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INTRODUCTION

1. Problématique

La drépanocytose est une maladie génétique autosomique récessive de

l’hémoglobine caractérisée par une substitution d’un acide aminé de la chaine béta
de la globine. L’expression clinique est variable selon que l’anomalie
chromosomique, est portée à l’état homozygote ou hétérozygote. (1)

La première description de la drépanocytose a été faite en 1910 par Herrick. Il

a noté chez un jeune étudiant originaire de l’ile de Grenade la présence d’hématies
en forme de croissant. La drépanocytose est caractérisée sur le plan moléculaire par
une substitution de l’acide glutamique par la valine au niveau du 6éme codon de la
chaine béta de la globine. L’anomalie génétique responsable de cette substitution a
été découverte vers les années 60 par Vernon Ingram. En effet la mutation porte sur
le gène codant pour la chaine β de la globine. Il y a remplacement du 2éme nucléotide
du 6éme codon (GAG) du chromosome 11 qui est l’adénine par la thymine,
transformant ce dernier en GTG, réalisant ainsi la mutation : (GAG→ GTG) qui
détermine le gène de la drépanocytose. (2)

Ainsi, la drépanocytose fut la première hémoglobinopathie identifiée et la plus

répandue dans le monde. L’OMS compte environ 50 millions d’individus dans le
monde qui sont porteurs du trait drépanocytaire. C’est sur le continent africain et
dans sa diaspora, qu’on compte le plus grand nombre de personnes atteintes de cette
maladie.

En Afrique, la drépanocytose est essentiellement retrouvée dans les régions

tropicales. La prévalence varie entre 10 et 45%, suivant une bande appelée la ceinture
sicklèmique. La majorité ne l’a hérité que d’un des parents et ne présente aucun signe.
Ce sont les porteurs du trait drépanocytaire (AS). (1,3)
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Cependant, de leurs unions naissent les enfants porteurs de la drépanocytose

maladie (SS) avec 25 % des risques à chaque grossesse. Le diagnostic biologique de
la drépanocytose a beaucoup évolué ces dernières années. Jadis c’était uniquement
le test d’Emmel qui était utilisé pour la confirmation biologique de la maladie.

Ce test rapide et simple, permet de reconnaitre en quelques minutes la présence de

l’hémoglobine S dans les globules rouges sans toutefois distinguer la forme
homozygote de la forme hétérozygote. (4)

Aujourd’hui en République Démocratique du Congo, le diagnostic de la

drépanocytose est généralement réalisé par les techniques électrophorétiques.

Cependant, les nourrissons de moins de 6 mois ne peuvent bénéficier d’un diagnostic

sur base de ces techniques en raison de l’interférence de l’hémoglobine fœtale.

Ainsi d’autres méthodes sont indispensables pour un diagnostic précoce.

Parallèlement d’autres techniques ont été mises au point notamment la technique de
biologie moléculaire, basé sur la PCR qui permet une analyse des gènes codant pour
la globine. (5)

2. Question de recherche

Au regard des progrès réalisés, nous nous sommes demandé si les résultats de la
technique moléculaire seraient similaires à ceux de la technique électrophorétique
d’hémoglobine pour le diagnostic des sujets drépanocytaires.

3. Hypothèse

Nous estimons que les deux types d’analyses donneront les mêmes résultats.
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4. Objectif général

L’objectif général de cette étude était de comparer la technique de biologie

moléculaire (PCR) avec la technique de l’électrophorèse d’hémoglobine dans le
diagnostic de la drépanocytose.

5. Les objectifs spécifiques:

 Sélectionner les sujets homozygotes SS et AA et hétérozygotes AS ;
 Procéder au prélèvement sanguin ;
 Effectuer le diagnostic de la drépanocytose par PCR ;
 Analyser les échantillons des mêmes sujets par la technique d’électrophorèse
d’hémoglobine
6. Méthodologie du travail

Pour atteindre les objectifs, la méthodologie consiste à procéder aux

prélèvements des échantillons du sang, Ensuite d’effectuer les analyses moléculaires
(PCR) et analyses électrophorétiques d’hémoglobine pour le diagnostic de la
drépanocytose

7. Intérêt du travail

L’intérêt de ce travail est de fournir les informations sur les deux méthodes de
diagnostic de la drépanocytose, afin de garantir une bonne prise en charge de ces
sujets.

8. Subdivision du travail

Ce travail est subdivisé en deux grandes parties, la première partie se base sur
les généralités et la seconde partie est consacrée sur l’expérimentation au laboratoire
ainsi que sur les résultats et discussion.
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I ERE PARTIE: REVUE DE LA LITTERATURE

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CHAPITRE I: GÉNÉRALITÉS SUR LA DRÉPANOCYTOSE ET LES

TECHNIQUES DE DIAGNOSTIQUE DE LA DRÉPANOCYTOSE

I.1.Generalités sur la drépanocytose

I.1.1. Définition:

La drépanocytose (parfois appelée « anémie falciforme ») est une maladie

génétique qui touche l’hémoglobine, la protéine contenue dans les globules rouges
qui sert à transporter l’oxygène à travers le corps. (6)

La drépanocytose est une maladie génétique autosomale récessive dans

laquelle l’hémoglobine A normale (α2β2) est remplacée par l’hémoglobine S
(α2β2Σ), produit d’une mutation génique sur le gène de la globine β substituant au
niveau du 6ème codon une adénine par une thymidine, aboutissant au remplacement
d’un acide glutamique en valine.

La drépanocytose, est une maladie monogénique héréditaire, à transmission dite

autosomique récessive. Chacun des parents doit transmettre le gène muté à l'enfant
pour que la maladie se déclare chez ce dernier.

Lorsqu'on a reçu un seul allèle muté, on est porteur sain. Ainsi donc, lorsque les deux
parents sont porteurs sains, leur risque de concevoir un enfant souffrant de la maladie
est de 1sur 4, soit 25%. Par contre lorsqu'un couple comporte un porteur sain et un
malade, ce risque est de 1 sur 2 soit 50 %.( 1,6)
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I.1.2. Historique de la drépanocytose

La première description moderne de la drépanocytose remonte peut-être à

1846 avec la publication aux États-Unis de l'autopsie d'un esclave fugitif dépourvu
de rate. Des cas d'esclaves montrant une résistance au paludisme et ayant tendance
aux ulcères de la jambe ont également été décrits.

En 1874, un médecin africain de l'armée britannique originaire de

Freetown, « James Beale » Africanus Horton, décrivit une rhumatic fever, équivalent
clinique de la drépanocytose, correspondant aujourd'hui à une crise vasoocclusive
osseuse, mais ce travail passa inaperçu. (7)

Les caractéristiques anormales des globules rouges ont été décrites pour la première
fois en 1910 par Ernest Irons (en) et James Herrick à partir du cas de Walter Clement
Noel, un étudiant en odontologie d'une vingtaine d'années originaire de la Grenade,
dans les Antilles: ce patient était traité à Chicago pour une anémie depuis 1904, puis
pour des « rhumatismes musculaires » et des « attaques biliaires », avant de mourir
d'une pneumonie à Saint-Georges en 1916.

Ce patient souffrait de toux, de fièvre, de vertiges, de maux de tête et d'un

état de faiblesse, et ressentait des palpitations et un essoufflement, comme certains
membres de sa famille. Son sang montrait qu'il était très anémique, le nombre de ses
globules rouges n'atteignant que la moitié de la valeur normale.

