des matières

Table des matières

A bréviations

Introduction … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...1

II- Etude bibliographique … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . ...3

1- Les métaux lourds … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .........................3

1.1- Définition … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3
1.2- Source d’é mission des métaux lourds … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..5
1.2.1- Source naturelle … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..........................6
1.2.2- Source anthropogénique … … … … … … … … … … … … … … … … … ....................6

1.3- Propriétés et caractéristiques de quelques m étaux lourds et leurs effets sur la

santé … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .6
1.3.1- Le cad miu m … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .....................6
1.3.2- Le plo m b … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..6
1.3.3- Le zinc … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...8

1.4- La résistance bactérienne aux métaux lourds … … … … … … … … … … … … … … … .....8

1.4.1- Séquestration, bio sorption, im m obilisation et bio minéralisation … … … … … 1 0
1.4.2- Réduction enzy matique … … … … … … … … … … … … … … … … … … .................11
1.4.2.1- La résistance au mercure … … … … … … … … … … … … … … … … … … ......11
1.4.2.1.1- La résistance à spectre étroit… … … … … … … … … … ...........................11
1.4.2.1.2- La résistance à spectre large… … … … … … … … … … ............................11
1.4.3- Les transporteurs me m branaires … … … … … … … … … … … … … … .................12
1.4.3.1- Les protéines de transport R N D … … … … … … … … … … … … … … … … ...12
1.4.3.1.1- Définition et mode d’action … … … … … … … … … … … ..........................12
1.4.3.1.2- Distribution des protéines RN D chez les procaryotes … … … … … .......14
1.4.3.1.3- Structure des co m posantes de la po m pe efflux Czc CB A … … … … … .17
1.4.3.2- Les protéines de transport C D F … … … … … … … … … … … … … … … … ...17
1.4.3.2.1- Définition et mode d’action … … … … … … … … … … … … … … … … … ..17
1.4.3.2.2- Répartition et classification des protéines C D F … … … … … … … … … 1 9
1.4.3.2.3- Description de quelques protéines C D F … … … … … … … … … … … … .19
1.4.3.3- Les protéines de transport P-type A T Pases … … … … … … … … … … … … 2 1
1.4.3.3.1- Définition et mode d’action … … … … … … … … … … … … … … … … … .21
1.4.3.3.2- Classification des protéines P-type A T Pases … … … … … … … … … … ..23

2- Les antibiotiques … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .25

2.1- Définition … … … … … … … . … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 5
2.2- Mode d’action … … … … … … … . … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .....25
2.2.1- Les antibiotiques inhibiteurs de la biosynthèse du peptidoglycane ….. … …...25
2.2.1.1- Les •-Lacta mines … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 7
2.2.1.2- La fosfom ycine. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...........27
 Table des matières

2.2.1.3- La cyclosérine … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..27

2.2.1.4- Les glycopeptides.. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..29
2.2.1.5- La bacitracine … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..29

2.2.2- Les antibiotiques agissant sur les mem branes … … … … … … … … … … … … … .29

2.2.2.1- Les polym yxines … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...29

2.2.3- Les antibiotiques actifs sur l’A D N … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 9

2.2.3.1- Inhibition de la réplication … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..29
2.2.3.1.1- Les quinolones … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .29
2.2.3.1.2- Les nitrofuranes.. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 1
2.2.3.1.3- La novobiocine … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 1
2.2.3.1.4- Les antibiotiques imidazolés … … … … … … … … … … … … … … … … … ..31
2.2.3.2- Inhibition de la transcription … … … … … … … … … … … … … … … … … ......31
2.2.3.2.1- Les Rifa m picines … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .31

2.2.4- Les antibiotiques inhibiteurs de la synthèse des protéines … … … … … … … … .31

2.2.4.1- Les a minosides.. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 2
2.2.4.2- Les tétracyclines … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ....34
2.2.4.3-Les macrolides et apparentés … … … … … … … … … … … … … … … … … … ....34
2.2.4.4- Les antibiotiques phénicolés … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 4
2.2.4.5- L’acide fusidique … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...34

2.2.5- Les antibiotiques agissant par co m pétition … … … … … … … … … … … … … … ..34

2.2.5.1- Les sulfa m ides … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .......34
2.2.5.2- La triméthopri me … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..35
2.2.5.3- L’acide para a mino salicylique (PA S) … … … … … … … … … … … … … … … .35

2.3- Origine de la résistance bactérienne … … … … … … … … … … … … … … … … … … .....35

2.3.1- La résistance naturelle … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 5
2.3.2- La résistance extra chro moso mique … … … … … … … … … … … … … … … … … ...35
2.3.2.1- Les plas mides … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 5
2.3.2.2- Les transposons … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .....36
2.3.2.3- Les intégrons … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .....36

2.4- Les mécanis mes biochi miques de la résistance … … … … … … … … … … … … … … … 37

2.4.1- I mper méabilité me m branaire … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .37
2.4.2.1- Di minution de la per méabilité de la me m brane externe … … … … … … … … 37
2.4.2.2- Systè mes efflux actifs … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .37

2.4.2- Modification de la cible des antibiotiques … … … … … … … … … … … … … … … .37

2.4.3- Synthèse d’enzy me inactivant les antibiotiques … … … … … … … … … … … … … 3 8

3- Le transfert génétique … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ....38

3.1- La conjugaison … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 8
3.2- La transduction … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...38
 Table des matières

3.3- La transfor mation.. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 9

4- Les Flavobacteriaceae … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .....40

4.1- Historique et position taxono mique... … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..40

4.2- Caractères bactériologiques.. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...40
4.3- Habitat et pouvoir pathogène … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...41

II- Etude expéri mentale… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .44

1- Isole ment et identification des souches … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..44

1.1- Matériel et méthodes. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ........44

1.1.1- Matériel d’étude et prélève ments des échantillons … … … … … … … … … … … ..44
1.1.2- Méthodes d’étude … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 4 4
1.1.2.1- Préparation des échantillons et ense m ence ment. … … … … … … … … … … … .44
1.1.2.2- Isole ment, purification et sélection des souches … … … … … … … … … ...........44
1.1.2.3- Caractérisation biochi mique des souches … … … … … … … … … … … … … … .46
1.1.2.4- Opti misation des para mètres physicochi miques de la souche 1 Y B- R12 T....46
1.1.2.4.1- La te m pérature de croissance … … … … … … … … … … … … … … … … … ...46
1.1.2.4.2- Le p H de croissance … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...48
1.1.2.4.3- La tolérance au chlorure de sodium … … … … … … … … … … … … … … ....48

1.1.2.5- Recherche de pig ments spécifiques à la souche 1Y B- R12 T....… … … … … … .48

1.1.2.6- Etude de la sensibilité de la souche 1Y B- R12 T au lysozy me..… … … … … … .48
1.1.2.7- Identification m oléculaire de la souche 1Y B- R12 T . … … … … … … … … … ....48
1.1.2.7.1- A m plification du gène codant pour l’A R Nr-16S et séquençage … … …...49
1.1.2.7.2- Déter mination du contenu de l’AD N en (G+ C) moles %.............................50
1.1.2.7.3- La chi mio taxono mie … … … … … … … … … … … … … … … … ......................51

2- Etude de la résistance aux agents antimicrobiens … … … … … … … … … … … … … … ..51

2.1- Etude de la résistance aux métaux lourds… … … … … … … … … … … … … … … … ....51

2.2.1- Préparation des solutions métalliques… … … … … … … … … … … … … … … … … 5 1
2.2.2- Déter mination de la concentration seuil pour chaque métal … … … … … … … … 5 1
2.1.3- Evaluation du taux d’accu m ulation des ions métalliques … … … … … … … .........52
2.2- Etude de la résistance aux antibiotiques … … … … … … … … … … … … … … … … … ...53

3- Transfert génétique et déter mination du support génétique … … … … … … … … … … .54

3.1- Transfert génétique par conjugaison … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...54

3.2- Déter mination du support génétique … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...55

III- Résultats et discussion … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .57

1- Isole ment et identification … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .57

 Table des matières

1.1- Caractérisation des souches isolées … … … … … … … … … … … … … … … … … … .......57

1.2- Caractérisation m orphologique et biochimique de la souche 1Y B -R12T … … … … .57
1.3- Identification moléculaire de la souche 1YB- R12 T … … … … … … … … … … … … … .63

2- Etude de la résistance aux agents antimicrobiens … … … … … … … … … … … … … … ..71

2.1- Les métaux lourds … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .71

2.2- Etude de la résistance aux antibiotiques… … … … … … … … … … … … … … … … … .80

3- Transfert génétique et déter mination du support génétique de la résistance … … … ..84

IV- Conclusion … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .86

Références bibliographiques … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..89

A n nexes
 Les abréviations

Les abréviations

A B C - Transporteur: transporteurs liant l’A T P

A D N: acide désoxy-ribonucléique
A L A: acide a mino levulinique
A L A D: a mino levulinique déshydratase
A R N: acide ribonucléique
A T B: antibiotique
B L A S T: basic local align ment search tool
C C U G: culture collection, University of G Ô T E B O R G
C D F: cation diffusion facilitator
C H R: chro mate transporteur
cnr: gène de résistance au cobalt et au nickel
czc: déter minant génétique de la résistance aux cobalt, zinc et cad mium
D O: densité optique
D S M Z: Deutsh Sa mlung Von Mikro organis men und Zelkulturen
H A E - R N D: hydrophobic and a m phiphilic com p ounds export resistance – nodulation –
cellular – division
H M E – R N D: heavy m etal efflux resistance – nodulation – cellular – division
H T M: hélice trans me m branaire
M F P: me m brane fusion protein
O M P: outer me m brane factors
N A C – G : N-acetyl glucosa mine
N A C – M U R : N-acetyl m ura mique
Pb : paire de bases
P C R : poly merase chain reaction
P L P : protein liant la pénicilline
P M F : proteine force m otivation
U D P – N A M P : uridine di phosphate-N –acetyl mura myl pentapeptide
 Liste des tableaux

Tableau I : Les principales fa milles des protéines de transport des métaux lourds … …..9

Tableau II : Répartition et classification des protéines R N D transporteurs des ions

m étalliques … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...16

Tableau III : Les différents groupes des protéines C D F chez les micro-organis mes …...20

Tableau IV : La nature, le lieu et la date des prélève ments … … … … … … … … … … … … 4 5

Tableau V : Les différents tests biochi miques effectués … … … … … … … … … … … … … ..47

Tableau VI : Différentes étapes du progra m m e … … … … … … … … … … … … … … … … ...50

Tableau VII : Les différentes concentrations des ions métalliques testés en ug/ ml … …..52

Tableau VIII : La liste des différents antibiotiques testés avec leurs charges … … … … ..56

T
Tableau IX : Caractères différentiels entre la souche 1Y B- R12 T et les autres espèces
proches … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .....64

T
Tableau X : Profil des acides gras cellulaires (% ) de la souche 1Y B- R 12T et les autres
espèces proches du genre Chryseobacterium … … … … … … … … … … … … … … … … … … 6 7

Tableau XI : Profil des acides gras cellulaires (% ) majoritaires chez les espèces du genre
Chryseobacterium et la souche 1Y B- R12 TT ........................................................................70
 Liste des figures

Figure 1 : Co m porte ment du polluant dans l’environne ment … … … … … … … … … … … ..4

Figure 2 : Ga m m e de concentration en métaux lourds et réponses biologiques associées

… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .5

Figure 3 : Les deux models de résistance au mercure … … … … … … … … … … … … … … .11

Figure 4 : Modèle montrant la topologie et le mode de fonction du systèm e Czc C B A chez

les bactéries à Gra m négatif … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..13

Figure 5 : Mode d’action du déter minant czc de la résistance aux ions m étalliques …...15

Figure 6 : Représentation sché matique du plasmide p M O L 30 qui code pour la résistance

aux cobalt, zinc et cadmiu m chez Alcaligenes eutrophus … … … … … … … … … … … … … 1 5

Figure 7 : Organisation génétique du systè me efflux czc C B A des espèces d’Helicobacter

pylori et de Ralstonia metallidurans……………………………………………………….. 18

Figure 8 : Représentation sché matique du plasmide pI O 258 qui code pour la résistance
aux ions métalliques du cad miu m et du zinc chez Staphylococcus aureus … … … … … … 2 2

Figure 9 : Structure sché matique des protéines A T Pases P1 avec 8 hélices

trans me m branaires … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2 4

Figure 10 : Représentation sché matique des sites d’action des antibiotiques … … … … ..26

Figure 11 : Représentation sché matique des sites d’action de certains antibiotiques sur
la biosynthèse du peptido glycane … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..28

Figure 12 : Représentation sché matique de la paroi des bactéries à Gra m négatif (a) et à
G ra m positif (b) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...30

Figure 13 : Représentation sché matique des sites d’action des antibiotiques actifs sur la
synthèse des protéines… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .33

Figure 14 : Sché ma représentant l’organisation générale de l’Opéron riboso m al des

procaryotes … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..49

Figure 15 : Photos représentant l’aspect des colonies de la souche 1Y B- R12 T âgée de

plus de 7 jours sur un milieu ordinaire (a) et un autre riche (b) … … … … … … … … … … 5 8

T
Figure 16 : Position phylogénétique de la souche 1Y B- R12 T à l’intérieur du genre
Chryseobacterium sur la base de la séquence du gène A R Nr-16S … … … … … … … … … ...66

Figure 17 : Evaluation du taux de la résistance aux trois sels métalliques chez la souche
T
1 Y B- R12 T … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .72
 Liste des figures

T
Figure 18 : Courbes de croissance de la souche 1Y B- R12 T en absence et en présence
des ions métalliques en fonction du p H … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .77

Figure 19 : Histogra m m e représentant les concentrations résiduelles m étalliques dosées

dans le milieu de culture en fonction du p H … … … … … … … … … … … … … … … … … .79

Figure 20 : Profils plasmidiques obtenus après extraction de l’A D N plas midique par la
m éthode de Kado et Liu et éléctrophorèse sur gel d’agarose 0.7 %................................85
 Liste des courbes

C ourbe 1 : Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de la

te mpérature … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .61

C ourbe 2 : Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de te mps …..61

C ourbe 3 : Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de p H … …...62

C ourbe 4 : : Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de la

concentration de Na Cl… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...62
INTRODUCTION
 INTRODUCTION

INTRODUCTION
Le développe ment accru de la technologie ces deux derniers siècles, s’est acco mpagné par un
développe ment de l’urbanisation, la concentration et la diversification des activités
industrielles et agricoles de l’ho m me, ce qui a conduit à un accroissem ent général de la
pollution de l’environnem ent.

Les hydrocarbures et les métaux lourds sont considérés co m me étant les polluants les plus
prépondérants. Le pre mier type d’effluent résulte de l’exploitation hu maine des gise ments de
pétrole, l’extraction, le transport et l’utilisation de cette source d’énergie en entraînant des
risques de pollution (accidentelle et chronique) pour l’environne ment pouvant influencer sur
l’équilibre écologique et conduire à la destruction totale des différents écosystè mes.

Les métaux lourds, et plus particulière ment le zinc, le cad miu m et le plo mb ont fait leur
apparition ces dernières années à des concentrations anor malem ent élevées dans
l’environne ment, ce qui pose un vrai problè me et un grand risque sanitaire pour l’ho m me. Le
cad miu m et le plo mb sont en effet des co mposés chimiques haute ment toxiques, possédant la
capacité de se concentrer le long de la chaîne alimentaire et de s’accum uler dans certains
organes du corps hu main. En revanche, le zinc est considéré co m me un élém ent essentiel à la
vie biologique, mais au-delà d’une certaine concentration peut devenir toxique.

Les activités responsables de l’émission de ces métaux dangereux dans l’environne ment sont
no mbreux, nous évoquons ceux qui sont liées surtout à l’utilisation abusive de substances non
exe mptes de ces co mposés chimiques en agriculture, aux activités industrielles et nucléaires
qui engendrent une pollution à la fois directe (rejet de déchets ou d’effluents polluants) ou
indirecte (transport de substances polluantes par voie aérienne, marine et terrestre). Il faut
aussi citer les industries métallurgiques, les exploitations et les extractions minières sans
oublier les activités urbaines liées au développem ent des villes et des réseaux routiers. Le
trafic routier constitue en effet une source principale de pollution par le plo mb (présent dans
l’essence et les batteries), le cad miu m et le zinc (présents dans les huiles, les pneu matiques et
les freins). La pollution ainsi générée se retrouve dans les eaux de ruisselle ment de chaussées
routières et dans l’atmosphère (poussières). Dans les deux cas, les polluants minéraux posent
des risques de dégradation de la qualité des sols et aussi pour la ressource en eau superficielle
et souterraine.

Face à cette situation alarmante à l’échelle mondiale, plusieurs travaux de recherche se font
dans les différents laboratoires dans le but de développer des méthodes et des techniques de
dépollution efficaces et m oins coûteuses.

Certains micro-organismes sont capables de résister à ces agents antimicrobiens très toxiques
et peuvent être utilisés dans le processus de bio- remédiation de l’environne ment. Ils sont
distingués surtout par leurs co mplexes enzy matiques particuliers ce qui leur confèrent la
caractéristique de bio dégrader les polluants de nature organique toxique en d’autres produits
m oins dangereux, ainsi que les systèmes de résistance qui leur permet de supporter les
conditions hostiles de l’environne ment.

1
 Introduction

A u cours de la réalisation de ce modeste travail, notre pre mier but était d’isoler et d’identifier
des bactéries à Gra m positif, aérobies strictes, imm obiles, non sporulées, supposées appartenir
aux genres Rhodococcus et Micrococcus connus par leur haute capacité de dégrader les
hydrocarbures ainsi que leur forte résistance aux agents antimicrobiens. Cependant, la
caractérisation d’une nouvelle espèce nous a obligé de réorienter notre travail de recherche et
de concentrer notre étude à cette dernière.

Ainsi, nous avons isolé des bactéries à partir de différentes niches écologiques extrê me ment
polluées par les hydrocarbures et autres types de rejets. Après purification, nous avons
procédé à leur caractérisation par l’étude des caractères morphologiques, physiologiques,
physico-chimiques et biochimiques.

Pour la souche qui a fait l’objet principal de notre étude, en pre mier lieu nous avons effectué
son identification par les outils de la biologie moléculaire (le séquençage de l’A R Nr 16S, la
détermination du contenu de son D N A chro mosomique en (G+ C) moles % et la détermination
du profil des acides gras cellulaires). En second, nous avons fait une étude plus accentuée
concernant sa morphologie, sa physiologie et son co mporte ment vis-à-vis certains para mètres
physico-chimiques indispensables pour la croissance tels que le pH, la température, la [Na Cl],
sa résistance au lysozym e et éventuellement la détermination du milieu de culture le plus
adéquat pour son développe ment ainsi que la recherche de pig ments spécifiques.

N ous avons aussi étudié la capacité de ce nouveau taxon de tolérer et de résister à des
concentrations croissantes de trois métaux lourds très toxiques (plo mb, cad miu m, zinc), puis
évalué le taux d’accu mulation de ces co mposés inorganiques par adsorption et/ou absorption
en fonction du pH en milieu liquide stérile par le dosage à l’aide d’un spectrophoto mètre à
flam me et en mê me temps déterminé son taux de dépollution.

L’étude de la résistance vis-à-vis d’un grand no m bre d’antibiotiques a été réalisée, suivie par
des essais de transfert génétique par conjugaison. En vu de déterminer l’origine des supports
génétiques de la résistance chez cette bactérie, nous avons étudié le profil plasmidique par
extraction de l’A D N plasmidique.

2
 ETUDE

BIBLIOGRAPHIQUE
 Etude bibliographique

I/- Etude bibliographique

Chaque année des millions de tonnes de rejets industriels, nucléaires, urbains et hospitaliers
sont déversés dans l’environne ment, ce qui conduit à la libération de quantité considérable de
co mposés organiques et inorganiques de nature chimiques très toxiques. Certains, sont
volatiles (Hydrocarbures aro matiques) et contribuent à la pollution de l’air atmosphérique,
d’autres sont très solubles dans l’eau et indestructibles tels que les métaux lourds.

Ces derniers, peuvent conta miner le sol et les eaux superficielles (mer, rivières, oueds, lacs …),
co m me ils peuvent s’infiltrer dans le sol et conta m iner les nappes phréatiques, ce qui pose un
véritable problè me pour la santé publique.

Les micro-organismes om niprésents dans les environne ments extrême ment pollués peuvent
jouer un rôle prépondérant dans la dégradation du pre mier type de polluants (Co mposés
organiques toxiques) et la fixation et l’im mobilisation des ions métalliques, et ainsi servir de
barrière au passage de ces éléments aux êtres vivants. Ceci, peut être effectuer par des
réactions d’oxydo - réduction permettant de passer le polluant d’un état soluble, donc mobile
et bio - disponible à un état solide moins ou non toxique.

Dans certains cas, la biom asse bactérienne à la capacité à la fois de catalyser les réactions
d’oxydo – réduction et d’im mobiliser le polluant après internalisation ou à sa surface. Ces
phéno mènes peuvent alors être mis à profil pour développer des procédés de bio- remédiation
ou le polluant est concentré par la bio masse (Figure 1).

1/- Les métaux lourds

1.1/- Définition

Les métaux lourds sont définis co m me étant des éléments métalliques ayant une masse
3
volu mique supérieure à 5g /cm (Nies, 1992). Parmi les 53 métaux concernés par cette
définition, certains ne sont pas disponibles dans les écosystèmes habituels. Cette
biodisponibilité dépend de la concentration du métal et de sa solubilité dans ces milieux. Pour
pouvoir interagir avec les cellules vivantes, le métal doit donc être sous une forme soluble et
présent à une concentration de l’ordre de nano molaire ou moins.

L’interaction des bactéries avec les métaux lourds se produit sur une ga m me de
concentrations en ions m étalliques allant du nano molaire pour l’hom éostasie ( Métaux
essentiels), au milli molaire pour la résistance (Toxicité pour les micro-organismes) et
jusqu’au molaire pour certains micro-organismes chimio lithotrophes acidophiles ( Monchy,
2007) (Figure 2).

Les métaux lourds sont classés en deux catégories :

La pre mière englobe les m étaux lourds dits de la série noire dont le mercure (Hg), le plo mb
(Pb) et le cad miu m (Cd), caractérisés par leur forte toxicité mê me à très faibles concentrations.

3
 Etude bibliographique

Atmosphère

Volatilisation

Pollution
Volatilisation
Infiltration Volatilisation
Adsorption

Sol Eaux de surface

Infiltration
Volatilisation Adsorption Ecoulement

Aquifère

Figure 1: Comportement du polluant dans l’environnement. (Ballerini et al., 1998).

4
 Etude bibliographique

Cette appellation est due au fait que ces éléments minéraux sont indestructibles, et persistant
dans l’environne ment

Nano Micro Milli Molar

1 10 100 1 10 100 1 10 100 1 10
* * * * * * * * * * *

Homéostasie……. Complexation, Efflux

Metallothionins Réduction

Plasmides
Eucaryotes, Gram + Acidophilic obligate
Cyanobactéries Chemolithotrophs
(Archaea,Th. Ferrooxydans)

Low GC High GC
Proteobacteria

γ α β

Figure 2: Ga m me de concentration en métaux lourds et réponses biologiques

Associées ( Monchy, 2007).

La seconde, co mprend les métaux lourds nécessaires pour le bon fonctionne ment des
différentes activités vitales pour la cellule, mais avec des doses bien déterminées. Ils sont
appelés aussi des ions métalliques physiologiques, tels que le zinc (Zn), le cuivre (Cu), le fer
(Fe), le cobalt (Co), le nickel (Ni) et autres (Levesque et al., 1993).

Ce sont des cofacteurs indispensables pour la stabilisation et la conform ation de certaines

protéines. Nous citons co m me exe mple le nickel qui est un cofacteur de l’uréase et des
hydrogénases (Higuchi et al., 1997) et le cobalt qui est un cofacteur de certaines enzy mes du
m étabolisme de la méthionine ou de la vitamine B12 ( Wang et al., 2003).

La grande variété de métaux lourds et de leurs effets biologiques nécessite chez les bactéries
une régulation pour le maintien (Ho méostasie) et le contrôle de leur concentration
intracellulaire (Nies, 1999). Cette régulation évite l’expulsion des métaux essentiels présents
aux concentrations ho m éostasiques (en nano molaire), ou l’entrée de métaux en quantité
toxique (en micro molaire).

1.2/- Sources d’é mission des métaux lourds

5
 Etude bibliographique

Il existe deux principales sources d’é mission des métaux. L’une est naturelle, l’autre
anthropogénique (Levesque et al., 1993).

1.2.1 /- Source naturelle

En général, ils sont présents dans les roches en proportions variables (minerais) et les
éruptions volcaniques. Il est a noté que la plupart sont hydrosolubles et peuvent diffuser dans
le sol et conta miner les nappes phréatiques les plus profondes.

1.2.2 /- Source anthropogénique

On entend par ce terme les émissions dues aux activités hu maines (activités industrielles,
nucléaires, agricoles et autres).

1.3/- Propriétés et caractéristiques de quelques m étaux lourds et leurs effets sur la santé

1.3.1/- Le cad miu m :

C’est un métal blanc, mou et malléable. Il ternit au contact de l’air et résiste à la corrosion.
Les propriétés physico-chimiques de ce métal sont très proches de celles du zinc. Il n’existe
pas à l’état natif. Son minerai la green - Ochite (Cds) est très rare et inexploitée. Il est présent
dans presque toutes les minerais de zinc avec un taux de 0.01 % à 0.05 % et aussi les minerais
de plo mb, de cuivre et de phosphate (Chiffoleau, 2001).

Il est très toxique sous toutes ses formes (métal, vapeur, sels, co mposés organiques), et il est
absorbé d’abord par inhalation et moins par absorption gastro-intestinale. Il n’est pas absorbé
par la peau.

L’ho m me est exposé aux risques de ce métal via la fu mée et les poussières perdues de
certaines industries co m m e la métallurgie, le recyclage des batteries, les activités nucléaires,
les engrais phosphorés, les effluents et les boues d’épuration urbaines et/ou industrielles
épandues sur les cha mps. Certains aliments peuvent aussi être considérés co m me source de
conta mination de l’être hu main tel que le foie, les reins, les cha mpignons, le blé et des
végétaux co m me les épinards et autres.

Le cad miu m est cancérigène, et affecte le systèm e im m unitaire, les poum ons et l’appareil
respiratoire en général (Elson & Haas, 1984).

1.3.2/- Le plo m b

Il est très malléable et résiste à la corrosion. Ceci, est due au fait qu’il se recouvre très
rapide ment sous l’attaque des agents d’un film protecteur, continu et insoluble formé d’un
m élange de sulfures, sulfates, oxydes et carbonates de plo mb, qui lui confère une teinte gris -
bleuté caractéristique.

6
 Etude bibliographique

Il est très utilisé dans l’industrie, ce qui rend la possibilité de la pollution de l’environne ment
par le plo mb extrêmem ent importante. Il est employé dans les carburants auto mobiles
(Essence) co m me antidétonant, en imprimerie et surtout en métallurgie. Il n’a aucun rôle
physiologique connu chez l’ho m me, sa présence dans l’organisme témoigne donc toujours
d’une conta mination. Le Plo mb pénètre dans l’organisme par voies cutanée, digestive et
aérienne (inhalation des poussières atmosphériques conta minées). Cette dernière est la plus
dangereuse car il atteint directement la circulation sanguine. La toxicité du Plo mb dans
l’organisme ne se manifeste qu’au-delà d’un certain seuil. Les cibles essentielles sont :

-Les enzy mes : Le Plom b modifie les propriétés de no mbreuses protéines cytosoliques et
m e m branaires en se liant de façon réversible avec les groupe ments thiol. Il inhibe ainsi des
enzy mes et particulière m ent celles de la voie de biosynthèse de l’hè me co m m e l’acide amino-
lévulinique déshydratase (AL A D) et la ferrochélatase. L’inhibition de l’A L A D entraîne une
aug mentation de l’excrétion urinaire d’acide aminolévulinique (AL A), par contre celle de la
ferrochélatase entraine l’accu mulation de protoporphyrine érythrocytaire libre. Il en résulte
une carence en hè me, carence qui affecte la synthèse de l’hé moglobine et aussi celle des
processus cellulaires co m m e l’activité respiratoire mitochondriale ou le métabolisme oxydatif.

