Présent et futur de la Protéomique clinique

Sylvain Lehmann, A. Dupuy, K. Peoc’H, Stephane Roche, B. Baudin, J.-L.

Beaudeux, M. Quillard, F. Berger, G. Briand, S. Chwetzoff, et al.

To cite this version:

Sylvain Lehmann, A. Dupuy, K. Peoc’H, Stephane Roche, B. Baudin, et al.. Présent et futur de la Pro-
téomique clinique. Annales de Biologie Clinique, 2007, 65 (5), pp.463-471. �10.1684/abc.2007.0149�.
�hal-00179241�

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 revue générale abc
Ann Biol Clin 2007 ; 65 (5) : 463-71

Présent et futur de la Protéomique clinique

Bilan d’activité du Groupe de travail « Protéomique clinique » de la SFBC 2004-2006

Present possibilities and future development of Clinical Proteomics

S. Lehmann Résumé. Cet article de synthèse se penche sur une nouvelle discipline biologi-
A. Dupuy que et médicale, la « protéomique clinique ». Cette approche « post-
génomique » vise à utiliser l’étude du protéome, c’est-à-dire de l’ensemble des
K. Peoc’h
peptides et protéines présents dans un échantillon biologique, pour donner une
S. Roche information diagnostique, pronostique ou de suivi thérapeutique des patholo-
B. Baudin gies humaines. Cette nouvelle discipline est en plein développement car elle
M. Quillard présente d’importantes perspectives pour les pathologies complexes ou pour la
F. Berger détection précoce de pathologies telles que les cancers. Les éléments de cette
revue résultent du travail d’un groupe thématique de la SFBC (Société fran-
G. Briand
çaise de biologie clinique) de 2004 à 2006 dont l’objectif était d’évaluer l’état
S. Chwetzoff actuel de la « protéomique clinique » et de s’interroger sur son développement
G. Dine et son application future pour les biologistes. Il s’agit donc d’un état des lieux
P. Gonzalo assez large décrivant les approches déjà accessibles dans les laboratoires d’ana-
B. Dastugue lyses biologiques (dosages multiplex...) et les outils disponibles en recherche
clinique et en protéomique « fondamentale », sans oublier les aspects bio-
M. Sève informatiques nécessaires à l’utilisation des données générées.
G. Siest
Mots clés : protéomique, multiplex, biomarqueur
J.-L. Beaudeux
Abstract. This review focuses on “clinical proteomics” which represents an
emerging discipline in biomedical research. “Clinical proteomics” relies on the
analysis of the proteome, i.e. the entire set of peptides and proteins present in a
biological sample, to provide relevant data for diagnosis, prognosis or thera-
peutic strategies of human pathologies. This new type of approach has tremen-
dous potential for the diagnosis of complex pathologies or for the early detec-
tion of cancers. This article reports the conclusions of a workgroup of the
French Society for Clinical Biology (SFBC) 2004-2006 which evaluated the
status, the impact and the future development of proteomics in the clinical
field. It provides therefore a broad view going from the methods already
present in the clinical laboratories (multiplex technologies...), to the tools for
clinical and basis research including bioinformatics.
Article reçu le 21 avril 2007,
accepté le 3 juillet 2007 Key words: proteomics, multiplex, biomarker

Cet article rapporte les travaux du groupe de travail « Pro- de la « protéomique clinique » afin de définir ses compo-
doi: 10.1684/abc.2007.0149

téomique clinique » de la Société française de biologie santes actuelles et de prévoir son développement et ses
clinique (SFBC) 2004-2006. L’objectif général de ce applications futures pour les biologistes médicaux.
groupe de travail était de faire un état des lieux assez large
Rappelons tout d’abord que la « protéomique » se situe au
premier plan des approches dites « post-génomiques »
Tirés à part : S. Lehmann comprenant également « métabolomique », « lipido-
<[email protected]> mique », « interactomique » [1]... Le terme générique de

