Extraction et analyse des protéines du rein de souri :
Auteurs :
SEKHRI KAHINA
YEMMELI LISA
RESUME :
Un échantillon de rein de souris (35,8 mg) est traité avec un tampon d'extraction, EDTA
inhibant les enzymes. Après homogénéisation, sonication et centrifugation, le surnageant,
contenant les protéines, est préservé pour le dosage. Des concentrations variables de BSA
sont ajoutées à six tubes avec tampon d'extraction, eau, et échantillon de protéines de rein
de souris, suivies de la solution de Bradford. Après agitation et incubation à l'abri de la
lumière, l'absorbance est mesurée pour estimer la concentration en protéines.
L'électrophorèse commence par la coulée d'un gel polyacrylamide à deux parties, séparant
les protéines par poids moléculaire. Le gel de concentration, initié avec persulfate
d'ammonium et TMED, favorise la concentration des protéines. Après formation des puits,
60 µL d'échantillon protéique sont ajoutés. L'appareillage est connecté à une alimentation
électrique pour observer la migration des protéines.
Mots clés :
- Protéines.
- Extraction.
- Dosage.
- Électrophorèse.
INTRODUCTION :
Les reins sont situés dans la région lombaire, dans le rétro péritoine. Ils comportent deux
parties : le cortex (périphérique) et la médullaire (centrale). Le cortex est homogène et
abrite les glomérules. La médullaire est formée de pyramides de Malpighi se terminant par la
papille où l’urine terminale est excrétée dans le calice. Entre les pyramides se trouvent les
colonnes de Bertin où les artères inter lobaires pénètrent pour se ramifier et vasculariser le
parenchyme rénal. (Gueutin, 2012)
Les reins contiennent différentes protéines telles que l'albumine, les immunoglobulines, les
enzymes, les hormones et les protéines structurales. Elles jouent un rôle essentiel dans le
fonctionnement de cet organe vital du système urinaire, ainsi qu'à divers processus
physiologiques et mécanismes de régulation, y compris l'élimination des déchets et
l’excrétion des produits de dégradation du métabolisme cellulaire et des substances
étrangères; le maintien de la composition du milieu intérieur, donc de maintien de
l’homéostasie de l’eau et des électrolytes ; et une fonction endocrine avec les synthèses de
la rénine, de l’érythropoïétine et du calcitriol. (Lacour, 2013). Ces fonctions sont essentielles
pour le maintien de la santé globale et du bien-être du corps humain.
Matériels et méthodes :
1. Extraction protéique :
On allume la balance et on met le vers de montre dedans puis on appuis sur taré pour
annuler le poids de la coupelle et à l’aide d’une spatule et d’un bistouri on découpe un
échantillon du R9R (rein de souris) qu’on met dans un tube Eppendorf qu’on pèse ensuite et
on aura un échantillon de 35,8mg de R9R, ensuite on ajoute à l’aide d’une micropipette une
quantité de 500µL de tampon d'extraction contenant de l'EDTA. On écrase et homogénéise
l'échantillon avec le vortex, puis on le soumet à des ultrasons dans un bain sonicateur et on
met le tube dans une centrifugeuse 1400g x 10min a 4° afin de séparer les protéines des
débris cellulaire.
Après une première centrifugation, on récupère le surnageant et on répète le processus avec
un nouveau tampon d'extraction. Enfin, on associe les deux surnageant obtenus et on les
conserve au froid pour le dosage des protéines et on se débarrasse du culot.