-Le calciu m : Le Plo m b libre ionisé perturbe l’ho méostasie calcique. Il interagit avec le
calciu m à différents niveaux cellulaires et inhibe les systèmes de transport me mbranaires
+ +
co m me les po mpes ioniques (ATPase Na / K ) et certains canaux calciques. Il peut donc
indirectement altérer les réactions intracellulaires dépendant des concentrations de calciu m.
Il peut aussi être responsable d’intoxications importantes à long terme.

Le saturnis me est l’une des intoxications aigues ou chroniques, professionnelles ou

do mestiques par le Plom b, ses vapeurs ou ses sels qui pénètrent dans l’organisme par voie
digestive ou respiratoire. La toxicité est essentiellement hé matologique, neurologique et
rénale.

O n distingue le saturnisme aigue qui s’accom pagne de violentes douleurs intestinales

(coliques de Plo mb) avec constipation et des troubles neuropsychiques et le saturnis me
chronique caractérisé par :

-Le liseré saturnin ou liseré de Burton qui est un liseré gingival noirâtre
s’acco mpagnant souvent de plaques pig mentées jugales ou plaques de Gubler qui témoignent
de la formation d’un dépôt de sulfure de Plo mb au contact du S H2.

-Des lésions rétiniennes, des manifestations rénales observées surtout par une diminution
de la filtration glo mérulaire, goutte saturnine, néphropathies tubulo - interstitielles.

-Le syndro me urinaire co mprend une protéinurie discrète, une hé maturie et une leucocyturie
microscopique, un abaisse ment des clairances de l’urée et de la créatinine.

7
 Etude bibliographique

En plus des sy mptô mes précités, s’y ajoute des troubles de co mporte m ent, des pertes de
m é m oires, des encéphalopathies saturnines marquées par une a maurose, une surdité ou une
aphasie de quelques jours et une hypertension artérielle . ( Miquel, 2001).

1.3.3/- Le zinc

Il est présent de façon naturelle dans l’air, l’eau et le sol. Suite au processus d’érosion
naturelle, le zinc est consta m ment en mouve ment et transporté dans l’environne ment. En
raison de sa disponibilité pour les organismes vivants et de ses Caractéristiques, le zinc est
utilisé par la cellule pour jouer un rôle spécifique dans diverses réactions biologiques. Il est
par conséquent un élément essentiel pour toute form e de vie.

Chaque organisme vivant, possède une ga m m e de concentration (dans le do maine

nano molaire) relative à chacun des éléments essentiels et à l’intérieur de laquelle des
exigences sont satisfaites. Il est utilisé pour le bon fonctionne ment des enzy mes, la stabilité de
l’A D N et l’expression des gènes, ainsi que la transmission des signaux du système nerveux.
Il intervient aussi dans le processus im munologique ( Hantke, 2005 ; Lazzerini, 2007).

1.4/- La résistance bactérienne aux métaux lourds

Les ions métalliques entrent dans la cellule selon deux voies principales:

La pre mière, est empruntée par une large ga m m e de substrats. Elle est rapide, indépendante
du métal, fait intervenir des protéines de type porines exprimées de manière constitutive et
dépend unique ment d’un gradient chimio os motique au travers de la mem brane bactérienne.
La seconde, de mande une conso m mation d’énergie souvent sous la form e d’hydrolyse de
l’ATP tel que le cas des transporteurs A B C, les protéines C D F (Cation diffusion facilitators)
et les protéines chro mates, les A T Pases de type P et les facteurs de résistance – NreB et
C nr T - like. Ces systèm es sont inductibles, synthétisés et mis en fonction en réponse à des
besoins particuliers (Nies & Silver, 1995). Ils sont large ment distribués chez les procaryotes
et servent co m me un moyen de défense vis-à-vis les ions métalliques. D’autres, sont plus
spécialisés et présents unique ment chez quelques bactéries, ce qui leur confèrent une forte
résistance aux métaux lourds (Nies, 2003) (Tableau I).

U ne fois dans le cytoplasm e, la toxicité des métaux lourds se manifeste com m e suit :

- Inhibition des activités enzy matiques : les ions métalliques se fixent sur des résidus
cystéine, acide glutamique ou acide aspartique qui font partie du site actif de plusieurs
enzy mes. Un grand excès d’ions métalliques peut aussi entrer en co mpétition avec un
autre ion nécessaire à l’activité d’une enzy me et localisé dans son site actif. Quelques ions
m étalliques ont une structure proche du phosphate ou de l’A D P / ATP et dès lors peuvent
inhiber des ATPases tel que le cas du vanadate (Nies, 1999). D’autres ions métalliques

8
 Etude bibliographique

Tableau I : Les principales familles de protéines de transport des métaux lourds (Nies, 2003).

Fa mille Type de Source d’énergie Ions métalliques

transport

2+ 2+ 2+ 2+
AB C Captage (uptake) ATP M n , Zn , Fe , Ni .

Efflux ATP // // // //

2+ 2+ 2+ +
P-type Les deux ATP M g , Mn , Ca , K ,
2+ 2+ 2+
Cu , Zn , Cd ,
2+ +
Pb ,Ag .

A-type Efflux ATP Arsenite

2+ 2+ 2+ 2+
RN D efflux Gradient Co , Zn , Cd , Ni ,
2+ +
protonique Cu , Ag .

2+ 2+
Hox N Captage (uptake) Che mi-os motique Co , Ni .

CHR antiport // // Chro mate

MIT Captage (uptake) // // La plupart des ions

2+ 2+ 2+ 2+
C DF efflux // // Zn , Cd , Co , Fe .

9
 Etude bibliographique

- peuvent occuper les sites de groupe ments phosphates et nitrates essentiels tels que le cas
des oxy anions co m me l’arsenate, le fluorate, le borate, le bro mate, le sélénate, le tellurate
et le tungstate (Pendias & Pendias, 1992).

- Altération de la structure des acides nucléiques: la fixation des ions m étalliques sur les
groupe ments phosphates des acides nucléiques peut entraîner des modifications de
structure, empêchant ainsi la transcription ou la traduction des gènes (Hengstler et al.
2003).

- Interaction des ions métalliques avec des com posés oxygénés issus des processus
cellulaires respiratoires, ce qui entraîne la formation de radicaux libres, lesquels peuvent
endo m mager l’A D N (création de mutations), les protéines (en créant des pontages entre
m olécules ou en leur sein), ou encore les acides gras insaturés de la me mbrane cellulaire.

Il est à préciser que la résistance aux métaux lourds dans des do maines de concentrations
situés juste au dessus de la C MI est différente d’une résistance conduisant à l’adaptation à des
milieux extrêmes. Cependant, les mécanismes de résistance aux ions métalliques co m me la
séquestration, la bio minéralisation, ou la conversion enzy matique différent des véritables
résistances liées à la présence de gènes portés par des éléments génétiques m obiles tels que les
plas mides ou les transposons. Ces derniers portent des déterminants de résistance qui assurent
l’extrusion des métaux lourds (C DF, R N D, ATPases de type P).

1.4.1/- Séquestration, bio sorption, im m obilisation et bio minéralisation

La séquestration du métal dans un co mpartiment de la cellule ou sur la face externe de la

m e m brane cellulaire est un mécanisme efficace mis en place par les bactéries pour résister et
échapper à l’effet toxique des ions métalliques. Elle permet l’im mobilisation rapide des
m étaux lourds et par conséquent la survie de la bactérie. Elle peut agir en co mplé ment
d’autres mécanismes de résistance (mécanismes d’efflux), empêchant ainsi la réentrée du
m étal expulsé, surtout dans les conditions extrêm es. Dans certains cas, les mécanis mes de
séquestration pourraient s’enclencher en présence de stimuli - toxiques et assurer seuls
la résistance aux métaux lourds.

Chez les bactéries à Gram négatif, la séquestration dans un co mpartiment de la cellule ou la

bio sorption à la surface de la me mbrane externe s’effectue souvent en co mbinaison avec
d’autres systèmes et nécessite parfois des protéines à hautes affinités pour les ions métalliques
co m me la métallo- thionine S mt (Blindauer et al., 2002), les sidérophores dont certains ont
une forte affinité vis-à-vis les métaux lourds, les agents co mpléxants tels que les acides
organiques ou encore les poly phosphates.

La séquestration peut aussi se faire sous forme de cristaux (bio minéralisation) lié à une

10
 Etude bibliographique

alcalinisation du milieu résultant de l’activité cellulaire, et à la formation de carbonates à la

surface cellulaire qui, lorsqu’il y a sursaturation, cristallisation avec les ions métalliques
présents. Les cristaux for més peuvent s’adsorber de façon non spécifique sur la paroi
extracellulaire (Diels et al., 1995 a ; Podda et al.,2000).

1.4.2/- Réduction enzym atique

La réduction enzy matique consiste à la conversion d’un métal d’une forme toxique en une
autre moins toxique ou une forme qui peut être plus facilement et plus rapide ment évacué de
la cellule. Le mécanisme de la conversion peut être une oxydation ou une réduction tel que le
cas pour le mercure (Silver & Phung, 1996), ou encore après réaction avec un produit du
m étabolisme énergétique de la cellule co m me la réduction du sélénium par les produits
soufrés (thiosulfate ou les sulfites).

1.4.2.1/- La résistance au mercure

Ce mode de résistance est très étudié chez les bactéries à Gra m positif et les bactéries à Gra m
négatif ( Weiss et al., 1978 ; Clark et al., 1977). Les ions mercure sont tout d’abord captés par
la protéine MerP puis transportés à l’intérieur de la cellule par la proteine M erT qui forme un
2+
canal dans la me mbrane interne. Dans le cytoplas me, le mercure (Hg ) très toxique sera
0
réduit en Hg non toxique qui se volatilise hors de la cellule ( Misra, 1992 ; Su m mers et al.,
1995). D’aprés Su m mers (1985), la résistance extra chro moso mique aux com posés mercuriels
se fait selon deux mécanismes : la résistance à spectre étroit, et la résistance à spectre large.

1.4.2.1.1/- La résistance à spectre étroit

2+
Elle concerne le mercure inorganique Hg et quelques organo mercuriels tels que le
m ercurochro me et l’acétate mercurique.

1.4.2.1.2/- La résistance à spectre large

Elle concerne les co mposés précités et d’autres organo mercuriels plus co mplexes tels que
l’éthyle mercure thiosalycylate.

Hg+ Réductase FAD NADPH2, R-SH

Résistance à spectre large Résistance à spectre étroit [ Hg0 volatile

+
R- Hg Organomercuriel lyase R-SH
Hg2+ + R-H

Figure 3 : Les deux models de résistance au mercure (Sum m ers, 1985).

11
 Etude bibliographique

Selon le mê me auteur, le mécanisme à spectre étroit (Hg2+ Hg0) est catalysé par une
enzy me spécifique la m ercure réductase flavoprotéine hydrosoluble intracellulaire, FA D
dépendante active en présence de N A D P H (cofacteur) et de groupe ments thiols. Les
séquences réactionnelles de la résistance à spectre étroit ont été décrites ainsi :

• Réduction du F A D en FA D H 2

N A D P H (H+ ) N A D P+
FA D FA D H 2

* Le F A D H 2 réduit la liaison disulfides entre deux cystéines adjacentes dans le site actif de
l’enzy me.

2+ 2+ 0
* Le Hg est lié au groupe ment SH des deux cystéines et les ions Hg sont réduits en Hg .

2+
Dans le cas de la résistance à spectre large, en plus de la Hg réductase s’ajoute une autre
enzy me inductible l’organo mercuriel b-lyase.

1.4.3/- Les transporteurs me m branaires

Le plus souvent la résistance bactérienne aux ions métalliques fait intervenir un systè me
d’efflux ou d’extrusion. Le transport actif à travers l’enveloppe cellulaire est assuré soit à
l’aide d’un gradient électrochimique (protéines RN D, M FS, C DF), soit par des transporteurs
énergie dépendants (transporteurs A B C, ATPases).

1.4.3.1/- Les protéines de transport R N D ((Resistance-Nodulation-Cell Division)

1.4.3.1.1/- Définition et m o de d’action

Cette superfa mille de protéines est la pre mière être décrite co m me un groupe de protéines
impliquées dans le transport des ions métalliques chez les bactéries (Ralstonia metallidurans ),
la nodulation (Mesorhizobium meliloti) et la division cellulaire (Escherichia coli). (Saier et al.,
1994).

Ces protéines sont très no mbreuses et assurent le transport d’un grand nom bre de co mposés
organiques et inorganiques (Tseng et al., 1999). Elles interagissent dans la plupart des cas
avec les protéines de fusion me mbranaires ( M F P) et les facteurs mem branaires externes
(O M F), pour former des pores et des canaux trans-enveloppe, permettant la sortie d’un flux
du cytoplasme vers le périplasme, la me mbrane externe puis directement vers l’extérieur.
(Paulsen et al., 1997 ; Johnson & Church, 1999) (Figure 4 et 5).

12
 Etude bibliographique

Extérieur 6
Czc C

ME

Czc B
Peptidoglycane 2

5
Périplasme
2

Czc A
MCP
Respiratio n

a 1 b

1 2+
Mg
+
H 3
4

Figure 4 : Modèle montrant la topologie et le mode de fonction du système Czc C B A Chez

les bactéries à Gra m négatif (Nies, 2003).

M C P : Me mbrane Cytoplas misque, M E : me mbrane externe

La protéine Czc A est co mposée de : canal à protons (a), canal à cations (b). Le gradient de
protons entre le cytoplasme et le périplasme est en partie du aux transporteurs de la chaîne
respiratoire (1). L’affinité des protons pour le site (2) situé dans une des boucles de Czc A
induit une translocation des protons dans le cytoplas me créant ainsi un déficit de charge à ce
niveau. (4) Ce déficit de charge crée une attraction électrostatique des cations métalliques qui
peuvent alors diffuser dans Czc C et sortir de la cellule (6). (5). Actuellement on pense que les
cations métalliques situés dans le périplasme peuvent égale ment accéder au site (2).

13
 Etude bibliographique

Le pre mier me mbre identifié des protéines R N D est Czc A, suivi par Cnr A chez
Alcaligenes eutrophus (Saier et al., 1994). La pom pe efflux Czc C B A détoxifie le cobalt, le
zinc et le cad miu m (Rensing et al., 1999). C’est un système inductible, codé par un méga
plas mide, p M O L 30 (Nies, 1992 ; GroBe et al., 1999) (Figure 6).

A u sein des systèmes R N D on trouve les protéines H A E - R N D (Hydrophobic and

A m phiphilic co mpounds Export) et H M E-R N D (Heavy Metal Efflux) (Nies, 2003)
(Tableau II).

Chez Pseudo monas aeruginosa, il éxiste 13 protéines de transport R N D, dont une est
H M E- R N D, qui exportent les métaux lourds (Hassan et al., 1999). Escherichia coli, contient
environ 6 protéines H A E- R N D, dont certaines détoxifient beaucoup de co mposés toxiques
surtout en cas d’une croissance lente (Rand et al.,2002).

Les bactéries à Gra m positif contiennent peu de protéines R N D. Ceci, est en relation avec la
principale fonction de ces dernières, des po mpes efflux trans-enveloppe. Autre ment dit, le
co mplexe efflux C B A ne pourra pas fonctionner au niveau de la paroi des bactéries Gra m +.
Cependant, la protéine CzcA seule intervient dans quelques résistances (Rensing et al., 1997).
Ainsi, chez les bactéries à Gra m positif, les protéines R N D fonctionnent en tant que systè me
efflux avec une seule sous unité.

La plupart des protéines R N D chez les Proteobacteria appartiennent à la famille H A E, et dans

la plupart des cas ces protéines H A E- R N D sont de la grappe H A E1, forte ment liées à Czc A
2+ 2+ 2+
qui confère aux bactéries la résistance aux Zn / Co / Cd (Nies et al., 1989 ; Hassan et al.,
1999).

Toutes les protéines RN D des bactéries à Gra m positif sont regroupées dans la grappe
/
(Cluster) H A E2, identique avec la famille des protéines H A E2 présente chez les bactéries à
Gra m positif et Borrelia burgdorferi. Ceci indique, que le mécanisme d’action des protéines
R N D chez les bactéries à Gra m positif est différent de celui des bactéries à Gra m négatif
(Tseng et al., 1999).

2+
Les bactéries qui possèdent la protéine Cnr liée à la grappe H M E 2 sont résistantes aux Ni /
2+ 2+
Co / Cd (Sch midt & Schlegel, 1994). La grappe H M E 3 contient toutes les protéines non
associées avec H M E 1, H M E 2 ou H M E 4. Le groupe de protéines H M E 3 est divisé en deux
sous groupes : H M E 3 a et H M E 3 b. Le pre mier transporte les ions métalliques divalents et le
deuxiè me les ions métalliques monovalents (Sch m idt & Schlegel, 1994 ; Nies, 2003).

1.4.3.1.2/- Distribution des protéines R N D chez les procaryotes

U ne étude co mparative entre 64 géno mes issus de différentes espèces bactériennes et

d’archaebactéries et celui de la bactérie Ralstonia metallidurans souche C H 34, a aidé les

14
 Etude bibliographique

Figure 5: Mode d’action du déterminant czc de la résistance aux ions métalliques

(Nies, 1992)

Figure 6 : Représentation sché matique du plasm ide p M O L 30 qui code pour la

2+ 2+ 2+
resistance aux Co , Zn et Cd chez Alcaligenes eutrophus (Nies, 1992).

- Le déterminant génétique (czc) est localisé Sur le frag ment Kpnl-Ba m HI de 8.0-kb),
- La protéine Czc D est im pliquée dans la régulation de czc.
K= site KpnI ; H= site Hind III.

15
 Etude bibliographique

Tableau II : Répartition et classification des protéines R N D transporteurs des ions

métalliques (Nies, 2003).

N o m des protéines Séquences protéiniques Substrats exe mples

Protéines H M E :

2+ 2+ 2+
-H M E1- ( M1) D F G- D G A- Ven Zn ,Co , Cd Czc A, CztA, HelA
2+ 2+
-H M E2- ( M2) D F G- D G A- Ven Ni , Co Cnr A, Ncc A
-H M E3a- ( M3a) G F D- D( G,S,A)(S,A)-(V,M ) E N Ions divalents R S A 1040
-H M E3b- ( M3b) (A,g)(I.L)G- D( G- A,s)-VE N Ions monovalents H P O 969
+ +
-H M E4- ( M4) A(I,V)G- D A( A,s)-V,I)(E,d)N Cu , Ag SilA, CusA
2+
-H M E5- ( M5 AI G- D D X-( M, V)E N Ni AII 7631

Protéines H A E:

-H A E1- (A1) X( V,L)G- D( N,G) A- X( D,E) N Inconnu AlrI 1656

-H A E2- (A2) X X G- D( D,X)(S,a)-X(D,E)(N,S) Inconnu YerP
-H A E3- (A3) X X G- D D A- X E N Inconu N olG
-H A E4- (A4) X X G- D( D,S,N)(S,A)-XE( N,1) Inconnu Al5294
-H A E5- (A5) AI G- D D A- X E N Co m posés AcrB
organiques

G, D, E, N: Ce sont des résidus d’acides aminés de la protéine Czc A correpondant à G404, D408,
E415 et N416.

La ( ) indique alternation des acides aminés pour la mê me position

X : Indique n’importe quel acide aminé

Origine des protéines représentatives : CzcA, CnrA (Ralstonia metallidurans souche C H 34

et 31A), RS A 1040 (Ralstonia solanacearu m ), CztA (P. fluorescens), HelA (Legionella
pneu mophila), HP O960 (H. pylori), SilA (S. enterica pv typhimurium), CusA, AcaB ( E. coli),
All7631, AlrS 294 (Nostoc sp), YerP (B. subtilis et NolG (S. meliloti).

16
 Etude bibliographique

Chercheurs à sélectionner toutes les séquences protéiniques présentant une ho mologie avec la
protéine Czc A et de procéder à leur classification (Nies, 2003) (Tableau II).

1.4.3.1.3/- Structure des co m posantes de la pom pe efflux Czc C B A- (CzcA, CzcB, Czc C)

-La protéine Czc A : Elle est l’archétype des protéines R N D, co mposée de 1064 acides
a minés et se localise dans la me mbrane cytoplas mique. Elle est constituée de deux canons
(Un à proton et l’autre à cations). Certains auteurs, suggèrent qu’elle possède 12
hélices trans me mbranaires (H T MI à H T M XII) (Dong & Mergeay, 1994 ; Saier et al., 1994),
et deux grandes boucles périplasmiques situées entre les hélices H T M – I et H T M –II et les
hélices H T M – VII et H T M – VIII. Elle est pauvre en cystéine et en histidine. L’ultra structure
de cette protéine montre qu’elle est constituée de 4 do maines dont deux sont hydrophobes et
deux autres hydrophiles.

- La protéine CzcB : Elle est co mposée de 521 acides aminés, et contient environ 8 résidus
d’histidine. C’est une protéine périplasmique dont une partie est dans le cytoplas me et l’autre
extra - me mbranaire. Elle possède au niveau de son extrémité N- terminale un petit seg ment
hydrophobe qui pourrait per mettre son ancrage à la me mbrane externe. Elle est sous forme de
dimère.

-La protéine Czc C : Elle est co mposée de 346 acides aminés, ne contient pas de résidus
d’histidine et son fonctionne ment dépend de la protéine CzcB. Elle est probable ment en
contact avec une protéine intégrante dans la mem brane externe. Son extrémité C- terminale
est dans le périplasme, m ais elle est localisée dans la me mbrane externe.

L’organisation génétique de ces trois protéines chez les espèces Helicobacter pylori souche
1328, 1329, 0971, 0970, 0969 et Ralstonia metallidurans souche C H 34 est représentée sur la
figure 7.

1.4.3.2/- Les protéines de transport C D F (Cation Diffusion Facilitators)

1.4.3.2.1/- Définition et mode d’action

Ce sont des protéines im pliquées dans le transport des ions métalliques de manière passive,
par simple diffusion (Saier, 2000). Le pre mier substrat des protéines CD F est le zinc avec
d’autres tels que le cobalt,le nickel, le cad miu m et le fer.

Le transport est assuré par un Gradient chimio osm otique (gradient de potentiel ou de pH) ou
un gradient de potassiu m ( Wong et al., 2000 ; Bloss et al., 2002 ; Lee et al., 2002).

Le pre mier me mbre des protéines C D F, a été décrit chez l’espèce Alcaligenes eutrophus

17
 Etude bibliographique

Figure 7: Organisation génétique du système efflux czcC B A des espèces

Helicobacter pylori et de Ralstonia metallidurans (Stahler et al., 2006).

18
 Etude bibliographique

Souche H34, Czc D. Cette protéine régule l’expression du système CzcC B A, responsable
2+ 2+ 2+
d’une haute résistance aux ions métalliques Zn / Co / Cd chez les bactéries (Nies, 1992).
En absence du système à haute résistance Czc C B A, la protéine Czc D peut intervenir dans la
2+ 2+ 2+
résistance vis-à-vis de Zn / Co / Cd . Elle diminue la concentration cytoplas mique des ions
m étalliques précités (Anton et al., 1999) (Figure 6).

Deux autres familles de transporteurs chimio os motiques plus spécifiques existent. Un

transporteur est impliqué dans l’extrusion du Chrom ate (ChrA) (Juhnke et al., 2002 ; Silver &
3+ 3+
Phung, 2005), l’autre dans l’éxtrusion de l’Arsenic As (ArsB) et de l’antimonite Sb s
(Silver & Phung, 2005) . Ces systèmes sont uniques dans le sens et peuvent fonctionner aussi
bien seuls co m me un systè me d’éxtrusion chimio os motique ou en co mbinaison avec une
autre sous unité nécessitant de l’énergie sous la form e d’A TP tel que le cas de ArsA.

2+ + 2+ +
Chez Bacillus subtilis, la protéine Czc D agit co m me un antiport Zn /K ou Zn /H
2+ + 2+ + 2+
(Guffani et al., 2002). L’échange serait électriquem ent neutre (Zn / 2K , Zn / 2H ou Zn
+ +
/K + H et l’énergie nécessaire provient des gradients trans me mbranaires orientés de façon
opposée. Le gène czcD est situé au niveau du mê me opéron avec le gène trkA
déhydrogénase Trk A (W a ng et al., 2000).

2+
Chez Staphylococcus aureus, la protéine Czc D est impliquée dans la résistance aux Zn /
2+ 2+
Co . Par contre chez Thermus thermophilus, elle est responsable de la résistance aux Zn /
2+ 2+
Cd , mais pas pour le Co (Spada et al., 2002).

Trois protéines C D F ont été aussi déterminées chez Escherichia coli dont deux sont
caractérisées co m me ZitB et Zup T, responsables de la résistance au zinc (Grass et al., 2005).
La troisième protéine impliquée dans la résistance aux ions métalliques est la YiiP. (Grass et
al., 2001). Une autre protéine C D F a été déterminée chez les bactéries magnetotactiques, la
M a m B, localisée dans la me mbrane magnétoso m e (Grunberg et al., 2001).

1.4.3.2.2/- Répartition et classification des protéines C D F chez les procaryotes

Les protéines C D F spécialisées dans le transport des ions métalliques identifiées chez les
procaryotes ont été classées dans trois groupes différents (Tableau III).

1.4.3.2.3/- Description de quelques protéines C D F

- La protéine Czc D : Elle a été identifiée pour la pre mière fois chez les bactéries à Gra m
négatif (R. metallidurans souche C H 34) (Goris et al., 2001). Elle fait partie du systè me Czc
2+ 2+ 2+
impliqué dans la résistance au Zn ,Co ,Cd . C’est une protéine à 6 do maines trans-
m e m branaires avec plusieurs résidus d’histidine. Un do maine hydrophobe est constituée
d’environ 200 résidus d’acides aminés avec probable ment 6 • hélices trans me mbranaires et
un autre do maine hydrophile co mposé de 115 résidus d’acide aminé localisé dans le
cytoplas me (Anton et al., 2004). Elle contient environ 8 résidus de cystéine localisés dans (H5,

19
 Etude bibliographique

Tableau III : Les différents groupes de protéines C D F chez les micro-organismes

(Nies, 2003).

Les différents sous groupes de protéines Substrats Exe mples et origines des protéines
CDF
Protéines C D F du groupe 1 :
2+
- (Proteobacteria • , • , •) Zn P A 1297- ( P. aeruginosa ).

Protéines C D F du groupe 2:
2+
- 2b (Bactéries à Gra m positif) Zn Spr 1672- (S. pneu moniae ).
2+
- 2c (Bactéries) Zn P H 0896
2+
- 2e (Proteobacteria et cyanobactéries) Zn AII 7610- (Nostoc).
2+
- 2f (Bactéries à Gra m positif) Zn S A 0155 -(S. aureus).
2+
- 2g (Bactéries) Zn ZitB,Czc D,Bacsu-(E.coli,R.metalliduran
et B. subtilis).
2+ 2+ 2+
- 2h (Bactéries) Zn ,Co ,Cd Czc D,Ralme-(R.metalliduran et
B. subtilis).
Protéines C D F du groupe 3 :
- 3a (Bactéries) Inconnu .Aq_2073- (Alcaligenes aeolicus).
- 3b (Proteobacteria • , •) // // YiiP- (E.coli).
- 3c (Bactéries) // // D R 1236-(Deinococcus radiodurans) .
- 3d [Bactéries à Gra m +, à faible (G+ C)] // // EF0859-(Enterococcus faecalis ).
- 3e [Bactéries à Gra m +, à faible (G+ C) // // Yea B, Ybd O- (B. subtilis).
et les Ther motaga]
2+
- 3f (Procaryotes) Fe M a m B-( Magnetococcus
gryphiswaldensis) .

20
 Etude bibliographique

H 7, H9) de l’extrémité N du do maine hydrophobe ou dans (H234, H237, H251, H280, H298)
de l’extrémité carboxyle du do maine hydrophile.

- La protéine ZitB : Elle est très proche de la protéine Czc D. Elle a été identifiée pour la
pre mière fois chez E. coli et contient au niveau de l’extrémité N de son do maine
trans me mbranaire (T Ms) les résidus d’acides aminés H53, H159, D163, D186. Cette protéine
est conduite par la motivation de la force des protons (P M F). Elle assure l’ho méostasie du
Zinc (Anton et al., 2004).

En général, le transport des protons (Import) et des ions métalliques (Export) est réalisé par
les résidus d’acides aminés chargés et polarisés au niveau de l’extrémité amino- acyl des deux
protéines précitées et autres protéines C D F du groupe 2 (Nies, 2003). Il est à souligner que les
résidus d’histidine sont très importants et essentiels pour le bon fonctionnem ent des protéines
Czc D et ZitB (Lee et al., 2002).