Ann Biol Clin, vol. 65, n° 5, septembre-octobre 2007 463

revue générale

protéomique désigne l’étude du « protéome » qui comprend Réflexions et conclusions du groupe

l’ensemble des peptides et protéines présents dans une cel- sur les six thèmes définis
lule, un tissu, ou un prélèvement biologique, à un instant
donné, et dans un environnement donné. Le champ plus État des lieux des approches de protéomique
spécifique de la « protéomique clinique » concerne l’étude clinique actuellement disponibles dans
du protéome à la recherche d’une part, de marqueurs dia- les laboratoires d’analyses de biologie médicale
gnostiques, pronostiques et de suivi thérapeutique des
Ce thème est particulièrement important pour les labora-
pathologies humaines et, d’autre part, d’acteurs physiopa-
toires d’analyses et pour l’avenir de la protéomique clini-
thologiques pouvant servir de cible thérapeutique [2].
que. Les approches décrites ci-dessous permettent princi-
Trois niveaux différents d’approche protéomique peuvent palement la mesure simultanée de plusieurs paramètres,
être définis (tableau 1). En premier lieu on retrouve la tous pertinents dans un cadre « clinico-protéomique »
protéomique « fondamentale » qui fait appel à des outils donné, c’est-à-dire sous la forme de panels regroupant des
complexes ou coûteux, généralement de faible débit, tels biomarqueurs d’intérêt.
que l’électrophorèse bidimensionnelle (2D) ou la plupart
des applications de spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Analyseurs miniaturisés multiparamètres
Q-TOF, FT-ICR...) (tableau 2). Ces approches sont surtout Il s’agit d’analyseurs déjà utilisés depuis quelques années,
utilisées pour la caractérisation de peptides et de protéines souvent transportables, utilisables en urgence et/ou de
avec leurs modifications post-traductionnelles. On assiste façon délocalisée pour mesurer en une fois un petit nom-
ces dernières années à des évolutions technologiques bre de biomarqueurs. Ils reposent sur le développement de
importantes faisant passer certaines de ces technologies la miniaturisation et des micro- ou nanotechnologies
vers le haut débit. Ceci définit un deuxième groupe (micro-fluidique...) comme le système Triage® (Biosite)
d’approche protéomique dans le domaine de la « recher- [5] (figure 1A). Ces approches sont en fait à la limite de la
che clinique » focalisé sur la découverte de nouveaux protéomique clinique mais sont intéressantes conceptuel-
biomarqueurs. C’est le cas en particulier d’approches cou- lement, car elles préfigurent le devenir possible de ce
plant préfractionnement chromatographique et spectromé- domaine où de nombreux paramètres pourraient être
trie de masse pour l’obtention rapide de profils protéiques déterminés rapidement, localement, et avec un faible
[3]. L’intérêt de ces technologies réside dans la décou- volume d’échantillon. De même, il est possible que le
verte, individuelle ou combinée, de biomarqueurs à partir rendu des résultats de ce type d’analyseurs soit à terme
d’échantillons biologiques complexes. Ces profils pour- représenté par des indices (scores) indiquant une probabi-
raient être utilisés directement comme marqueur. Alterna- lité plus ou moins grande de la présence d’une patholo-
tivement, des approches plus classiques permettant la gie (infarctus, AVC...). Il est essentiel que le biologiste,
mesure simultanée de multiples paramètres (multiplexage) par exemple par l’intermédiaire de la SFBC, participe et
pourront être celles qui représenteront l’essentiel de la valide de tels scores.
« protéomique clinique » pratiquée dans les laboratoires Multiplexage
d’analyses (tableau 1) [4]. On assiste au développement récent d’analyseurs de type
Après ces premières observations et pour couvrir l’ensem- multiplex, réellement multi-paramètres, c’est-à-dire capa-
ble de la protéomique clinique, le travail de réflexion du bles de détecter plusieurs molécules simultanément dans
groupe a porté sur six thèmes : un seul milieu réactionnel et dans une même unité de
1. État des lieux des approches de protéomique clinique temps. Le multiplexage est basé sur des technologies
(type multiplexage en phase liquide ou solide) actuellement novatrices développées depuis quelques années pour les
disponibles dans les laboratoires d’analyses biologiques. laboratoires de recherche, dans la lignée des « puces »
2. Évaluation de l’intérêt et de la place des technologies de développées pour l’analyse du transcriptome. Il s’agit de
recherche en haut débit de marqueurs de protéomique cli- mesurer en multiplex des marqueurs biologiques déjà
nique (type « profiling » SELDI/ClinProt). connus en réalisant une économie significative de coût, de
3. Évaluation de la place et de l’intérêt de la technologie temps et de volumes d’échantillons biologiques. L’aspect
d’électrophorèse bidimensionnelle. « protéomique » avec sa notion d’exhaustivité réside ici
4. Bilan des méthodes d’identification des protéines, en dans la possibilité d’établir de véritables profils d’expres-
particulier de type spectrométrie de masse. sion protéique à visée diagnostique, thérapeutique ou pro-
5. Procédures pré-analytiques et protéomique. nostique.
6. Analyse des données protéomiques et bio-informatique. Les analyseurs multiplex disponibles dans les laboratoires
Certaines de ces questions se sont révélées particulièrement cliniques font appel principalement à deux types de tech-
importantes et d’actualité pour les biologistes et feront nologies, soit sur des surfaces de type « puce » [6], soit
assurément l’objet de réflexions et de travaux ultérieurs. des billes en phase liquide [7] (figure 1B et C).