L'observation d'un frottis sanguin montra des globules rouges de forme inhabituelle
en faucille c'est-à-dire « falciforme » ou en feuille d'acanthe, résultat publié en
novembre 1910. (8,9)
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Quelques mois après cette publication, un autre article intitulé exactement de

la même manière « Peculiar elongated and sickle-shaped red blood corpuscles in a
case of severe anemia » décrivit le cas d'un patient admis à l'hôpital de l'université
de Virginie le 15 novembre 1910; la publication qu'en fit Verne Mason en 1922
employait pour la première fois le terme « anémie falciforme » pour définir cette
maladie. (7)

En 1917, Victor E. Emmel parvint à reproduire la falciformation in vitro chez

certains sujets cliniquement sains, et conclut à l'existence de deux formes de la
maladie. Par la suite, des études familiales envisagèrent l'hypothèse d'une
transmission héréditaire autosomique récessive avec des formes manifestes et des
formes latentes ou silencieuses. Les facteurs de falciformation furent précisés, dont
la pression partielle d'oxygène, ainsi que la durée de vie plus courte des globules
rouges falciformes.

C’est en 1933 que furent ainsi décrits la drépanocytose d'une part, et le trait
drépanocytaire d'autre part, grâce aux travaux de Lemuel Diggs, mais il fallut
attendre 1949 pour que James Neel établisse les propriétés génétiques de la maladie
et l'existence d'une forme homozygote héritée de parents hétérozygotes.

C'est également en 1949 que les Américains Linus Pauling et Harvey Itano,
décrivirent la solubilité anormale de l'hémoglobine S et attribuèrent ces anomalies à
la molécule d'hémoglobine elle-même, la discrimination entre hémoglobine S et
hémoglobine A étant réalisée par électrophorèse des protéines; ce fut la première
description de la base moléculaire d'une maladie génétique. (10)
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I.1.3. Épidémiologie

C’est la maladie génétique monogénique (liée à un seul gène) la plus

répandue dans le monde. Selon l’OMS, 300 000 enfants naissent dans le monde
chaque année avec une anomalie majeure de l’hémoglobine dont la plus fréquente
est celle de la drépanocytose. En 2015, la grande majorité de ces naissances ont lieu
dans trois pays: Nigéria, République Démocratique du Congo, Inde.

L’allèle « S », responsable de l’anomalie, est surtout répandu dans le continent

africain (avec une fréquence de 30% chez certaines populations); on le trouve
également en Inde, en Arabie saoudite et dans d’autres régions du bord de la
Méditerranée, en Italie (surtout en Sicile), en Grèce et en Anatolie. Les migrations
ont accru la fréquence de cette maladie sur le continent américain. (11)

La drépanocytose est une maladie fréquente en RDC. Les données

épidémiologiques récentes montrent que 2 % des nouveau-nés sont homozygotes
pour drépanocytaires ont lieu chaque année en RDC. Si ce chiffre est significatif au
point de vue épidémiologique, la maladie reste peu connue, avec pour conséquence
une forte mortalité dans un pays aux ressources limitées. Cliniquement, la
drépanocytose crises douloureuses appelées crises vaso-occlusives et une
susceptibilité aux infections. (11,10)

I.1.4. Bases physiopathologique et génétique de la drépanocytose

I.1.4.1.Génétique

 Rappel sur l’hémoglobine

L'hémoglobine est la protéine des globules rouges assurant le transport de

l'oxygène dans le sang. Il s'agit d'un hétérotétramère constitué de deux paires
identiques de deux sous-unités de types différents.
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L'une de ces sous-unités est dite α (alpha) et est codée par un gène situé sur le
chromosome 16 tandis que l'autre sous-unité est codée par un gène du chromosome
11 et est soit de type β (bêta), γ (gamma) ou δ (delta), donnant respectivement
l'hémoglobine A de formule α2β2 et notée HbA, l'hémoglobine F de formule α2γ2 et
notée HbF, et l'hémoglobine A2 de formule α2δ2 et notée HbA2. L'hémoglobine A
est de loin la plus abondante des trois, constituant environ 95 % de l'hémoglobine
totale d'un adulte sain. (12)

 Cause génétique de la drépanocytose

La drépanocytose résulte de la substitution d'une seule base nucléique dans le

gène HBB codant la chaîne β de l'hémoglobine A : une paire adénine–thymine est
inversée dans la double hélice de l'ADN, ce qui conduit à remplacer un résidu
d'adénine par une thymine dans le codon du brin d'ADN sens correspondant au
glutamate en position 6, qui se trouve de ce fait remplacé par une valine dans le
produit de transcription. Il s'agit d'un polymorphisme nucléotidique. (4)

La chaîne β produite ne diffère donc d'une chaîne β normale que par un seul résidu
d'acide aminé, en position 6 selon la nomenclature historique, ou 7 selon la
nomenclature actuelle. L'hémoglobine résultante est dite S, initiale du mot anglais
sickle signifiant « faucille », et est notée HbS, de formule α2βS2.

Cette mutation s'est probablement produite plusieurs fois de manière indépendante

dans des zones géographiques distinctes, comme le suggèrent les études par enzymes
de restriction. Ces haplotypes sont dits Sénégal, Bénin, Cameroun, Bantu (originaire
d'Afrique centrale) et arabo-indien (péninsule arabique et sous-continent indien).

Ils ont une certaine importance clinique, car certains sont associés à une production
accrue d'hémoglobine fœtale HbF, notamment Sénégal et arabo-indien, d’avantage
que Bénin et Cameroun, ce qui tend à atténuer les complications de la maladie. (13)
 P a g e | 10

 Transmission héréditaire et formes composites :

La drépanocytose est une maladie génétique à transmission autosomique
récessive. Cela signifie que la mutation affecte un chromosome homologue non
sexuel (autosome), et que seuls les homozygotes porteurs de deux allèles mutés
(notés SS) sont affectés par la maladie.
Les hétérozygotes porteurs d'un allèle muté S et d'un allèle normal A (notés SA)
expriment ces deux allèles, car l'allèle S est codominant. On dit de ces personnes
qu'elles ont le trait drépanocytaire: elles sont généralement dépourvues des
symptômes de la drépanocytose, de sorte qu'on parle de porteurs sains, présentant
simplement des hématies falciformes, ou plus ou moins sujettes à la falciformation,
qui ne contiennent pas nécessairement un mélange en proportions égales d'HbA et
d'HbS. (14)
Compte tenu du caractère autosomique récessif de la transmission de cette
maladie, la probabilité de mettre au monde un enfant drépanocytaire est de 100 % si
les deux parents sont eux-mêmes atteints de drépanocytose, de 50 % si l'un des deux
parents est drépanocytaire tandis que l'autre est porteur du trait drépanocytaire, de
25 % si les deux parents sont porteurs du trait drépanocytaire, et est nulle si l'un des
deux parents est sain et ce même si l'autre parent est drépanocytaire.
Il existe parallèlement des hétérozygotes dits composites, ou doubles, associant
la drépanocytose (allèle S) avec une autre hémoglobinopathie, notamment
l'hémoglobine C, voire l'hémoglobine E (thalassémie β). La forme SC est la plus
courante d'entre elles, formant une hémoglobine HbSC de formule α2βSβC. (14, 15)
 Avantage de l’état hétérozygote AS

La drépanocytose est l'exemple type de maladie offrant un avantage

hétérozygote par rapport aux formes les plus graves de paludisme, dues au
Plasmodium falciparum : les hétérozygotes AS bénéficient d'une protection estimée
 P a g e | 11

Entre 60 et 80 % contre ce paludisme, ce qui signifie qu'ils ont une susceptibilité

réduite à cette infection, et qu'ils présentent des symptômes atténués lorsqu'ils sont
touchés. Les homozygotes drépanocytaires SS, en revanche, sont encore plus
vulnérables au paludisme que les personnes saines (homozygotes AA), au point que
cette maladie est le principal déclencheur de crises drépanocytaires chez ces patients
dans les zones impaludées. (14)

I.4.1.2. Bases physiopathologiques

Au cours de la désoxygénation qui suit le passage dans la microcirculation la

molécule d’HbS subit un changement de conformation. Le remplacement de l’acide
glutamique β6 hydrophile par une valine hydrophobe fait que cette dernière établit
des liaisons hydrophobes avec d’autres résidus hydrophobes sur la chaîne β
d’une autre molécule de désoxy-HbS.