1.4.3.3/- Les protéines de transport P-type A T P ases

1.4.3.3.1/- Définition et mode d’action des protéines P-type A T Pases

Elles constituent une superfa mille de protéines conduites par l’hydrolyse de l’ATP (Fagan &
Saier, 1994). Elles doivent leur étiquette (P) au motif D K T G impliqué dans la
phosphorylation de l’Aspartate. Ces protéines se trouvent chez tous les organismes vivants et
2+ 2+ + + 2+
transportent les co mposés inorganiques surtout les ions tels que Mg , Ca , Cu , Ag , Zn et
2+
Cd . Une protéine P-type ATPase peut effectuer le transport des ions dans les deux sens
et joue un rôle important dans l’ho méostasie ionique intra cellulaire par le processus
de détoxification. Les protéines P-type A T Pases métallo - transporteurs, portent un résidu
proline et/ou suivi par un autre de cystéine et ont une spécificité pour les ions métalliques
+ + 2+ 2+ 2+
Cu / Ag / ou Zn / Cd / Pb (Fan & Rosen, 2002 ; Tong et al., 2002).

2+ 2+ 2+ 2+
Les protéines de la sous fa mille Zn - CPx-type AT Pases transportent le Zn /Cd /Pb /Co ,
du cytoplasme vers le périplasme, puis à l’extérieur de la cellule grâce à un gradient
d’ions au travers de la me mbrane interne (Degen & Eitinger, 2002). Il a été dé montré
que la protéine Pbr A se trouve sur le plasmide qui confère à Ralstonia metallidurans
la résistance au plo mb (Borre mans et al., 2001). Les protéines ZntA d’Escherichia coli
2+ 2+
et Cad A de Staphylococcus aureus sont impliquées dans la résistance aux Zn /Cd
(Legatzki et al., 2003). Le pre mier me mbre décrit de cette famille est CadA, responsable de la
résistance au cad miu m chez S. aureus (Udo et al., 2000) (Figure 8).

Ces protéines exposent deux faces, et leur principal rôle est d’exporter les groupe ments thiols
liés aux ions métalliques du cytoplasme vers le périplasme et/ou vers l’extérieur. (Shar ma et
al., 2000 ; Nies, 2003).

21
 Etude bibliographique

Figure 8 : Représentation sché matique du plas mide pI 258 qui code pour la résistance
2+ 2
aux ions m étalliques Cd et Zn chez Staphylococcus aureus (Nies, 1993 ).

- cad A est le déterminant génétique porté par le plas mide pI 258, localisé sur le frag ment
Bg/II-XbaI de 3.5- Kb.

- C ad C A est un co mplexe protéinique inductible dont le rôle est de transporter les ions
2+ 2
m étalliques Cd et Zn à l’extérieur de la cellule.

- G =site de Bg/II et A=site de XbaI

22
 Etude bibliographique

1.4.3.3.2 /- Classification des protéines P-type A T Pases

Ces protéines sont classées en deux sous familles; les ATPases P1-A et les P1-B. Les
m e m bres de la pre mière sous famille (P1-A) sont généralement impliquées dans le transport
+
du potassiu m (K ) surtout, mais certaines peuvent transporter les ions métalliques (oxyanions
principale ment) tels que le cas de ArsA et ArsB d’Escherichia coli (Saier, 1994). Ces
A T Pases sont rares, et se distinguent par la présence d’un motif distinct pour le site de
fixation du nucléotide par rapport aux autres me mbres de cette superfamille (Chen et al.,
1996).

Les ATPases de type P1-B contrôlent la concentration cytoplas mique d’une grande variété de
m étaux lourds et elles se divisent en deux principalux groupes. Le pre mier regroupe les
protéines de type Cad A de S aureus (Nucifora et al., 1989) impliquées dans l’extrusion du
cad miu m et du zinc (Silver & Phung, 1996), tandis que le second co mporte les transporteurs
2+
du cuivre et de l’argent. La protéine ZntA d’E coli est impliquée dans l’efflux des ions Zn ,
2+ 2+
Pb , et Cd , (Rensing et al., 1998).

Les ATPases de type P1 sont distinguées par quatre particularités (Palmgren, 1998 ; Rensing
et al., 1999) (Figure 9) :

-Au moins un site de fixation au métal du côté N - terminal, qui peut être un do maine à
Cystéine de type « C X X C » et/ou un do maine riche en histidine.

-Une séquence conservée « CP X », (X pouvant être un résidu histidine, sérine ou Cystéine)

qui joue un rôle au niveau du canal permettant le passage de l’ion.

-Une séquence dipeptidique conservée « HP » dans le second do maine cytoplasmique dont le

rôle n’est pas encore définit.

-Une topologie me mbranaire unique (Solioz & Vulpe, 1996) :

a/- du côté N - terminal, il y’a quatre hélices m e m branaires qui précèdent la pre mière
boucle cytoplas mique au lieu de deux chez les autres ATPases.

b/- du côté C – terminal, après la seconde boucle cytoplas mique, il y’a que deux hélices
trans - me mbranaires au lieu de quatre chez les autres.

23
 Etude bibliographique

Figure 9 : Structure sché matique des protéines ATPase P1 avec 8 hélices trans
me mbranaîres ( Monchy, 2007).

- Sites co m m uns à toutes les ATPases type P1sont: site phosphatase (T G ES), site de
phosphorylation (D K T G T), site de fixation de l’ATP (G D G X N D X P).
- Sites spécifiques intervenant dans le transport des métaux lourds sont : sites CP X,
H P et les sites de fixation au métal (poly-His, C X X C).

24
 Etude bibliographique

2/- Les antibiotiques

2.1/- Définition d’un antibiotique

Le terme antibiotique a été proposé pour la pre m ière fois par Selmane W aks man en 1942, et
désigne toute substance chimique ou biologique ayant la capacité d’inhiber la croissance ou
de détruire les micro-organismes.

Actuellement, un antibiotique est défini co m m e étant une substance d’origine biologique

(Produite par des bactéries ou des mycètes), synthétique ou se mi synthétique agissant
spécifique ment sur une étape essentielle du métabolisme des micro-organis mes
(Berche et al., 1991).

2.2/- Mode d’action des antibiotiques

Selon le spectre d’activité des antibiotiques, certains sont bactéricides du fait qu’ils inhibent la
biosynthèse de molécules vitales pour la cellule, et d’autres sont bactériostatiques. Cette
activité anti-microbienne peut être large ou étroite. Cependant, deux grands lieux d’action ; la
paroi et le cytoplasme avec cinq différents mécanismes sont distingués : action sur la synthèse
du peptidoglycane, action sur la me mbrane cytoplas mique, action sur la réplication de l’A D N,
action sur la synthèse des protéines et action par inhibition co mpétitive (Lavigne, 2007).
Figure 10).

2.2.1/- Les antibiotiques inhibiteurs de la biosynthèse du Peptidoglycane

Le Peptidoglycane est un poly mère majeur spécifique de la paroi des bactéries à Gra m positif
et à Gra m négatif. Il est co mposé de chaînes linéaires de N– acétyl D glucosa mine et
d’acide N– acétyl muramique dont le no mbre de molécules va de 20 à 100. Ces chaînes
polyosidiques sont reliées entre elles par de courtes chaînes de tétra- peptides (L – Ala – D –
Glu – L – Lys – D – Ala) à l’aide des ponts peptidiques (Vandenesch & Etienne, 1997 ;
Cavallo et al., 2004) (Figure 11). La biosynthèse du Peptidoglycane est effectuée en 3
principales étapes :

-La pre mière étape

Elle est effectuée dans le cytoplasme et correspond à la formation du précurseur du

Peptidoglycane (U D P – N A M P).

-La deuxiè me étape

C’est une étape me mbranaire. Elle correspond au transport de l’U D P – NA M P au travers de

la me mbrane cytoplas m ique et en mê me temps addition d’un autre sucre le N – acétyl
glucosa mine et d’une autre chaîne peptidique secondaire dont la séquence varie en fonction
des espèces bactériennes. Cependant, on aura un disaccharide pentapeptide (N – acétyl

25
 Etude bibliographique

Figure10: Représentation sché matique des sites d’action des antibiotiques

(Fournier & Roy, 1997).

26
 Etude bibliographique

glucosa mine/N – acétyl m ura mique pentapeptide). Ces éléments constituent les unités de base
du Peptidoglycane.

-La troisiè me étape

Elle consiste à la polym érisation des disaccharides penta peptides au niveau de la face
externe de la me mbrane cytoplas mique selon deux réactions différentes:

-La pre mière réaction est réalisée en présence des trans- glycosidases dont le rôle
principal est de lier les unités élémentaires du Peptidoglycane entre elles pour donner
naissance à de longues chaînes poly saccharidiques linéaires.

-La deuxiè me réaction consiste à l’incorporation des chaînes poly saccharidiques

néo synthétisées au Peptidoglycane pré existant par le biais des transpeptidases
(Cavallo et al., 2004).

2.2.1.1/- Les •-lacta mines

Ce sont des antibiotiques bactéricides, inhibent la dernière étape de la synthèse du

peptidoglycane par analogie structurale avec le dipeptide D – alanyl – D - alanine. Elles se
lient spécifique ment au site actif de leurs protéines cibles présentes sur la face externe de la
m e m brane cytoplas miques ; les PLP (Protéine liant la pénicilline) ou PBP (Penicillin binding
protein). Le no mbre et la nature des PLP varient en fonction des espèces bactériennes. Pour
atteindre les PLP, les •-lacta mines doivent traverser la paroi bactérienne. Chez les bactéries à
Gra m positif, ces molécules atteignent facilement leurs cibles car Leur diffusion au travers de
la paroi se fait passivem ent. Par contre, chez les bactéries à Gra m négatif la me mbrane
externe empêche la diffusion de no mbreuses molécules. Cependant, ces agents antimicrobiens
e mprunte la voie des porines et leur passage est fonction de leur taille, de leur charge et aussi
d’autres facteurs tel que la nature du LPS ce qui explique la résistance de P aeruginosa
à de no mbreuses •-lactamines (Vandenesch & Etienne,1997) (Figure 12).

2.2.1.2/- La fosfo mycine (Phospho m ycine)

C’est un antibiotique bactéricide, inhibe la conversion de l’U D P – N - acetyl glucosa mine en

acide U D P – N - acetyl m ura mique en se liant par une liaison covalente à un résidu cystéine
de la pyruvyl transférase. Pour atteindre sa cible dans le cytoplasme, la fosfo mycine doit
franchir la me mbrane cytoplasmique en empruntant deux systèmes de transport : le systè me
L- • glycérophosphates et celui des héxoses phosphates (Lavigne, 2007).

2.2.1.3/- La cyclosérine

Elle présente une analogie de structure avec la D-alanine, inhibe la racé mase transformant la

27
 Etude bibliographique

Figure 11 : Représentation sché matique des sites d’action de certains

antibiotiques sur la biosynthèse du peptidoglycane (Lavigne, 2007).

28
 Etude bibliographique

L - alanine en D - alanine et la D – alanyl – D - alanine synthétase. Sous l’effet de cet agent

antimicrobien très toxique, il se produit une accum ulation d’U D P- N-acetyl mura myltripeptide
(Berche et al., 1991).

2.2.1.4/- Les glycopeptides

Ces antibiotiques sont bactéricides, avec une grande affinité vis-à-vis les précurseurs du
peptidoglycane co mportant le dipeptide D – alanyl – D - alanine. Leurs cibles sont donc
situées soit dans le cytoplas me, soit au niveau de la paroi en formation. Chez les bactéries à
Gra m négatif, aucune cible n’est atteinte à cause de l’imper méabilité de leur me mbrane pour
ces molécules, contrairem ent aux bactéries à Gram positif. En revanche, ces antibiotiques ne
peuvent franchir la mem brane cytoplasmique de ces derniers et leur action s’exerce sur la
paroi en formation. Les glycopeptides forment un co mplexe avec les dipeptides D-alanyl-D-
alanine présents dans la paroi en formation, ce qui conduit à l’inhibition des transglycosylases
et des transpeptidases. Par ailleurs, l’élongation de la paroi et la croissance bactérienne est
inhibée (Lavigne, 2007).

2.2.1.5/- La bacitracine

Cette molécule est inactive sur les bactéries à Gra m négatif grâce au mécanisme
d’imper méabilité me mbranaire. Chez les bactéries à Gra m positif, forme un co mplexe
irréversible avec l’undécaprényl – pyrophosphate et inhibe sa déphosphorylation
(Berche et al., 1991).

2.2.2/- Les antibiotiques agissants sur les me m b ranes

2.2.2.1/- Les poly myxines

Ces agents antimicrobiens sont constitués d’un polypeptide cyclique et d’un acide gras. Ils
pénètrent à l’intérieur de la me mbrane et s’incorporent à la couche lipidique grâce à leur
extré mité hydrophobe, ce qui induit une désorganisation de la structure me mbranaire et
entraîne la mort de la cellule. Ces molécules sont très actives sur les bactéries à Gra m négatif
(Berche et al., 1991).

2.2.3/- Les antibiotiques actifs sur l’A D N

2.2.3.1/- Inhibition de la réplication

2.2.3.1.1/- Les quinolones

Ces molécules inhibent la synthèse de l’A D N par action sur les topo - iso mérases
bactériennes. Ils franchissent la paroi des bactéries à Gra m négatif grâce aux porines et
pénètrent à l’intérieur de la cellule par diffusion passive. Leurs cibles sont l’A D N- gyrase
(topo - iso mérase II) et la topo - iso mérase IV. L’A D N gyrase est co mposée de deux sous

29
 Etude bibliographique

(a) (b)

Figure 12 : Représentation sché matique de la paroi des bactéries à Gram négatif (a) et à
Gra m positif (b) d’après Gutmann & W illiamson, 1987 in Berche et al., 1991.

P = protéines de type porine

L P S = lipo polysaccharides
M . E = me mbrane externe
P. G = peptidoglycane
E.P = éspace périplasmique
P L P = protéine liant la pénicilline
M .I = me mbrane interne

30
 Etude bibliographique

unités A (codées par le gène gyrA) et de deux sous unités B (codées par le gène gyrB). Le site
catalytique de l’A D N gyrase est centré sur la tyrosine en position 122 de la sous unité A. La
sous unité B co mprend un site d’hydrolyse de l’ATP fournissant l’énergie nécessaire à
l’activité enzy matique. L’ A D N gyrase intervient au mo ment de la réplication de la double
hélice, en produisant des coupures et des ligations au niveau des brins d’A D N ce qui per met
la progression de la fourche de réplication. Au m o ment de la coupure, l’A D N et l’enzy me
(gyrase) sont transitoirem ent liés de manière covalente (sous forme de co mplexe). Les
quinolones agissent sur ce dernier en formant un autre co mplexe irréversible (enzy me –
antibiotique). Ainsi, les brèches au niveau des brins d’A D N ne peuvent être soudées et l’A D N
bactérien reste sous for me de frag ments. Ces antibiotiques agissent aussi sur la
topo - iso mérase IV qui intervient lors de la séparation des copies d’A D N circulaires
présentes après réplication. Ils inhibent aussi la transcription (Berche et al., 1991).

2.2.3.1.2/- Les nitrofuranes

Ces agents antibactériens ne peuvent fonctionner correctement qu’après une réduction de leur
groupe ment N O2. Ils induisent des coupures et des mutations dans l’A D N.

2.2.3.1.3/- La novobiocine

Cet antibiotique est actif surtout sur les bactéries à Gra m positif. Elle inhibe la réplication de
l’A D N en e mpêchant la fixation d’ATP sur la sous unité B de l’A D N-gyrase.

2.2.3.1.4/- Les antibiotiques imidazolés

Co m me pour les nitrofuranes, le bon fonctionnem ent de ces agents nécessite une réduction
partielle de leur groupem ent N O2. Ils se fixent sur l’A D N au niveau des régions riches en
adénine et thy mine, tout en provoquant une oxydation suivie d’une coupure des brins et d’un
déroule ment de l’A D N ce qui entraîne la mort de la cellule (Berche et al.,1991).

2.2.3.2/- Inhibition de la transcription

2.2.3.2.1/- Les rifa m picines

Ces molécules sont bactéricides. Cet effet serait lié à l’oxydation in vivo du site quinone de la
m olécule ce qui formerait des ions super oxydes et des radicaux libres toxiques pour l’A D N
bactérien. Elles se fixent sur la sous unité • de l’AR N poly mérase et empêchent l’initiation de
la synthèse des A R N m (Lavigne, 2007).

2.2.4/- Les antibiotiques inhibiteurs de la synthèse des protéines

La traduction des A R N m en protéines se fait au niveau des riboso mes et peut se déco mposer
en trois étapes : initiation, élongation, terminaison (Lavigne, 2007).
31
 Etude bibliographique

Pre mière étape (initiation)

A u cours de l’initiation, la sous unité riboso male 30S et le co mplexe form yl – méthionine -
A R Nt se fixent au site d’initiation A U G de la molécule d’A R N m. Trois protéines et des
facteurs d’initiation sont nécessaires pour cette étape. Par la suite, la sous unité riboso male
50S se lie à ce co mplexe d’initiation pour former le riboso me 70S.

Deuxiè me étape (élongation)

Durant l’élongation, on aura incorporation séquentielle des acides aminés spécifiques. Cette
étape peut être divisée en trois phase différentes à savoir: reconnaissance, transfert peptidique
et translocation.

- La reconnaissance : Pendant cette phase, une molécule d’acide aminé AR Nt se fixe

sur le site A (aminoacyl) du riboso me.

- Le transfert peptidique : Transfert du peptide en formation du site P (peptidyl) au site

A et formation d’une liaison peptidique avec l’acide a miné du site A ce qui conduit à
l’élongation de la chaîne peptidique.

-La translocation : Cette phase fait intervenir trois protéines connues sous le no m de
facteurs d’élongation. Son but est de transporté le peptide au site P.

Troisiè me étape (incorporation des acides a minés)

L’incorporation des acides aminés se répète jusqu’à ce qu’un codon de terminaison soit
reconnu sur l’A R N m. A l’aide de trois protéines accessoires spécifiques, on aura libération du
peptide, séparation du riboso me et de l’A R N m et la dissociation du ribosom e en ses deux sous
unités.

L’effet inhibiteur des antibiotiques sur la synthèse des protéines est exercé surtout sur la sous
unité riboso male 30S ou 50S, parfois les deux à la fois (Figure 13).

2.2.4.1/- Les a minosides

Ce sont des antibiotiques bactéricides. Pour atteindre leurs cibles dans le cytoplasme, ils
franchissent l’enveloppe externe à l’aide des porines, puis la me mbrane cytoplas mique par le
biais d’un système de transport d’électron et d’oxygène co m me accepteur final. Une fois à
l’intérieur de la cellule, ces agents se fixent sur la sous unité 30S et provoquent des erreurs de
reconnaissance codons – anti codons et l’incorporation d’acides aminés erronés dans la chaîne
peptidique en formation. D’autre part, ils empêchent la fixation du facteur F3 qui en fin de
synthèse provoque la dissociation du riboso me en ses deux sous unités. De ce fait, les
riboso mes sont incapables de s’unir à de nouveaux A R N m. Certains aminosides se fixent à la
fois sur la sous unité 30S et 50S du riboso me (Berche et al., 1991).

32
 Etude bibliographique

Figure 13 : Représentation sché matique des sites d’action des antibiotiques

actifs sur la synthèse des protéines (Lavigne, 2007).

33
 Etude bibliographique

2.2.4.2/- Les tetracyclines

Ce sont des antibiotiques bactériostatiques à large spectre. Pour exercer leur effet inhibiteur,
traverse la me mbrane externe grâce aux porines, puis la me mbrane cytoplas mique soit par
diffusion passive, soit par des systèmes de transport actif. Ces molécules se fixent sur les
riboso mes au niveau du site A par liaison avec les protéines de la sous unité 30S. De ce fait,
l’aminoacyl - AR Nt sera inhibé et la phase de reconnaissance au cours de l’étape
d’élongation de la chaîne peptidique sera bloquée (Berche et al., 1991) .

2.2.4.3/- Les macrolides et apparentés

Les L M S sont des antibiotiques lipophiles, constitués par un noyau central lactonique
co mposé de 12 à 16 atom es sur lesquels sont fixés des sucres. Ces molécules et d’autres sont
actifs surtout sur les bactéries à Gra m positif et quelques bactéries à Gra m négatif. Ils inhibent

la synthèse des protéines en se fixant de façon réversible sur la sous unités 50S, nota m ment
au niveau de l’A R N riboso mal 23S, au voisinage du site P. Ceci, inhibe l’élongation du
peptide en cours de synthèse par blocage des étapes de transfert peptidique ou de translocation.
Certains agents antibactériens de ce groupe inhibent la synthèse des protéines par inhibition
de la formation des liaisons peptidiques (Berche et al., 1991).

2.2.4.4/- Les phénicolés

Ces antibiotiques s’attachent à la sous unité riboso male 50S préférentiellem ent sur le site A,
en e mpêchant l’attachem ent des amino - acyl A R Nt et inhibent la form ation des liaisons
peptidiques (peptidyl transférase) et enfin l’élongation de la chaîne. Ils sont bactériostatiques
et actifs sur les bactéries à Gra m positif et à Gram négatif (Lavigne, 2007 ; Berche et al.,
1991).

2.2.4.5/- L’acide fusidique

C’est un antibiotique de nature stérolique. Il est hydrophobe et actif unique ment sur les
bactéries à Gra m positif. Il intervient au cours de la translocation et inhibe l’élongation du
peptide en im mobilisant le co mplexe riboso me- facteur d’élongation qui doit normale ment se
dissocier juste après la translocation du peptide.

2.2.5/- Les antibiotiques agissant par co m pétition

2.2.5.1/- Les sulfa mides

Ce sont des agents antimicrobiens à effet bactério - statiques. Ils inhibent l’enzy me
dihydrofolate synthétase par analogie structurale avec l’acide para amino - benzoique (P A B)
ce qui conduit à l’inhibition de la synthèse de l’acide tétrahydrofolique impliqué dans la voie
de biosynthèse des purines et des pyrimidines (Lavigne, 2007).

34
 Etude bibliographique

2.2.5.2/- La triméthoprim e

C’est un antibiotique à effet bactériostatique, et inhibe l’activité de l’enzy me dihydrofolate

réductase.

2.2.5.3/- L’acide para aminosalicylique (P AS)

Il se caractérise surtout par une structure analogue au PA B. Il est très actif sur les
m ycobactéries et son mécanisme d’action est similaire à celui des sulfamides.

2.3/- Origine de la résistance bactérienne

La résistance des bactéries aux différents agents antimicrobiens peut être naturelle
(intrinsèque) ou acquise.

2.3.1/- La résistance naturelle

Dans le cas d’une résistance naturelle, le support génétique est le chrom oso me bactérien.
Cette résistance est considérée co m me une propriété de l’ense mble des souches d’une mê me
espèce. Elle est fixe, constante (trans mission verticale), et constitue un critère d’identification.
Elle est due à un grand no mbre de mécanismes biochimiques tel que le cas de
l’imper méabilité me mbranaire à certains antibiotiques hydrophobes ou de masse moléculaire
élevée (pénicilline G et M, macrolides, rifam picine, acide fusidique, vanco mycine,
novobiocine) chez les entérobactéries et Pseudo monas aeruginosa. La résistance
chro moso mique peut être le fait d’une mutation (acquisisition). Cette dernière est rare et ne se
5 10
produit en moyenne que toutes les 10 à 10 divisions cellulaires. La mutation affecte
un caractère, et souvent la résistance ne touche qu’un antibiotique ou une fa mille
d’antibiotiques ayant le mê me mode d’action. Il existe toutefois quelques exceptions en
cas d’une mutation qui affecte les porines. Cependant, une seule mutation conduit à une
résistance simultanée à plusieurs antibiotiques tel que le cas de la résistance aux • lacta mines
et aux a minosides chez Serratia marcescens et Pseudo monas aeruginosa.

2.3.2/- La résistance extra chro moso mique

Ce type de résistance est lié à des éléments génétiques extra chro mosomiques ; plasmides,
transposons et intégrons.

2.3.2.1/- Les plas mides

Les plasmides ont été décris dans les années 1950. Ils codent pour la résistance à un ou
plusieurs agents antimicrobiens à la fois. Cette insensibilité est liée à la synthèse de nouvelles
protéines et non à une modification des constituants normaux des bactéries. Ils confèrent aussi
aux bactéries la résistance à certaines conditions hostiles de l’environne ment (acidité,

35
 Etude bibliographique

salinité ….), co m me ils peuvent porter égalem ent des facteurs de virulence, de la
biodégradation de certains co mposés organiques toxiques (hydrocarbures), de la production
de toxines et autres (Le Minor & Veron, 1990 ; Cle well,1993). Ils sont dotés d’un systè me de
réplication autono me qui est à l’origine du phéno mène d’inco mpatibilité et du contrôle du
no mbre de copies de plasmides dans la cellule. Les plasmides conjugatifs, autotransférables
(transfert horizontal) portent les gènes de transfert nécessaires pour la synthèse des pili
responsables de la conjugaison et la régulation de la fréquence du transfert (Hayes, 1968).

Il existe aussi des plasmides non conjugatifs, pouvant ou non être mobilisables. Les plas mides
non autotransférables mobilisables sont dotés d’une région de transfert mais pas des fonctions
de transfert et ils sont transférés par l’intermédiaire d’un plasmide conjugatif. Dans certains
cas, les plasmides non conjugatifs et non mobilisables peuvent former un co-intégrat avec un
plas mide conjugatif ce qui leur permet d’être transférés en bloc lors d’un croise ment (Davison,
1999).

2.3.2.2/- Les transposons

Ce sont des séquences d’A D N capables de pro m ouvoir leur translocation d’un réplicon à un
autre (transposition interm oléculaire) ou en un autre site du mê me réplicon (transposition
intramoléculaire) (Le Minor & Veron, 1990). Les éléments transposable les plus simple sont
les séquences d’insertion (IS= Insertion sequence). Cette dernière ne contient que les gènes
utiles à sa mobilité et elle est flanquée aux deux extré mités par des séquences nucléotidiques
inversées, repetées, de 20 à 40 pb impliquées dans la fixation de la transposase et dans les
phases de coupure, d’excision et de transposition de l’A D N (IR). Les élém ents transposables
peuvent égale ment contenir d’autres gènes de résistance ou de toxines et dans ce cas il s’agit
de transposons co mposites. La transposition peut se faire par excision/intégration, par
transposition conservative ou réplicative (Craig, 1996).

2.3.2.3/ Les intégrons

Ils ont été découverts au cours des années 1980. Ce sont des structures génétiques linéaires
d’A D N qui servent à la capture de gènes et de vecteurs d’expression. Les casettes sont
considérés co m me des élé ments mobiles qui peuvent être facilement intégrés dans un intégron
par un mécanisme de reco mbinaison spécifique de site. Ils existent chez les bactéries à Gra m
positif et négatif (Roy, 1997 ; Ploy et al., 2005). Ces unités mobiles sont incapables de s’auto
répliquer et portés par un réplicon (plasmide ou chro moso me). En général, l’intégron est
co mposé de trois régions, deux sont conservées situées de part et d’autre de la troisiè me
région qui est connue d’être variable. L’enzy me responsable de la catalyse de l’insertion d’un
ou de plusieurs gènes casettes au niveau du site d’attache ment att I est codée par le gène int I
’ ’
localisé au niveau de la région 5 conservée (5 C R). Les gènes casettes de résistance aux
différents antibiotiques peuvent être insérés dans un seul intégron et confère ainsi à une
bactérie la multirésistance (Ro we – Magnus & Mazel, 2001 ; To wner, 2002).

36
 Etude bibliographique

2.4/- Les mécanis mes biochi miques de la résistance

Les bactéries se défendent contre l’action des antibiotiques par imper méabilité me mbranaire,
inactivation enzy matique ou modification de la structure de leurs cibles (Courvalin et al.,
1985 ; Lavigne, 2007).