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 Protéomique clinique, actualité

Tableau 1. Trois niveaux différents d’approche protéomique.

Niveau Exemples Avantages Inconvénients

Protéomique MALDI-TOF Précision, sensibilité, Faible débit
« fondamentale » Q-TOF, MSn, Analyse des modifications Coût équipements
FT-ICR, 2D... post-traductionelles Technique manuelle
Recherche LC-2D Haut débit Coût total des analyses
clinique SELDI, ClinProt, Automatisé Sensibilité
Protéine « array » Adapté à la recherche de biomarqueurs
Protéomique Multiplex sur puce ou liquide Adapté à la validation de bio-marqueurs Limité à des marqueurs
clinique Analyse en micro-fluidique et à la biologie délocalisée déjà identifiés

Tableau 2. Approches protéomiques.

Abréviation Signification Description succincte

MALDI-TOF Matrix assisted laser desorption ionisation Technique de séparation de peptides et de protéines selon leur masse. Les molécules
– Time of flight sont déposées sur une cible. Un laser UV permet l’ionisation et la désorption par
Désorption et ionisation laser assistées l’intermédiaire d’une matrice adjuvante. La séparation se fait par la mesure du temps
par une matrice – temps de vol de déplacement (vol) des molécules dans un tube sous vide
Q-TOF Quadripole – Temps de vol Variante sophistiquée de spectromètres de masse constitués de 2 spectromètres de
Ion Trap-TOF Trappe ionique - Temps de vol masse en tandem, le premier permettant une sélection d’un ion de masse donnée
(quadripôle ou trappe d’ions) et le second permettant de connaître sa séquence en
aminoacide
LC-MS/MS Chromatographie liquide - spectrométrie Technique combinant une séparation des protéines par chromatographie liquide (LC)
de masse (MS) / MS haute performance avant de les analyser par deux techniques spectrométriques de
masse successives
FT-ICR Fourier Transform - Ion Cyclotron Resonance Cette technique de spectrométrie de masse est la mesure de la masse d’un ion par la
Résonance cyclotronique ionique à transformée mesure du courant qu’il induit lors de son déplacement dans un champ magnétique.
de Fourier Cette technique permet d’obtenir une très grande précision de masse, de l’ordre de
1 ppm. Cette technologie peut être associée à une LC, LC-MS ou un MALDI
Profil type Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Technique combinant la fixation de protéines d’un milieu biologique complexe sur
SELDI-TOF / TOF et ClinProt Magnetic chromatographic différentes surfaces (SELDI) ou bille (ClinProt) selon leur affinité biochimique
ClinProt beads and MALDI-TOF (ionique...) ou biologique (ligand...) et leur analyse ultérieure par spectrométrie de
masse type MALDI-TOF