Un polymère se forme et s’allonge en fibres hélicoïdales qui se regroupent, se

rigidifient, et provoquent la falciformation, déformation cellulaire caractéristique des
globules rouges classiquement en forme de faucille. (16)

De longues fibres d'HbS rigides et insolubles se forment donnant une

gélification. Les érythrocytes perdent leur déformabilité et leur plasticité et prennent
un aspect caractéristique en faucille (drépano ou sickle).

Les molécules d 'Hb polymérisées mènent à la falciformation des érythrocytes,

lesquels peuvent se trouver coincés dans les petits vaisseaux sanguins, causant ainsi
une vaste gamme de complications graves sur le plan clinique et une hausse du taux
de mortalité chez les personnes affectées.
 P a g e | 12

Cette hématie de forme anormale tend à se bloquer dans les petits vaisseaux
formant des thromboses; le trouble circulatoire qui en résulte aggrave la désaturation
locale en oxygène et par conséquent la falciformation. (17)

La formation de polymère drépanocytaire dans un globule rouge entraîne deux

phénomènes interdépendants:

 la vaso-occlusion

 L’hémolyse.

 Vaso-occlusion :

Les membranes de globules rouges sont anormalement endommagées et adhèrent

anormalement à d’autres cellules et tissus (endothelium, plaquettes…) et provoquent
une cascade de micro-blessures. Une adhérence cellulaire accrue peut causer des
ischémies et exacerber l’hémolyse.

Les douleurs aiguës et chroniques sont les effets à long terme des crises vaso-
occlusives (CVO). (4)

 Hémolyse et vasculopathie :

La prééminence des CVO a longtemps placé l’hémolyse au second plan dans

la recherche des mécanismes intimes de physiopathologie drépanocytaire. Depuis
une dizaine d’années pourtant, les travaux du groupe de M.T. Gladwin ont mis en
lumière son importance potentielle.

La régulation du tonus vasculaire dépend d’un équilibre subtil entre des médiateurs
produits par l’endothélium tels l’endothéline-1 (ET-1), à action vaso-constrictrice, et
le monoxyde d’azote (NO), à action vaso-dilatatrice. (4)
 P a g e | 13

Dans la drépanocytose, le NO est abaissé et ET-1 est augmentée,

particulièrement lors des CVO. Il en résulte un état vaso-constrictif susceptible de
participer aussi au ralentissement du flux circulatoire et au maintien voire à la
précipitation de la CVO. Or l’Hb est l’agent destructeur de NO le plus puissant connu.
L’Hb libre détruit le NO mille fois plus rapidement que l’Hb dans le globule rouge
en générant des radicaux libres. Cette déplétion en NO est encore accrue par le fait
que l’hémolyse libère aussi l’arginase érythrocytaire dans le plasma où celle-ci
dégrade la L-arginine, substrat de l’enzyme produisant le NO : la NO synthase
endothéliale. (14)

I.1.5. Aspects Cliniques

I.1.5.1. Chez les drépanocytaires homozygotes

Les signes cliniques de la maladie débutent dans les premiers mois ou les
premières années de la vie, quand l’hémoglobine S a progressivement remplacé
l’hémoglobine F. La symptomatologie clinique comporte trois situations : les phases
stationnaires, les complications aiguës et les complications chroniques.

L’anémie est constante (muqueuses et téguments pâles), l’ictère conjonctival est

variable, la splénomégalie est constatée dès les premiers mois de vie. Cette
splénomégalie persiste quelques années pour disparaître spontanément
(autosplénectomie).

La croissance staturopondérale et le développement pubertaire sont généralement

normaux. On peut observer également un épaississement des os de la voûte du crâne;
ostéoporose parfois importante des os du rachis avec un aspect concave des plateaux
vertébraux réalisant la vertèbre en H lorsqu’il s’y associe une dépression centrale.
(18,19)
 P a g e | 14

On observe quelques complications aigues et chroniques:

- Crises douloureuses drépanocytaires: Désignées sous le terme de crises

vaso-occlusives, elles se caractérisent par leur grande fréquence.

Elles peuvent être spontanées ou provoquées par un facteur comme l’infection, le

froid, la fatigue, la fièvre, la déshydratation et toute situation entraînant une
hypoxémie.

- Infections: pneumopathie et ostéomyélites (salmonelles et les

staphylocoques). Les méningites et les septicémies à pneumocoque sont les
infections les plus graves chez l’enfant car elles mettent en jeu le pronostic
vital et laissent des séquelles (complications neurosensorielles).

- Accidents vaso-occlusifs graves (20,21):

 Déficits neurologiques et sensoriels: Hémiplégie, monoplégie, amaurose.

En raison de la gravité de ces accidents, le dépistage systématique des sténoses
des artères intracrâniennes par Doppler transcrânien fait partie des examens
qui doivent être faits régulièrement chez les enfants drépanocytaires.
 Syndromes thoraciques aigus: définis par l’association: douleur, dyspnée,
image pulmonaire radiographique anormale (atteinte alvéolaire).

- Ulcères de jambe: Ils siègent dans les régions des chevilles et sont favorisés
par les traumatismes. Leur guérison est difficile à obtenir et la récidive est la
règle.

- Nécroses osseuses: Les hanches et les épaules sont les principales

articulations intéressées. Ces nécroses sont d’abord asymptomatiques, puis
elles sont responsables de douleurs et de gêne fonctionnelle (boiterie,
limitation de l’abduction).
 P a g e | 15

- Complications oculaires: les plus fréquentes sont les rétinopathies

prolifératives.

- Complications rénales: elles sont précoces et longtemps infracliniques.

- Complications pulmonaires et cardiaques: infarctus pulmonaires,

infections pulmonaires répétées, insuffisance cardiaque.

- Complications hépatobiliaires: lithiase biliaire pouvant se compliquer de

cholécystite aiguë.

I.1.5.2. Chez les drépanocytaires hétérozygotes:

Les hétérozygotes A/S ne sont habituellement pas symptomatiques, mais

peuvent cependant faire des infarctus spléniques en situation d’hypoxie sévère.
L’hémogramme est normal et il n’y a pas de drépanocytes circulants. Le test
d’Emmel exposant les GR à l’hypoxie provoque leur falciformation.

L’électrophorèse de l’Hb montre 55 à 60% d’Hb A, 40 à 45% d’Hb S et 2 à 3% d’Hb

A2. Ces sujets doivent être informés du risque de transmission de la maladie sous
forme homozygote. (19)

I.1.6. Aspects biologiques

La drépanocytose homozygote est caractérisée par un taux d’hémoglobine situé

entre 7 et 9 g/dl, un volume globulaire moyen normal, une réticulocytose entre
200000 et 600000/mm3 Il est habituel d’observer une hyperleucocytose à
polynucléaires neutrophiles pouvant atteindre 30 000/mm3.

