PROCÉDURE OPÉRATIONNEL STANDARD
Doc. No .
Control Copy No Service de Laboratoire:
Version No.: 01 COPROCULTURE
Revision No.: 00 BACTERIOLOGIE
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1.0 But
Assurer la procédure correcte, validée est suivi pour traiter des spécimens de coproculture et fournir des
résultats exacts, fiables et reproductibles qui ont l'utilité clinique.
1.1 Domaine d’applications:
Techniciens, stagiaires et Biologistes
2.0 Procedure
2.1 Principe
Ce mode opératoire décrit toutes les étapes effectuées lors de l’examen bactériologique des selles
visant à mettre en évidence des micro-organismes pathogènes responsables de diarrhées et
d’infections digestives (salmonelles, shigelles, certains Escherichia coli EPEC si enfant <2ans et EHEC
en fonction du contexte clinique et épidémique) ; les germes rares tels que Yersinia, Campylobacter,
Clostridium ne sont pas recherchés.
2.2 REACTIFS
Au réfrigérateur
1. Bouillon Müller Kauffman
2. Géloses :
Hektoen,
EMB (pour la recherche d’EPEC si enfant < 2ans)
Sabouraud au chloramphénicol (si nombreuses levures)
3. Eau physiologique
4. Eau distillée
5. Urée indole (prêt à l’emploi),
6. Galerie RAPID ONE
2.3 MATERIEL
1. Lame et lamelle
2. Etuve 37°C en aérobie
3. Oese stérile
4. Microscope optique
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5. Flacon (pot) à coproculture
6. Bec Bunsen
7. Vortex
2.4 PROTOCOLE
2.4- 1 Types de prélèvements
Selles fraîchement émises au laboratoire dans un pot propre
Patient sans traitement d’antibiothérapie, sinon signaler.
Analyse sans délais.
2.4- 2 Réalisation de l’examen
J1 Premier jour
Adulte ou enfant de plus de deux ans et contexte par défaut :
Réalisation d’une coproculture standard comprenant la recherche de
Salmonella spp, de Shigella spp.
Enfant de moins de deux ans :
Réalisation d’une coproculture standard avec recherche supplémentaire des
E. coli entéropathogène
a) Examen macroscopique
Editer la fiche paillasse
Noter sur la fiche paillasse :
Consistance : Liquide, glaireux,…
Préparer des suspensions de selle : eau physiologique (1) et Müller Kaufmann (2)
Un empois de selle ou 1
ml de selle liquide dans Un empois de selle ou 1
10 ml eau physiologique ml de selle liquide dans
stérile (1) bouillon Müller
Kaufman
(2)
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Vortexer les suspensions.
Prendre quelques µl et réaliser un frottis sur une lame à partir de suspension
b) Examen microscopique
Faire un état frais entre lame et lamelle
- Recherche de leucocytes
- D’hématies
- De parasites (amibes, helminthes)
- De levures et filaments mycéliens
Puis effectuer une coloration de Gram
Après coloration, poser une goutte d’huile sur la lame sèche, et l’observer au
microscope _ objectif ×100 :
- recherche de leucocytes (en cas de diarrhée à germes invasifs)
- apprécier la coproflore : % bactéries Gram négatif / % bactéries Gram positif
NB : la flore est déséquilibrée lorsqu’un % est >70
c) Ensemencement de milieux de culture (J1)
Allumer le bec bunsen
Identifier et dater les milieux de culture suivants :
1 milieu différent pour chaque prélèvement
A l’aide d’une oese stérile, prélever quelques µl de la suspension.
Ensemencement
EMB
Hektoen 3 Sabouraud 2ans
Si levures+++
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Ensemencer les boîtes en utilisant la technique de cadran
Refermer et incuber les boites à 37°C en milieu aérobie pendant 24 heures.
1. La boîte Hektoen N°1(Hkt 1)
2. Le bouillon Müller Kaufman
(J2) Deuxième jour
Lecture des boites et repiquage du bouillon Müller Kaufman sur une 2ème gélose Hektoen (Hkt 2)
A- Repiquage du bouillon Müller Kaufman :
B-
Sortir de l’étuve le bouillon Müller Kaufmann
Identifier une gélose Hektoen par le même N° d’identification que la première en
précisant REP (repiquage)
A l’aide d’un öese de 10µL, repiquer systématiquement le milieu d’enrichissement
Müller Kaufman sur gélose Hektoen2 (technique cadran).
Repiquage- bouillon
Müller Kaufmann
Sur 2ième G. Hektoen
Refermer la boîte Hektoen, incuber dans l’étuve à 37°C pendant 24 heures.
B)- Lecture des milieux de culture (J1),
b.1 Sur Hektoen Recherche de Salmonella et de Shigella
Identifier les colonies suspectes :
- Colonies Vertes - bleues (Lactose- / Saccharose -) : Suspicion Shigelles
- Colonies avec centre noir (H2S +) : Suspicion Salmonelles
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b.2 Recherche urée- indole
o Prendre 3 à 5colonies bien isolées suspectes / boîte une colonie / urée.
Colonies suspectes 3 à 5 urées…/ boîte
Incuber 3h, à 37°C.
Urée (-) ; Urée (+) ; Eliminer et arrêter l’ID°
ID° / galerie RAPID ONE (=identification)
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Recherche de E. Coli EntéroPathogène EPEC
(chez le nourrisson moins de 2 ans)
b.3 Sur gélose EMB
EMB
Présence de colonies à Absence de colonies à
éclat métallique éclat métallique
Identification biochimique
Si [Link] Recherche d’agglutination sur une Noter sur la fiche
lame propre. Cf POS groupage des paillasse ; Absence EPEC
[Link]
Une goutte anti- sérum nonavalent
Etaler une colonie, et mélanger avec
l’antisérum
Agglutination
+ -
Mélange IV, puis anti-sérum trivalent 1, 2 et 3
Antibiogramme : ATB Entérobactéries
( +) ( -)
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Noter sur la feuille paillasse
Présence d’EPEC :
E. Coli Entéropathogène
(J3) : Troisième jour
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Lecture du repiquage (milieu HEKTOEN), et recherche urée- indole
systématique.
Lecture galerie RAPID ONE
Remarques
Envoyer uniquement la souche Salmonelles* au CPC pour sérotypage
Salmonelles / galerie réduite
Faire Antibiogramme ATB :
Voir ATB enterobactéries
Confirmer, Identifier la souche
sur RAPID ONE
Incubations à 37°C, en aérobie pendant 24
heures
Non Oui
Salmonella sp
Absence de Salmonella et de Envoyer la souche au CPC
Shigella (Sur Gélose ordinaire)
Voir le Biologiste
Transcription des résultats : dans le registre.
Transcription dans l’ordinateur
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3.0 - REGLES D’HYGIENE ET DE SECURITE
Elimination des déchets selon la procédure pour les déchets infectieux et/ou souillés par des
liquides biologiques
4.0- RESULTATS
Saisie des résultats complets par la secrétaire médicale,
5.0- INTERPRETATION DES RESULTATS
Interprétation et Validation biologique par la Biologiste.
6.0- ENREGISTREMENT
Le registre de paillasse constitue une forme d’archivage.
Les données sont aussi conservées sous forme informatisée
7.0 BIBLIOGRAPHIE
REMIC 2007.
Précis de bactériologie : François Denis 2007
Etude cytobactériologique des produits de Guy Leyral 3 ième édition
Précis de Bactériologie clinique : Jean Freney 2007
COPROCULTURE
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DOCUMENT ATTESTATION RECORD
J'ai lu et compris le (POS-PST-02) sur COPROCULTURE
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