Le principe général des « biopuces » (biochips) est de d’enzymes telles que des phosphatases, ou pour des études
déposer/adsorber sur une surface de taille minimale, géné- d’interaction protéine-protéine et ligand-protéine.
ralement en silice traitée, des microgouttes (ou spots) de L’industrie est particulièrement utilisatrice de ce type de
réactifs (anticorps, protéines...). Ces surfaces permettent produit pour la recherche et la validation de molécules à
alors, après incubation avec un échantillon, de réaliser la visée thérapeutique. Le passage de ces approches « précli-
mesure de marqueurs d’intérêt (protéines plasmatiques, niques » vers la clinique n’a vu le jour que récemment.
anticorps...). Chaque spot permet la capture d’un biomar-
Le système sur billes quant à lui repose sur une approche
queur, généralement révélé par un réactif secondaire (anti-
de capture/détection comparable, mais la lecture est faite
corps...), lui-même marqué le plus souvent par un com-
par une technique de type cytométrie en flux, dans
posé fluorescent. Ainsi, sur une petite surface, on peut
laquelle un premier laser détecte le type de billes, et un
réaliser des dizaines de réactions de type Elisa (figure 1B).
second assure la quantification (technologie Luminex®).
La lecture est souvent effectuée avec une caméra de type
Le multiplexage est obtenu par la possibilité de mélanger
CCD (charge-coupled device). Ces « puces à protéines »
jusqu’à 100 types de billes différentes dans un échantillon
sont principalement disponibles en recherche fondamen-
de volume réduit. Lors de la lecture, chaque type de bille
tale et dans l’industrie pour la détection d’ensembles de
sera reconnu et lu individuellement.
protéines telles que des cytokines et facteurs de crois-
sance, des protéines impliquées dans des voies de signali- Ces technologies permettent donc théoriquement de détec-
sation, dans l’apoptose, etc. Certaines puces comprennent ter de multiples paramètres, rapidement et dans un faible
plus de 5 000 spots de protéines recombinantes pour la volume d’échantillon, répondant ainsi aux exigences de la
recherche d’auto-anticorps, pour l’étude de la spécificité protéomique clinique. Plusieurs sociétés ont commencé à

Ann Biol Clin, vol. 65, n° 5, septembre-octobre 2007 465

revue générale

proposer l’utilisation de ces technologies pour mesurer ques. En France, pour les puces, seule la société Randox
des ensembles de paramètres cohérents ou « panels ». Fort dispose d’analyseur à « biochips » : le système Evidence®
de ce constat, notre groupe s’est penché sur les différents automatisé et à haut débit et le système Investigator®, qui
aspects de ces technologies en se limitant à la partie « pro- utilise les mêmes puces, mais dont l’utilisation n’est pas
téique » de leur utilisation. Il faut en effet noter, pour la automatisée. Pour la technologie Luminex par contre, le
technologie Luminex® mais aussi pour certaines biopuces, choix d’analyseurs est plus étoffé avec notamment les sys-
que ces systèmes permettent également la détection d’aci- tèmes xMAP® (Luminex), Bio-Plex® (Bio-Rad),
des nucléiques pour de nombreuses applications dans le QUANTA Plex® (Inova/Menarini), Athena Multi-Lyte®
domaine génomique. (Zeus/InGen), LiquiChip® (Qiagen) et FIDIS-Caris®
Malgré le nombre important de sociétés proposant des (Biomedical Diagnostics). Différentes sociétés vendent
panels pour la recherche fondamentale ou l’industrie, peu juste des kits de détection basés sur cette technologie
de systèmes sont disponibles pour les laboratoires clini- (Cliniscience, Euromedex, R&D Systems...) [4].

