TP : CHROMATO-SPECTRO

TP 4 de : Chromatographie Liquide Hau

Compte rendu

NOME ghamoud

PRENOME RAID

PROFE [Link]

Chimie pharmaceutique
Master 1

2023/2024

UNIVERSITE : Ferhat abbas setif 1

DELL1
FACULTE :Des sciences
Departement : de chimie
 Somaire

 Introduction :
 Principe du TP :
 TYPES :
 Partie expérimentale :
 Conclusion :
 1)Introduction :
La chromatographie liquide haute performance
(HPLC) ou simplement La chromatographie en
phase liquide (CPL) ou liquid chromatography (LC) est une
technique séparative utilisée en analyse quantitative, qualitative
et principalement employée dans le domaine de la chimie
analytique comme outil scientifique majeur mais aussi dans des
domaines variés tels que la Toxicologie et la Biochimie.

Le champ d’application de l’HPLC recouvre une grande partie

du domaine de la chromatographie en phase gazeuse
auquel s’ajoute celui de l’analyse des composés thermosensibles
ou de masses moléculaires à la fois très grandes et même
polaires. Son succès est dû à la possibilité d’agir de manière très
précise sur la sélectivité entre les composés par le choix de la
colonne et de la composition de l’éluant, c’est-à-dire en
exploitant les interactions soluté/phase
mobile/phase stationnaire. L’efficacité des colonnes est
moindre qu’en CPG, mais l’utilisation de phases chirales ou des
nouvelles phases stationnaires opérant suivant plusieurs modes,
les techniques par appariement d’ions ainsi que d’interaction
hydrophobe accroissent encore plus les possibilités de la CLHP.
Enfin la miniaturisation de la technique
(nanochromatographie) a facilité son association avec la
spectrométrie de masse.

Histoire :
La chromatographie classique sur colonne a évolué au fil des
ans, avec des innovations introduites à intervalles d’environ dix
ans en matière de séparation chromatographique. Les
techniques basée sur la chromatographie offraient des
améliorations majeures en termes de vitesse, de puissance de
résolution, de détection, de quantification, de commodité et
d’applicabilité à de nouveaux types d’échantillons. La plus
notable de ces modifications était la chromatographie liquide
haute performance (HPLC). Les techniques modernes de CLHP
sont devenues disponibles en 1969; Cependant, ils n’étaient pas
largement acceptés dans l’industrie pharmaceutique jusqu’à
plusieurs années plus tard. Une fois que les systèmes HPLC
capables d’une analyse quantitative sont devenus disponibles
dans le commerce, leur utilité dans l’analyse pharmaceutique a
été pleinement appréciée.

Dans les années 1990, la HPLC avait entamé une croissance

explosive qui en se faisait la méthode analytique la plus
populaire jugée en fonction des ventes d’instruments et de
l’importance scientifique. Sa popularité actuelle résulte de sa
séparation pratique d’une large gamme de types d’échantillons,
d’une puissance de résolution exceptionnelle, de la vitesse et des
niveaux de détection nanomolaires. Il est actuellement utilisé
dans la recherche pharmaceutique et le développement:

 Pour purifier les produits synthétiques ou naturels.

 Caractériser les métabolites.
 Pour doser les ingrédients actifs, les impuretés, les
produits de dégradation et dans les essais de dissolution.
 Dans les études pharmacodynamiques et
pharmacocinétiques.
Les améliorations apportées à la CLHP au cours des dernières
années comprennent:

 Changements dans le matériau d’emballage, tels que la

taille des particules plus petites, les nouveaux matériaux
d’emballage et de colonne.
 Séparation à haute vitesse.
 Micro-HPLC, automatisation et optimisation assistée
par ordinateur.
Amélioration des méthodes de détection, y compris les
systèmes de détection dits « coupés ».
Origine de la CLHP (HPLC) :
La chromatographie liquide haute performance, souvent désignée par son
abréviation CLHP – HPLC en anglais –, constitue une technique analytique très
générale d’emploi. Elle dérive de la forme la plus ancienne de la
chromatographie liquide sur colonne dont les performances, en termes de
sélectivité et de résolution, se sont trouvées grandement améliorées par la
miniaturisation et l’utilisation de phases stationnaires très élaborées.

Ces phases, constituées de la réunion de micro-particules sphériques dont le

diamètre est compris entre 2 et 5 micromètres ou de matériaux monolithiques
poreux conduisent à une perte de charge importante dans la colonne. Il faut donc
exercer sur la phase mobile une forte pression pour obtenir un débit convenable.
Pour marquer cette particularité de la technique, la lettre P du sigle CLHP a
pendant longtemps correspondu au mot pression.