Le frottis sanguin objective des drépanocytes sans infection et une tendance à la

thrombocytose.
 P a g e | 16

L’électrophorèse de l’hémoglobine met en évidence la présence d’hémoglobines

S, F et A2. Il n’y a pas d’Hb A.Le test de falciformation (ou le test de solubilité)
sont indispensables pour confirmer la nature drépanocytaire de l’hémoglobine
migrant à l’endroit de l’hémoglobine S. (4)

I.2. Généralités sur les techniques de diagnostic de la drépanocytose

I.2.1. Diagnostic phénotypique de la drépanocytose

 Test d'Emmel ou test de falciformation

Le TE ou test de falciformation est le 1er test d'orientation à réaliser en cas de

suspicion de la drépanocytose. Il repose sur la mise en évidence au laboratoire de la
falciformation des hématies en hypoxie, témoin de la présence d'hémoglobine S.

La désoxygénation est accélérée soit en rajoutant du métabisulfite de sodium à 2%

au sang du malade, soit en créant artificiellement une atmosphère pauvre en oxygène
en accolant les bords de la lamelle à la lame à l'aide de vernis.

On observe alors à l'état frais, entre lame et lamelle, les hématies qui prennent
progressivement la forme typique en "faucille". Ce test est peu sensible, contre-
indiqué avant l'âge de 6 mois; et ne différencie pas le profil SS du profil AS. (22)

 Test de solubilité ou test d'ITANO

Les tests de drépanocytose sont principalement basés sur la polymérisation de

l'HbS à l'état désoxygéné. Le test de solubilité est le plus largement utilisé de nos
jours.

Son principe repose sur l'insolubilité de l'HbS en présence de tampon phosphate

concentré, d'un agent hémolysant, et de dithionate de sodium.
 P a g e | 17

Ces agents cristallisent l'HbS et précipitent les cellules, qui réfractent la lumière
et provoquent la turbidité de la solution. Le résultat est comparé à des contrôles
négatifs et positifs.

Ce test est facile à réaliser et peu coûteux. Toutefois, Il souffre d'un résultat
faussement négatif lorsqu'il est réalisé chez les nouveau-nés, du fait de quantité
excessive d'hémoglobine F, et lorsque l'HbS est inférieure à 10% de l'hémoglobine
totale.

De plus, des résultats faussement négatifs sont observés chez les patients présentant
une Co-hérédité du trait a-thalassémique et une anémie sévère.

En revanche, des faux positifs sont observés chez les patients présentant une viscosité
sérique élevée, une érythrocytose, une leucocytose très marquée et dans certains cas
une anémie. (22, 23)

De plus, les tests de solubilité drépanocytaire ne permettent pas de différencier le

trait drépanocytaire (SCT) et le SCD, et ils sont insensibles à la détection de
l'hémoglobine AS (Hb AS). Ce qui limite leur utilisation dans les programmes de
dépistage.

 Electrophorèse d'hémoglobine

L'électrophorèse est un type de techniques de chromatographie. Elle est

considérée comme l'un des tests importants utilisés pour détecter les variants de l'Hb.

Dans ce test, un champ électrique est appliqué pour faciliter la migration des
molécules chargées électriquement. Le premier variant d'hémoglobine HbS décrit en
utilisant l'électrophorèse date de 1949. (24)
 P a g e | 18

Pour identifier les variants d'hémoglobine, on recourt aux différents pH et milieux,

parmi laquelle on peut citer: l'électrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin.

L'électrophorèse alcaline est un outil de diagnostic qui a été utilisé pour détecter la
thalassémie et l'anémie falciforme à pH 8, 4. Tout d'abord, un hémolysat est préparé
à partir des globules rouges; puis, il est ajouté à une bande de cellulose et un tampon
de rodage à une tension constante dans une chambre d'électrophorèse. En
conséquence, les différents types d'hémoglobine avec des charges nettes différentes
sont séparés en différentes bandes en fonction de leur mobilité.

L'électrophorèse de l'hémoglobine est capable de différencier l'HbS et l'HbC. Ce sont

les deux variantes les plus cliniquement significatives.

Cependant, l'électrophorèse ne distingue pas les variants d'hémoglobine avec les

mêmes charges électriques et donne les mêmes schémas de migration, tels que HbD
et HbG, qui co-migrent avec HbS; HbE et Hb0-Arab ont une migration similaire vers
les molécules HbC.

De plus, l'électrophorèse alcaline peut être affectée par la présence de quantités

accrues d'hémoglobine F chez les nouveau-nés, qui peuvent parfois dominer la bande
d'électrophorèse plus petite.

Par conséquent, certaines précautions supplémentaires doivent être prises afin de

détecter de manière fiable l'HbS.

De plus, des plus petites bandes telles que l'HbA2, HbH et Hb Bart peuvent parfois
manquées. Par conséquent, un test plus efficace devrait être utilisé comme test de
diagnostic pour surmonter ces limitations. (25, 26)
 P a g e | 19

L'électrophorèse capillaire a été documentée pour séparer les fractions d'Hb et

diagnostiquer la drépanocytose et la thalassémie. L'électrophorèse capillaire sépare
la protéine dans une colonne de silice fondue non traitée de manière fiable.

Des méthodes entièrement automatisées telles que le système CAPILLARYS 2 sont

disponibles sur le marché depuis le début des années 2000 (24,27).

I.2.2. Les techniques électrophorétiques

I.2.2.1. Techniques de l'isoélectrofocalisation (IEF)

La focalisation isoélectrique (IEF) est une méthode à haute résolution pour

séparer les protéines en fonction de leurs points isoélectriques (pl). Les molécules
d'Hb traversent un gradient de pH jusqu'à ce qu'elles atteignent leurs points
isoélectriques où la charge nette est nulle. Les molécules d'Hb précipitent et
apparaissent comme une bande nette.

Cette technique permet de détecter facilement l'HbS et l'HbA dans une concentration
élevée d'HbF. De plus, il sépare l'Hb D-Punjab de l'HbS.

Généralement, il peut fournir le résultat en 45 min. Bien que l'IEF soit relativement
coûteux et nécessite un personnel hautement qualifié pour interpréter les résultats en
raison du plus grand nombre de bagues, il est toujours considéré comme le test
standard pour le dépistage néonatal, car il nécessite un très petit volume d'échantillon
et peut être utilisé avec du sang séché. (25)

 Principe

L'isoélectrofocalisation est une technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide

en gradient de pH, sous voltage élevé.
 P a g e | 20

Les hémoglobines sont séparées grâce à leur point isoélectrique. La visualisation

définitive des fractions hémoglobiniques est réalisée par une brève fixation par
l'acide trichloracétique.

Le pouvoir de résolution de cette technique est proche de celui des meilleures

techniques chromatographiques. Elle permet d'identifier les hémoglobines anormales
chez l'adulte par comparaison de la position isoélectrique du mutant inconnu avec
celle d'un mutant de référence.

Elle permet de détecter les hémoglobines anormales chez le nouveau-né alors que
l'hémoglobine F est le composant hémoglobinique majeur dans les premiers mois de
la vie. Permet aussi de caractériser l'hémoglobine S.