Fixation Lavages Révélation Lecture

Micro-fluidique

Multiplexe sur puce

Multiplexe en phase liquide

SELDI-TOF

Figure 1. Schéma de principe de différentes méthodes d’analyse protéomiques. Dans les technologies immuno-chromatographiques
communément appelées dans leur version miniaturisée : « micro-fluidiques », (A) les molécules d’intérêt (protéines, peptides...) sont
capturées par des anticorps fixés à des billes (colorées...). Ces complexes sont entraînés par un système micro-fluidique dans des
capillaires où sont immobilisés, à une position donnée, d’autres anticorps reconnaissant également la molécule à doser. Les billes sont
arrêtées à ces positions et les complexes sont alors visibles dans une fenêtre prévue à cet effet. Dans les approches multiplex sur
puce (B) ou en milieu liquide (C), les molécules d’intérêt sont capturées par des anticorps (ou par un autre type de ligand tel que des
antigènes spécifiques). Ces anticorps sont fixés à des positions précises sur une surface (B) ou liés à des billes de couleurs différentes
(C). Après rinçage, un second anticorps fluorescent, ou associé à une activité enzymatique, va lier la molécule à doser réalisant ainsi
une réaction « sandwich ». La révélation se fait comme pour un Elisa classique (B) (la position sur la puce donnant une valeur pour
chacun des paramètres analysés), ou comme une analyse de cytométrie en flux (C) (avec deux lasers, l’un lisant le type de bille, l’autre
la quantité de second anticorps). Le SELDI-TOF (D) est basé sur la capture de molécules par une surface de type chromatographique
(hydrophobe, ionique, affinité...). La révélation des molécules retenues repose sur l’utilisation d’un spectromètre de masse en temps de
vol (TOF) donnant ainsi un profil des peptides et protéines retenus.