2.4.1/- Imper méabilité m e m branaire

2.4.1.1/- Di minution de per méabilité de la me m brane externe

Elle empêche la pénétration de l’antibiotique ou limite sa concentration dans l’espace

périplasmique, et résulte souvent d’une mutation affectant la structure des porines ou
diminuant leur synthèse. Il a été dé montré que l’acquisition d’une multi - résistance aux
antibiotiques chez les bactéries à Gra m négatif est due à un disfonctionnem ent ou à la perte de
l’une des majeurs porines (O mp ou Opr), qui constituent des canaux aqueux ou hydrophiles
co mposés de trois protéines laissant diffuser diverses molécules de faibles poids moléculaires
(Lavigne, 2007). Chez Pseudo monas aeruginosa, elle résulte de la perte de la porine OprD
qui affecte principale ment l’imipénè me, par contre chez Escherichia coli est liée à la perte
des porines O mp C et O m p F ( Nikaido & Vaara, 1985 ; Dalhoff et al., 2006 ; Mesaros et
al., 2007).

2.4.1.2/- Systè mes efflux actifs

Les bactéries peuvent résister aux antibiotiques par exportation active à l’aide des
transporteurs me mbranaires appelés po mpes d’efflux. Ces dernières sont énergie dépendante
et interfèrent avec les mécanismes de transport de type imper méabilité (Lavigne, 2007).

Ces deux mécanismes associés constituent les principaux mécanismes de la résistance

intrinsèque élevée des bactéries à Gra m négatif vis-à-vis de no mbreux agents antimicrobiens.
Les systèmes d’efflux se distinguent surtout par une structure tripartite co mposée d’une
po mpe trans me mbranaire, une protéine de fusion périplasmique et une porine de la me mbrane
externe. Parmi les systèm es d’efflux actifs décrits chez les bactéries à Gra m négatif, le
transporteur A mr A B - OprA responsable de la résistance aux a minoglycosides et aux
m acrolides chez Burkholderia pseudo mallei, Mex X Y qui assure l’éxtrusion des • lacta mines,
des aminoglycosides, de la tétracycline et de l’érythro mycine chez Pseudom onas aeruginosa
et Acr A B/Tol C d’Escherichia coli (Magnet et al. , 2001 ; Cattoir, 2004 ; Mesaros et al.,
2007).

2.4.2/- Modification de la cible des antibiotiques

Ce mécanisme de résistance confère aux bactéries la résistance à un grand no mbre

d’antibiotique de familles différentes. La modification des PLP (protéines liant les
pénicillines), fréque m ment rencontrée chez les bactéries à Gra m positif est due à une mutation

37
 Etude bibliographique

spontanée qui survienne dans les gènes chro moso miques codant les PLP nor males, ce qui
conduit à la modification de la structure de ces protéines (affinité diminuée) tel que le cas de
la PLP2a de Staphylococcus aureus résistante à toutes les • lactamines), et la PLP2 x de
Streptococcus pneu moniae (diminution de la sensibilité aux pénicillines) (Lavigne, 2007).
Elle peut aussi être due à l’acquisition de gènes codant pour des variants de PLP qui
présente une faible affinité pour les • - lactamines par un transfert horizontal (transformation)
(Brisou et al., 2004).

2.4.3/- Synthèse d’enzym es inactivant les antibiotiques

L’inactivation enzy matique des antibiotiques (• - lactamines, aminosides, phenicoles, … … ),

est le mécanisme de résistance le plus souvent observé chez les bactéries à Gra m positif et à
Gra m négatif. Ces enzym es ont une localisation intracellulaire ou extracellulaire, de nature
constitutive ou inductible, codés par des gènes chro moso miques ou extra chro moso mique
(plasmides, transposons et intégrons). L’exe mple le mieux connu est celui des • - lacta mases
responsables de l’hydrolyse du noyau • lactam e des antibiotiques de la famille des •
lactamines, ce qui confèrent la résistance bactérienne vis-à-vis ces agents antimicrobiens.
Selon des études récentes, plus de 350 • - lactam ases ont été identifiées (Babic et al., 2006 ;
Lavigne, 2007).

3/- Le transfert génétique

Le transfert horizontal des gènes de résistance d’une bactérie à une autre peut être réalisé par
trois principaux mécanism es : la conjugaison, la transformation et la transduction.

3.1/- La conjugaison

C’est un mécanisme de transfert du matériel génétique entre les bactéries le plus fréquent. Elle
est unidirectionnelle à déterminisme plasmidique qui nécessite un contact direct entre les
bactéries dites sexuellement différenciées par form ation d’un pont cytoplasmique. Elle est très
fréquente chez les bactéries à Gra m négatif, et le transfert des gènes peut être interspécifique,
intra - génique ou hétéri - génique. Les gènes de résistance sont transportés vers la bactérie
réceptrice sensible à tous les agents antimicrobiens (antibiotiques, métaux lourds ….) excepté
le marqueur grâce au transfert des plasmides conjugatifs, ce qui lui confère la résistance
partielle ou en bloc (Franke & Clewell, 1980). Les bactéries donatrices de gènes possèdent un
facteur de fertilité ou facteur « F » et elles sont qualifiées de F+, contrairem ent aux bactéries
réceptrices qualifiées de F-, car elles sont primitive ment dépourvues de facteur « F ».

3.2/- La transduction

Ce processus de transfert de gènes entre les bactéries se fait par l’intermédiaire de virus
(phage). Les gènes provenant de la bactérie donatrice sont incorporés dans une capside de
phage suite à des erreurs faites durant le cycle de vie de ce dernier. Il transporte ces gènes et
les injecte alors dans la bactérie réceptrice, co mplétant ainsi le transfert.

38
 Etude bibliographique

Il existe deux types de transduction : la transduction généralisée et la transduction spécialisée.

Dans le pre mier cas, un phage virulent ou tempéré peut transporter et transférer des frag ments
d’A D N générés au cours de la lyse bactérienne, par contre dans le second, les phages
tempérés ne transportent que certains gènes spécifiques du géno me de leur hôtes, situés prés
de leur sites d’attache ment (att) tel que le cas du phage lambda d’Escherichia coli, donc c’est
une transduction restreinte (Davison, 1999).

3.3/- La transfor mation

L’échange d’A D N entre les bactéries correspond à l’acquisition de gènes par une bactérie
réceptrice mise dans un milieu en présence de l’A D N nu d’une autre donatrice. Ce processus
est aléatoire, et toute partie du géno me peut être transférée vers la réceptrice. La
transformation dépend de la concentration de l’AD N dans le milieu et de la co mpétence de la
bactérie réceptrice. C’est phéno mène réalisé surtout in vitro, du fait que l’A D N libre dans
l’environne ment est rapide ment dégradé, de mêm e les bactéries naturelle ment co mpétentes
sont rares (Do wson, 1994).

39
 Etude bibliographique

4/- Les Flavobactéries

4.1/- Historique et position taxono mique

La fa mille des Flavobacteriaceae est l’une des principales familles du groupe Cytophaga –
Flavobacteriu m - Bacteroides (Hirsh et al., 1998). Elle a été proposée par Jooste (1985),
puis incluse dans le Bergey’s Manual de systématique et de bactériologie (Reichenbach,1989).
La validation du no m de cette famille a eu lieu en 1992 par Reichenbach. En 1996, Bernardet
et al., ont publié une étude très détaillée, intéressant plus de 100 souches bactériennes, dont
81 appartiennent au genre Flavobacterium, Cytophaga ou Flexibacter, et les résultats ont
conduit à une véritable description de cette famille et de son genre type Flavobacterium.
En 2002, Bernardet et al., agissant au no m du sous co mité de taxono mie des Flavobacterium,
Cytophaga - like bacteria, ont modifié la description de cette famille. Selon Garrity et al.,
2004, elle est classée com m e suit :

- Phylu m :Bacteroidetes
- Classe :Flavobacteria
- Ordre :Flavobacteriales

Ces dernières années, cette famille a fait sujet de recherche de plusieurs laboratoires dans le
m onde, ce qui a permet l’isolement et l’identification d’un grand no mbre de nouveaux taxons
à titre d’exe mple les genres For mosa (Ivanova, 2004), Pibocella et Bizionia (Nedashkovskaya
et al., 2005 a et b), Nonlabens (Lau et al., 2005), Sejongia (Yi et al., 2005), Wautersiella
(Ka mpfer et al., 2006) et Ta mlana (Lee, 2007).

4.2/- Caractères bactériologiques:

Les me mbres de la famille des Flavobacteraceae sont des bacilles à Gra m négatif, non
sporulés, le diamètre des cellules est situé entre 0.2-0.6 u m et leur longueur entre 1-10 u m.
Certaines espèces peuvent former des cellules filam enteuses qui se frag mentent pour donner
naissance à des bacilles puis des cocci dans les vieilles cultures. Certaines souches du genre
Polaribacter possèdent des vésicules gazeuses. D’autres genres se distinguent par la présence
des appendices longs et fins qui semblent servir à unir les cellules entre elles (Muricauda
ruestringensis) (reichenbach, 1989, 1992 a ; Bernardet et al., 2002).

Toutes les souches sont dépourvues de flagelles sauf l’espèce Polaribacter irgensii. La
m obilité par glisse ment a été observée chez les espèces de plusieurs genres tels que Algibacter,
For mosa et Gelidibacter. Cette mobilité est étroitement liée à la co mposition du milieu
de culture qui doit être pauvre en nutriments (Reichenbach & D workin, 1981 ; Reichenbach,
1992 a) et aux conditions physico - chimiques de la croissance co m m e la température
d’incubation ( Mc Grath et al., 1990). Il a été dém ontré que la mobilité par glisse ment est en

40
 Etude bibliographique

relation directe avec le mécanisme d’adhésion. La conco mitance adhésion - mobilité

per mettrait aux espèces pathogènes surtout pour les poissons de coloniser et d’envahir les
tissus de l’hôte. Ces micro-organismes sont aérobies. Toutes fois, certains préfèrent voire
exigent des conditions micro aérophiles pour se développer ou sont des aéro - anaérobies
facultatifs (Segers et al., 1993 a ; Vanda m me et al., 1994 b, 1996 b, 1999 ; Vancanneyt et al.,
1999). La température optimale de croissance est co mprise entre 23-35°C, m ais beaucoup de
genres sont psychrophiles ou psychrotolérants. Le caractère d’halophilie ou d’halotolérance
a été noté chez certains genres tels que Gillisia, Chryseobacteriu m, Psychroflexus,
Flavobacterium (Bo w m an et al., 1997 et 1998 ; G osink et al., 1998 ; Barbeyron et al., 2001).
Ces bactéries sont caractérisées surtout par la présence de pig ments (jaune pâle, jaune
foncé ou orange, beige) et le pig ment n’est pas diffusible. Parfois la pig mentation est absente
(genre Riemerella) (Reichenbach, 1989 ; Bernardet et al., 1996).

Les réponses aux tests catalase, oxydase et nitrate réductase sont variables (K oski et al., 1993 ;
Vanda m me et al., 1999). Le métabolisme est chimio - organotrophes, la principale quinone
respiratoire est une ménaquinone à 6 unités isoprènoides, la cellulose sous forme cristalline
(papier filtre) n’est jamais hydrolysée, les sphingolipides sont absents et le contenu de leur
D N A en G+ C est co mpris entre 27-44 mol % (Bernardet et al., 2002).

4.3/- Habitat et pouvoir pathogène

Les représentants de la famille des Flavobacteriaceae sont large ment distribués dans la
nature (sol, eau douce, sédiments des lacs et des rivières, eau de mer et environne ment marin,
boues activées, bio films, plantes, aliments (notam m ent produits laitiers), cavité buccale de
l’ho m me et des animaux. Dans l’environne ment, ces micro-organismes joueraient un rôle
important dans la dégradation de multiples co mposés de nature organiques et de structure
simple ou co mplexe (Bernardet et al., 2002). Certaines espèces ont été isolées du milieu
extérieur mais se co mportent co m me des bactéries pathogènes opportunistes tels que le
cas des genres Chryseobacterium, Elizabethkingia, Flavobacterium et autres (Bernardet et al.,
2002 et 2003).

- Le genre Chryseobacterium

a/- Etude taxono mique

Il est considéré co m m e l’un des pre miers mem bres de la famille des Flavobacteriaceae
(Holmes, 1992). Il a été créé suite au transfert de 6 espèces du genre Flavobacterium [F
balustinu m (Harrison et al., 1929) , F indoltheticum (Ca mpbell & W illiams, 1951), F
indologenes (Yabuuchi et al., 1983), F meningosepticum (Vanda m me et al., 1994), F gleum
(Holmes et al., 1984) et F scophthalmu m ( Mudarris et al., 1994)], dont le séquençage de
leurs A R Nr 16S avait montré qu’elles étaient phylogénétique ment proches (Vanda m me et al.,
1994). Plus tard, il s’est élargie grâce à l’éxtension des études génétiques et phylogénétiques
sur la famille des Flavobacteriaceae (Vanda m me et al., 1994 ; Bernardet et al., 1996).
41
 Etude bibliographique

Le no mbre d’espèces est resté constant jusqu’à 2003 quand Chryseobacterium defluvii
(Ka mpfer et al., 2003), Chryseobacterium joostei (Hugo et al., 2003) et Chryseobacterium
miricola (Li et al., 2003) ont été décrites. Ultérieure ment, C meningosepticu m et C miricola
ont été transférées dans un nouveau genre Elizabethkingia mais les résultats de ce travail ne
sont pas encore validés (Kim et al., 2005 b). Depuis, le no mbre d’éspèces ne cesse
d’aug menter pour atteindre environ 36 espèces en 2008. L’espèce type est C gleum
(Vanda m me et al., 1994).

b/- Caractères bactériologiques

Les me mbres de ce genre sont des bacilles à Gra m négatif, non sporulés, im mobiles,
dépourvus de granules de poly – • - hydroxy - butyrate, aérobies, chimio - organotrophes,
oxydase et catalase positives, halotolérantes, psychrotolérantes et pig mentées surtout
en jaune (Bernardet et al., 2002 et 2006). La tem pérature optimale de croissance est à
30°C, mais certaines poussent à des températures allant de 5°C à 37°C et mê me à 42°C en
donnant des colonies translucides (parfois opaques), circulaires, convexes, lisses, brillantes
typique ment pig mentées en jaune. Une réponse variable selon les espèces est notée pour
la croissance sur la gélose de Mc Conkey et la gélose à la cétrimide (Barro w & Feltha m,
1993). Les cellules peuvent avoir une morphologie filamenteuse dans les cultures jeunes,
bacillaire dans les cultures plus ou moins âgées et coccoide dans les cultures âgées
(plus de 15 jours). Certaines espèces sont protéolytiques co m me Chryseobacterium haifense ;
Chryseobacterium bovis et Chryseobacterium proteolyticum (Ya maguchi & Yokoe, 2000 ;
Hantsis – Zakarov & Halpern, 2007 ; Hantsis - Zakarov et al., 2008). Les acides gras
cellulaires majoritaires sont: iso- C15: 0 , iso- C17: 1 w9c et iso-C17:0 3-O H ( Weon, 2008).

U n autre caractère frappant de ce genre est la fréquence élevée de multirésistance aux

antibiotiques (Hsuch et al., 1997 ; Hoque et al., 2001).

c/- Habitat et pouvoir pathogène

Les espèces du genre Chryseobacterium ont pour habitat le milieu extérieur (sol, eau douce,
eau de mer, eaux usées, plantes), mais elles ont été égale ment isolées de divers prélève ments
et de denrées alimentaires (lait, produits laitiers, poissons, carcasses de volailles, de porcs, de
b œufs et d’agneau) (Bellais et al., 2000 ; Gonzalez et al., 2000 ; Hugo et al., 2003 ; Bernardet
et al., 2005 et 2006 ; Chen et al., 2006 ; Weon et al., 2006 ; Gallego et al., 2006 ; de Beer et
al., 2006 ; Zhou et al., 2007 ; Behrendt et al., 2007 ; Quan et al., 2007 ; Weon et al., 2008 ;
Ki m et al., 2008 ; Park et al., 2008 ; Ca mbell et al, 2008 ; Herzog et al., 2008).

- L’espèce Chryseobacterium ho minis a été isolée de divers prélève ments effectués en milieu
hospitalier (sang, liquide de dialyse, pus) (Vaneechoutte et al., 2007).

- Les espèces isolées du lait co m me C haifense et C bovis pourraient être à l’origine

d’altération des produits laitiers et nota m ment du beurre (modification de la couleur et de
l’odeur) (Hantsis-Zacharov & Halpern, 2007 et Hantsis-Zacharov et al., 2008).
42
 Etude bibliographique

Chryseobacterium shigense est considérée co m m e un germe de la flore normale d’un lait

fermenté Japonais (Shimo mura et al., 2005).

- Chryseobacterium vrystaatense a été isolée de volailles, de carcasse de volailles et de

l’environne ment des abattoirs. Elle semble être responsable d’altération des viandes (de Beer
et al., 2005).

Certaines espèces présentent un intérêt dans le do maine médical et vétérinaire telles que
C balustinum impliquée dans les maladies des branchies, C scophthalmu m responsable
d’infections branchiales et de septicé mies chez le turbot, C indologenes isolée chez des
grenouilles élevées dans le laboratoire et atteintes de la maladie des jambes rouges est
impliquée aussi dans des infections nosoco miales et la pneu monie surtout chez les personnes
im munodéprimées ainsi que Chryseobacterium gleum (Vanda m me et al., 1994). Ces deux
dernières espèces sont souvent considérées com m e des germes pathogènes opportunistes
(Sader et al., 1995 ; Bloch et al., 1997 ; Hsuch et al., 1997 ; Chiu et al., 2000).

43
 ETUDE

EXPERIMENTALE
 Etude expérim e ntale

II/- Etude expérimentale

1/-Isolement et identification des souches

1.1/- Matériel et méthodes

1.1.1/- Matériel d’étude et prélève ments des échantillons

Les échantillons de sol pollué par des hydrocarbures, des rejets de pneus de véhicules et des
rejets do mestiques ont été prélevés des villes de M E F T A H, située à l’ouest d’Alger à côté de
la ville de Blida, de B A B EZ Z O U A R « S O R E C A L » qui se trouve à quelques kilo mètres de
la ville d’EL H A R R A C H, côté est d’Alger et de la ville de Hadjout faisant partie de la
wilaya de Tipaza à l’ouest d’Alger. Pour le sable pollué par des huiles et des hydrocarbures,
les prélève ments ont été effectués à partir d’un parking de véhicules prés de la plage au
niveau de la ville d’AIN TA Y A à l’est d’Alger. Les eaux usées ont été prélevées de l’Oued
El Harrach, recevant des effluents d’origine urbaine et industrielle, par contre celles de l’eau
de mer polluée par des huiles et des hydrocarbures provenant du Port d’Alger (Tableau IV).

Pour le sol et le sable, les prélève ments ont été réalisés en surface. Après avoir écarté la
couche superficielle du sol à l’aide d’une spatule, un flacon stérile de 250 ml a été rempli à
m oitié. On a procédé de la mê me manière pour le sable provenant de la ville d’AIN T A Y A.
Les échantillons des eaux usées ont été prélevés à quelques mètres de la rive (au niveau du
pont de l’Oued El Harrach) avec un seau attaché à une corde, par contre l’eau de mer juste au
niveau du bord du port d’Alger par le biais d’une perche. Le volu me prélevé est de 250 ml
environ dans des flacons stériles de 250 ml. Le transport des échantillons (sol, sable, eaux
usées et eau de mer) a été fait à température ambiante (Tableau IV).

1.1.2/- Méthodes d’étude

1.1.2.1/- Préparation des échantillons et ensem e nce ment

10g et 10 ml de chaque échantillon prélevé ont été introduits stérilement dans un Erlen Meyer
de 250 ml contenant 90 ml de bouillon nutritif. Après 24 h à 72 h d’incubation à 30°C sous
agitation (130 rp m), 0.1 ml a été prélevé et ensem encé par étalement à la surface d’une boite
de Petri contenant environ 20 ml de la gélose nutritive à pH = 7.3.

1.1.2.2/- Isole ment, purification et Sélection des souches

L’isole ment des souches a été basé sur certains critères morphologiques à savoir ; l’aspect, la
pig mentation et la taille des colonies. Les souches ainsi récupérées, ont été purifiées par des
repiquages successifs sur un milieu gélosé non sélectif (Gélose nutritive).
La sélection des souches a été réalisée sur la base des para mètres suivants :

44
 Etude expéri mentale

Tableau IV : La nature, le lieu et la date des prélève ments

Lieu et nature des prélève ments Type de pollution Date de prélève ment

B A B EZ Z O U A R « S O R E C A L » Rejets do mestiques 08 / 04 / 2002

(sol)

O ued EL H A R R A C H « pont » Rejets urbains et 11 / 04 / 2002

(eaux usées) industriels et
23 / 02 / 2006

AI N T A Y A (sable) H ydrocarbures et des huiles 21 / 02 / 2006

H A DJ O U T (sol). H ydrocarbures 08 / 03 / 2005

M E F T A H (sol). H ydrocarbures et rejets de 22 / 03 / 2006

pneus de véhicules

Port d’AL G E R (eau de m er). Nappe des hydrocarbures et 08 / 03 / 2006

des huiles

45
 Etude expéri mentale

- Etude morphologique à l’état frais par observation au microscopique photonique G x 40.

- Etude morphologique après fixation et coloration double (coloration de Gra m) puis

observation au microscopique photonique G x 100.

- Détermination du type respiratoire en milieu gélosé viande foie (VF).

Toutes les souches à Gram positif, aérobies strictes, im mobiles, non sporulées avec une
m orphologie variable ont été sélectionnées.

U ne seule souche à Gram négatif, provenant du sol de la ville de M EF T A H a attiré notre

attention et a été sélectionnée et identifiée avec les autres souches bactériennes par les tests
biochimiques conventionnels.

1.1.2.3/- Caractérisation biochi mique des souches

Cette étude consiste à rechercher les différentes enzy mes de la chaîne respiratoire d’une part,
et de mettre en évidence certaines enzy mes et m étabolites issus des différentes activités
biologiques d’autre part selon les reco m mandations de Marchal et al.,1987. Les tests
biochimiques réalisés sont regroupés dans le tableau V.

Sur l’ense mble des souches caractérisées, une seule a fait objet de notre travail, provenant du
sol pollué de la ville de M E F T A H. Elle a été choisie à cause de sa morphologie particulière et
aussi son identification m oléculaire qui a révélé que c’est un nouveau taxon. Une autre souche
isolée des eaux usées de l’oued EL H A R R A C H a aussi été identifiée par la biologie
m oléculaire (séquençage), mais nécessite l’application de l’hybridation D N A/ D N A pour
savoir si c’est une nouvelle espèce. Les autres souches sont conservées à +4°C.

N ous tenons à signaler que cette souche à fait aussi objet d’une identification par deux types
de galeries : Api 20 E et 20 NE selon les indications de Bernardet et al., 2002).

1.1.2.4/- Opti misation des para mètres physico-chi miques de la souche sélectionnée

En vu d’optimiser certains para mètres physico- chimiques tels que le pH, la température et la
pression osmotique, la souche bactérienne en question a été tout d’abord cultivée sur
cinq milieux gélosés à titre co mparatif (Gélose nutritive, gélose TS A, gélose T G E A, gélose
Colu mbia et gélose de M ac Conkey). Après incubation à 30°C pendant 3 jours, le milieu sur
lequel une bonne croissance a été obtenue, sera choisi pour le reste de notre étude.

1.1.2.4.1/- La te mpérature de croissance

La détermination de la te mpérature optimale de croissance de cette bactérie, a été réalisée en

bouillon nutritif et sur gélose TS A. En pre mier lieu, la souche bactérienne a été ense mencée
en stries sur la gélose TSA. L’incubation a été faite à différentes températures (+4°C, +20°C,
+25°C, +28°C, +30°C, +37°C, +40°C) pendant 72h. La température à laquelle une bonne

46
 Etude expéri mentale

Tableau V : Les différents tests biochimiques effectués.

- Recherche de la catalase, de l’oxydase et de la nitrate réductase

- // // de la production d’indole
- // // de la B galactosidase
- // // de la D N A S E
- // // de la LE CIT H IN A S E
- // // de la Tryptophane désa minase
- // // des Décarboxylase et de l’U R E A S E en milieu urée- indole
- // // de la production d’H2S sur milieu KIA
- Etude de l’hydrolyse de l’A midon, de l’Esculine et de la Caséine
- // de l’hydrolyse du T W E E N 80 et 20
- // du métabolisme des acides organiques sur milieu de SI M M O N S
- // de la dégradation des sucres en milieu H U G H et LEIFS O N (H U G H et
L EIFS O N, 1953) : Adonitol, A midon, A mygdaline, Arabinose, Cellobiose, Dextrine,
D ulcitol, Esculine, Galactose, Glucose, Glycérol, Glysiline, Inositol, Levulose,
Lactose, Maltose, Mannitol, Mélibiose, Raffinose, Rha mnose, Saccharose, Salicine,
Sorbitol, Sorbose, Tréhalose, Xylose, Fructose, M annose.

47
 Etude expéri mentale

croissance a été obtenue sera considérée co m me le seuil optimu m. En second, un inoculu m

dense de la mê me souche a été ense mencé en bouillon nutritif. l’incubation a été effectuée
sous agitation (130 rp m), à des températures allant de +20°C à +40°C et la croissance a été
m esurée à l’aide d’un spectrophoto mètre à U V (Référence - 6405 U V/ V is JE N W A Y), à une
longueur d’onde de 600nm.

1.1.2.4.2/- Le p H de croissance

La souche a été ense mencée en stries sur la gélose TS A à différents pH (3, 4, 5, 6, 7.3, 8, 9, 10,
11, 12), puis incubée à la température optimale déterminée pendant 3 jours. Pour le bouillon
nutritif, après avoir adjusté les pH précités à l’aide d’une base (K O H 20%) et un acide (H Cl
6 N), on a procédé à un ense mence ment, puis une incubation pendant 3 jours à la température
optimale déterminée sous agitation (130 rp m). Le p H optimal de croissance correspond à celui
auquel une bonne croissance a été obtenue sur milieu gélosé et de mê me une densité optique
(D O) importante mesurée à une longueur d’onde (•) égale à 600 n m.

1.1.2.4.2/- La tolérance au chlorure de sodiu m (N a Cl)

Dans le but de déterminer la concentration optimale de Na Cl tolérée par cette bactérie, on a

fait un ense mence ment en bouillon nutritif et sur milieu gélosé TSA en présence de
concentrations croissantes de Na Cl allant de 1% à 14 %. Les boîtes de Petri ainsi que les
Erlens ont été incubées pendant 72 h à la température optimale déterminée sauf que ces
derniers étaient sou mis à une agitation (130 rp m).

1.1.2.5/- Recherche de pig ments spécifiques à la souche étudiée

Cette étude consiste à rechercher les pig ments Fléxirubines caractéristiques des bactéries de la
famille des Flavobacteriaceae. La technique utilisée est celle reco m mandée par Bernardet et
al., 2002. Il s’agit de traiter une colonie bien distincte de la souche à étudier sur boite ou sur
lame avec quelques gouttes d’une solution de KO H à 20 %. Le résultat est considéré co m me
positif s’il y à apparition de la couleur rouge. Dans le cas contraire, le résultat est négatif.

1.1.2.6/- Etude de la sensibilité de la souche étudiée au lysozy me.

La technique appliquée est similaire à celle utilisée pour l’étude de la résistance aux différents
agents antimicrobiens. O n a ense mencé en stries la bactérie sur milieu TS A contenant une
concentration finale de lysozy me de 2.5 mg/ ml de milieu. Après 72h d’incubation à la
température optimale, la lecture a été faite. L’absence de toute croissance indique que la
bactérie est sensible à cette [lysozy me].

1.1.2.7/-Identification m oléculaire

En vu de co mpléter et en mê me temps confirmer avec certitude l’identité de cette souche

bactérienne, le séquençage de l’A R Nr 16S a été réalisé dans Le laboratoire de microbiologie à.

48
 Etude expéri mentale

L’IR D de l’université de la M E DITE R R A N E E à Marseille en France. La séquence d’A D Nr

16S obtenue, a été co mparée à celles d’une banque de données (BL A S T), à partir desquelles
l’arbre phylogénétique spécifique a été construit.

Les différentes étapes de travail effectuées pour le séquençage sont :

1.1.2.5.1/- A m plification par P C R du gène codant pour l’A R Nr 16S et séquençage

Principe :

L’objectif principal de l’a mplification du gène codant pour l’A R Nr 16S est d’obtenir un grand
no mbre de copies de frag ments d’A D N grâce à l’utilisation de la Taq poly mérase et en
présence d’a morces dans le milieu réactionnel. La visualisation et la vérification de
l’amplification se fait par électrophorèse, qui fait apparaître une seule bande, correspondant à
la taille de l’A D N a mplifié.