C'est la technique de référence pour le diagnostic néonatal des

hémoglobinopathies; elle peut alors être réalisée à partir de quelques gouttes de sang
recueillies sur un papier buvard. Elle individualise précisément l'hémoglobine C.
l'hémoglobine E se distingue très discrètement des hémoglobines A2 et C. (24)

I.2.2.2. l'électrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin

Les techniques de séparation électrophorétique appliquées à un hémolysat permettent,

dans des conditions physico-chimiques bien déterminées, de séparer les différents
types d'hémoglobines.

C'est la technique standard la plus simple à mettre en œuvre. Elle sépare les
différentes hémoglobines en fonction de leur charge et de la position de l'acide aminé
muté dans la molécule, les hémoglobines qui ont un gain de charge positive migrent
plus lentement vers l'anode. Elle permet une bonne séparation des différentes
fractions hémoglobiniques normales: A, F, A2 et le dépistage des syndromes
thalassémiques.
 P a g e | 21

Cependant il faut doser l'hémoglobine A2 pour confirmer le diagnostic de et utiliser

un autre système de séparation pour identifier les hémoglobines anormales. (28,29)

I.2.2.3. l'électrophorèse sur agar à pH acide

Cette technique complète l'électrophorèse à pH alcalin. La migration d’une

hémoglobine anormale en agar dépend d'abord de la localisation de la mutation et
secondairement du changement de charge; cette migration résulte de
l’électroendosmose, de la liaison à l'agaropectine et de l'effet de l'ion citrate.

En effet, elle permet de séparer les variantes ayant la même mobilité que les
hémoglobines A, S ou C sur acétate de cellulose. Elle permet une très bonne
séparation des hémoglobines A et F, ce qui n'est pas le cas dans l'électrophorèse à
pH alcalin, peut permettre de caractériser

L’hémoglobine S, l'hémoglobine C’est la plus lente de toutes les hémoglobines

anormales et l'hémoglobine E se distingue des précédentes car elle migre comme
l'hémoglobine A, contrairement aux deux autres.

Cependant la mise en évidence de mutants de même mobilité que l'hémoglobine A

n'est pas possible par cette seule technique. De plus, les anomalies qualitatives
observées sur les tracés doivent être précisées par dosage.

Cette technique est extrêmement sensible aux conditions expérimentales et leur

reproductibilité est difficile (27,28).

I.2.2.4. L'électrophorèse des chaînes de globine

Cette électrophorèse est réalisée en gel de polyacrylamide en milieu acide

dissociant, c'est-à-dire en présence d'urée 8M et d'un détergent le Triton-XlOO.
 P a g e | 22

Cette technique met en évidence toute substitution d'acides aminés impliquant une
différence d'hydrophobicité de la chaîne latérale de l'acide aminé concerné, même en
l'absence de différence de charge.

Elle permet de séparer les deux chaînes 'Y qui ne diffèrent entre elles que par un
résidu méthyl (y136 Ala ou Gly). Cette technique permet la séparation de la chaîne
de globine normale et de la chaîne mutée de l'hémoglobine instable (30).

I.2.3. Diagnostic génotypique de la drépanocytose

Plus de 300 maladies génétiques humaines différentes sont causées par des
mutations d'un seul gène. De fait, une maladie ou un dysfonctionnement dû à un gène
défectueux apparait dans environ 1 % de la population humain. Des mutations qui
entraînent la synthèse de protéines anormales peuvent ainsi donner des maladies
comme la drépanocytose (mutation de la des hématies). La détection d'une maladie
génétique n'est pas toujours strictement dépendante des techniques de biologie
moléculaire (4, 31).

I.2.3.1. Polymerase chain reaction (PCR) dans le diagnostic de la drépanocytose

La Polymerase Chain Reaction (PCR) est une technique de biologie moléculaire

d'amplification génique in vitro, qui permet de dupliquer en grand nombre une
séquence d'ADN ou d'ARN déterminée et spécifique, à partir d'une faible quantité
d'acide nucléique.

Elle a été décrite en 1985 par K Mullis et coll. Elle se déroule dans un tube PCR qui
est introduit dans un Thermocycleur (appareil sur lequel on peut programmer des
cycles de durée et de température variables). (30)

Le principe consiste à faire le diagnostic de la mutation ponctuelle au niveau du

gène de la drépanocytose par une nichée.
 P a g e | 23

Au cours de cette technique, le produit issu d'une première PCR est de nouveau
amplifié à l'aide d'un second couple d'amorce, qui s'hybride à une partie interne
(nichée) de la séquence amplifiée d'hybridation, elles se positionnent en face de leurs
séquences complémentaires respectives. Puis en faisant agir une ADN Polymérase
(Taq Polymérase), chaque amorce est allongée dans le sens 5' ------ 3' d'une séquence
exactement complémentaire du brin recopié. (25, 32)

La mutation drépanocytaire conduit à la suppression d'un site de l'enzyme de

restriction Bsul. Il est donc possible de détecter la présence ou l'absence de la
mutation par l'utilisation de cette enzyme. La région contenant ce site de restriction
est amplifiée par PCR à partir de l’ADN génomique du patient à tester (33).

 Milieu réactionnel (32, 33,17)

Le milieu réactionnel de la PCR comporte plusieurs composants, tels que: l'ADN à

amplifier, les amorces (sens et anti-sens), les dNTP, un tampon d'amplification
(MgCl2 ou Mg2+), la Taq polymérase.

Ces deux derniers composants définissent un milieu avec un pH optimal et une

concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de l'enzyme.

 L'ADN

L'acide désoxyribonucléique est une macromolécule contenant l'ensemble de

l'information génétique et est ainsi, le support de l'hérédité. Il permet de constituer le
génome des êtres vivants et se transmet lors de la reproduction. Il se compose d'un
sucre, d'une base azotée et d'un phosphate; l'ensemble est appelé nucléotide. Le sucre
et le phosphate forment le « squelette » de la molécule d'ADN tandis que les bases
azotées se succèdent pour former le brin d'ADN.
 P a g e | 24

 Amorce :

Ce sont des courts fragments d'ADN généralement constitues d'une vingtaine de

désoxyribonucleotides. Ils sont capables de s'hybrider de façon spécifique, par
complémentarité des bases, sur l'un des deux brins d'ADN. Les amorces sont choisies
de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier. Dans la réaction, les amorces
sont en très forte concentration par rapport à celle de l'ADN à amplifier.

 dNTPs (desoxynucleotide triphosphate d'ATP) :

Ce sont des molécules de base, constituant l'ADN, et qui sont utilisés par la Taq
polymérase afin de synthèse le nouveau brin d'ADN complémentaire.

Un mélange de quatre nucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) utilisé

par la Taq polymerase lors de l’élongation.

 Cofacteur et Tampon d’amplification:

Le cofacteur est une substance dont la présence est nécessaire en plus d'une enzyme
pour qu'une réaction se déroule. Le magnésium (Mg2+) est le cofacteur le plus
couramment utilisé.

Le tampon d’amplification utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH

du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq Il contient souvent des cations
bivalents Mg2+ servant de cofacteur.

 Taq polymérase :

La Taq polymérase est un exo nucléase extrait de la bactérie Thermos aquatiques,

qui vit dans les sources d’eaux chaudes et résiste à des températures supérieures à
100°C, avec une température optimale d'action à 72°C.
 P a g e | 25

L'enzyme utilisée est une polymérase, c'est-à-dire qu'elle peut synthétiser un nouveau
brin d'ADN à partir du brin d'ADN matrice après s'être fixée à une amorce.