466 Ann Biol Clin, vol. 65, n° 5, septembre-octobre 2007

 Protéomique clinique, actualité

Analyse critique des systèmes multiplex qui se dégage est celle d’un développement « hâtif ». Il est
En premier lieu nous avons passé en revue les différents en effet associé à un transfert des opérations de validation
panels protéiques disponibles. Sur les sites et brochures sur les utilisateurs (y compris pour ce qui est de la valida-
des différentes sociétés, de très nombreux panels sont tion de l’intérêt en biologie clinique d’un panel donné).
mentionnés : marqueurs tumoraux, cardiaques, bilans hor- Ceci est difficilement acceptable en phase “commerciale”,
monaux, allergènes, dépistage des drogues, AVC, anémie, avec, qui plus est, des systèmes de coût élevés. L’ensem-
maladies infectieuses, marqueurs osseux, cytokines... En ble des difficultés relatées explique probablement la faible
fait, la plupart des panels annoncés ces deux dernières pénétration actuelle de ces équipements dans les laboratoi-
années ne sont pas encore disponibles commercialement. res hospitaliers, contrastant avec une bonne implantation
De notre analyse préliminaire, il ressort une grande attente dans les unités de recherche.
des biologistes du groupe de travail concernant le choix → Le groupe souligne la nécessité d’agir en amont de
des paramètres et la pertinence des panels proposés. En l’industrie pour concevoir et/ou obtenir des panels clini-
effet, certains paramètres ne sont pas ou plus d’actualité, quement pertinents
des marqueurs récents sont manquants et il y a un manque
de cohérence global des panels. Une explication repose Devant l’insuffisance de pertinence clinique des panels
peut-être sur le fait que ces panels sont générés par chaque proposés, une question a été débattue au fil des réunions :
société en fonction des réactifs disponibles. D’autre part, est-ce le rôle d’un groupe tel que le nôtre de proposer des
la mise au point de ces dosages pose des problèmes tech- panels cliniquement pertinents ? D’un côté, nous pouvons
niques pour garantir une qualité analytique de niveau considérer que c’est la mission des industriels mais pas
« clinique ». En effet, il s’agit généralement de combiner celle des biologistes de concevoir des produits commer-
la capture simultanée de nombreuses protéines par des ciaux ; de l’autre, il est certain que cela pourrait éviter des
anticorps fixés au support et leur détection par un mélange mois d’errements à valider dans nos laboratoires les
de nombreux anticorps secondaires marqués. On imagine panels mal conçus et insuffisamment évalués par nos par-
aisément les difficultés d’optimisation des conditions de tenaires industriels. On peut souligner que cette démarche
capture et les problèmes liés au manque de spécificité de se rapproche du concept de puce à façon.
certains réactifs. → En conclusion, il faut clairement montrer que les
L’un des types de panels qui semble le plus abouti et le dosages multiplex ont un intérêt pour le biologiste (coût,
plus représenté parmi les sociétés concerne le domaine des qualités analytiques, intérêt physiopathologique..), pour
cytokines. On y retrouve généralement de nombreuses le clinicien (aide au diagnostic, suivi, recherche clini-
interleukines (IL-1, 2, 4, 6, 8...), différents facteurs de que) et pour le patient (bénéfice direct/indirect, diminu-
croissance et cytokines (FGF, PDGF, IGF, IFN, TNF...). tion des prélèvements..).
On remarquera tout d’abord qu’aucun biomarqueur de ces
panels n’est reconnu dans la nomenclature et qu’il reste à Intérêt et place des technologies de recherche
démontrer l’intérêt clinique de nombre d’entre eux. Il est en haut débit de marqueurs de protéomique
possible que leur présence sur le marché soit la consé- clinique (type « profiling » SELDI-Ciphergen
quence de la disponibilité de tels panels dans leur version ou ClinProt-Brucker)
« recherche ». Il est apparu récemment des technologies permettant
Conclusion et perspective d’acquérir des données sur un grand nombre d’échan-
tillons (haut débit), donnant lieu à une approche de protéo-
→ Les diffıcultés à la fois technologiques et analytiques mique différentielle. Il s’agit ici de mettre en évidence des
retardent l’avènement de ces systèmes en biologie clini- peptides/protéines dont l’expression est modulée dans une
que pathologie donnée et qui pourront alors servir de biomar-
Le groupe de travail souligne le passage délicat de ces queurs. Nous sommes ici dans une situation qui s’appa-
méthodes multiplex des unités de recherche aux laboratoi- rente plus à une « recherche clinique », mais il n’est pas
res de diagnostic. Ceci restera vrai tant que les fournis- exclu que de telles technologies soient un jour directement
seurs ne prendront pas conscience de l’importance des utilisées à des fins de diagnostic/pronostic/suivi et donc
phases de validation de leurs techniques : évaluer intéressent les laboratoires d’analyses biomédicales.
l’influence des facteurs pré-analytiques (voir thème 5), des La première approche répondant à ces critères est appelée
interférences, des réactions croisées potentielles ; évaluer « Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-
les performances analytiques des systèmes (imprécision, Of-Flight Mass Spectrometry » ou SELDI-TOF® (Cipher-
justesse, valeurs usuelles...), les comparer aux méthodes gen - Biorad). Décrit pour la première fois en 1993, il
déjà utilisées en diagnostic et fournir des documents com- s’agit d’un système permettant dans une première phase
plets aux futurs utilisateurs. Pour l’instant, l’impression de retenir des protéines sur une petite surface chromato-