Elle a été réalisée directe ment sur des extraits d’A D N par PC R (Poly mérase – Chain -
Reaction), en utilisant 4 a morces universelles spécifiques pour le gène fD1 et rD1, qui
Correspondent aux positions respectives 8–27 et 1524-1540 pb du gène d’Escherichia coli, et
per mettent d’a mplifier des frag ments du gène rrs • 1500 pb ( Mirandella -Tello et al., 2004) .

Les produits purs de la PC R ont été par la suite séquencés en utilisant un A D N – séquenceur
de type A BI PRIS M 3100, avec un terminateur Big - Bye.

Les a morces utilisées sont :

/ /
8f-(5 - G G A T C C A G A C T T T G A T A A T G G C T C A G- 3 ),
/ /
534r- (5 - ATT A C C G C G G C T G C T G G-3 ),
/ /
968f- ((5 - A A C G C G A A G A A C C T T A C-3 ),
/ /
1512f- (5 - GT G A A G C T T A C G G C T A G C T T G T T A C G A C T T-3 ).

fD1 16S rD1 23S 5S

ITS1 ITS2

Figure 14: Sché ma représentant l’organisation générale de l’Opéron

Riboso mal des procaryotes.

A près extraction de l’AD N (technique co mplète en annexe), la solution de cet dernier a été
conservée à -20°c, puis on a procédé à la préparation du milieu réactionnel dans des tubes
EPP E N D O R F co m me suit :
49
 Etude expéri mentale

Technique :

-D N TP (10 m M) … … … … … … … … 0 0.5 ul,

- Ta mpon (X10) … … … … … … … … .05 ul,
- Mg Cl2 (25 m M) … … … … … … … .05 ul
- A morces (50 p.m ol/ul) … … … … … 0 0.5 ul
- Taq poly mérase (5 u/ul) … … … … .00.3 ul
- Eau ultra pure … … … … … … … … .37.7 ul

U ne fois le mélange a été préparé, 0.5ul d’échantillon d’A D N ont été ajoutés puis une
centrifugation avec un tom be goutte (mini centrifugeuse) a été réalisée. Pour le témoin, 0.5ul
d’eau pure ont été ajoutés à la place de l’A D N. Par la suite, les préparations ont été placées
dans l’appareil PC R et le progra m me indiqué dans le tableau VI a été appliqué.

Tableau VI : Différentes étapes du progra m me

Dénaturation initiale 1 mn à 95°C

20 s à 95°C (dénaturation)
30 s à 55°C (hybridation)
Cycles : X 30 1.5 mn à 72°C (élongation)
5 mn à 72°C (élongation finale)

Fin +4°C

Les produits PC R ainsi obtenus, ont été récupérés et la vérification de l’amplification a été
réalisée sur gel d’agarose à 1 %, permettant de m ettre en évidence l’apparition d’une seule
bande de minimu m de 200 ng / 50ul (• 1500 pb).

1.1.2.5.2/- Déter mination du contenu de l’A D N chro moso mique en (G+C) moles %

Le taux de (G+ C) moles % de l’A D N chro moso mique de cette bactérie a été effectué en
Alle magne au DS M Z (Deutsch Sa m mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,
Braunsch weig) par la méthode chro matographique (chro matographie à phase liquide à haute
performance « HPL C ») ( Mesbah et al., 1989 ; Tam aoka & Ko magata, 1984).

Principe :

A près extraction, l’A D N chro moso mique a été purifié sur hydroxyapatit conformé ment à la
procédure de Cashion et al., 1977, et l’hydrolyse a été réalisée à l’aide de la phosphatase

50
 Etude expéri mentale

alkaline d’origine bovine ( Mesbah et al., 1989). Le produit ainsi obtenu a été analysé par
H P L C de marque (SHIM A D Z U C O R P O R A TIO N. JAP A N). L’analyse chro matographique a
été effectuée sur 10 ul d’échantillon en présence d’un solvant 0.3 M de (N H 4) H2P O4/ acéto
- nitrile [40:1(v/v)] à un pH = 4.4 et une température de 45°C. (Ta m aoka & Ko magata,
1984). Le calcul du G C % a été effectué selon la méthode de Mesbah et al., 1989, tout en se
référant à des valeurs de (G+ C) mol % de souches de référence de DS M Z.

1.1.2.5.3/- La Chi mio taxono mie (analyse biochimique de la paroi cellulaire)

Cette étude consiste à analyser la paroi des cellules bactériennes, dans le but de déterminer les
différents acides gras présents et leur taux chez la bactérie étudiée, puis faire une étude
Co m parative avec les autres bactéries proches afin de pouvoir co mpléter l’identification de
nouveaux genres et espèces bactériennes. Pour cela, la souche bactérienne a été cultivée sur le
milieu gélosé TS A pendant 72h à 30°C, puis les acides gras ont été isolés et méthylés (Ben
Zeev et al., 2005). L’analyse des acides gras m éthyle- ester a été faite à l’aide d’une
chro matographie à phase gazeuse (CP G). Cette partie de travail a été réalisée dans le
laboratoire C C U G à G O E T T B U R G en Suède.

2/- Etude de la résistance aux agents antimicrobiens

2.1/- Etude de la résistance aux métaux lourds

Le but de cette partie de travail est de déterminer d’une part le seuil de résistance de la
bactérie retenue pour cette étude vis-à-vis 3 sels m étalliques et d’autre part, évaluer le taux
d’accu mulation de chaque métal dans la cellule par les mécanismes d’absorption et/ou
d’adsorption. Les trois sels étudiés sont : Nitrate de cad miu m, sulfate de zinc et acétate de
plo mb

2.1.1/- Préparation des solutions métalliques

4
Les trois sels métalliques testés sont très solubles dans l’eau. Deux solutions mères de 10
ug/ml pour le zinc et le plomb et une autre de 500 ug/ml pour le cad miu m ont été préparées.

2.1.2/- Déter mination de la concentration seuil pour chaque sel métallique

Une série de boites de Petri a été préparée avec des concentrations croissantes de chaque
m étal incorporé dans la gélose Mueller Hinton (tableau VII). La souche bactérienne a été
ense mencée en stries sur les boites de sélection ainsi préparées. Après 3 à 7jours d’incubation
à la température optimale obtenue, la concentration seuil de la résistance a été déterminée.
Cette dernière correspond à la concentration la plus élevée à laquelle une croissance
bactérienne a été obtenue, c'est à dire la dernière concentration avant la C MI (concentration
minimale inhibitrice).

51
 Etude expéri mentale

Tableau VII : Les différentes concentrations des ions métalliques testés en ug/ml.

Nitrate
de 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 125 150 175 200
cadmium

Sulfates 25 50 75 100 125 150 200 225 250 300 350 400 450 500 550 600
de zinc
Acétate
de 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 600 700 800 900 1000 1200
plomb

2.1.3/- Evaluation du taux d’accu m ulation des ions métalliques

L’objectif principal de cette étude expérimentale est de déterminer l’effet du pH sur les
m étaux lourds testés. Le dosage du taux des ions métalliques résiduel dans un milieu liquide
stérile à différents pH a été réalisé à l’aide d’un spectrophoto mètre d’absorption ato mique à
flam me type U NIC A M de marque PHILIPS série PU – 9200 X et SA A avec FL A M E
S O L A M A R 929.

Le principe du spectrophoto mètre d’absorption ato mique à flam me est basé sur la détection
de très faibles niveaux de concentration de no mbreux éléments par digestion acide, grâce à
l’utilisation de différentes sources de rayonne ment pour chaque élément à mesurer et ce, en
co mparaison avec des solutions de références dont les concentrations sont connues de
l’élément à doser.

Technique :

Les échantillons contenant les ions métalliques ont été dissous dans une solution acide. Par
la suite, cette dernière a été transférée dans un flacon volu métrique et diluée à la concentration
voulue. Une ga m me de solutions étalons de métaux recherchés, permet de tracer une courbe à
étalon (Figures en annexe), et la concentration des métaux lourds recherchés dans les
échantillons peut alors être calculée.

Cette analyse a été réalisée dans le laboratoire de chimie de l’O R G M de Bou merdes et le
laboratoire central de la police d’Alger.

2.1.3.1/- Préparation du milieu et ense mence ment de la souche

Dans le but d’avoir un milieu de culture de co mposition simple, on a opté pour la formule de
base suivante :
52
 Etude expéri mentale

Co m position en g/l :

Extrait de levure … … … … … … … … … 3 g
MgS O4 – 7H2 O … … … … … … … … … 1 g
K2 HP O – 3H2 O … … … … … … … … ....1g

Les expériences d’accum ulation des métaux lourds par adsorption et/ou absorption ont été
réalisées en milieu liquide stérile agité (130rp m), dont le pH a été adjusté avec un acide (H Cl
à 6N) et une base (K O H à 20 %). Les pH testés sont : (pH= 5, 5.5, 6, 6.5, 7.3, 8, 8.5, 9).

Dans une série d’Erlen - M eyer de 250 ml, on a introduit 100 ml de milieu précité à différents
p H auquel les ions métalliques ont été ajoutés à raison d’une concentration finale de 100 mg/l
de milieu. En parallèle, on a préparé des témoins avec 100 ml de milieu seulement à différents
p H (sans ions métalliques). Par la suite, dans chaque série d’Erlen Meyer un inoculu m de 10 %
des cultures préparées dans le mê me milieu et à différents pH (Carlberg et al., 1980), et dont
la densité optique préalable ment mesurée à • = 600 n m a été ense mencé. Après 5 jours
d’incubation sous agitation (130 rp m) à température optimale, la densité optique (D O) de
chaque préparation ainsi que les témoins a été mesurée à la mê me longueur d’onde à l’aide
d’un spectrophoto mètre à U V (6405 U V/ Vis JE N W A).

50 ml de chaque culture ont été prélevés et filtrés au travers d’une mem brane filtrante de
nature cellulosique de 0.45u m de porosité. Les filtrats ont été récupérés stérilement et les
m étaux libres dans le milieu ont été dosés par un spectrophoto mètre à absorption ato mique à
flam me à des longueurs d’ondes spécifiques (Di- Benedetto et al., 1997)).

- Cad miu m : • = 228.8 n m

- Zinc : • = 214 n m
- Plo m b : • = 217 n m

2.2/- Etude de la résistance aux antibiotiques

En vu de mieux connaître le profil de résistance de cette bactérie vis à vis des différents
agents antimicrobiens, 45 antibiotiques ont été testés par la méthode de diffusion en milieu
gélosé ( Méthode des disques) selon la technique de Courvalin et al., 1985 (Tableau VIII ).

Technique

Tout d’abord, une culture bactérienne dense a été préparée dans du bouillon cœur cerveau
(B HIB), et après 3 jours d’incubation à 30°C, on a réalisé une dilution de façon à obtenir
après une bonne ho mogénéisation une D O = 0.08 ou 0.1 à 625 n m, équivalent à 0.5 Mc
Farland. L’ense mence ment des boites de Petri a été effectué par inondation, et l’application
des disques a été faite à l’aide d’une pince stérile à raison de 6 à 7 disques par boite.
La lecture a été faite après 3 jours d’incubation à la température précitée. Elle consiste à

53
 Etude expéri mentale

m esurer le diamètre de la zone d’inhibition apparue autour du disque, et l’interprétation (Rt,

Ri, S) a été établie selon les diamètres critiques proposés par le N C C LS - 2004.

3/-Transfert génétique et déter mination du support génétique

3.1/- Transfert génétique par conjugaison

Le croise ment par contact direct entre les bactéries permet le transfert horizontal des gènes de
résistance suspectés d’être portés sur des élém ents génétiques extra chro moso miques
(plasmides) d’une bactérie dite donatrice (résistante) vers une autre réceptrice (sensible) par le
biais d’un pont qui se form e entre les deux souches.

La souche réceptrice E coli B M 21 utilisée au cours de notre étude nous a été fournie par le
laboratoire de génétique de la FSB/US T H B. Elle est dépourvue de plasmides et marquée à
l’acide nalidixique (marqueur chro moso mique). La technique appliquée est celle décrite par
Chabbert, 1973.

Technique

O n a réalisé trois cultures de la souche réceptrice dans des flacons de 250 ml contenant
chacun 20 ml de B HIB stérile, et trois autres de la donatrice dans des tubes à essai de 5 ml du
m ê me bouillon. L’ense m ble a été incubé sous agitation (130 rp m) à tem pérature optimale
pendant 8 h. Par la suite, la réceptrice a subit un chauffage à 50°C pendant 10 mn afin
d’e mpêcher le phéno mène de restriction, puis on a procédé au mélange de façon à obtenir un
rapport de ¼ (donatrice/ réceptrice).

Préparation des boites de sélection des trans-conjugants et ense mencem e nt

Vue que notre souche est résistante au marqueur chro moso mique de la souche réceptrice
(acide nalidixique) donc, on a utilisé la gélose de Mac Conkey sur laquelle la souche
donatrice ne pousse pas co m me agent sélectif. Les antibiotiques dont la résistance est
suspectée d’être porté sur des éléments génétiques extra – chro moso miques chez la souche
donatrice (imipénè me, céfalotine et tétracycline) sont ajoutés dans le milieu à 45°C. On a
ense mencé les boites ainsi préparées par stries à partir des mélanges, de la souche donatrice
et de la réceptrice (âgés de 72h). Un résultat n’est considéré co m me positif que si les trois
cultures (mélanges) donne le mê me résultat et les souches parentales ne poussent pas.

3.2/- Déter mination du support génétique

L’extraction d’A D N plasmidique a été réalisé par lyse alcaline selon la méthode de Kado &
Liu (1981) dans le laboratoire de génétique de la FSB/US T H B. Après une centrifugation
d’un volu me de 3 ml environ des cultures bactériennes à 12000 rp m pendant 2 mn, le culot

54
 Etude expéri mentale

obtenu a été resuspendu dans 100ul de Ta mpon TE (Tris 50 m M, E D T A 10 m M). Ce dernier,

per met de fragiliser la paroi cellulaire et empêcher la dégradation de l’A D N par les nucléases
grâce au chélateur d’ions. Par la suite, la lyse des cellules a été réalisée par un traitement au
S D S (3 % de S DS dans du Tris 50 m M à pH=12.6) alcalin co mbiné à la chaleur. Juste après,
200ul de la solution de lyse ont été introduits dans les micro tubes EPPE N D O R F et on a
m élangé par inversion de ces derniers. Cette étape a été suivie par un chauffage à 60 °C
pendant 2 mn. Dans ces conditions, l’A D N linéaire (pas circulaire) est dénaturé. Dans le but
d’éliminer les conta minants majeurs de l’A D N plas midique (protéines¸AD N chro moso mique
et A R N de poids moléculaire élevé), 2 volu mes de phénol / chloroforme (600ul) ont été
ajoutés et le mélange a été réalisé par inversion des micro tubes. Après une dernière
centrifugation à 12000rpm pendant 12 mn, la phase supérieure très limpide contenant l’A D N
plas midique a été prélevée et introduite dans un nouveau micro tube stérile.

Pour analyser cet A D N extra chro moso mique, on a utilisé une méthode standard dont le but
principal est de séparer et d’identifier les frag ments d’A D N chargé négative ment
(ELE C T R O P H O R E S E sur gel d’agarose). La visualisation de ces derniers sur gel a été
effectuée par un révélateur (bro mure d’éthidiu m) fluorescent aux U V selon les
reco m mandations de Sam brook et al., 1989. La migration de l’A D N plasmidique a été faite
sur gel d’agarose 0.7 % dans du tampon TB E 1 X. La tension de fonctionnem ent a été réglée à
50 volts pendant 1 heure 30 mn. Par la suite, le gel a été im mergé dans une solution de
bro mure d’étidiu m (0.5 ug/ml) pendant 1 heure à température ambiante, puis on a visualisé
l’A D N sous U V à 254 nm dans le laboratoire de biologie moléculaire de B O U M E R D E S.

En vu de co mparer nos résultats à des témoins, une souche de référence (Salmonella ordonez
souche B M2000) contenant un plasmide de taille connue pIP173 « • 127.5 kb » en plus de son
chro moso me a été utilisée (Allard et al., 1993).

55
 Etude expéri mentale

Tableau VIII: La liste des différents antibiotiques testés avec leurs charges

familles antibiotiques abréviation Charge

Ampicilline AM 10 ug
Amoxicilline AMX 25 ug
Carbénicilline CB 100 ug
Cefolexime CN 30 ug
Céfalotine CF 30 ug
Céfamandole MA 30 ug
Céfotaxime CTX 30 ug
Β lactamines Céfuroxime CXM 30 ug
Céfazoline CZ 30 ug
Céfoxitine FOX 30 ug
Ceftazidine CAZ 30 ug
Imipénème IPM 10 ug
Oxacilline OX 05 ug
Pénicilline G P 10 UI
Pipéracilline PIP 100 ug

Amikacine AN 30 ug
Dibékacine DKB 10 ug
Aminosides Gentamycine GM 10 ug
et Kanamycine KN 30 ug
Aminocyclitols Néomycine N 30 UI
Nétilmycine Net 30 ug
Streptomycine S 10 ug
Tobramycine NN 10 ug
Tétracyclines Tétracycline TE 30 UI
Doxycicline D 30 ug

Macrolides Erythromycine E 15 ug
Spiramycine SP 100 ug
Quinolones Ofloxacine OFX 05 ug
Acide nalidixique NA 30 ug
Acid pipémidique Pi 20 ug
Phénicoles Chloramphénicol C 30 ug
Nitrofuranes Nitrofurantoine F/M 300 ug
et
Furanes Furanes FT 300 ug
Sulfamides Sulfamides G 20 ug
et
associés Triméthoprime + SXT 1.25 ug + 23.75 ug
Sulfatoxazole
Polypeptides Colistine CL 50 ug
et
Gramicidines Bacitracine B 10 UI
Rifampicines Rifampicine RA 30 ug
Lincomycines Lincomycine L 15 ug
Fusidamines Acide Fusidique FA 10 ug
Glycopeptides Vancomycine V 10 ug
Fosfomycines Fosfomycine FOS 50 ug
Fluoroquinolones Fluméquine UB 30 ug
Oxiquinolones Nitroxoline Ni 20 ug
Streptogramines Pristinamycine PR 15 ug

56
 Résultats et discussion

III/ - Résultats et discussion

1/- Isole ment et identification

1.1/- Caractérisation des souches isolées

Le no mbre de souches sélectionnées et identifiées sur la base des critères morphologiques,

physiologiques et biochimiques est de 17. Six souches sont isolées des eaux usées de l’oued
E L H A R R A C H et du sol de B A B EZ Z O U A R « S O R E C A L » en 2002, six autres provenant
du sol et de sable pollué des villes de H A DJ O U T et d’AIN T A Y A en 2005 et les cinq
dernières sont récupérées des eaux usées de l’oued EL H A R R A C H, des eaux de mer au
niveau du port d’Alger et du sol de la ville de M E FT A H en 2006.

Toutes les souches sont de taille petite ou moyenne (1 à 3 m m de diamètre) après 24h à 72h
d’incubation à 30°C sur gélose nutritive, rondes avec un contour régulier, une surface lisse,
bo mbées ou légère ment bo mbées, parfois plates avec un centre élevé, pig mentées en crè me,
en jaune ou en jaune qui vire à l’orange avec le temps (1 à 2 se maines). Elles sont à Gra m
positif excepté la souche 1Y B- R12 T isolée du sol pollué par des hydrocarbures et des rejets
de pneus de véhicules de la ville de M EF T A H qui est à Gra m négatif.

Les souches sont aérobies strictes, im mobiles, ne forment pas de spores, oxydase positive et
négative et catalase positive. Sous microscope optique (Zeiss - G x100), apparaissent sous
forme de bacilles isolés, de coccobacilles et de cocci isolés ou regroupés en diplocoques, en
courtes chaînettes, en tétrades et parfois en amas. On a aussi observé des filaments branchés
qui se frag mentent. (Tableau II a, II b, IIc en annexe).

La souche retenue pour le reste de notre étude est 1Y B- R12 T.

1.2/- Caractérisation m orphologique et biochimique de la souche 1Y B -R12T

1.2.1/- Etude morphologique

1.2.1.1/- Sur gélose nutritive et gélose M ueller Hinton

A près 72h d’incubation à 30°C, les colonies sont de taille moyenne (1 à 1.3 m m de diamètre),
avec un bord régulier, bo mbées, opaques avec une surface lisse et brillante, visqueuses et
pig mentées en jaune ocre qui vire avec le temps à l’orange. Le pig ment n’est pas diffusible
dans le milieu et au-delà d’une à deux se maines d’incubation à +4°C elle produit beaucoup
de mucus. Sur gélose M ueller Hinton, les colonies sont relative ment volumineuses, bo mbées,
très brillantes et très visqueuses et la pig mentation est plus foncé que sur le pre mier milieu
(Figure 15).

57
 Résultats et discussion

a/- Culture âgée de plus d’une semaine b/- Culture âgée de plus d’une semaine sur
Sur gélose nutritive conservée à +4°C gélose Mueller Hinton conservée à +4°C

Figure 15 : Photos représentant l’aspect des colonies de la souche 1 Y B- R12 T

âgée de plus de 7 jours sur un milieu ordinaire (a) et un autre riche (b).

58
 Résultats et discussion

1.2.1.2/- Après observation microscopique

La souche 1Y B- R12 T est caractérisée surtout par un cycle morphogénétique très variable.
A près 3 à 7 jours d’incubation à 30°C, elle apparaît au microscope photonique (Zeiss G X
1000) sous forme de branches ramifiées qui se frag mentent pour donner naissance à beaucoup
de longs filaments (12-80 x 0.5-1u m), de bacilles (2-4 x 0.5-1u m) et quelques cocci. Après
15 à 20 jours et plus, la culture est co mposée unique ment de cocci (0.5-7u m x 0.9-1.5u m)
(Planche 1).

1.2.2/- Etude des caractères biochi miques et physico - chi miques

1.2.2.1/- Opti misation de quelques facteurs de croissance

Cette bactérie pousse bien sur la gélose nutritive, la gélose TS A, la gélose T G E A et la Gélose
Colu mbia. L’optimu m de croissance est obtenu sur la gélose TS A. Aucun développe ment
n’est observé sur la gélose de Mac Conkey.

La température optimale de croissance déterminée par la mesure de la densité optique à

• = 600 n m se situe entre 28°C et 30°C avec des chiffres respectifs de l’ordre de 1.969 et
2.033 (courbe 1). Au-delà de 30°C, la croissance a nettement diminué pour atteindre une D O
de 0.815 à 37°C et 0.285 à 40°C. A des températures en dessous de 28°C (20°C, 25°C et
27°C), la croissance est importante. Nous tenons à préciser que sur milieu gélosé une
croissance dense est aussi obtenue après incubation à ces deux températures. Au cours de la
conservation de cette souche à +4°C elle se prolifère lente ment.

La densité cellulaire obtenue à la mê me longueur d’onde au cours du suivi de la cinétique de

croissance en bouillon nutritif à 30°C et en fonction de temps, montre bien que cette bactérie
est psychro- tolérante. La phase exponentielle de son développe ment s’étale sur 10 jours
environ (courbe 2).

Le pH optimal de croissance déterminé après la m esure de la densité cellulaire se situe entre

7.3 et 8 avec des D O respectives de 1.974 et 1.848 (courbe 3). Il y’a lieu de noter que cette
bactérie peut croître à des pH allant de 3 à 11.

La souche 1Y B- R12 T tolère des taux importants de Na Cl. Selon les résultats obtenus (courbe
4), la concentration seuil de tolérance déterminée par la mesure de la densité cellulaire
(D O = 1.725) correspond à un taux de 4 % en Na Cl. La tolérance de cette bactérie en sel, va
jusqu'à 6 % (D O = 1.253). A des concentrations élevées en Na Cl (8 % à 14 %), la croissance
est trop faible et stable. Les mê mes résultats sont obtenus sur milieu gélosé.

1.2.2.2/- Caractérisation biochi mique

A ucune précipitation n’est observée après traitement d’une colonie de la souche 1 Y B- R12 T
avec quelques gouttes d’une solution de K O H à 20 %. Ceci montre que les pig ments
fléxirubines sont absents.
59
 Résultats et discussion

a (cultures âgées de trois jours) b

c (cultures âgées de trois jours) d

e (culture âgée de 7 jours) f (culture âgée de plus de 20 jours)

Planche 1: Figures représentant la morphologie cellulaire de la souche 1YB-R12T après coloration

de Gram (coloration double). Observation au microscope photonique (ZEISS- HB 050/AC) G x 1000

60
 Résultats et discussion

2,5

2 1,969 2,033
1,848
DO à 600 nm

1,5 1,534
1,315
1
0,815
0,5
0,285
0
20 25 27 28 30 37 40
T°c

Courbe 1: Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de la température

A
2 ,0

1 ,8

1 ,6

1 ,4

1 ,2

1 ,0
Do

0 ,8

0 ,6

0 ,4

0 ,2

0 ,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
te m p s ( jo u r s )

C ourbe 2: Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de temps

61
 Résultats et discussion

2,5
2 1,974
DO à 600 nm

1,76 1,848
1,5
1
0,701
0,5 0,391
0,121 0,127 0,147 0,096
0
3 4 5 6 7,3 8 9 10 11
pH

C ourbe 3: Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de pH

2,5

2 1,975 1,963
1,725
1,5
DO à 600 nm

1,253
1

0,5
0,085
0 0,087 0,089
0,084
0 2 4 6 8 10 12 14
-0,5
[Nacl] en %
C ourbe 4: Evolution de la croissance de la souche 1Y B- R12 T en fonction de la [Na Cl

62
 Résultats et discussion

A ucun développe ment n’est obtenu sur milieu gélosé contenant une concentration de
2.5 mg/ ml de lysozy me, ce qui indique que cette bactérie est sensible.

La souche 1Y B- R12 T ne pousse pas sur la gélose KI A (Kligler, Iron, Agar) et par conséquent
ne produit pas de sulfure d’hydrogène (H2S). Elle est dépourvue de la tryptophane
désa minase (T D A -), de la tryptophanase (indole -), de l’ornithine décarboxylase (O D C -) et
de la lysine décarboxylase (L D C -). Les citrates ne sont pas utilisés co m m e seule source de
carbone sur le milieu citrate de SI M M O N S (citrate perméase -). La B galactosidase est
absente, ainsi que la lécithinase. Elle n’hydrolyse pas le T ween 20, le T w een 80, l’amidon,
l’ésculine, l’A D N, la caséine et le sang de cheval, contrairement à l’urée et l’arginine (uréase
+ et A D H +). Les nitrates sont réduits en nitrites (nitrate réductase +). Pour les sucres testés,
aucun n’a été dégradé excepté le D glucose qui a donné un léger virage au jaune après plus
d’une se maine (Tableau IX).
Les mê mes résultats sont obtenus avec les galeries api 20 E et 20 NE. Pour la galerie 20 E
l’amygdaline n’a pas été dégradé et le virage de la couleur dans la cupule du glucose a été très
faible (jaune pale) après 72h d’incubation à 30°C.

1.3/- Identification moléculaire de la souche 1YB- R12 T

Cette identification est basée surtout sur des caractères génotypiques com m e la séquence du
gène codant pour l’A R Nr 16s (gène rrs), qui est considéré actuellement co m me un outil
d’identification très fiable et rapide et aussi la détermination du contenu de l’A D N en bases
(G+ C) moles % permettant de confirmer l’identification d’un nouveau genre dans le cas ou le
taux de similitude entre la séquence du gène de l’A R Nr 16S de ce dernier et celle des taxons
proches est inférieur à 97 %. Si ce taux est • 97 % une hybridation est nécessaire pour
déterminer l’espèce.

La détermination du profil des acides gras pariétal est aussi d’une importance considérable.
Elle permet la mise en évidence des acides gras co m m uns entre les me mbres du mê me genre,
la détection de nouveaux acides gras caractéristiques pour un taxon donné, ainsi que leur taux
et leur structure.

1.3.1/- Le séquençage

La séquence co mplète du gène codant pour l’AR Nr 16S obtenue est alignée manuellement
avec celles des taxons les plus proches obtenus de Gen - Bank. (Benson et al., 1999) en
utilisant le Riboso mal Database Projet II ( Maidak et al., 2001) et la séquence align ment
editor Bio Edit (Hall, 1999). La position de la séquence et les régions contenant des <indels>,
régions avec des insertions ou des délétions créant des trous <<gaps>>, sont supprimées de
l’analyse. Les distances génétiques entre paires de séquences sont corrigées pour les
substitutions multiples de bases par la méthode de Jukes & Cantor (1969).