 Le déroulement de la réaction

La PCR est une technique automatisée au cours de laquelle la réaction fait dans un
Thermocycleur. Cet appareil contient un bloc chauffant dans lequel on insère les
différents tubes contenant notre mélange pour la réaction de PCR, et un clavier pour
la programmation de cycles. Le Thermocycleur est alors programmé pour effectuer
les différents cycles de la PCR. Ainsi donc, chaque cycle est composé d'une
succession de paliers de température prédéterminée, et d'une durée bien définie.
Chaque cycle est donc constitué de trois périodes différentes:

 dénaturation,
 hybridation;
 élongation.

La température et temps, dépendent essentiellement de la taille de la séquence à

amplifier, ainsi que de la taille et de la composition en désoxyribonucléotides des
amorces.

 Détection et analyse des produits PCR

La détection des produits de PCR varie selon le mode de PCR, dans la PCR classique,
la détection est faite en end-point (à la fin des réactions de PCR).

Le produit d'une PCR est constitué d'un ou de plusieurs fragments d'ADN (la ou les
séquences d'intérêt). La détection se fait grâce aux enzymes de restriction.
 P a g e | 26

I.2.3.2. Application de la PCR dans le diagnostic de la drépanocytose

L’approche moléculaire est complémentaire de l’analyse biochimique. Elle est

basée sur l’extraction de l’ADN et son analyse en vue de déterminer la nature et la
localisation de la mutation responsable de la drépanocytose. Les deux techniques les
plus utilisées dans le diagnostic moléculaire de la drépanocytose sont la RFLP et le
séquençage, toutes deux basées sur l’analyse des produits de PCR de l’ADN à
étudier. (4)

 PCR-RFLP dans le diagnostic de la drépanocytose (34)

C’est la technique de biologie moléculaire utilisée pour le diagnostic de la

drépanocytose. Elle consiste à faire le diagnostic de la mutation ponctuelle au niveau
du gène de la drépanocytose. Ce n’est pas un examen de routine, mais il est proposé
dans les pays développés lorsque les parents sont porteurs de la mutation.
Il existe dans le génome de nombreuses substitutions ou insertions nucléotidiques
détectables par les enzymes de restriction.

Ces enzymes clivent l’ADN quand elles rencontrent une séquence de bases
spécifique (site de restriction). La mutation peut aussi abolir le site de clivage de
l’enzyme.

Le résultat dans les deux cas donne lieu à des différences (« polymorphismes »)
dans la longueur des fragments de l’ADN générés par rapport au témoin de référence
d’où le terme RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisme).

En pratique, la technique consiste à amplifier par PCR un fragment d'ADN supposé

contenir la mutation (sur la base de l’analyse biochimique), puis à le digérer par une
enzyme de restriction spécifique de la zone mutée. Les fragments obtenus sont alors
analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou agarose. (9)
 P a g e | 27

DEUXIEME PARTIE: PARTIE EXPERIMENTALE

 P a g e | 28

CHAPITRE II: MATERIEL ET METHODES

II. 1. MATERIELS
II.1.1. Site et période de l`étude
Notre étude s’est déroulée dans les laboratoires du Centre de Génétique Humaine
de l'UNIKIN et du laboratoire de chimie et hématologie de l'UNIKIN.

Notre étude s’est déroulée durant la période allant du 1er février au 20 Juillet 2023.

II.1.2. Types et population d`étude

Nous avons mené une étude prospective comparative, descriptive et analytique.

Notre population d’étude était constituée des sujets porteurs ou non du trait
drépanocytaire.

II.1.3. Matériel biologique

Le matériel biologique pour cette étude est l’échantillon du sang du total.

La procédure du prélèvement est présentée dans la partie annexe.

II.1.4.1. Matériels de laboratoire

Tout au long de notre période d'expérimentation au laboratoire nous avions utilisé

les matériels suivant:

 Membrane d’acétate de cellulose ;

 Cuve à électrophorèse ;
 Générateur du courant électrique ;
 Papier buvard ;
 Applicateur ;
 Plaque d’alignement ;
 P a g e | 29

 Microtube à hémolyse ;
 Gants ;
 Portoir tube ;
 Tips ;
 Eppendorf ;
 Cool rack ;
 Strip PCR ;
 Chronomètre ;
 Micropipettes
 Vortex ;
 Thermocycleur (Marque Thermo Fischer scientific veriti);
 Le Transilluminateur UV (VWR) ;
 Bain-marie ;
 Gants nitrile
 Centrifugeuse réfrigérée ;
 Nanodrop (Spectrophotomètre) ;
 Tubes de centrifugation plastic conique de 50ml ;
 Glace ;
 Cool box;
 Accumulateur de froid;
 Réservoir des déchets liquides dangereux ;
 Papier essuie-tout;
 Centrifugeuse
 Mini tube à essai support
 Pipette pasteur
 Bougie;
 Allumette;
 P a g e | 30

 Tubes EDTA
 Micropipettes multicanaux;
 Peigne
 Seringue;
 Ouate ;
 Moule;
 Hameçon à base de pipette pasteur
 Ordinateur pour le Nanodrop

II.1.4.2. Réactifs
 Tampon Red Cell Lysis (RCL)
 Tampon SE (sodium EDTA)
 Protéinase K
 SDS 10%
 NaCl 5M
 Isopropanol ou éthanol à 96%
 TE : Tris EDTA
 Tube d’eppendorf 1,5ml
 Éthanol 70%(-20°C)
 Tampon pH 9.2
 TBE
 Gel red (Biotium TM)
 Dinucléotides triphosphate (dATP. dCTP, dGTP, dTTP : marque Invitrogen)
 Taq polymérase (Roche TM)
 Amorces (100 mM Sens : 5’TTGGAGCCACACCCTAGGGCTG 3’ et
Anti-sens : 5’CATCAGGAGTGGACAGATCC 3’ Marque IDT);
 Endonucléases (Ddel, Marque Thermo scientific) ;
 P a g e | 31

 Bleu de Bromophénol
 Solution DNA AWAY
 Tampon d’amplification Mg2+ (Roche)
 Agarose Ultra-pure (Invitrogen);
 Marqueur de poids moléculaire 1kb (Invitrogen)

II.2. Méthodes
II.2.1. Techniques d’échantillonnage
Les prélèvements de sang total ont été faits sur tube EDTA sur lequel étaient
mentionnés le nom et le prénom de sujets d’étude ainsi que le numéro d'identification
du prélèvement. Les échantillons étaient conservés au réfrigérateur dans les tubes
EDTA à une température allant de 2 à 8 ºC.

II.2.2. Critères de sélection

 Critères d’inclusion: étaient inclus dans l’étude, une population de 30
patients venus durant notre période d’étude au sein du laboratoire de
Génétique humaine de la faculté de médecine (UNIKIN).
 Critères de non inclusion: n’ont pas été inclus toutes les personnes n’ayant
pas étaient reçues durant notre période d’étude.