Ann Biol Clin, vol. 65, n° 5, septembre-octobre 2007 467

revue générale

graphique (type échange ionique, hydrophobe...). Les nique ancienne d’analyse protéique a bénéficié récemment
peptides/protéines retenus sont ensuite analysés par spec- d’améliorations importantes (gels pré-coulés, identifica-
trométrie de masse en temps de vol (MS-TOF) générant tion facilitée...), mais elle reste une technique lourde qui
un profil représenté par une série de pics de nature incon- permet difficilement l’analyse rapide de nombreux échan-
nue mais qui peuvent être analysés par des outils statisti- tillons. En fait, elle ne semble pas avoir d’application
ques et bio-informatiques. Il est apparu récemment une directe pour le diagnostic, ou alors réduite à la détection
approche similaire au SELDI-TOF, la technologie d’isoformes protéiques (haptoglobine, protéine 14-3-3...)
ClinProt® (Brucker Daltonics) dans laquelle la capture se dont la détermination pourrait être cliniquement intéres-
fait grâce à des billes magnétiques plutôt que sur surface sante.
plane. Dans l’attente d’études comparatives, notre groupe Pour finir, notons qu’apparaissent sur le marché des
de travail n’a pas pour l’instant de recommandation sur approches appelées « 2D liquides » [9]. Il s’agit en fait de
l’intérêt d’une approche plutôt qu’une autre. Quoi qu’il en techniques chromatographiques automatisées mettant en
soit, ces approches permettent l’étude du profil d’expres- série deux colonnes pour séparer les protéines selon leur
sion protéique d’une grande variété d’échantillons biolo- charge (et non réellement leur point isoélectrique) et leur
giques complexes comme le sérum, le plasma, l’ascite, les masse. De multiples fractions sont ainsi générées pour une
urines et les lysats cellulaires. Le SELDI-TOF a été utilisé étude analytique, voire de protéomique comparative de
dans de nombreuses études pour identifier des biomar- type profiling. Cette nouvelle approche devra être évaluée
queurs dans des pathologies diverses et en particulier dans dans l’avenir ; elle présente en effet des avantages d’auto-
les cancers, ce qui lui a valu une très grande notoriété matisation par rapport à la 2D classique mais l’analyse de
initiale. Cependant, l’application de ces découvertes à la chaque échantillon dure plus d’une dizaine d’heures.
clinique se fait attendre et il semble dans un certain nom-
→ Notre groupe considère que la 2D classique n’a pas
bre de cas que les résultats initiaux en termes de sensibi-
sa place dans les laboratoires d’analyses biologiques
lité et de spécificité diagnostiques de ces nouveaux bio-
classiques même s’il s’agit d’une approche essentielle de
marqueurs potentiels ne soient à revoir à la baisse.
la protéomique.
Si l’intérêt de telles approches pour les phases de décou-
verte et de validation de biomarqueurs est évident et leur Bilan des méthodes d’identification des protéines
présence au sein de « plateformes » de protéomique clini- et en particulier de type spectrométrie de masse
que justifiée, on peut se poser la question de leur perti- L’identification des protéines à la suite d’une électropho-
nence dans les laboratoires d’analyses biologiques. rèse bidimensionnelle ou d’une chromatographie est de nos
Notons que, d’un point de vue pratique, leur utilisation jours principalement réalisée en spectrométrie de masse. On
routinière s’apparente à celle de trousses Elisa avec une peut compter en premier lieu sur le peptide mass finger-
succession d’étapes de distribution, d’incubation et de printing où l’identification repose sur la mesure de masse
lavage (figure 1C). de fragments peptidiques, générés en particulier par la tryp-
→ Notre groupe de travail constate que, malgré les sine à partir de la protéine à identifier ; l’interrogation de
annonces faites, il n’y a pas encore d’application clini- banques de données peptidiques permet le plus souvent de
que disponible sur ces appareils et donc que l’investisse- donner l’identité de la protéine avec une forte probabilité.
ment dans ces technologies est plus du domaine des Dans ce cas, la technique de MALDI-TOF (Matrix-Assisted
plateformes de protéomique clinique pour la recherche Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight) est encore
et la validation de nouveaux marqueurs. souvent utilisée. On peut également réaliser un micro-
séquençage par fragmentation des peptides avec des appro-
Évaluation de la place et de l’intérêt ches MS/MS, Q-TOF (Quadripole-TOF), Ion Trap-TOF ou
de la technologie d’électrophorèse bidimensionnelle même avec la très performante FT-ICR (résonance cyclotro-
L’électrophorèse bidimensionnelle (2D) est la technologie nique ionique à transformée de Fourier) permettant d’iden-
la plus classiquement utilisée en protéomique. Cette tifier de nombreuses modifications post-traductionnelles
approche repose sur la séparation en gel des protéines, en (tableau 2). Il est possible, et même souvent nécessaire, de
fonction de deux caractéristiques biochimiques : leur coupler des techniques de chromatographie liquide et de
point isoélectrique et leur masse moléculaire. Après sépa- spectrométrie de masse (LC-MS), en particulier de nano
ration, les protéines sont repérées (coloration, fluores- HPLC pour la séparation des ions peptidiques à séquencer.
cence...) et une approche de protéomique différentielle Cela permet de réaliser des profils protéiques extrême-
peut être réalisée à la recherche de biomarqueurs poten- ment complets qui ont leur place dans les approches de
tiels. L’identification des protéines présentes dans les gels protéomique différentielle à la recherche de nouveaux bio-
fait appel principalement à la spectrométrie de masse marqueurs. On constate en fait une amélioration continue
(MALDI-TOF, LC-MS/MS...) (tableau 2) [8]. Cette tech- de ces techniques, d’où la nécessité d’une veille technolo-