La migration forcée d’une phase liquide au contact d’une phase stationnaire se

retrouve dans plusieurs techniques chromatographiques. La particularité de la
CLHP est de faire intervenir des mécanismes d’échange soluté/phase
mobile/phase stationnaire basés sur les coefficients d’adsorption ou de partage.

Conception générale d’un appareil de HPLC

(CLHP)
Une installation de CLHP (HPLC) comporte divers modules spécialisés,
qui se présentent dans des boîtiers distincts ou intégrés dans un même
châssis pour des raisons de moindre encombrement (fig. 1.1).

Ces modules sont reliés entre eux par l’intermédiaire de canalisations de

très faible diamètre interne (0,1 mm) pour assurer la circulation de la
phase mobile. Elles peuvent être en acier inoxydable ou en PEEK ® (ou
polyether-etherketone), un polymère souple et coloré qui résiste aux
solvants usuels, même sous des pressions élevées (350 bars).

L’écoulement des faibles débits obéit à la loi de Poiseuille. La vitesse de la

phase mobile est maximum au centre des canalisations et nulle au
contact des parois. Une dispersion des composés se produit donc
inévitablement. Pour améliorer les séparations on fait donc en sorte que
le volume de phase mobile hors-colonne soit le plus réduit possible (10 %
du volume mort de la colonne).
L’utilisateur compose son installation en fonction des applications
prévues. La présentation en colonne des différents modules est commune
à de très nombreux modèles concurrents. Ici le chromatographe modèle
HP 1100 (reproduit avec l’autorisation de la société Agilent
Technologies), comporte un injecteur automatique permettant un
fonctionnement en continu et une colonne thermostatée pour améliorer
la reproductibilité des séparations. Les composés élués, après passage
par le détecteur UV sont identifiés avec encore plus de certitude au
moyen d’un spectromètre de masse, situé à droite de l’image.

Pompe et gradients d’élution

Pompes pour éluants :

Toute installation de CLHP comporte au moins une pompe pour forcer le
passage de la phase mobile à travers la colonne dont le remplissage est
très compact. Il en résulte une pression importante au niveau de
l’injecteur. Celle-ci peut atteindre 20 000 kPa (200 bars) selon le débit
imposé à la phase mobile ou sa viscosité ainsi que selon la nature de la
phase stationnaire.

On utilise des pompes conçues pour maintenir un débit non pulsé et

stable, même si la composition de la phase mobile varie. Ces pompes
débit-métriques comportent généralement deux pistons : en série (fig.
2).
C’est la partie qui sert à stocker l’éluant et à l’injecter sous pression dans
la colonne. Elle est composée de :

 Deux pistons alternatifs fonctionnant en opposition pour éviter

les interruptions de débit dues au remplissage du cylindre. Le
déplacement des pistons est contrôlé par un moteur pas à pas
associé à une came de forme particulière.
 Réservoirs de phase mobile
 Électrovannes
 Amortisseur de pulsations
 Système de purge et d’amorçage
 Capteur de pression

De manière simplifiée et en ignorant les corrections de compressibilité

des solvants, on peut décrire ainsi le cycle de fonctionnement. Partant de
l’instant où le clapet de sortie du cylindre A vient de se fermer et le clapet
d’entrée vient de s’ouvrir, le piston de A recule pour remplir la chambre
A. Pendant ce temps le cylindre B est ouvert et le piston de B avance pour
chasser la phase mobile vers la colonne. Le volume déplacé par le piston
de B est deux fois plus petit que le volume aspiré par le piston de A.
Arrivé au fond de sa course, le clapet d’entrée de A se ferme et le clapet
de sortie s’ouvre.

Le piston de A avance et chasse le contenu du cylindre A. Ce volume pour

moitié est expulsé vers la colonne, l’autre moitié servant à remplir le
cylindre B dans sa phase de recul. Entre les deux cylindres est placé un
amortisseur de pulsations (dessin réalisé à partir d’un document de la
société Agilent-Technologies). (En bas), Variations de débit
d’une pompe en fonction des cycles.
 2)Principe du TP :

L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelé phase mobile)

dans une colonne remplie d'une phase stationnaire (les « grains » sont de
très petite taille). Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour
séparer les composants le long de la phase stationnaire.
En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface
d'échange augmente si la granulométrie est fine. Les pics obtenus (via un
détecteur à UV1 (les protéines absorbent à 275-280 nm) relié à un
système d'intégration et de calcul) sont plus étroits donc la résolution est
améliorée (les pics sont bien séparés, on peut donc bien les différencier),
le seuil de détection est également plus bas (des pics étroits et hauts sont
plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas).
Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de
l'analyse, c'est le mode dit « gradient » ou « élution graduée » (en
opposition au mode « isocratique », pour lequel la composition de la
phase mobile reste la même tout au long de la séparation).
Par exemple, sur une colonne apolaire, en utilisant un mélange
eau/méthanol comme phase mobile, les composants les plus
hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en méthanol alors
que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec
une concentration faible en méthanol. Selon la nature de la phase
stationnaire et la nature des composés à séparer, on commencera par une
concentration élevée en méthanol ou le contraire.