II.2.3. Méthode de l’électrophorèse sur la membrane d’acétate de cellulose

 Principe :
Elle consiste à faire migrer un hémolysât sur une membrane d’acétate de
cellulose à pH alcalin. Les différentes fractions de l’hémoglobine migrent plus ou
moins rapidement en fonction de leurs poids moléculaire et de leurs charges
électriques.
 P a g e | 32

 Mode opératoire :
- Préparation de la membrane d’acétate de cellulose :
 Remplir la moule avec le tampon de triglycine ;
 Sur la surface lisse de la membrane marquer le haut par le marqueur du début
de la migration ;
 Déposer la membrane en la plongeant doucement dans le bac ;
 Recouvrir le bac ;
 Préparer l’hémolysât en mélangeant 200 µl d’eau distillée et 30 µl de culot de
globule rouge ;
 A l’aide d’une micropipette déposer 5 µl de l’hémolysât sur la plaque
d’alignement ou la plaque à microtitration sur cette plaque doit contenir un
échantillon témoin en première place ou en dernière place ;
 Retirer la membrane d’acétate de celllulose de la solution tampon, la sécher
entre deux papiers buvard et la déposer sur le support (la partie lisse contre le
support)
 Déposer les hémolysât sur la membrane d’acétate de cellulose à l’aide d’un
applicateur ;
 Mettre la membrane d’acétate de cellulose dans la chambre de migration ;
 Appliquer une différence de potentiel de 200 volt, 60 watts à partir d’un
générateur pendant 16 minutes ;
 Interprétation après analyse :
 L’évaluation qualitative est visuelle ; la membrane de migration est inspectée
pour déterminer la présence des bandes de fractions d’hémoglobine ;
 P a g e | 33

II.2.3. Méthode de diagnostic moléculaire (PCR et RFLP)

La méthode de diagnostic moléculaire de la drépanocytose est très complexe
comprenant en premier lieu l’extraction de l’ADN, le contrôle qualité d’ADN, la
PCR, la restriction enzymatique et la migration des amplicons à l’électrophorèse
dur Gel d’agarose.
 Extraction de l’ADN
Elle consiste à effectuer la lyse des cellules au moyen d’un tampon hypotonique
par osmose, et ensuite le lysat est traité par une solution saline jusqu’à l’extraction
complète de l’ADN.
La méthode utilisée pour l’extraction est la méthode de Salting-out comprenant 4
grandes étapes : Lyse des globules rouges, Séparation et purification d’ADN aux
autres constituants, Précipitation et la Pèche et dilution de l’ADN
 Transvaser 0,5 à 10ml du sang dans un tube à centrifuger conique 50ml.
Rincer le tube de prélèvement en déversant dans le tube de centrifugation.
Compléter le niveau du RCL dans le tube à centrifugation jusqu’à 50ml.
Agiter très fortement et mettre dans la glace pour 15min.
Centrifuger à 2000T/min pendant 15 min à 4°C.
Jeter le surnageant dans un réservoir à déchets liquide dangereux
Ajouter 20ml de RCL au culot et agiter très fortement.
Centrifuger encore à 2000T/min pendant 15min (4°C)
Jeter le surnageant et garder le culot qui est fait des GB.
Ce culot peut être conservé à -20°C ou utilisé immédiatement pour les étapes
ultérieures.
Ajouter 5ml de tampon SE dans le tube contenant le culot de GB.
Ajouter 50μl de protéinase K (20mg/ml)
 P a g e | 34

Ajouter 500μl de SDS 10%

Agiter de manière à décoller le culot
Placer dans un bain- marie chauffé à 50° pour une heure au moins ou pour toute
la nuit.
Ajouter 2ml de NaCl 5M
Centrifuger à froid à 3500T/min pendant 20min
Attention !!! Le culot est maintenant le déchet et non le surnageant
Transverser le surnageant dans un nouveau tube étiqueté
Centrifuger à froid à 3500T/min pendant 15min
Transverser de nouveau le surnageant dans un nouveau tube étiqueté
Ajouter 1 volume d’isopropanol (7,5ml) ou 2 volume d’alcool 96%(15ml)
Retourner le tube doucement à plusieurs reprises jusqu’à l’apparition de la
ficelle d’ADN.
Crocheter la ficelle d’ADN en évitant l’enroulement de celle-ci autour du
crochet
Laver successivement cet ADN accroché à l’hameçon dans 2 tubes à éthanol 70%
(-20°C)
Aspirer l’excès alcool avec une micropipette en veillant au préalable à coller la
ficelle sur la paroi de l’eppendorf
Sécher à température ambiante pendant 30 minutes
Ajouter le TE1/0,1mM
Laisser de dissoudre pour nuit (minimum 1 heure en plaçant dans un bain marie
à 50°C pour une bonne dilution
Le jour suivant ajuster la dilution et mesurer la concentration Si la ficelle est trop
petite
 P a g e | 35

Centrifuger le tube à froid 3500T/min pendant 15min

Jeter au culot 600μl d’éthanol 70%
Pipeter tout le contenu et reverser dans le tube eppendorf 1,5ml
Centrifuger l’eppendorf avec une mini-centrifugeuse vortex à 1000T/min
pendant 5minutes à 4°C
Pipeter le liquide ou renverser
Sécher le tube à l’air ambiante 30 minutes
Diluer avec le TE, incuber la nuit et mesurer la concentration le lendemain matin.
 Contrôle qualité de l’ADN
On utilise le Nanodrop, son fonctionnement est basé sur la spectrophotométrie.
Cet appareil est piloté à l’ordinateur.
Nettoyer l’appareil là où on dépose l’échantillon
Mettre 3μl de l’eau de PCR pour nettoyer
Mélanger l’échantillon à une faible vitesse.
Mettre 1μl d’eau de PCR
Cliquer sur blanc
Nettoyer l’appareil avec essuyeur de précision
Identifier l’échantillon dans l’ordinateur
Prélever 1μL de l’échantillon à tester et déposer sur la mini-cuvette du
Nanodrop;
Cliquer sur mesure dans le logiciel Nanodrop de l’ordinateur;
A la fin on fait la décontamination avec de l’eau PCR.
 P a g e | 36

 PCR classique
La PCR est basée sur la polymérisation en chaine d’une séquence spécifique
d’ADN en suivant un pallier des températures de façon répétitive jusqu’à
l’amplification. .
3 grandes étapes définissent la PCR. :
1ere étape : la dénaturation (95 °C)
L’ADN Template est chauffé à 94°C ; les 2 brins d’ADN se séparent
2eme étape : l’hybridation (58 °C)
En diminue la température, les amorces s’apparient (s’hybrident) par
complémentarité à leurs séquences cibles sur l’ADN.
3eme étape : l’élongation (72°C)
A cette température, la Taq synthétise les brins d’ADN complémentaires en ajoutant
des dNTPs à la suite des amorces. L’étape d’élongation dépend de la taille du
fragment à amplifier et de la vitesse de polymérisation de l’enzyme (Taq
vitesse=1000 nuceotide/min).
Les 3 étapes correspondent à 1 cycle de PCR : ≈30 cycles sont effectués dans 1
expérience PCR classique on aura amplifié 230 fois l’ADN cible ; ˃35 cycles de
risque de contamination.
- Déroulement de la PCR :
 Décontaminer paillasse et portoir avec la solution DNA free
 Sortir les échantillons (ADN extrait des différents patients) et réactif
 Préparer la solution de travail des primers 2,5 uM et dNTPs 2 mM
 Préparation du MIX réactionnel ou mélange réactionnel
- Ajouter ADN génomique au Mix PCR :
 Numéroter les strip PCR souvent le plan de la feuille de travail
 Pipeter dans chaque strip PCR 19μl de Mix
 Ajouter 1μl d’ADN génomique, sauf dans strip n°1avec contrôle négatif.
 P a g e | 37

 Mélanger ; si présence de bulles d’air, centrifuger légèrement

 Couvrir avec les caps strips par tube PCR ; toujours faire, signe (p.ex.1point
avec le marqueur) sur le 1 er strip cap avec contrôle négatif = important pour
reconnaitre le sens de lecture.
- Déposer les strips sur la plaque du Thermocycleur.
 A la fin conserver les strips à 4°C.
 Restriction enzymatique (enzyme DdeI)

Elle consiste à l’ajout d’une enzyme de restriction (Endonucléase Ddel) aux

amplicons pour couper à des endroits spécifiques (5’ CTNAG 3’ et 3’ GANTC
5’). Si le site de restriction est intact sur la séquence analysée, l’enzyme réalise la
coupure de l’ADN. Sinon, la séquence n’est pas coupée au niveau de ce site. On
obtient ainsi des fragments de différentes tailles.