63
 Résultats et discussion

T
Tableau IX: Caractères differentiels entre la souche 1Y B- R12 T et les espèces proches.

T T
1: 1B Y- R12 T , 2: C haifense souche L M G 24029 (Hantsis-Zakarov & Halpern, 2007)
T
3 : C bovis souche L M G 24227 (Hantsis-Zakarov et al., 2008), 4 : C hispanicu m souche
T T
JC M 13554 (Gallego et al., 2006), 5 : C arothri souche DS M 19326 (Ca mpbell et al.,
T
2008), 6 : C hominis souche C C U G 52711 (Vaneechoutte et al., 2007), 7: C caeni souche
T T
D S M 17710 (Quan et al., 2007), 8: C Pallidu m souche DS M 18015 et 9: C molle souche
T
D S M 18016 (Herzog et al., 2008).

Caractéristiques 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Pigmentation: Y C C Y Y Y Y C C
Flexirubines : - + + - - - + - -
Type respiratoire: A A A A A A A A A
Croissance sur:
TSA agar + + + + + + + + +
Mac Conkey agar - - - - - - - - -
NaCl (%): 0-4 0-2.5 0-2.5 0-3 0-2.5 0-3 0-2 0-2 0-2
Croissance à:
4°C + + + + - ND + - -
20°C + + + + + + + + +
30°C + + + + + + + + +
37°C F + + - + + + + +
40°C - + + - - - - - -
Activités enzymatiques:
Uréase + - - - - - + + +
ADH + - - - - - + + +
LDC - - - - - - - + +
ODC - - - - - - - + +
Tween 80 - ND ND - + - - + +
Réduction des nitrates + - + + - + - + +
B galactosidase - + + - - - + - -
Production de:
H2S - - - - + - - + +
Indole - + - w - + - + +
production d’acide à partir de:
D glucose + + + + + + - + +
L arabinose - - - - - - - + +
D fructose - + - + + - - - -
Lactose - + + - - - - + +
Maltose - + + + + + - + +
D mannitol - - - - - - - + +
Trehalose - - - - - - - ND ND
D xylose - - - + - - - ND ND
Aesculine - + + + - + - + +
(G+C)moles %: 40.9 37.8 38 .6 34.3 36.5 36.5 38.2 38.1 39.2
Habitat Sol Lait Lait Eau poisson Sang Bioréacteur Plantes Pl antes
Pays Algerie Palestine Espagne USA Belgique Koréa Allemagne

Y= pigment jaune ; C= pigment crème; A=aérobie ; F= Très faible; w = après une semaine ; ND=
non déterminé ; + = positif ; - = négatif
64
 Résultats et discussion

L’arbre phylogénétique de la souche 1Y B- R 12T est construit selon la méthode de

rapproche ment des voisins (Neighbour joining) (Saitou & Nei, 1987) et le maxi mu m de
resse mblance (Felsenstein, 1993). Une analyse par sous échantillonnage de type (bouts traps)
est réalisée sur 1000 répétitions dans le but de déterminer le niveau de confiance dans les
topologies obtenues (Felsenstein, 1985). La représentation graphique de l’arbre
phylogénétique est obtenue à l’aide d’un logiciel spécifique.

L’arbre phylogénétique (figure 16), établit à partir de la séquence co m plète co mposée de

T
1473 pb montre que la souche 1Y B- R12 T est un nouveau me mbre de la famille des
Flavobacteriaceae. Cette dernière, est l’une des principales familles du groupe Cytophaga,
Flavobacterium, Bacteroides (Bernadet et al., 2002) , dont le no mbre de genres et d’espèces
nouvelles ne cesse d’augm enter chaque année.

1.3.2/- Déter mination du taux de (G+ C) moles %

Le contenu de l’A D N chro moso mique en bases (G+ C) de cette bactérie, déterminé par la
m éthode chro matographique (HPL C) est de 40.9 moles %.

1.3.3/- La chi mio - taxono mie (analyse des acides gras de la paroi)

T
Le profil des acides gras cellulaires obtenus pour la souche 1Y B- R12 T est différent de celui
des autres espèces proches co m me le montre le tableau X. Le taux et la structure de chaque
acide gras est co m me suit :

A nteiso-C15: 0 (41.4 %), iso-C15: 0 (14 .4 %), iso-C17: 1 w9c (9.0 %), iso-C16:0 (7.2 %),C17: 0 2-
O H (5.7 %), iso-C17:0 3- O H (5.2 %), iso-C16:0 3-O H (4.2 %), iso-C16:1 H (2.8 %), anteiso-C15:1
A (2.4 %), iso-C14: 0 (2.0%), anteiso-C17: 1 w9c (1.8 %), C15:0 2-O H (1.4 %), C16:1 w3c (1.3 %),
C16:1 w7c (1.0 %), iso-C15:0 2-O H (1.0 %), C16:1 w6c (1.0 %), C18:0 2 D M A.

Sur la base de ces critères morphologiques, physiologiques, biochimiques et moléculaires, la

souche 1Y B- R12 T appartient au genre Chryseobacterium dont la plupart des espèces sont
isolées de l’environne ment (Sol, eaux usées et salées), et forme une branche monophylétique
T T T
avec l’espèce Chryseobacterium haifense souche H 38 (=L M G 24029 = DS M 19056 ).

Elle est aussi étroitement liée à d’autres branches co mposées des espèces Chryseobacterium
T T T
bovis souche H 9 (= LM G 24227 = DS M 19482 ), Chryseobacterium hispanicum souche
T T T T
V P48 (= JC M 13554 = CC M 5973 = CE C T7129 ), Chryseobacterium aquaticum souche
T T T T
10-46 (= K C T C12483 = CE C T7302 ), Chryseobacterium ho minis souche NF802 (=
T T T T
C C U G 52711 = CIP109415 ), Chryseobacterium caeni souche N4 (= DSM 1 7710 = K C T C
T T T T
12506 = CC B A U 10201 ), Chryseobacterium pallidu m souche 26-3St2b (= DS M 18015 =
T T T
C C U G 52548 ) et Chryseobacterium molle souche D W 3 (=DS M 18016 =C C U G 52547).

65
 Résultats et discussion

2%

Chryseobacterium haifense LMG 24029T (EF204450)

85
Strain 1YB-R12T

Chryseobacterium bovis LMG 24227T (EF204446)

86
Chryseobacterium hispanicum JCM 13554T (AM159183)

Chryseobacterium aquaticum KCTC 12483T (AM748690)

100
100 Chryseobacterium arothri DSM 19326T (EF554408)

Chryseobacterium hominis CCUG 52711T (AM261868)

Chryseobacterium caeni DSM 17710T (DQ336714)

Chryseobacterium pallidum DSM 18015T (AM232809)

100
Chryseobacterium molle DSM 18016T (AJ534853)

Elizabethkingia meningoseptica ATCC 13253T (M58776)

Riemerella columbina LMG 11607T (AF181448)

T
Figure 16: Position Phylogénétique de la souche 1Y B- R12 T à l’intérieur du genre

Chryseobacterium, sur la base de la séquence du gène 16S rRN A.

66
 Résultats et discussion

T
Tableau X: Profil des acides gras cellulaires (%) de la souche 1Y B- R12 T et les espèces
Proches du genre Chryseobacterium.

T T
1: 1Y B- R12 T , 2: C haifense souche L M G 24029 (Hantsis - Zakarov & Halpern, 2007),
T
3: C bovis souche L M G 24227 (Hantsis - Zakarov et al., 2008), 4: C hispanicum souche
T T
JC M 13554 (Gallego et al., 2006), 5: C arothri souche DS M 19326 (Cam pbell et al., 2008),
T
6: C hominis souche CC U G 52711 (Vaneechoutte et al., 2007), 7: C caeni souche DS M
T T
17710 (Quan et al., 2007), 8: C pallidum souche DS M 18015 et 9: C molle souche DS M
T
18016 (Herzog et al., 2008).

Fatty acid 1 2 3 4 5 6 7 8 9
anteiso-C15:0 41.4 16.6 15.6 03.0 05.45 08.8 04.3 05.2 10.3
Iso-C15:0 14.4 41.6 38.9 22.6 35.3 31.5 26.4 41.8 32.3
iso-C17:1w9c 09.0 02.7 14.8 01.5 - 15.6 - - -
iso-C16:0 07.2 - - - - - - - -
C17:0 2-O H 05.7 01.0 01.3 - 00.8 - - - -
iso-C17:0 3-O H 05.2 10.3 12.7 17.5 14.9 18.1 09.8 11.4 10.1
iso-C16:03-O H 04.2 01.1 01.6 - Tr - - - -
iso-C16:1H 02.8 - - - - - - - -
A nteiso-C15:1 A 02.4 - - - - - - - -
Iso-C14:0 02.0 Tr Tr - - - - - -
anteiso-C17:1w9c 01.8 - - - - - - - -
C15:02-O H 01.4 Tr Tr - Tr - - - -
C16:1 w3c 01.3 - - - - - - - -
C16:1 w7c 01.0 - - - - - - - -
iso-C15:0 2-O H 01.0 - - - - - - - -
C16:1w6c 01.0 - - - - - - - -
C18:0 2 D M A Tr - - - - - - - -

- = non déterminé, Tr = sous forme de trace

67
 Résultats et discussion

Par co mparaison avec les espèces les plus proches, le taux de similitude le plus élevé relevé
T
est de 96.8 % avec l’espèce C haifense souche LM G 24029 (EF 204450) dont la séquence
co mplète est co mposée de 1483 paires de bases, et un taux inférieur à 96 % avec l’espèce
T
C bovis souche L M G 24227 (EF 204446) avec une séquence de 1485pb. Les deux espèces
précitées ont été isolées du lait cru de vache à Haifa (Palestine) au cours d’une étude réalisée
sur la biodiversité de la microflore du lait (Hantsis-Zakarov & Halpern, 2007 ; Hantsis-
Zakarov et al., 2008).

N otre souche diffère de ces deux taxons par quelques caractères phénotypiques (Tableau IX).
Chryseobacterium haifense et Chryseobacterium bovis sont colorées en crème et la
pig mentation en jaune doré n’apparaît que si les cultures sont incubées sous conditions
de haut éclairage . Chryseobacterium haifense possède une • - galactosidase, une esculitine
ce qui lui confère la capacité d’hydrolyser l’esculine. Elle produit aussi de l’indole et
T
les pig ments flexirubines, par contre la souche 1Y B- R12 T est dépourvue de ces enzy mes.

Les deux espèces précitées tolèrent une [Na Cl] égale à 3 % par contre la concentration tolérée
T
par la souche 1Y B- R12 T est de 1 % à 6 % avec une concentration optimale de 4 % de Na Cl.

Les autres espèces rattachées phylo - génétiquem ent à notre souche (Figure 16), ont certains
caractères phénotypiques co m m uns avec elle co m me la présence d’une nitrate réductase,
l’absence des pig ments fléxirubines et des décarboxylases ainsi que l’incapacité de dégrader
les sucres tels que le mannitol, le tréhalose, le D xylose et les autres (Tableau IX) .

T
Le contenu de l’A D N chro moso mique en bases (G+ C) de la souche 1YB- R12 T est très
important (40.9 moles % ) alors qu’il est de 37.8 moles % pour C haifense et de 38.6
m oles % pour C bovis.

T
La chimio - taxono mie a m ontré que les acides gras majoritaires chez la souche 1Y B- R12 T
sont : anteiso-C15:0 (41.4% ), iso-C15:0 (14.4 %), iso-C17: 1 w9c (9.0 %) et iso-C16: 0 (7.2 %)
avec la présence de deux autres sous forme de traces, anteiso- C15 :1 A et C18: 0 2 D M A.
Ces derniers sont considérés co m me inconnus, car ils n’ont pas été mis en évidence chez
les autres espèces identifiées du genre Chryseobacterium (Tableau X).

Les acides gras prédo minants chez C haifense et C bovis sont les mê mes, mais avec des taux
différents ; anteiso-C15:0 (16.6 % et 15.6 %), iso-C15:0 (41.6 % et 38.9% ), iso- C17: 1 w9c
(2.7 % et 14.8 %).

T
Deux acides gras minoritaires identifiés chez la souche 1Y B- R12 T C17:0 2-O H et C15:0
2- O H sont aussi présents chez C haifense, C bovis et C arothri. Pour l’acide gras iso-C14:0
est présent sous forme de traces chez les deux premières espèces seule ment.

68
 Résultats et discussion

Il y’a lieu de remarquer que les acides gras suivants : iso-C15:0, anteiso-C 1 5:0 et iso-C17:0
3- O H sont présents chez toutes les espèces rattachées phylo génétiquem ent à la souche
T
1 Y B- R12 T .

N ous tenons à signaler que les acides gras suivants : iso-C15:0, iso-C17:0 3-O H, iso- C17: 1 w9c,
anteiso-C17:1 w9c sont souvent majoritaires chez les me mbres du genre Chryseobacterium, par
T
contre anteiso-C15:0 est minoritaire. Chez la souche 1Y B- R12 T ce dernier est prédo minant
(tableau XI).

Sur la base des résultats phénotypiques, génotypiques et de la chimiotaxono mie, la souche

T
1 Y B- R12 T est considérée co m me une nouvelle espèce du genre Chryseobacterium , et on
lui a attribuée le no m de « Chryseobacterium solincola", qui est un nom latin en relation
directe avec son habitat le sol.

T T T
La souche type est 1YB- R12 T (=DS M -1183 = C C U G – 55604 ).

Le nu méro d’accession de la séquence géno mique obtenu du séquençage de l’A R Nr 16S de la

T
souche 1Y B- R12 T est : E U 516352.

D’après le Bergey’s Manual de systématique et de bactériologie (2001), la classification de

cette espèce est co m me suit :

Do maine des Bacteria

Phylu m B X X : Bacteroidetes
Classe II : Flavobacteria
Fa mille : Flavobacteriaceae
Genre : Chryseobacterium
Espèce : Chryseobacterium solincola

69
 Résultats et discussion

Tableau XI: Profil des acides gras cellulaires (%) majoritaire chez les souches du genre
T
Chryseobacterium et la souche 1Y B- R12 T .

T T
1: 1Y B- R12 T , 2: C ureilyticum souche F - fue - 04IIIaaaa (Herzog et al.,, 2008) ,
T T
3: C ga mbrini souche 5 -1sTIa (Herzog et al., 2008), 4: C formosense souche C C- H3-2
T
(Young et al., 2005), 5: C daecheongense souche DS M 15235 (Kim et al., 2005 a),
T T
6: C defluvii souche B2 (Ka mpfer et al., 2003), 7: C soli souche J S6-6 ( Weon et al.,
T
2008), 8: C jejuense souche JS17-8 ( Weon et al., 2008), 9: C Wanjuense souche DS M
T T
17724 ( Weon et al., 2006 ), 10: C taiwanense souche L MJ23355 (Tai et al., 2008),
T
11: C aquifrigidense souche K C T C12894 (Park et al., 2008),12: C piscium souche C C U G
T T
51923 (De Beer et al., 2006),13: C shigense souche DS M 17126 (Shimum ora et al., 2005),
T
14: C balustinum souche L M G 8329 (Hugo et al., 2003),15: C indologenes souche N C T C
T T
10796 (Hugo et al., 2003),16: C indoltheticum souche AT C C27950 (Hugo et al., 2003),
T
17: C scophthalmu m souche L M G 13028 (Hugo et al., 2003), 18: C joostei souche K C T C
T T
12128 (Hugo et al., 2003), 19: C gleum souche NC T C 11432 (H ugo et al., 2003),
T
20: C taeanense souche N B R C 100863 (Park et al., 2006), 21: C soldanellicola souche
T T
K C T C 12382 (Park et al., 2006), 22 : C taichungense souche CC U G 50001 (Chen et al.,
T
2005), 23: C vrystaatense souche L M G 22846 (De Beer et al., 2005), 24: C luteum souche
T
P456/04 (Behrendt et al., 2007).
Acides gras Iso-C15:0 iso-C17:0 3 O H iso-C17:1w9c anteiso-C15:0

1 14.0 05.2 09.0 41.4

2 40.2 14.7 tr 00.4
3 57.4 16.2 tr 00.6
4 51.7 10.6 04.3 02.4
5 56.1 17.4 tr 01.0
6 61.8 13.3 tr 01.4
7 15.7 15.0 15.5 01.6
8 26.8 21.2 12.1 01.6
9 40.0 21.9 11.7 tr
10 43.0 16.6 17.5 tr
11 45.5 13.0 14.4 tr
12 22.0 14.0 12.9 03.8
13 24.7 19.1 13.3 02.8
14 32.3 16.8 27.1 tr
15 38.2 21.0 27.3 02.0
16 29.5 14.0 24.6 04.9
17 35.4 16.4 21.7 tr
18 22.6 17.5 15.5 01.9
19 38.3 22.1 24.1 tr
20 36.1 18.8 15.8 01.1
21 24.0 18.3 11.2 05.5
22 35.4 22.4 08.9 00.7
23 41.8 - 22.0 17.0
24 40.51 16.15 - 03.7
tr: sous forme de traces, - : non déterminé

70
 Résultats et discussion

2/- Etude de la résistance aux agents antimicrobiens

2.1/- Les métaux lourds

2.1.1/-Déter mination des concentrations seuils de la résistance

Les résultats obtenus de cette étude montrent bien que ce nouveau taxon de la famille des
Flavobacteriaceae tolère des concentrations non négligeables des trois ions métalliques testés
2+
(plo mb, zinc, cad miu). Les concentrations tolérées sont de l’ordre de 500ug/ml pour le Pb ,
2+ 2+
300ug/ml pour le zn et 150ug/ml pour le cd (Figure 17).

Pour pouvoir interpréter ces résultats, il est très im portant de préciser que l’origine de cette
souche bactérienne est un sol pollué surtout par des hydrocarbures et des rejets de pneus
de véhicules de la ville de M EF T A H. Il est connu que les hydrocarbures contiennent
une concentration importante de plo mb co m me antidétonant, en plus de son abondance
fréquente dans l’environne ment due aux divers rejets déchargés un peu partout dans
la nature.

T
Cependant, cette tolérance de haut niveau au plom b (500ug/ml) chez la souche 1Y B- R12 T
peut être due à une adaptation physiologique naturelle. Par conséquent, cette bactérie a
développé certains systèm es et mécanismes de résistance co m me moyen de défense et de lutte
contre les conditions hostiles de cet écosystème. Il y’a lieu de noter que les ions du plo mb
sont très toxiques pour les différents systèmes biologiques cellulaires, et n’ont pas de rôle
dans le métabolisme. Toutefois, la présence du plo mb dans le milieu peut induire certaines
voies métaboliques telles que celle du pyruvate et une partie de celle de la cobala mine,
co mposé essentielle pour la biosynthèse de la méthionine nécessaire au renouvellement
2+
du pool thiol conso m mé par la bactérie pour détoxifier le Pb et mê me la voie de réduction
périplasmique dissimilative des nitrates surtout quand il est ajouté sous form e de [Pb (N O3)2]
(Steenhoudt et al., 2001).

Il est aussi intéressant d’évoquer l’effet du pH du sol sur le degré de toxicité de cet agent
2+
minéral toxique. Selon la littérature, de haut niveaux de résistance au Pb sont décrit chez
de no mbreuses bactéries à Gra m positif et à Gram négatif. Ces dernières années une étude
détaillée sur la résistance à 13 métaux lourds chez une bactérie à Gra m négatif (Cupriavidus
metallidurans C H 34), isolée en Belgique (Houba,1976), a mieux élucidé le mécanisme
génétique de résistance vis-à-vis ce métal qui était mal connu ( Mergeay et al., 2003).

Concernant la résistance aux ions de zinc et de cad miu m, il faut tout d’abord préciser que le
2+
pre mier métal (Zn ) à de très faibles concentrations est considéré com m e un cofacteur
essentiel à l’activité et à la stabilité conformationelle de certaines protéines de la cellule, mais
2+
au-delà d’un certain seuil,il devient toxique. Le second (Cd ), est connu d’être très toxique
pour la plupart des bactéries mê me en concentrations minimes co m me le mercure. Il agit

71
 Résultats et discussion

Plomb

500 ug/ml
Cadmium
150 ug/ml

Zinc

300 ug/ml

Figure 17: Evaluation du taux de la résistance aux trois sels métalliques

T
Chez la souche 1 Y B- R12 T .

72
 Résultats et discussion

co m me inhibiteur co mpétitif vis-à-vis des cations essentiels tel que le zinc. La présence de
ces deux métaux lourds dans l’environne ment est due surtout aux rejets provenant des
différentes activités industrielles. Le cad miu m peut aussi être considéré co m me l’un des
déchets majeurs des activités nucléaires.

Cette forte résistance à ces deux agents toxiques (300ug/ml et 150ug/ml respective ment)
T
observée chez la souche 1Y B- R12 T peut être liée à une adaptation à ces conditions
extrê mes tel que le cas pour le plo mb, ce qui a induit le développe ment ou la production de
certaines molécules (protéines) et systèmes de résistance constitutives. Ces résultats nous
donne aussi une idée sur le degré de pollution du milieu d’origine de cette souche, et la
nature des effluents conta minant ce sol, provenant d’une pollution directe (rejets) ou indirecte
liée à la cimenterie de la ville de M EF T A H. Le mécanisme de séquestration qui est
généralement enclencher en présence de stimuli - toxiques et assure la résistance peut aussi
être envisagé.

Les microorganismes des environne ments pollués doivent donc développer des mécanismes
de résistance leur permettant de contre- balancer l’effet des fortes concentrations en métaux
lourds, tout en assurant le maintien du rôle biologique des ions essentiels. Il convient de faire
la différence entre la résistance aux ions métalliques dans des do maines de concentrations
situés juste au dessus de la C MI et les véritables résistances conduisant à l’adaptation à des
milieux extrêmes. Il faut aussi faire une corrélation entre les hautes résistances aux métaux
lourds et le degré de la pollution de l’environnem ent (Diaz-Ravinâ & Baath, 2001 ; Mertens
et al., 2006).

Les métaux lourds sont connus pour leurs effets très toxiques pour les bactéries et de porter
atteintes à leurs différentes molécules très importantes mê me vitales (enzy mes et acides
nucléiques) et par conséquent leurs activités biologiques (Nies, 1999 ; Hengstler et al., 2003).
Néa moins, certains sont im pliqués dans l’induction de quelques voies métaboliques tels que
le cas du cuivre et du plom b, ce qui explique en partie les taux élevés de résistance vis-à-vis
de ces deux métaux lourds chez les bactéries à Gra m négatif en général et de la souche
T
1 Y B- R12 T en particulier (pour le plo mb). L’activation de ces voies métaboliques induites
pourrait être le résultat de l’induction de certains facteurs sig ma qui activeraient à leur tour
tout un réseau de régulation. Ce facteur est connu pour son implication dans la réponse aux
carences et aux stress des bactéries des environnem ents pollués (Lonetto et al., 1992 ; Gross
et al., 2007).

Le métabolisme du glutathion se mble être aussi activé en présence des deux ions métalliques
précités (cuivre et plo mb). Ce co mposé (glutathion « GS H ») peut fixer les ions lourds afin
de permettre leur im mobilisation dans le cytoplasme. Il est co mposé d’un tripeptide très
important, produit en cas de stress bactérien surtout en cas d’une forte acidité, une forte
salinité ou une forte concentration des ions métalliques ( Murata et al.,1985 ; Ches mey et
al., 1996 ; Fergason & Booth, 1998 ; Riccillo et al., 2000).
73
 Résultats et discussion

Les modifications qu’entraîne ce tripeptide laissent supposer qu’il s’agit d’un agent de
détoxification du pre mier ordre (Xiang et al., 2001 ; Figueira et al., 2005).

2+
La croissance de cette bactérie en présence de fortes concentrations de plom b (Pb ), de zinc
2+ 2+
(Zn ) et de cad miu m (Cd ), laisse suggérer que ses protéines intrinsèques ne sont pas ou
sont peu infectées et aussi supposer qu’elle est dotée d’un ou de plusieurs éléments génétiques
qui codent pour des systèm es et des mécanismes variés de résistance (Tibazarwa et al., 2000 ;
Grass et al., 2001). Ces éléments génétiques peuvent être de nature constitutive ou inductible,
le cas le plus fréquent (Nies et al., 1998 ; Franke et al., 2001 ; Saltikov et al., 2002), portés
par des molécules d’A D N extra chro moso mique (Beveridge et al., 1997 ; Al mas et al., 2004).
2+
Chez de no mbreuses bactéries à Gra m négatif, la résistance au cad mium (Cd ) et au zinc
2+ 2+ 2+
(Zn ) est toujours liée à celle du cobalt (Co ) et parfois à celle du plom b (Pb ). Elle peut
être réalisée par des protéines de transport ATP dépendantes, par des protéines gouvernées
par le système czc ou par des protéines C DF.

Il a été dé montré que la présence du cad miu m dans le milieu induit l’aug mentation de la
synthèse de certaines protéines spécifiques chez quelques bactéries à Gra m négatis
(Rhizobium legu minosaru m) ce qui leur confèrent le pouvoir de tolérer et de résister à
des concentrations considérables (2 m M ol/l) de ce métal (Figueira et al., 2005). Ce mécanisme
T
peut être incriminé pour expliquer cette insensibilité remarquée chez la souche 1Y B- R12 T .

Le pre mier mécanisme d’insensibilité au cad miu m déterminé, via un transporteur ATPase-
type P est celui de Staphylococcus aureus codé par l’opéron cad et porté par le
plas mide pI - 258 (Nucifora et al., 1989 ; Yoon & Silver, 1991 ; Endo & Silver, 1995 et
1996). Ces dernières années, d’autres opérons similaires ont été détecté et décris chez
des bactéries à Gra m (+) et à Gra m (-). L’opéron zntA d’Escherichia coli, code pour une
protéine ATPase - type P de structure très proche de la protéine Cad A. La protéine ZntA
confère la résistance au zinc, au cad miu m et au plo mb. Son expression est régulée par la
2+
protéine ZntR de la famille MerR. En général, la résistance au Cd est due à une extrusion
active des ions de ce m étal vers l’extérieur de la cellule grâce à Cad A qui peut aussi
2+ 2+
expulser d’autres ions métalliques co m me le Zn et le Pb quand ils sont présents en fortes
concentrations (Rensing et al., 1998). Il a été dé montré que les gènes codant pour les
protéines ATPase- type P, principaux agents de l’extrusion des ions lourds sont no mbreuses
et leur répartition chez les bactéries est très variable. L’analyse phylogénétique de ces
protéines, a permis leur regroupe ment dans trois classes distinctes ; la classe I co mporte 4
2+ 2+ 2+
A T Pases qui seraient impliquées dans l’efflux du Cd , Zn et le Pb ; la classe II avec deux
2+ 2+
protéines intervenant dans la résistance aux Cu et Ag et la classe III avec deux protéines
similaires aux ATPases – type FixI de Bradyrhizobium dont les substrats transportés sont
inconnus (Nies, 2003).

74
 Résultats et discussion

2+ 2+
La résistance aux Cd et Zn via l’extrusion chimio osmotique par le systè me czc identifié
chez un grand no mbre de bactéries à Gra m négatif est effectué lorsque les gènes czc sont
exprimés via les AR N m correspondants. La détoxification des ions métalliques se fait par
la diminution de leur taux d’accu mulation intracellulaire due à leur expulsion du cytoplas me
vers le périplasme puis la me mbrane externe pour se retrouver enfin à l’extérieur. Le
déterminant génétique czc gouverne un polypeptide co mposé de trois séquences protéiniques,
Czc A de la famille R N D qui assure l’antiport cations- protons, CzcB de la famille MFP
(protéines de fusion me m branaires) qui assure le lien entre Czc A dans la me mbrane interne
et la protéine canal CzcC appartenant aux O M F (facteurs externes mem branaires), insérée
dans la me mbrane externe (Nies, 1995). Ce sont des protéines de transport constituant la
po mpe à éfflux Czc CB A chez les bactéries à Gra m négatif (Nies, 2003). L’expression de
cette po mpe à efflux est régulée par un système à deux co mposantes CzcR et CzcS ainsi
que deux autres protéines CzcI et Czc N qui seraient impliquées dans la régulation de
l’opéron czc (Zgurskaya & Nikaido, 2000 a et b).