3)LES TYPES :
Il y a plusieurs types de chromatographie en phase liquide. La nature de
la phase stationnaire dépend du type de chromatographie en phase
liquide que l'on veut faire ainsi que de la nature et du nombre de
composés que l'on veut séparer.
1)Chromatographie d'adsorption :
Dans cette chromatographie, la phase stationnaire consiste en une
matière solide à grand pouvoir d'adsorption, telle que l'oxyde
d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice. Les
composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la
phase stationnaire par adsorption physique. C'est une technique qui
prend en compte la polarité des composants.
2)Chromatographie de partage :
Dans cette chromatographie les analytes sont séparés en fonction de leur
affinité avec les phases stationnaire et mobile. L'affinité dépend de la
polarité des analytes et des phases. En mode normal la phase
stationnaire est polaire, en mode inverse elle est apolaire. Il y a deux
types de chromatographie de partage :

liquide - liquide : la phase stationnaire consiste en une très fine


couche de liquide répartie par adsorption physique à la surface
du matériau support le plus inerte possible. Les composants
sont séparés comme dans une extraction liquide-liquide, sauf
que la répartition des composants se fait lors du passage dans la
phase liquide et non par agitation ;
 liquide - solide ou liquide - phase greffée : la phase stationnaire
consiste en une espèce organique liée par des liaisons chimiques
à la surface des particules du matériau support.
3)Chromatographie en phase normale :
La chromatographie en phase normale (NPLC) consiste à séparer
différents analytes selon leur polarité. Cette technique de séparation
découle de l’expérience de Tswett et de son montage de chromatographie
réalisé avec des pigments végétaux. Au cours des années, cette dernière a
été développée davantage afin de séparer des mélanges de plus en plus
complexes, en modifiant la polarité des phases et en améliorant la
méthodologie de séparation analytique (ajout d’une pompe pour
augmenter la pression du système et accélérer l’élution, automatisation
du procédé, etc.). Celle-ci est basée sur les interactions hydrophiles et les
affinités d’un analyte envers la phase mobile et stationnaire dans le but
de les séparer en fonction de leur polarité2.
Principe
La chromatographie en phase normale (NPLC) est un type de
chromatographie qui fait intervenir les interactions polaires,
contrairement à la chromatographie en phase inverse (RPLC), qui fait
intervenir les interactions hydrophobes. Il s’agit d’un mécanisme de
compétition entre la rétention d’un soluté dans la phase stationnaire et
l’élution du soluté dans la phase mobile, donc des affinités de chaque
analyte envers la phase mobile et la phase stationnaire. On fait donc
passer un solvant non polaire ou modérément polaire dans la colonne.
Les solutés les plus retenus dans la phase stationnaire seront élués en
dernier alors que les solutés les moins retenus seront élués en premier.
Différents types d’interactions sont exploités tels que les ponts
hydrogène, les interactions dipôle-dipôle et les interactions acide-base3.
Phases stationnaires
Les phases stationnaires utilisées pour une chromatographie en phase
normale sont des phases polaires. Un avantage de cette chromatographie
est qu’il est possible de modifier les interactions, autant celles entre les
analytes et la phase stationnaires, que celles avec les analytes et la phase
mobile et la phase mobile avec la phase stationnaire. Puisque l’analyte se
déplace en fonction de son affinité pour la phase mobile et la phase
stationnaire, il est possible de choisir les deux phases afin d’optimiser la
séparation d’un système complexe. On peut directement utiliser la silice
puisqu’elle contient des groupements silanols (Si-OH) en surface. Selon
la méthode utilisée pour la synthèse de la silice, la surface spécifique des
particules, le diamètre des particules ainsi que le diamètre des pores
varie grandement. Chaque type de silice possède ses propres propriétés
de séparation. Des types des silices contenant plus de groupement
silanols libres (plus acide) ou moins de groupements silanols peuvent
aussi être utilisés en fonction du type de séparation désiré. Il est aussi
possible de fonctionnaliser la silice afin de faire varier la polarité ou le
caractère de la silice en surface, tout en rendant sa surface plus
homogène. Selon le type de séparation que l’on désire faire, on doit
choisir entre trois classes de silice fonctionnalisée suivant le triangle de
sélectivité suivant :