 Dans un tube de 1,5ml préparer un mixte de digestion pour le nombre

d’échantillon.
 Mélanger le mixte et disposer 5μl dans chaque tube de digestion, y ajouter
10μl du produit de PCR et laisser incuber à 37°C pour minimum 2 heures.
 Electrophorèse sur gel agarose à 2 %
 On utilise comme tampon de migration TBE 1×
 Peser 2 g agarose dans un Erlenmeyer et y ajouter 100ml de TBE 1x.
 Placer l’Erlenmeyer à la micro-onde et agiter régulièrement.
 Lorsque l’agarose est complètement dissout, laisser refroidir sous agitation
jusqu’à environ 50°C.
 Ajouter 2,5μl d’un révélateur d’ADN (GelRed)
 Couler l’agarose dans le moule avec le peigne et laisser refroidir.
 Placer le gel dans la cuve et s’assurer qu’il est recouvert de tampon. retirer
ensuite le peigne, charger les échantillons et standards.
 P a g e | 38

 Charger sur le gel d’agarose tous les échantillons avant et après digestion
(patients, contrôles (sain, porteur, malade, et contrôle négatif (eau).
 Placer 5μl de produit de PCR avant digestion et 2μl de bleu de Bromophénol
 Placer 15μl de produit de digestion enzymatique et 3μl de bleu de Bromophénol
 Placer 2μl marqueur de poids moléculaire, 5μl eau et 2μl de bleu de
Bromophénol.
 Laisser migrer 60 minutes à 120Volts.
 Visualiser le gel au Transilluminateur
 Interprétation des résultats
 Individu sain : la mutation n’est pas présente 3 bandes sont présentes sur gel
(201bp, 167bp et 72bp).
 Porteur sain : la mutation est présente à l’état hétérozygote 4 bandes sont
présentes sur gel (368bp, 201bp, 167bp et 72bp).
 Malade : la mutation est présente à l’état homozygote 2 bandes sont présentes
sur gel (368bp et 72bp).
 P a g e | 39

CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION

III.1.RESULTATS

Après l’expérimentation au laboratoire, nous avons obtenus les résultats

provenant de deux méthodes utilisées tout au long de notre étude.

Tableau I : Répartition des sujets de l’étude selon le sexe

Phénotype AA AS SS TOTAL

Sexe

Masculin 4 (13,3 %) 3 (10 %) 11 (36,6%) 18 (60 %)

Féminin 5 (16,6 %) 1 (3,3%) 6 (20 %) 12 (40 %)

Total 9 (30 %) 4 (13,3%) 17 (56,6%) 30 (100 %)

Ce tableau montre que masculins étaient prédominants avec 18 cas soit 60 % par
rapport aux sujets de sexe féminin, qui étaient représentés par 12 individus,
représentant 40 %.
 P a g e | 40

Tableau II : Concordance des résultats entre l’électrophorèse sur la membrane

d’acétate de cellulose et la technique moléculaire (PCR et RFLP)

Méthodes utilisées
Phénotypes
et Génotypes Electrophorèse PCR et RFLP concordance des
Résultats en %

AA 9 9 100

AS 4 4 100

SS 17 17 100

TOTAL 30 30 100

Ce tableau a montré que la concordance des résultats entre la technique de

l’électrophorèse d’acétate de cellulose et la technique moléculaire, dont on a observé
une absence de différence significative entre les résultats de l’électrophorèse sur la
membrane d’acétate de cellulose et la technique moléculaire.
 P a g e | 41

III.2. DISCUSSION
Notre travail s’intègre dans le cadre d’une étude comparative de deux
techniques de diagnostic de la drépanocytose, dont la technique de l’électrophorèse
sur la membrane d’acétate de cellulose et la technique moléculaire utilisées dans le
diagnostic biologique de la drépanocytose.
Les sujets étudiés au cours de notre étude nous ont permis de faire une concordance
des résultats issus de deux techniques de diagnostic de la drépanocytose (technique
de l’électrophorèse sur la membrane d’acétate de cellulose et la technique
moléculaire).
Parmi les sujets étudiés, le tableau I montre que les sujets masculins étaient
prédominants avec 18 cas soit 60 % par rapport aux sujets de sexe féminin, qui étaient
représentés par 12 individus, représentant 40 %. Ces résultats sont quasi-similaires
avec les résultats issus de l’étude menée par Abdoulaye Diawara, Thiam L., Diatta
A., et Ndiaye O. en 2020 sur la comparaison entre la PCR et la technique de
l’électrophorèse sur la membrane d’acétate de cellulose.
Durant notre étude 30 échantillons ont été traités et analysés par les techniques de
l’électrophorèse sur la membrane d’acétate de cellulose et moléculaire (PCR-RFLP).
L’ensemble des échantillons traités à l’électrophorèse s’est confirmé par la technique
moléculaire.
Le tableau II, présente la concordance des résultats issus de deux techniques
utilisées dont la technique de l’électrophorèse sur la membrane d’acétate de cellulose
et la technique moléculaire (PCR-RFLP)
Nous n’avons observés aucune différence significative entre les deux techniques
utilisées dans le diagnostic de la drépanocytose.
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Nos résultats concordent avec les résultats trouvés en 2020 par Thiam L., et coll
pour son étude sur la comparaison de deux techniques (PCR et électrophorèse sur la
membrane d’acétate de cellulose), ainsi que Sène AN sur le même sujet.
Ces résultats obtenus nous amènent à conclure que l’électrophorèse de
l’hémoglobine sur la membrane d’acétate de cellulose demeure valable dans le
diagnostic de la drépanocytose malgré les avancés techniques de la biologie
moléculaire (PCR-RFLP), confirmant ainsi notre hypothèse nulle énoncée au début
de notre étude.
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CONCLUSION

La drépanocytose et une maladie génétique monogénique (liée à un seul gène)

la plus répandue dans le monde. Selon l’OMS, 300 000 enfants naissent dans le
monde chaque année avec une anomalie majeure de l’hémoglobine dont la plus
fréquente est celle de la drépanocytose.
Suite aux avancées scientifiques ces dernières années plusieurs techniques
analytiques fiables sont développées pour le diagnostic de l’hémoglobinopathie
drépanocytaire.
Le but principal poursuivi dans cette étude était de comparer la technique de
Biologie moléculaire avec la technique de l’électrophorèse d’hémoglobine sur la
membrane d’acétate de cellulose dans le diagnostic de la drépanocytose.
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RECOMMANDATIONS

A la fin de notre étude, nous avons trouvés quelques recommandations et

suggestions pour les recherches à venir sur le même sujet d’étude que nous avions
réalisée.

 Mener une étude approfondie sur le même sujet avec une taille d’échantillon
supérieur à 100
 Mener une étude sur les méthodes récentes dans le diagnostic de la
drépanocytose
 Mener une étude en Génie génétique pour trouver les meilleurs moyens
thérapeutiques de la drépanocytose ;
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