Ce co mplexe protéinique CzcC B A fait partie des po mpes à efflux de type H M E –R N D et il

est codé par au moins 13 gènes distribués sur les différents opérons des quatre classes de
protéines H M E – R N D (Liesegang et al., 1993 ; Diels et al., 1995 a et b).

La résistance au cad mium et au zinc par le systèm e C D F, est réalisée grâce à la protéine de
transport CzcD dont la synthèse est sous le contrôle de l’opéron czc. Cette protéine est le
pre mier transporteur chimio os motique qui permet le passage des ions métalliques au travers
de la me mbrane interne (Anton et al., 1999 ; Chao & Fut, 2004 ; Naz et al., 2005 ; Stahler et
al., 2006).

T
U ne haute résistance de la souche 1Y B- R12T aux plo mb (500ug/ml), zinc (300ug/ml)
et cad miu m (150ug/ml) peut être aussi liée à la présence de certains systèmes efflux de
support génétique chro m oso mique.

Des études récentes effectuées sur l’espèce Cupriviadus metallidurans C H 34 ont mis en
évidence la présence de l’opéron pbr TR A B C D (Borre mans et al., 2001). Nous tenons à
préciser qu’il est le seul à avoir été caractérisé chez les bactéries à Gra m - négatif.Le
m écanisme biochimique de la résistance de mande tout d’abord le passage du plo mb du
périplasme vers le cytoplasme de la cellule par la protéine PbrT. Une fois à l’intérieur,
les ions du plo mb dérépriment le pro moteur ppbrA, ce qui conduit à l’expression des gènes
de structure pbr AB C D. L’étape suivante consiste à expulser le plo mb du cytoplas me par
l’intermédiaire de la protéine PbrA qui est une ATPase - type P similaire à Cad A. L’énergie
nécessaire lui est fournie de l’hydrolyse de l’ATP. La translocation du plo m b de la me mbrane
interne vers l’extérieur de la cellule est réalisée par la lipoprotéine PbrB. La deuxiè me
lipoprotéine PbrC serait requise pour cliver la séquence signal de PbrB afin de lui permettre
de pénétrer dans la mem brane externe. La transcription des gènes de structure de l’opéron
pbr est inhibée lorsque le répresseur est lié aux pro moteurs ppbrA / ppbrR. Le répresseur
PbrR possède un do maine de liaison à l’A D N et un autre de liaison au plom b. Les gènes pbrR
et pbrT sont transcrits de manière divergente par rapport aux gènes de structure

75
 Résultats et discussion

(Borre mans et al., 2001). Cette insensibilité remarquable vis – à - vis les ions métalliques
de plo mb, de zinc et de cad miu m chez cette bactérie psychro - tolérante et halotolérante
peut être aussi en relation avec la quantité importante d’exo- poly saccharides produite. Il a
été rapporté que ces derniers peuvent jouer le rôle d’une barrière aux ions m étalliques chez
les souches du genre Rhizobium (Santa maria et al., 2003).

2.1.2/ - Evaluation du taux d’accu m ulation des ions métalliques en fonction du p H

T
La densité cellulaire évaluée des cultures tém oins de la souche 1YB- R12 T en milieu
de culture contenant de l’extrait de levure com m e seule source de carbone et d’énergie à
différents pH est relativem ent faible par rapport à celle des cultures mères. A pH = 7.3 La
D O obtenue à • = 600n m est de 1.033 pour la culture mère contre 0.888 pour celle du témoin.
Cette baisse au niveau de la densité cellulaire, sem ble être en relation directe avec le taux de
ger mes ense mencés dans le pre mier type de cultures (inoculu m de 10 %) contre une colonie de
taille importante dans le deuxiè me (Tableau II d en annexe).

En présence des différents métaux lourds (cad m ium, zinc, plo mb) avec une concentration
de 100 mg/l de milieu pour chacun, la densité cellulaire déterminée est légère ment
faible pour les deux premiers métaux (cad mium et zinc) par rapport à celle des témoins.
Celle du plo mb est relative ment importante (Figure 18). A pH = 7.3 Les densités optiques
(D O) déterminées sont: 0.444, 0.547 et 0.689 respective ment pour le cad miu m, le zinc et
le plo mb contre 0.888 pour le témoin. Cette baisse au niveau de la densité peut être due au
choc (stress) causé par les ions métalliques sur les cellules bactériennes mises en
contact directement avec ces polluants toxiques d’une part, et à l’effet du pH du milieu
d’une autre.

Pour interpréter ce résultat, il est intéressant d’évoquer la charge des différentes

m olécules cellulaires et leur stabilité à pH neutre ou voisin de la neutralité. Il se pourrait
que cela a conduit à la dissociation des ions m étalliques des différents groupe ments et
des protéines. Les concentrations résiduelles des trois métaux lourds quantifiées par
le dosage en utilisant la méthode spectroscopique sont faibles dans l’ense mble. Elles
varient en fonction du p H et du métal testé (Figure 18) et (Tableau II e en annexe).

2+
Pour le Cad miu m, la concentration déterminée [Cd ] r à pH égal à (5, 5.5 et 7.3)
est légère ment supérieure par rapport aux autres pH, avec des résultats respectifs de 13.26
m g/l, 9mg/l et15 mg/l. Les concentrations obtenues à pH basique sont faibles et fluctuent entre

76
 Résultats et discussion

Figure 18: Courbes de croissance de la souche étudiée en absence et en présence des ions
métalliques en fonction du pH

77
 Résultats et discussion

2+
0.198 mg/l et 1.800 mg/l. Les résultats obtenus pour le zinc [Zn ] r à pH très acide (pH = 5)
et à pH neutre (pH = 7.3) sont de l’ordre de 4.40 m g/l et 5 mg/l. Ces concentrations sont de
5.672 mg/l et 4.14 mg/l environ aux pH (8.5 et 9).

2+
Pour les ions du plo mb, la [Pb ]r est de 7.1 m g/l à pH égal à 7.3. Cette concentration
est plus ou moins importante à pH acide (5 et 5.5) avec des résultats de 5.7 mg/l et 5.4 mg/l
respective ment. Pour des pH élevés, elle fluctue entre 0.76 mg/l et 1.83 mg/l.

T
Sur la figure 19, on constate que la souche 1Y B- R 12T a capturé presque la totalité des ions
m étalliques présents dans le milieu, raison pour laquelle la concentration des métaux libres
2+
déterminée est faible. A p H acide (pH = 5 et 5,5), l’effet toxique du Cd est relative ment
considérable par rapport au zinc et au plo mb avec environ 86,74 mg/l et 91m g/l des ions sont
2+
adsorbés ou absorbés contre 95,6 mg/l et 97,1 mg/l pour Zn et 94,3 mg/l et 94,6 mg/l pour
2+
Pb . La densité cellulaire mesurée est aussi en accord avec ces résultats soit une D O = 0,197
et 0,233. Il est à noter que la toxicité du cadmiu m diminue avec l’aug mentation du pH.
Cependant, la concentration des ions capturés à pH neutre (pH = 7,3) est de 85 mg/l
seule ment. La concentration résiduelle plus ou moins importante à pH neutre peut être due au
relarguage ou le relâchage des ions après la mort et la lyse de certaines cellules et de mê me la
libération des ions par co mpétition avec d’autres cations. La mê me rem arque peut être
2+ 2+
faite pour les deux autres ions métalliques (Zn et Pb ) à pH neutre.

Pour des pH basiques, on constate que l’effet toxique des trois métaux lourds testés est
faible, ceci semble être en relation avec leur degré de solubilité. Il est à préciser que la
co mpléxation des métaux lourds et les constantes de stabilité conditionnelle aug mentent
avec l’aug mentation du p H, due à la diminution de la co mpétition du métal avec les protons
pour les sites co mpléxants. Par contre due au caractère poly-électrolyte et polyfonctionnel
des exsudats tels que les exo poly-saccarides, une aug mentation du rapport métal - exsudat
ou de la force ionique a m ontré une diminution dans les constantes de stabilité conditionnelle.
Les exo- polysaccarides bactériens, au regard de leurs caractéristiques physico-chimiques
(teneurs en oses acides et en oses amines, substituants sulfates et pyruvates), constituent
d’excellents bio- accu m ulateurs de métaux solubles (La melas, 2007).

Sur la base de ces résultats, on constate qu’une forte concentration des ions m étalliques testés
T
a été capturée par les cellules bactériennes de la souche 1Y B- R12 T selon des mécanismes
d’adsorption ou d’absorption. Ceci, semble être étroitement lié aux seuils de résistance
2+ 2+
déterminés pour chaque métal (150ug/ml pour Cd , 300ug/ml pour Zn et 500ug/ml pour
2+
Pb ). Cette forte accu mulation de métaux est due donc soit à une co mpléxation entre les ions
m étalliques et les ligands se situant à la surface des bactéries soit à une internalisation ou à
une diffusion (Daisuke et al., 2006). Dans le cas d’une accu mulation par absorption, on peut
supposer que les ions métalliques sont stockés dans les différents co mpartim ents des bactéries
tels que les vacuoles, mais ceci ne pourra être confirmé qu’après une observation au
microscope électronique.
78
 Résultats et discussion

concentrations des ions métalliques libres dans le milieu

16

14

12

10 cadmium
en mg/l

zinc
8 plomb

0
0 5 5,5 6 6,5 7,3 8 8,5 9
PH

Figure 19: Histogramme représentant Les concentrations residuelles

métalliques dosées dans le milieu de culture en fonction du PH

79
 Résultats et discussion

Les fluctuations observées au niveau des résultats obtenus à différents p H (acides, neutre,
basiques), peuvent être expliquées en partie par l’effet de ce para mètre physico chimique sur
le phéno mène d’ionisation des métaux lourds d’une part et sur la structure de l’enveloppe
et de la me mbrane cellulaire d’autre part. Il a été dé montré que le stress causé par certains
ions métalliques, la salinité et l’acidité sur les micro - organismes est souvent acco mpagné
par un change ment dans l’ultra-structure de l’enveloppe cellulaire (Leppard & Rao, 1988).

En effet, beaucoup d’auteurs considèrent le pH com m e l’un des principaux facteurs affectant
la toxicité des métaux lourds (Babiche & Stotzky, 1978 ; Cooney & Pettibone, 1986 ; Dean
Ross & Mills, 1989 ; Dean-Ross, 1991 ; Benyehuda et al., 2003). Il a été rapporté que les ions
m étalliques ont une faible solubilité à pH alcalin (Hahne & Kroontje, 1973).

A la lu mière de ces résultats, on peut dire que cette nouvelle espèce bactérienne du genre
Chryseobacterium, appartenant à la famille des Flavobacteriaceae, isolée du sol est très
intéressante et peut être utilisées dans le processus de biore médiation de l’environne ment en
particulier dans la dépollution des sols conta miné surtout par les métaux lourds précités ainsi
que dans le traitement des fluides pollués.

2.2/- Etude de la résistance aux antibiotiques

T
Les résultats obtenus de l’étude de la sensibilité de la souche 1Y B- R12T vis-à-vis des 45
antibiotiques appartenant à 16 familles différentes par la méthode de diffusion en milieu
gélosé, montrent que cette dernière est insensible à 11 d’entre eux, soit un taux de 25 %
environ (Tableau II f en annexe).

Une résistance de haut niveau (résistance totale « Rt ») est observée pour 8 antibiotiques
testés (imipénè me, cefuroxime, tétracycline, acide nalidixique, acide pipé midique,
fosfo mycine, furanes, nitrofurantoines). Des résistances à bas niveau ou intermédiaires (Ri)
sont relevées pour la céfalotine, la Dibékacine et l’acide fusidique.

Sur 15 antibiotiques testés de la famille des • lactamines, une résistance est observée vis-à-vis
de la Céfuroxime (Rt), la Céfalotine (Ri) et l’Imipénè me (Rt). Pour les autres • lacta mines
(Pénicillines, A mpicilline et dérivés), cette bactérie est très sensible.

Parmi 8 agents testés de la famille des aminosides et aminocyclitol, une seule résistance à bas
niveau est observée vis-à-vis de la Dibékacine (Ri).

La tétracycline les furanes et les nitrofuranes n’ont exercé aucune activité inhibitrice sur la
croissance de cette bactérie. La mê me re marque peut être faite pour l’acide nalidixique et
l’acide Pipé midique contrairement à l’ofloxacine (Q uinolones).

80
 Résultats et discussion

U ne forte sensibilité est constatée pour les glycopeptides (Vanco mycine), le Chlora mphénicol,
la Linco mycine, les polypeptides (Bacitracine, Colistine), les macrolides (Erythro mycine,
Spira mycine), la Rifampicine, les Sulfamides et associés, la Flu méquine, la Nitroxoline et la
Pristina mycine.

Ces résultats sont en partie en accord avec ceux obtenus par Bellais et al., 2000 a,b au cours
d’une étude réalisée sur des souches du genre Chryseobacterium isolées des milieux
aquatiques.

Pour interpréter cette poly-résistance chez ce nouveau taxon du genre Chryseobacterium, il

est très important de rappeler que trois principaux mécanismes de résistance sont décrits chez
les bactéries à Gra m négatif: Imper méabilité ou diminution de la perméabilité de la me mbrane
cellulaire, modification ou altération de la cible et inactivation des molécules d’antibiotique
par production d’enzy mes.

La résistance observée vis-à-vis des •-lactamines, peut être liée surtout à la production
d’enzy mes (• lactamases) appartenant à une ou plusieurs classes de la famille des
M étallo- • lactamases (M -•ls), qui peuvent co m biner chez cette bactérie. Il a été rapporté que
les espèces du genre Chryseobacterium produisent beaucoup d’enzy mes de ce type
(Ras mussen et al., 1990 ; Sanschaguin et al., 1998 ; Bellais et al., 2000 a, b ; Guiadko wski,
2001). Ces dernières, peuvent être des Céphalosporinases de nature constitutive
(chro moso mique) à bas niveau et à sécrétion inductible, ce qui a conduit à l’hydrolyse des
céphalosporines de la pre mière génération (Céfalotine) et de la deuxiè me (Céfuroxime). Il est
à signaler que la production de cette catégorie d’enzy mes a été mis en évidence chez de
no mbreuses espèces de la famille des Flavobacteriaceae telles que Chryseobacterium
meningosepticum (Bush & Jacoby, 1995 ; Bellais et al., 2000 a,b et 2002), Chryseobacterium
indologenes (Bellais et al., 1999), Chryseobacterium gleu m et Flavobacterium johnsoniae
(Bernardet et al., 1996 ; Naas et al., 2003) et de m ê me chez plusieurs bactéries à Gra m négatif
phylo - génétique ment éloignées de ce genre co m m e Pseudo monas aeruginosa, Enterobacter
cloacae et Acinetobacter (Le Minor & Veron, 1990 ; Hood & A m yes, 1991 ; Vila et al., 1993
et 1995)

L’insensibilité de haut niveau à l’Imipénè me est peut être le résultat de l’activité d’une
•- lactamase ( M-•ls) à spectre étroit ou à spectre élargi de nature constitutive. La
résistance aux Carbapénè mes et autres •- lacta mines a été déjà dé m ontré et caractérisée
chez le genre Chryseobacterium en particulier chez les espèces C meningosepticu m
(BlaB-1 et G O B-1), C indologenes (IN D-1) et C gleu m (C G B-1 et C G A-1) (Osa mo et al.,
1994 ; Ras mussen et al.,1997 ; Bloch et al., 1997 ; Visalli et al., 1997 ; Rossolini et al., 1998 ;
Di Pentima et al., 1998 ; Bush et al., 1998 ; Lauretti et al., 1999 ; Woodford et al., 2000 ;
Kirby et al. , 2004).

81
 Résultats et discussion

Des souches de Chryseobacterium meningosepticu m très résistantes à l’Imipépène ont

aussi été isolées en Chine (Chen et al., 2006). Ces dernières années, il a été dé montré que la
résistance aux carbapénèm es (Imipénè me) chez ce genre bactérien peut être portée sur des
élé ments génétiques mobiles (intégrons) (Bellais et al., 2000 a , b et 2002).

N ous tenons à évoquer la détection des enzy mes de type •-lactamases spécifiques (I M P-1,
GI M-1, VI M-1, SP M-1, SI M-1, SFB-1 …) acquises chez beaucoup de bactéries à Gra m
négatif isolées dans plusieurs pays (Pseudo monas aeruginosa, Acinetobacter bau mannii,
Serratia fonticola et d’autres entérobactéries). Elles confèrent la résistance de haut niveau
aux carbapénè mes et parfois à d’autres •-lactamines, et leurs gènes sont portés sur des
intégrons et des plasmides (Araka wa et al., 1995 ; Senda et al., 1996 ; Livermore, 1997 ;
Bradford et al., 1997 ; W alsh et al., 1997 ; Marchese et al., 1998 ; Com aglia et al., 1999 ;
K oh et al., 1999 ; Lauretti et al., 1999 ; Philippon & Arlet, 2005 ; Jacoby, 2006).

Il a été rapporté que chez certaines bactéries à Gra m négatif (Pseudom onas aeruginosa),
la résistance intrinsèque aux carbapénè mes (imipénè me) est en relation directe avec le
système d’efflux Czc C B A qui assure le transport des métaux lourds (zinc, cad miu m, cobalt).
Certains auteurs ont suggéré l’existance d’une co - régulation entre les co mposantes du
système d’efflux des ions métalliques et le système d’import de l’imipénè me. Donc, la
présence de ces métaux lourds en particulier le zinc (métallo-•-lactamases sont zinc
dépendantes) dans des environne ments conta minés, pourrait donc induire des bactéries
m utantes résistante à l’imipénè me mê me en absence de tout contact avec cet antibiotique
(Perron et al., 2004). Cette hypothèse peut expliquer la résistance de notre souche à
l’imipénè me.

T
La résistance de haut niveau à la Tétracycline chez la souche 1Y B- R 12T peut être le
résultat d’activation de l’expression de systèm e d’efflux trans me mbranaire spécifique, ne
per met que l’extrusion de molécules apparentées contrairement aux systèm es d’efflux poly-
résistance. Ce mécanism e biochimique confère aux bactéries l’insensibilité à toutes les
m olécules de Tétracyclines. Cette résistance observée peut être aussi liée à une mutation
dans la région régulatrice des systèmes d’efflux multirésistance. Ceci, a conduit à une
surexpression des systèm es d’efflux constitutives associés à la modification quantitative et
qualitative des porines. Il a provoqué une diminution dans la perméabilité me mbranaire et a
conduit à l’acquisition d’une résistance aux • lacta mines, aux quinolones et à la Tétracycline.
Il est à signaler que des systèmes d’efflux constitutifs ont été identifiés chez de no mbreuses
bactéries à Gra m négatif en particulier chez P aeruginosa et E coli dont le rôle principal est de
diminuer la concentration intra cellulaire des antibiotiques, mais ils confèrent générale ment
des résistances à bas niveau (Nikaido, 2000).

Selon la littérature, plusieurs espèces nouvelles du genre Chryseobacterium isolées de

différentes niches écologiques ainsi que d’autres appartenant aux différents genres de la
famille des Flavobacteriaceae sont résistantes à cet antibiotique (Nedashkovskaya et al.,
2004 ; Vaneechoutte et al., 2007 ; Herzog et al., 2008).
82
 Résultats et discussion

La résistance de haut niveau aux quinolones (acide nalidixique et acide pipé midique),
peut être le résultat d’une modification dans le gène gyr A, ce qui a conduit à un change ment
dans la sous unité A de l’A D N gyrase (cible des quinolones) et par conséquent diminution
de l’affinité de ces molécules vis-à-vis leurs cibles. Ce mécanisme très fréquent chez les
bactéries à Gra m négatif provoque souvent une résistance croisée à des degrés divers
pour l’ense mble des quinolones et une résistance de haut niveau surtout pour l’acide
nalidixique (Carbon et al., 1995).

Il existe un mécanisme de résistance lié aux systè mes d’efflux multi - drogues constitutives
qui confèrent aux bactéries la résistance à bas niveau aux quinolones, aux tétracyclines et
d’autres antibiotiques dont la cible est intracellulaire, mais ne peut pas expliquer
l’insensibilité de notre souche ( Michel et al., 2005).

U ne résistance intermédiaire à un seul aminoside (Dibekacine) peut être d’origine

chro moso mique et dont les gènes sont soit peu exprimés et dans ce cas la bactérie est
T
faiblement résistante, ce qui est le cas de la souche 1Y B- R12 T , ou non exprimés du tout
et la bactérie est parfaite ment sensible. Une imper méabilité relative à la production d’exo
polysaccharides ou de m odification des LPS qui conduit à des niveaux de résistance très
faibles et isolés, peut expliquer en partie le résultat obtenu pour notre souche. La
résistance par altération de la cible ne peut être envisagée parcequ’elle provoque souvent
une résistance de haut niveau. Par contre, une insensibilité liée à une activité enzy matique
ou à un système efflux actif constitutive peut être incriminée ( Moore et al., 1999 ; Mine et al.,
1999 ; Westbrock et al., 1999 ; Rosenberg et al.,2000). La résistance aux aminoglycosides a
été dé montrée chez beaucoup de souches du genre Chryseobacterium (A ber et al., 1978 ;
Bloch et al., 1997 ; Hsuch et al., 1996 a,b et 1997 ; Sibellas et al., 2007).

La résistance aux furanes et aux nitrofuranes, peut être naturelle (chro moso mique), liée
surtout à une réduction enzy matique (itrofurane réductase). Pour la Fosfo mycine, cette
insensibilité de haut niveau peut être acquise ce qui a conduit soit à une inactivation
enzy matique de cet antibiotique ou bien à une m odification dans le système de transport de
ces molécules. En plus de ce dernier mécanisme, la résistance à bas niveau à l’acide Fusidique
peut être aussi due à une altération de la cible intracellulaire.

T
Pour la pénicilline, les macrolides, la novobiocine et la vanco mycine, la souche 1 Y B- R12 T
est très sensible. Ce résultat mérite d’être souligné, vue que les bactéries à Gra m négatif
sont le plus souvent naturellement résistantes aux antibiotiques hydrophobes et/ou de poids
m oléculaire élevé ce qui rend leur pénétration au travers de la me mbrane externe de la paroi
impossible. Pour expliquer ce phéno mène, on peut supposer que cette bactérie a subit une
ou plusieurs mutations ce qui a conduit à une modification qualitative et quantitative au
niveau de ces protéines m e m branaires (porines) et a fait diminuer ou inhiber la synthèse de
certaines enzy mes (penicillinase). Ceci, a permis à ces agents d’atteindre leurs cibles et agir
active ment sur ce micro-organisme.
83
 Résultats et discussion

3/- Transfert génétique et déter mination du support génétique de la résistance

T
Le transfert génétique (conjugaison) réalisé entre la souche 1Y B- R12 T et la souche d’E
coli (receptrice), a montré que le caractère de résistance à l’imipénè me, la céfalotine et la
tétracycline n’a pas été transféré. Ceci, laisse supposer que les déterminants génétiques
responsables de la résistance à ces antibiotiques sont portés sur le chro moso me. Il est à
préciser que le transfert de la résistance plasmidique ou d’autres éléments génétiques extra
chro moso miques est inconnu chez le genre Chryseobacterium ( Michel et al., 2005).

Il a été dé montré que la résistance à l’imipénè me chez beaucoup de bactéries à Gra m

négatif est portée sur des intégrons chro moso m iques (Zong et al., 2003). De ce fait, les
intégrons représentent une sérieuse menace de diffusion rapide des facteurs de résistance
chez une espèce bactérienne (Bellais et al., 2000 a, b ; Michel et al., 2005). Pour la
céfalotine et la tétracycline, les gènes de résistance peuvent aussi être organisés sur le
chro moso me.

Selon les profils d’AD N obtenus sur gel d’agarose (figure 20), on observe un seul
T
type de bande identique au niveau des 4 pre miers échantillons de la souche 1Y B- R12 T .
La mê me constatation peut être faite pour l’échantillon n° 5 (souche réceptrice E coli B M
R
21 Na ) avec une différence dans le niveau de position et la taille. Pour le dernier
échantillon témoin (souche de référence contenant le plasmide pIP173 « • 127 kb avec le
chro moso me »), on constate la présence de deux bandes de taille et de position
différentes. Par co mparaison entre les résultats, on peut dire que notre souche ne contient
que de l’A D N chro moso mique ainsi que la souche réceptrice. Ceci veut dire que cette
bactérie est dépourvue d’éléments génétiques extra chro moso miques (plasmides), ce qui
peut expliquer l’absence de transfert des caractères de résistance pour les antibiotiques
chez la souche réceptrice. De mê me, la position de la bande de la souche réceptrice est au
m ê me niveau que celle du chro moso me du témoin, ce qui indique qu’elle est effective ment
dépourvue de plasmides. Cependant, la tolérance aux métaux lourds et la résistance aux
différents antibiotiques déterminée chez ce nouveau taxon parait être d’origine
chro moso mique (naturelle).

84
 Résultats et discussion

A1 A2 A3 A4 R T

Figure 20: Profils plasmidiques obtenus après extraction de l’A D N plasmidique

par la méthode de Kado et Liu (1981) et électrophorèse sur gel d’agarose 0.7 %.

T
A 1 + A2 + A3 + A4 : Profils de la souche 1Y B- R 12T
R
R : Profil de la souche réceptrice E coli B M 21 Na
ère
T : Profil du témoin portant deux bandes (1 bande en bas correspond à l’A D N
ème
chro moso mique, 2 bande en haut correspond à l’A D N du gros plasmide pIP173 • 127 kb).

85
 Conclusion

IV/- CONCLUSION

La protection de l’environne ment est essentielle au bien être des différents êtres vivants et
l’ho m me en particulier. Le développe ment durable au moyen de la prévention de la pollution
est le but principal de tout le monde. Ceci, suscite le développe ment et l’utilisation de
procédés pratiques qui em pêchent en réduisant au minimu m la production de polluants ou de
déchets et par conséquent réduire les risques d’atteintes à l’environnem ent et à la santé
hu maine. Les méthodes physico-chimiques utilisées éliminent le ou/les conta minants mais la
pollution y reste. Les méthodes biologiques sont simples, non dispendieuses et considérées
co m me les plus performantes vu leur large utilisation dans le traitement d’une grande variété
de co mposés organiques et inorganiques. Elles utilisent des micro-organismes capables de
dégrader principale ment de façon aérobie les co m posés organiques et limiter la concentration
de ceux qui sont inorganiques. Pour cette raison, il fallait tout d’abord déterminer quels
micro-organismes étaient en mesure d’effectuer ce travail.

Dans cette optique, nous avons isolé de différentes niches écologiques extrême ment polluées
par des hydrocarbures et d’autres types d’effluents d’origine urbaine et industrielle, puis
identifiée 17 souches bactériennes sur la base des critères morphologiques, physiologiques et
biochimiques. Elles sont à Gra m positif, aérobies strictes, im mobiles, non sporulées,
pig mentées et avec une m orphologie variable.

U ne d’entre elles, provenant du sol de la ville de M EF T A H en 2006 est à Gra m négatif

(1Y B- R12 T). Elle est psychrotolérante (+4°C) avec une température optim ale de croissance
située entre 28°C et 30°C et Halotolérante (tolère une [Na Cl] allant de 1 % à 6 % avec un
optimu m à 4 %). Son pH optimu m de croissance est de 7.3, avec un intervalle allant de (3 à
11). Elle est caractérisée surtout par un cycle m orphogénétique très variable en fonction
de l’âge de la culture.

Le séquençage de l’A R Nr-16S de cette bactérie a montré qu’il s’agit d’un nouveau taxon
du genre Chryseobacterium appartenant à la famille des Flavobacteriaceae. Le taux de
T
similitude de la souche 1Y B- R12 T avec les espèces phylo- génétique ment proches est de
96.5 % avec Chryseobacterium haifense souche H 38 isolée en 2007 d’un échantillon de lait
à H AIF A en palestine.

Le contenu de son D N A chro moso mique en (G + C) est de 40.9 moles %.

T
Les acides gras cellulaires prédo minants chez la souche 1Y B- R12 T obtenus de la chimio –
taxono mie sont: anteiso-C15:0 (41.4 %) et iso- C 1 5: 0 (14 .4 %).

Deux acides gras sous for me de traces sont mis en évidence pour la pre m ière fois chez une
espèce de ce genre ; anteiso- C15: 1 A et C18: 0 2 D M A.