1. Accepteur de proton ;
2. Donneur de proton ;
3. Interactions dipôle-dipôle.
Si la séparation ne fonctionne pas avec un type de silice, on choisit un
second type qui se situe dans une autre classe afin d’engendrer le
changement le plus drastique des interactions entre la phase stationnaire
et les analytes. Les silices fonctionnalisées les plus souvent utilisées pour
la chromatographie en phase normale sont la silice cyanopropylée, la
silice aminopropylée et la silice 1,2-hydroxypropylée (diol). D’autres
groupements peuvent aussi être utilisés pour la fonctionnalisation de la
silice pour des applications plus spécifiques, mais ceux-ci suffisent en
général. La colonne diol est une colonne acide, la colonne amino est une
colonne plutôt basique alors que la colonne cyano fait des interactions
dipôle dipôle modérées.
Phase mobile
Les solvants utilisés sont les mêmes que ceux utilisés pour les autres
types de chromatographie. Idéalement, on utilise des solvants peu
visqueux, afin de permettre un débit d’éluant plus élevé dans la colonne,
dont le point d’ébullition est bas pour faciliter la récupération des
analytes après élution. De plus, pour faire la chromatographie, le solvant
doit absolument être moins polaire que les analytes pour éviter une
élution directe des analytes. En général, on utilise l’hexane ou le pentane
comme solvant non polaire de base (que l’on appelle le solvant A). Il est
possible de jouer sur la polarité de l’éluant en faisant varier la polarité du
solvant A. Il est par contre plus simple d’utiliser un éluant binaire
puisque la polarité variera en fonction de la quantité d’un solvant polaire
ajouté. Les solvants polaire, aussi appelé solvants modificateurs (solvant
B), communément utilisés sont le chloroforme, le dichlorométhane,
l’acétate d’éthyle, le tétrahydrofurane, le méthyl tert-butyl éther (MTBE),
l’éther diéthylique ainsi que des alcools comme le méthanol ou
l’isopropanol.
Un autre facteur important concernant la phase mobile est la force du
solvant. Puisque la technique est basée sur les différentes interactions
entre les analytes, la phase mobile et la phase stationnaire, il est donc
important d’ajuster la force de l’éluant, que l’on définit par l’affinité de la
phase mobile pour la phase stationnaire. Ainsi, un solvant dont la force
d’élution est supérieure à une autre aura plus de facilité à entrainer un
analyte dans la phase mobile, puisque ses interactions seront plus fortes
avec la phase stationnaire. Aucune échelle absolue de force de solvants
n’existe puisque celle-ci varie d’une colonne à l’autre. Par contre,
plusieurs échelles empiriques permettent de classer les solvants dans un
ordre correspondant à leur force de solvant (ɛ0). Pour un mélange de
solvant, la force de solvant n’augmente pas linéairement avec le
pourcentage de solvant polaire ajouté. Il peut par contre être calculé à
l’aide de l’équation suivante :
Où εAB est la force du mélange de solvant, εA et εB la force de solvant de
chacun des solvants purs A et B respectivement, NB la fraction molaire
et nB la surface moléculaire du solvant modificateur et α le coefficient
d’activité, habituellement 1 pour une colonne analytique moderne.
Lorsqu’on veut optimiser une séparation, il est important de
conserver la même force de solvant après changement de solvant B.
Sélectivité du solvant
La sélectivité du solvant est l’ensemble des interactions acide-base,
dipôle-dipôle et liaisons hydrogène entre les molécules de solvant et
l’analyte. Il y a un changement dans la sélectivité du solvant quand les
interactions moléculaires entre la phase stationnaire, le soluté et la
phase mobile changent brusquement avec le changement de solvant.
La sélectivité du solvant est basée sur le triangle de sélectivité de
Snyder, qui guide le choix du solvant ou des solvants à choisir ainsi
que la phase stationnaire pour optimiser la séparation de l’analyte.
Chaque apex du triangle représente une caractéristique d’un solvant,
soit accepteur de proton, donneur de proton ou ayant un dipôle. Les
 solvants sont classés dans le triangle, de façon à les catégoriser selon
les interactions possibles du solvant avec l’analyte. Pour changer
subitement les interactions entre le solvant et les analytes, il suffit de
passer d’un solvant près d’un apex du triangle vers un solvant qui se
situe plus près d’un autre apex2,4.
4)Chromatographie en phase inverse :
La base d'une phase inverse est une phase normale sur laquelle des
chaînes alkyles (ou autres selon la polarité recherchée) ont été greffées au
niveau des groupes silanols (end-capping). En général, la phase
stationnaire est majoritairement composée de petites particules
de silice sur lesquelles on a greffé des fonctions chimiques, le plus
souvent de chaines alkyle à 8 ou 18 atomes de carbone.
Les fonctions silanols (Si-OH) qui subsistent engendrent des interactions
hydrophiles parasites, qui rendent les résultats non reproductibles
surtout pour les molécules basiques. Pour éviter cela, la surface de la
silice est généralement recouverte par une fonction méthyle et les
fonctions silanols ne sont plus libres mais sous la forme (Si-O-CH3), c'est
cette étape que l'on appelle « end-capping ». Les fonctions chimiques
utilisées pour le end-capping peuvent toutefois être de nature très
diverses et les colonnes de dernières générations résistant à des pH
extrêmes sont généralement end-capped avec des fonctions proposant
une plus grande gène stérique, telles que le tert-butyle (Si-O-C(CH3)3).
Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande
résolution.
Cette phase stationnaire est dite « inverse » car de polaire et hydrophile
(sans les « greffes »), la phase devient apolaire et hydrophobe.
5)Chromatographie par échange d'ions :
La phase solide est une résine insoluble munie de groupes fonctionnels
capable de dissocier. Ce sont, habituellement, des groupes « acide
sulfonique » (SO3H) pour les échangeurs de cations et « ammonium
quaternaire » (N(R)3) pour les échangeurs d'anions.
6)Chromatographie d'exclusion stérique :
Les composants sont séparés selon leur dimension moléculaire. La phase
stationnaire est composée d'un matériau poreux (petites particules de
silice ou de polymères), les molécules dont le diamètre est supérieur à
celui des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La durée de
séjour dans la colonne augmente lorsque la taille des analytes diminue.
7)Chromatographie chirale :
Cette technique de chromatographie consiste en la formation de liaisons
non covalentes entre les énantiomères du substrat et l'absorbant
chromatographique chiral donnant des
complexes diastéréoisomères ayant des affinités de liaisons différentes.
Elle sert donc en particulier à séparer des énantiomères