2. Dosage par spectrophotométrique :
Dans 6 tubes à essai propre on met (0-5-0-15-20-25 mg/ml) de BSA respectivement prélevé à
l’aide d’une micropipette, (la BSA qui le bovine sérum albumine permet d’estimer la
concentration en protéines dans les échantillons mesurant l’absorbance induite par la
formation u complexe protéines-colorant
Puis on prélève avec la micropipette 5µl de tampon d’extraction qu’on ajoute au 7 tube de
quantité équivalente
Puis en utilisant la micropipette on ajoute de l’h2O selon les quantités suivantes de façon
respective (795 -790-785-780-775-770) d’un autre coté on prend un tube dans lequel on met
10µl prélevé à l’aide d’une micropipette de notre échantillon de protéine de rein de souris
extrait lors de la précédente manipulation en lui ajoutant 5µl de tampon d’extraction ainsi
que 785µl d’h2O
Puis on prélève 200µl de la solution de Bradford qu’on ajoute à tous les 7tubes elle permet
de former un complexe coloré avec les protéines présente dans l’échantillon et la mesure de
l’absorbance de ce complexe coloré fournit une estimation de la concentration en protéines
On agite à l’aide d’un vortex et on laisse incuber a l’abris de la lumière
Puis on passe à la mesure de la densité optique a une longueur d’onde de 595 nm à l’aide
d’un spectrophotomètre dans lequel on fait passer nos 7 échantillons
3. Séparation par électrophorèse :
On commence par la préparation de l’appareillage nécessaire qui est constitué de la cuvette
d’électrophorèse dans laquelle on fait couler le gel polyacrylamide qui est constitué d’une
partie transparente appelé gel de séparation compose de 10 ml de glycérol - 1ml SDS - 2,27g
de TRI et acrylamide solution A se gel de séparation permet au protéines de se déplacer a
des vitesses différentes en fonction de leur poids moléculaire
Puis on prépare la deuxième partie qui est le gel de concentration qui permet de concentré
les protéines en une bande avant qu’ils n’entrent dans la partie séparent
A l’aide d’une micropipette on prélève 1000µL de gel de concentration sur lequel n ajoute
50µL de persulfate d’ammonium (qui initie la polymérisation) et 50µL du TMED qui agit
comme agent réducteur de persulfate d’ammonium ce qui active se dernier.
On fait couler la deuxième partie du gel
et on met le peigne amovible pour que
les puits où se charge les échantillons
de protéines se forme on laisse
solidifier et on passe à la préparation de
notre échantillon on prélève 60µl des
protéines extrait lors de la précédente
expérience on lui ajoute 20µl du
tampon
Une fois les puits se sont former on
prélève 40µL de notre échantillon et on
le fait couler dans la cuvette et on
continue avec les 40µl restante.
On lie l’appareillage a une alimentation
électrique et on observe la migration.
Résultats et discussion :
L’extraction protéique :
Le suivi des étapes de l’extraction protéique nous a permet d’obtenir deux couches : un culot
contient les dépôts solides généralement ce sont les protéines précipitées dans la partie
inferieure ; tandis que le surnageant est le vin clair qui contient les autres composants
solubles, Il se référé à la couche de liquide qui flotte au-dessus d’un mélange. Le surnageant
récupéré sera utilisé pour le dosage des protéines.
La concentration du tissu du R9R dans le tampon d’extraction :
Calcule de la force gravitationnelle :
Dosage protéique :
La comparaison entre l’absorbance de l’échantillon
BSA (µg/ml) Absorbance à 595 nm
protéique des reins et les autres contenant la BSA :
0 0.005
10 La concentration 0.135 des protéines du rein de souris est de
20 23,6µg/ml, elle 0.235 La courbe
est inférieure à celles représente
des protéines l'absorbance à
du foie
30 qui est de 39,38µg/ml
0.324 ; et en ce 595 nm en fonction
qui concerne de des
la courbe la concentration
40 absorbances en de la concentration
0.41fonction de la concentration de la BSA (µl/ml)
de BSA sont
50 tous linéaires et 0.55droites et toutes
0.6 les points sont presque sur
Protéine la droite. 0.262
0.5 f(x) = 0.0103971428571429 x + 0.0165714285714286
R² = 0.993897756804173
0.4
Calcule de la quantité de protéine :
L'absorbance à 595 nm
0.3
y−0,0166
On a : y =0,0104x + 0,0166 x = 0.2
0,0104
0.1
0
0 10 20 30 40 50
X = Y23,6
= 0,262
[BSA] (µg/ml)
La quantité de protéines est de 23,6 µg/ml.
Séparation par électrophorèse :
La migration des protéines selon leurs poids moléculaires :
Combien en µg y en a de protéines dans les 60 µl ?
On a : masse(µg) = volume(µl) × concentration de protéines(µg/µL)
= 60 × 23,6/1000
= 1,416µg
Il y en a 1,416 µg de protéines dans 60 µl.
Conclusion :
L’ensemble de ces étapes font partie d'une méthodologie complète pour caractériser les
protéines dans un échantillon de rein de souris, en utilisant des techniques telles que
l'extraction, le dosage de protéines par la méthode de Bradford, et l'électrophorèse pour
séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Ces techniques sont
couramment utilisées en biochimie pour comprendre la composition des échantillons
biologiques.
Références :
Gueutin, V. D.-B. (2012). Physiologie rénale. Bulletin du cancer, 99(3), 237-249.
Lacour, B. (2013). Physiologie du rein et bases physiopathologiques des maladies rénales. Revue
francophone des laboratoire, 2013(451), 25-37.