86
 Conclusion

Le nu méro d’accession de Gen Bank pour la séquence géno mique obtenu du séquençage
T
de l’A R Nr 16S de la souche 1Y B- R12 T est : EU 516352.

T
Le no m latin attribué à ce nouveau taxon est Chryseobacterium solincola souche 1 Y B- R12 T
T T
(= DS M 1183 = C C U G 55604 ).

- L’étude de la résistance aux métaux lourds montre que cette nouvelle bactérie tolère des
concentrations non négligeables des trois ions m étalliques testés soit ; 500 ug/ml pour le
2+ 2+ 2+
Pb , 300 ug/ml pour le zn et 150 ug/ml pour le cd .

Les concentrations résiduelles des trois métaux lourds évalués par le dosage en utilisant la
m éthode spectroscopique sont faibles dans l’ense mble et varient en fonction du pH et du
m étal testé.

2+
Pour le Cad miu m, la [Cd ]r déterminée à p H acide et neutre (5 , 5.5 , 7.3) est
respective ment de 13.26 m g/l, 9 mg/l et 15 mg/l. Les concentrations obtenues à pH basique
sont faibles et fluctuent entre 0.198 mg/l et 1.800 m g/l.

2+
Pour le zinc à pH=5 et à p H =7.3, la [Zn ]r est de l’ordre de 4.40 mg/l et 5 mg/l. Par contre à
p H basique (8.5 et 9) elle est de 5.672 mg/l et 4.14 mg/l.

2+
La [Pb ]r est de 7.1 mg/l à pH neutre avec 5.7 mg/l et 5.4 mg/l à pH acide (5 et 5.5).
Pour des pH élevés (basiques) elle fluctue entre 0.76 mg/l et 1.83 mg/l.

Sur la base de ces résultats, on peut conclure que cette bactérie issue d’un environne ment
très pollué à un pouvoir dépolluant remarquable puisque le taux de captation des ions
m étalliques est supérieur à 80 %.

T
-Pour l’étude de la sensibilité de la souche 1YB- R12 T vis-à-vis 45 antibiotiques par la
m éthode de diffusion en milieu gélosé on distingue :

U ne résistance totale pour: imipénè me, cefuroxim e, tétracycline, acide nalidixique,

acide pipé midique, fosfom ycine, furanes et nitrofurantoines.

U ne résistance intermédiaire pour: la céfalotine, la dibékacine et l’acide fusidique.

T
-Le transfert génétique réalisé par un croise ment (conjugaison) entre la souche 1Y B- R12 T
et la souche receptrice d’E coli B M 21, montre que le caractère de résistance à l’imipénè me,
la céfalotine et la tétracycline n’a pas été transféré, ce qui indique que le support génétique
n’est pas d’origine plasm idique.

87
 Conclusion

Le profil plasmidique obtenu après extraction de l’A D N plas midide et com paraison avec un
témoin confirme l’absence des éléments génétiques autres que le chrom oso me. Donc, la
T
souche 1Y B- R12 T est naturellement résistante aux différents agents antimicrobiens.

Les perspectives

- Etudier la résistance et la tolérance de ce nouveau taxon vis-à-vis d’autres métaux lourds.

- Etudier le pouvoir dépolluant de cette bactérie en milieu ouvert (non stérile) et en mê me

temps déterminer son pouvoir co mpétitif avec les autres micro-organismes.

- Etudier les mécanismes biochimiques impliqués dans la résistance aux agents antimicrobiens.

-Identifier par la PC R et le Séquençage les groupes et les sous groupes aux quels
appartiennent les •-lacta mases naturelles de cette bactéries, puis rechercher le degré de
similitude entre ces dernières et celles des autres bactéries à Gra m négatif provenant du
milieu clinique et de l’environne ment.

- Etudier la co- régulation entre le système d’efflux des métaux lourds et le système d’import
de l’imipénè me en cas d’éxistance.

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112
 Annexes

A n nexe I

Technique d’éxtraction d’A D N

Elle a été réalisée par utilisation du Wizard ® Geno mic D N A Purification Kit de Pro mega

1/- Préparation de l’échantillon:

Prélever 5 à 10 ml de culture,
Centrifuger à 8000 g pendant 10 mn
Jeter le surnageant et rajouter 480 ml d’E D T A (50 m M), mélanger soigneuse ment puis
transférer le mélange dans eppendorf (1,5 ml) et ajouter :
- 140 ul de TE (10 ml de Tris et 1 m M E D T A)
- 40 ul de lysozy me (20 mg/ul) puis conserver à – 2O° C
Incuber à 37°C pendant 30 mn
Centrifuger 2 mn à 13000 g (=14,5 rp m), jeterle surnageant

2/- Lyse des cellules :

Ajouter 6àà ul de Nucleis Lysis solution, puis mélanger douce ment

Incuber 5 mn à 80°C puis remettre à température a mbiante
Ajouter 3 ul de la solution de Rnase , mélanger et incuber à 37°C pendant 15 mn

3/- Précipitation des protéines :

Ajouter 200 ul de Protein Precipitation solution et vortexer

Incuber pendant 5 mn dans la glace, puis centrifuger à 13000 g durant 3 mn.

4/- Précipitation de l’AD N:

Transférer le surnageant dans un tube propre contenant 600 ul d’isopropanol à température

a mbiante, agiter et centrifuger à 13000 g pendant 2 mn
Jeter le surnageant et ajouter 600 ul d’éthanol à 70 % (froid) et mélanger
Centrifuger à 13000 g durant 2 mn , aspirer tout l’éthanol et laisser sécher à l’air libre pendant
15 mn
Réhydrater l’A D N avec 30 ou 50 ul de Tris 10 mM et incuber à +4°C pendant 18 h ou 1 h à
65°C puis conserver à -20°C.

i
 Annexes

A n nexe I

Spectrophoto m ètre d’absorption ato mique U NIC A M 929

Date : 25/03/08 Te m ps : 11 :03 :56

Fichier : L M D P B. RES

Detail echantillon

U nité conc. Corrigée : Masse no minale : 1.0000

* Identité échantillon. Masse échantillon. Facteur dilution.

1 pH = 5.0 1.0000 1.0000

2 pH = 5.5 1.0000 1.0000
3 pH = 6.0 1.0000 1.0000
4 pH = 6.5 1.0000 1.0000
5 pH = 7.3 1.0000 1.0000
6 pH = 8.0 1.0000 1.0000
7 pH = 8.5 1.0000 1.0000
8 pH = 9.0 1.0000 1.0000

M o de instru ment : flamm e Elément : Plo mb (Pb)

M o de spectro mètre : Densité op.

M o de instru ment : flam me Mode spectro : Densité optique

Longeur d’onde : 217.0 n m Fente : 0.5
Courant lampe : 100 % Correction de fond : En fonction
Haute résolution : En fonction

Type signal : Continu

N o m bre de mesures : 1 Tem ps de mesure : 4.0sec
M o de de rejet : N on

Type flam me : Air-C2 H2 Débit co mbustible : 1.1 l/mn

O xydant oxiliaire :Arrêt Stabilisation flam me : 4.0 sec

M o de d’étalonage : Nor mal Calcul : Courbe seg mentée

Li mites d’excés de courbure : -10 % à +4 %

U nité de concentration : mg/l
Etalon 1 : 1.000
Etalon 2 : 5.000
Etalon 3 : 10.000

Passeur : Arrêt
ii
 Annexes

A n nexe I

Identité échant. * Mesures Signal Conc Corrigée DS R

abs mg/l %

Blanc 1/1 -0.000 0.000

Etalon 1 1/1 0.004 1.000
Etalon 2 1/1 0.018 5.000
Etalon 3 1/1 0.037 10.00

A xe – X : concentration (mg/l)
X interception : 9.099E-002 mg/l
A xe-Y : hauteur signal (Abs)
Y interception : -3.757E-004 Abs
Courbure minimale : 0 %
Courbure maximale :7 %

iii
 Annexes

A n nexe I

Spectrophoto m ètre d’absorption ato mique U NIC A M 929

Date : 25/03/08 Te m ps : 11 :03 :56

Fichier : L M D P B. RES

Detail echantillon

U nité conc. Corrigée : Masse no minale : 1.0000

* Identité échantillon. Masse échantillon. Facteur dilution.

1 pH = 5.0 1.0000 1.0000

2 pH = 5.5 1.0000 1.0000
3 pH = 6.0 1.0000 1.0000
4 pH = 6.5 1.0000 1.0000
5 pH = 7.3 1.0000 1.0000
6 pH = 8.0 1.0000 1.0000
7 pH = 8.5 1.0000 1.0000
8 pH = 9.0 1.0000 1.0000

M o de instru ment : flamm e Elément : Zinc (Zn)

M o de spectro mètre : Densité op.

M o de instru ment : flam me Mode spectro : Densité optique

Longeur d’onde : 213.9 n m Fente : 0.5
Courant lampe : 75 % Correction de fond : En fonction
Haute résolution : En fonction

Type signal : Continu

N o m bre de mesures : 1 Tem ps de mesure : 4.0sec
M o de de rejet : N on

Type flam me : Air-C2 H2 Débit co mbustible : 1.2 l/mn

O xydant oxiliaire : Arrêt Stabilisation flam me : 4.0 sec

M o de d’étalonage : Nor mal Calcul : Courbe seg mentée

Li mites d’excés de courbure : -10 % à +4 %

U nité de concentration : mg/l
Etalon 1 : 1.000
Etalon 2 : 5.000
Etalon 3 : 10.000

Passeur : Arrêt
iv
 Annexes

A n nexe I

Identité échant. * Mesures Signal Conc Corrigée DS R

abs mg/l %

Blanc 1/1 -0.002 0.000

Etalon 1 1/1 0.052 1.000
Etalon 2 1/1 0.230 5.000
Etalon 3 1/1 0.402 10.00

A xe – X : concentration (mg/l)
X interception : 9.099E-002 mg/l
A xe-Y : hauteur signal (Abs)
Y interception : 1.577E-003 Abs
Courbure minimale : 0 %
Courbure maximale : 18 %
v
 Annexes

A n nexe I

Spectrophoto m ètre d’absorption ato mique U NIC A M 929

Date : 25/03/08 Te m ps : 11 :03 :56

Fichier : L M D P B. RES

Detail echantillon

U nité conc. Corrigée : Masse no minale : 1.0000

* Identité échantillon. Masse échantillon. Facteur dilution.

1 pH = 5.0 1.0000 1.0000

2 pH = 5.5 1.0000 1.0000
3 pH = 6.0 1.0000 1.0000
4 pH = 6.5 1.0000 1.0000
5 pH = 7.3 1.0000 1.0000
6 pH = 8.0 1.0000 1.0000
7 pH = 8.5 1.0000 1.0000
8 pH = 9.0 1.0000 1.0000

M o de instru ment : flamm e Elément : Cad miu m (Cd)

M o de spectro mètre : Densité op.

M o de instru ment : flam me Mode spectro : Densité optique

Longeur d’onde : 228.8 n m Fente : 0.5
Courant lampe : 90 % Correction de fond : En fonction
Haute résolution : En fonction

Type signal : Continu

N o m bre de mesures : 1 Tem ps de mesure : 4.0sec
M o de de rejet : N on

Type flam me : Air-C2 H2 Débit co mbustible : 1.2 l/mn

O xydant oxiliaire :Arrêt Stabilisation flam me : 4.0 sec

M o de d’étalonage : Nor mal Calcul : Courbe seg mentée

Li mites d’excés de courbure : -10 % à +4 %

U nité de concentration : mg/l
Etalon 1 : 0.500
Etalon 2 : 1.000
Etalon 3 : 10.000

Passeur : Arrêt
vi
 Annexes

A n nexe I

Identité échant. * Mesures Signal Conc Corrigée DS R

abs mg/l %

Blanc 1/1 -0.000 0.000

Etalon 1 1/1 0.011 0.500
Etalon 2 1/1 0.021 1.000
Etalon 3 1/1 0.194 10.00

A xe – X : concentration (mg/l)
X interception : 6.128E-003 mg/l
A xe-Y : hauteur signal (Abs)
Y interception : -1.316E-004 Abs
Courbure minimale :0 %
Courbure maximale : 4%
vii
 Annexes

A n nexe II

Tableau II a: les caractères morphologiques des souches isolées sur gélose nutritive après 24 à 72h
d’incubation à 30°C.

Souches Etude macroscopique Etude microscopique

R1- O.H
Colonies de 3 mm de diamètre, bombées, opaques, avec 24 h après : cocci, coccobacilles, isolés, en diplo avec
(2002) contour régulier, blanches, laiteuses, muqueuses, lisses qques bacilles courts.
et brillantes 48 h après : cocci isolés et en diplo avec des
coccobacilles
Gram positif et immobiles.
R2- B.E
Colonies de 1 mm de diamètre, bombées avec un centre 24 h après : cocci isolés, en diplo avec des
(2002) opaque et un contour régulier, pigmentées en orange, coccobacilles
muqueuses, lisses et brillantes. 48 h après : cocci isolés, en diplo avec des
coccobacilles
Gram positif et immobiles.

R3- B.E Colonies de 3 mm de diamètre, bombées, avec contour 24 h après : cocci isolés, en diplo avec de courtes
(2002) régulier et un centre opaque de couleur crème chaînettes et des coccobacilles.
48 h après : cocci isolés, en diplo et des coccobacilles
Gram positif et immobiles
R4-B.E
Colonies petites, de 1 mm de diamètre, opaques avec un 24 h après : cocci isolés, en chaînettes et des
(2002) contour régulier et un centre bombé, muqueuses, lisses coccobacilles.
et brillantes de couleur rose. 48 h après : cocci isolésen diplo et en chaînettes
Gram positif et immobiles.
R5-O.H
Colonies petites, de 1 mm de diamètre, opaques, 24 h après : cocci en diplo
(2002) bombées, avec un contour régulier, pigmentées en jaune, 48 h après : cocci isolés, en diplo et en courtes
muqueuses, lisses et brillantes. chaînettes.
Gram positif et immobiles.
R6-B.E
Colonies punctiformes, translucides avec un contour 24 h après : cocci isolés, en diplo, en courtes chaînettes
(2002) régulier, colorées en rose, muqueuses, lisses et avec qques coccobacilles.
brillantes. 48 h après : cocci isolés, en diplo, en courtes chaînettes
avec qques coccobacilles.
Gram positif et immobiles

R1- HAD
(2005) Colonies de 3 mm de diamètre, ± bombées, opaques, 24 h après : cocci isolés, en diplo avec des coccobacilles
rondes avec un contour régulier et complet, de couleur et des bacilles.
crème, lisses, brillantes et non visqueuses. 48 h après : cocci et des coccobaciulles.
Gram positif et immobiles.
R2-ELM
Colonies de 2 mm de diamètre, , ± bombées, opaques, 24 h après: Cocci en diplo avec des coccobacilles et des
(2005) rondes avec un contour complet, lisses, brillantes de filaments.
couleur crème. 48 h après: cocci et coccobacilles.
Gram positif et immobiles.
R3-ELM
Colonies de 2 mm de diamètre, , ± bombées, opaques, 24 h après: Cocci, coccobacilles, batonnets et des
(2005) circulaires avec contour régulier, lisses, brillantes de filaments.
couleur crème et opaques. 48 h après: batonnets et des filaments
Gram positif et immobiles.
R4-HDJ
Colonies de 3 mm de diamètre, bombées avec un centre 24 h après: cocci, coccobacilles, batonnets et des
(2005) concave, opaques de couleur crème avec un centre filaments.
complet, visqueuses, lisses et brillantes. 48 h après: cocci, coccobacilles et des batonnets.
Gram positif et immobiles.

viii
 Annexes

A n nexe II

Suite du tableau II a

R5-HDJ Colonies de 2 mm de diamètre, ± bombées, rondes 24 h après: cocci, coccobacilles, batonnets.

(2005) avec un contour complet, opaques de couleur 48 h après: cocci.
crème, lisses et brillantes. Gram positif et immobiles.

R6-HDJ Colonies de 3 mm de diamètre, rondes avec un 24 h après: cocci, coccobacilles, batonnets et de longs
(2005) contour complet, de couleur crème, opaques, ± filaments.
bombées avec un centre concave, visqueuses, lisses Gram positif et immobiles.
et brillantes.

1YB-R12T Colonies de taille moyenne après 72 h, rondes, 72 h après : filaments branchés ou non, des filaments
(2006) bombées, opaques de couleur jaune ocre qui vire à longs avec qques cocci et des bacilles.
l’orange avec un contour complet, muqueuses, Gram négatif et immobile.
lisses et brillantes.
2YB- R25.OH
(2006) Colonies petites de 2 mm de diamètre, bombées, 24 h après : cocci isolés, en chaînettes, en amas, en
circulaires, de couleur jaune, opaques, lisses et diplo, et batonnets courts.
brillantes. 48 h après : cocci en diplo.
Gram positif et immobiles.
3YB-R18.P
(2006) Colonies de taille moyenne après 72 h , bombées, 24 h après: Cocci, isolés, en amas et en tétrades.
rondes de couleur jaune, opaques à contour 48 h après: Coccci en diplo.
complet, lisses et brillantes. Gram positif et immobile.
4YB-R25JP.OH
Colonies de taille moyenne après 72 h, ± bombées, 24 h apés: cocci isolés, en diplo, en amas, en courtes
(2006) rondes de couleur crème, opaques, lisses et chainettes avec des filaments et des batonnets.
brillantes. 48 h après: cocci et batonnets.
Gram positif et immobiles.
5YB-R25JF.OH
Colonies de taille moyenne après 72 h, ± bombées, 24 h après: cocci, coccobacilles, batonnets et des
(2006) rondes, de couleur beige, opaques à contour filaments.
complet, lisses et brillantes. 48 h après: cocci et batonnets.
Gram positif et immobiles

ix
 Annexes

A n nexe II

Tableau II b : Résultats de l’activité physiologique et biochimiques des souches isolées et

Identifiées.

N° de souche 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1 14 15 16 17 18 19 20 21
0 1 2 3
R 1- O H (2002) A.S + - + - - - - - + - - - - - - - + - + +
R 2-B E (2002) // + - + - - - - - + - - - - - - + + - - -
R 3-B E (2002) // + - + - + - - - - - - - - - - - - - - -
R 4-B E (2002) // + - + - + - - - + - + - - - - + - + - -
R 5- O H (2002) // + - + + - - - - - - + - - - - + - + + -
R 6-B E (2002) // + - + - + - - + - - - - - - - - + - - -
R 1- H A D (2005) // + - + - + - - + - - - - - - - + - - - •
R 2-E L M (2005) // + - + - - - - - - - - - - - - + - - - •
R 3-E L M (2005) // + - + - - - - + - - + - - - - - - + + -
R 4- H D J (2005) // + - + - + - - + - - + - - - - - - + + •
R 5- H D J (2005) // + - + - + - - - - - + - - - - - - - - -
R 6- H D J (2005) // + - + - - - - + - - - - - - - - + + + •
1 Y B- R12 T 2006 // + + + + - - - + - - - - - - - + - - - -
2 Y B- R25.O H 2006 // + + + - + - - - - - + - - - - + - - - -
3 Y B- R18.P 2006 // + + + - - - - - - - + - - - - + - - - -
4 Y B- R25JP. O H 2006 // + + + - - - - - - - + - - - - - - - - -
5 Y B- R25JF. O H 2006 // + - + - - - - - - - - - - - - - - - - -

1: Type respiratoire , 2: catalase , 3: oxydase , 4: nitrate réductase , 5: uréase , 6: B

galactosidase , 7: production d’indole , 8: production d’H2S , 9: hydrolyse de l’amidon , 10:
hydrolyse de l’esculine, 11: hydrolyse de tween 80 , 12: hydrolyse de tween 20 , 13:
hydrolyse de la caséine , 14: lecithinase , 15: hydrolyse de l’A D N , 16: T D A (tryptophane
désa minase)= , 17: A D H (arginine dihydrolase) , 18: O D C (ornithine décarboxylase) , 19:
L D C (lysine décarboxylase) , 20: citrate perméase , 21: hé molyse de sang.

x
 Annexes

A n nexe II

Tableau II c : Com porte ment des souches isolées vis à vis des différents sucres.

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S1 S2 S3 S4 S5
2002 2002 2002 2002 2002 2002 2005 2005 2005 2005 2005 2005 2006 2006 2006 2006 2006

1 + + + + + + + + + + - - + - - + +
2 - - + + - + + - - + + - - - - - -
3 + + + + + - - - - - - - - - - - -
4 - - - - - + + - - - - - - - - - -
5 + + + - + - - - - - - + - - - -
6 - - + - - - - - - - - - - - - - -
7 - - - - - - - + - - + - - - - - -
8 + + - + - - - - - - - - - - - - -
9 - - - - - + + + - - - + - - - - -
10 - - - - - - - - - - + + - - - - -
11 - + - - - + + + + - + - - - - - -
12 - - - - + + + + - - - + + - - - -
13 + - + - - - + + - - - - - + + - -
14 + - + + - - + - - - - - -
15 + - - - - + + + - - - - - - - - -
16 + - - - - - - + - - - + - - - - -
17 - - + - - - - - - - - - +
18 - - - - - - - - - - - - - - - - -
19 - - - - - - - - - - - - + - - - -
20 - - - + - - + + + - - - - - - - -
21 - - - - - - - - - - - - - - - - -
22 - - - - - - - - - - - - - - - - -
23 - - - - - - - - - - - - - - - - -
24 - - - - - - - - - - - - - - - - -
25 - - - - - - - - - - - - - - - - -
26 - - - - + - - - - - - - - - - - -
27 - - - - - - - - - - - - - - - - -
28 - - - - - - - - - - - - - - - - -

1: glucose , 2: lactose , 3: saccharose , 4: mannitol , 5: arabinose , 6: fructose , 7: galactose , 8:

inositol , 9: maltose , 10: m elibiose , 11: rha mnose , 12: raffinose , 13: sorbitol , 14: glycerol ,
15: tréhalose , 16: mannose ,17: adonitol , 18: amygdaline , 19: cellobiose , 20: dextrine , 21:
dulcitol , 22: glysiline , 23: levulose , 24: salicine , 25: sorbose , 26: xylose, 27: amidon, 28:
esculine.

xi
 Annexes

A n nexe II:

Tableau II d : Résultats obtenus de la mesure de la densité cellulaire à • = 600n m en

présence et en absence des métaux lourds et en fonction du pH.

pH 5 5.5 6 6.5 7.3 8 8.5 9

Cultures mères 0.501 0.642 0.771 0.820 1.033 0.991 0.907 0.754
Cultures témoins 0.321 0.362 0.501 0.598 0.888 0.734 0.563 0.522
Cultures avec M L :
Le cad miu m : 0.197 0.233 0.294 0.307 0.444 0.400 0.321 0.301
Le zinc : 0.204 0.311 0.369 0.383 0.547 0.472 0.408 0.314

Le plo mb : 0.331 0.367 0.492 0.550 0.689 0.633 0.471 0.417

Tableau II e : Résultats obtenus du dosage des métaux lourds en mg/l de milieu de culture

pH 5 5.5 6 6.5 7.3 8 8.5 9

2+
[Cd ]r,ions libres 13.26 9 1.079 1.80 15 0.198 1.29 1.80

2+
[Cd ] capturée 86.75 91 98.9 98.2 85 99.80 98.7 98.2
2+
[Zn ] r,ions libres 4.40 2.90 1.46 1.18 5 1.30 5.672 4.14

2+
[Zn ] capturée 95.6 97.1 98.54 98.82 95 98.7 94.33 95.81
2+
[Pb ]r,ions libres 5.7 5.4 3.93 0.78 7.1 0.76 1.83 1.19

2+
[Pb ] capturée 94.3 94.6 96.07 99.22 92.9 99.24 98.2 98.81

xii
 Annexes

A n nexe II

Tableau II f: Résultats de l’antibiorésistance de la souche étudiée

Antibiotiques Diamètres critiques mesurés en mm Résultats (diamètre en mm)

Sensible résistant R I S
Cefalotine ≥ 18 < 12 14 mm
Cefazoline ND ND 18 mm
Cefamandole ≥ 22 < 15 16 mm
Cefuroxime ≥ 22 < 15 10 mm
Cefotaxime ≥ 21 < 15 18 mm
Cefoxitine ≥ 22 < 15 17 mm
Ceftazidine ≥ 21 < 15 22 mm
Cefalexine ≥ 18 < 12 14 mm
carbenicilline ≥ 22 < 17 22 mm
Ampicilline ≥ 19 < 14 16 mm
Amoxicilline ≥ 21 < 14 15 mm
Imipenème ≥ 22 < 17 12 mm
Oxacilline ≥ 20 < 20 22 mm
Piperacilline ≥ 18 < 12 14 mm
Penicilline ≥ 29 <8 14 mm
Tobramycine ≥ 16 < 14 22 mm
Neomycine ND ND
Dibekacine ≥ 16 < 14 13 mm
Amikacine ≥ 17 < 15 23 mm
Kanamycine ≥ 17 < 15 24 mm
Gentamycine ≥ 16 < 14 19 mm
Netilmycine ≥ 19 < 17 30 mm
Streptomycine ≥ 15 < 13 14 mm
Tetracycline ≥ 19 < 17 R
Doxycicline ≥ 19 < 17 22 mm
Acide nalidixique ≥ 22 < 16 R
Ofloxacine ≥ 22 < 16 22 mm
Acide pipemidique ≥ 19 < 14 11 mm
Bacitracine ≥ 15 < 15 19 mm
Colistine ≥ 15 < 15 21 mm
Furanes ≥ 17 < 14 R
Nitrofurantoine ≥ 17 < 14 R
Trimethoprimr + ≥ 16 < 10 15 mm
sulfomethoxazole
Sulfamides ≥ 17 < 12 14 mm
Pristinamycine ≥ 22 < 19 25 mm
Erythromycine ≥ 22 < 17 20 mm
Spiramycine ≥ 24 < 19 20 mm
Chloramphenicol ≥ 23 < 19 24 mm
Vancomycine ≥ 17 ND 22 mm
Acide fusidique ≥ 16 < 15 14 mm
Fosfomycine ≥ 14 < 14 11 mm
Nitoxoline ≥ 30 < 12 33 mm
Flumequine ≥ 25 < 21 24 mm
Lincomycine ≥ 21 < 15 21 mm
Rifampicine ≥ 19 < 14 24 mm

R= résistant, I= résistance intermédiaire, S= sensible, ND= non ddonné

Les diamètres critiques et les profils de sensibilité et de résistance sont déterminés selon les recommandations du comité de
l’antibiogramme de la société Française de microbiologie (2004).
xiii
 Annexes

A n nexe II

- iso- C15: 0 : acide 13- méthyl tétradécanoique

- iso- C17: 0 3-O H : acide 3- hydroxy -5-méthylhéxadécanoique

- iso- C17: 1 w9c : acide o méga-9-cis-15- méthylhéxadécanoique.

xiv
 Résu mé

SUMMARY
In this study, we have isolated fro m different polluted habitats and characterized 17 bacterial
strains. One of the m is identified as a Gra m - negatve, yellow – pig mented, strictly aerobic
designated 1Y B- R12 T,was isolated fro m a soil sa mple hydrocarbon contaminated in Mefteh
city.The temperature and pH optima for growth were 28-30°C and pH = 7.3-8 respectively.
The bacteriu m tolerated up to 0-6 % of Na Cl with an optima at 4 %. Cells were non- motile,
non-spore-forming, with a variable morphological cycle. Fro m results of 16S-rR N A gene
sequences, the strain occupied a distinct lineage within the genus Chryseobacterium and
sho wed moderate relationships to the species C haifense strain H 38 (96.5%). The D N A G+ C
content was 40.9 mol %.The predo minant cellular fatty acids were: anteiso-C 1 5:0 (41.4 %) and
iso-C15: 0 (14 .4 %). On the basis of phenotypic characteristics, che motaxono mic, genotypic
T
and phylogenetic distance, strain 1Y B- R12 T is proposed as a novel species in the family
Flavobacteriaceae and has been assigned to Chryseobacterium solincola.

Results obtained fro m heavy metal resistance study indicated that the novel isolate tolareted
up 500ug/ml of lead, 300ug/ml of zinc and 150ug/ml of cad miu m.The residuel concentration
of metals ions evaluated by spectroscopy - method, determined that the depolluted power of
this bacteriu m is higher than 80 %.

T
The strain 1Y B- R12 T is resistant to11 antibiotics fro m 45 tested and none results is obtained
fro m the genetic transfer. The extraction of plasmidic D N A indicated that the resistance is
coding by the chro mosom e.

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