4)Partie expérimentale :
Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics
correspondant à chacun des produits.

Un chromatogramme doit être parfaitement reproductible.

La composition de la phase mobile est un paramètre particulier à la
HPLC. Il faut donc
préciser pour chaque analyse :
- le type de colonne : marque, nature, diamètre, longueur, support…
- la nature de l'éluant : solvant, si c'est un mélange préciser sa
composition, débit,
mode de détection λ en nm.
- la quantité injectée, le début de l'injection sur le chromatogramme, la
sensibilité du
détecteur, etc…
Analyse qualitative :
Le temps de rétention (tR en min) est une caractéristique de chaque soluté dans
les conditions opératoires fixées. On peut comparer le t R de deux
solutés en définissant :
- le facteur de sélectivité α entre les deux solutés :
- l’efficacité d'une colonne qui est mesure en nombre de plateau théorique :
Nombre de molécule sortant de la colonne en fonction du temps
σ : écart type : distance entre le point
d'inflexion (point où la dérivée
seconde s'annule) et la moitié de la
courbe.
δ : largeur du pic à mi-hauteur
ω : largeur à la base (unité de temps)

Analyse quantitative :
Cette analyse est basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques
est proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé.
 4)Conclusion :
La chromatographie est une technique qui se décline selon de
multiples variantes pour séparer des constituants dans un but
soit analytique, soit préparatif. Cet ensemble de techniques,
parfois très différentes dans leur mise en œuvre, est très utilisé
en laboratoire comme dans les établissements scolaires (la
chromatographie des chlorophylles d’un végétal est un grand
classique). S’agissant de séparer des molécules pouvant être très
variées dans leur composition, poids moléculaire ou forme, la
chromatographie nécessite le plus souvent une étape de mise au
point pour trouver le protocole adapté. Il est également rare de
pouvoir purifier convenablement une molécule en une seule
étape, et il est généralement nécessaire de réaliser
successivement plusieurs types de chromatographies, ou de
coupler cette technique avec d’autres techniques de purification
(centrifugation, électrophorèse, précipitation, etc.). Vous
trouverez, dans la figure 10, une comparaison entre les
différents types de chromatographie
Référence :
Chromatographie en phase liquide à haute performance —
Wikipédia ([Link])
Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) » Analytical
Toxicology
La chromatographie en phase liquide à haute performance
(HPLC) - Recherche ([Link])
[Link]
Chromatographie_en_pha ([Link])