468 Ann Biol Clin, vol. 65, n° 5, septembre-octobre 2007

 Protéomique clinique, actualité

gique les concernant. À titre d’exemple, se développent protéomiques aboutissent presque toujours, dans une
actuellement des approches de spectrométrie de masse phase initiale, à des candidats potentiels, dont l’identifica-
quantitative détectant des peptides spécifiques de protéi- tion et la validation demandent alors de gros investisse-
nes d’intérêt [10]. L’une de ces approches dite Multiple ments. Il faut donc être particulièrement attentif aux biais
reaction monitoring, est potentiellement utilisable pour la potentiels dès le début d’une étude.
détection en multiplex de peptides et protéines dans des → Il faut uniformiser au maximum les procédures de
mélanges biologiques complexes, l’un des buts de la pro- constitution des échantillothèques de protéomique (tubes,
téomique clinique. anticoagulants, autres prétraitements, température de
→ Notre groupe considère que les méthodes d’identifica- conservation...) et en particulier pour les études prospecti-
tion de protéines par spectrométrie de masse sont pour ves, il faut garder une grande homogénéité des conditions
l’instant limitées à des laboratoires spécialisés de pro- préanalytiques à la fois tout au long de l’étude et entre les
téomique (plateformes) en raison des coûts, de la très centres participants.
haute technicité demandée et de la complexité de l’ana- → Idéalement, il conviendrait d’utiliser, ou de mettre au
lyse et de l’interprétation du résultat brut obtenu. point, une méthode de qualification des échantillons col-
lectés avant leur traitement par les techniques de protéo-
Procédures préanalytiques et protéomique mique lourdes et coûteuses. Plusieurs laboratoires tra-
Dans la pratique courante des laboratoires d’analyses de vaillent dans ce sens.
biologie médicale, les conditions préanalytiques, liées à la → Les paramètres préanalytiques optimaux en fonction
collection, au transport, à la transformation et au stockage des approches protéomiques restent encore à préciser dans
des échantillons biologiques influencent parfois de le cadre d’études en cours ou à venir. Il est d’ores et déjà
manière importante les résultats des étapes analytiques acquis que ces paramètres peuvent différer selon les ana-
ultérieures. Les biologistes du groupe de travail ont été lytes recherchés et/ou les méthodes analytiques appli-
confrontés dans leur activité « d’analyse protéomique » à quées. On ne peut donc pas proposer un protocole pré-
de nombreux exemples dans lesquels les conditions pré- analytique protéomique unique, d’autant plus qu’on ne
analytiques sont cruciales. Ce fut le cas en particulier lors peut pas forcément prédire qu’une banque biologique sera
des essais des systèmes multiplex décrits précédemment, analysée avec telle ou telle méthode dans le futur. À défaut
pour lesquels l’utilisation de plasma préparé sur tube de cela, il faut pouvoir avoir accès rapidement, pour cha-
EDTA ou sur tube hépariné a eu d’importantes conséquen- que type d’échantillon, aux conditions préanalytiques qui
ces sur les résultats. Notre groupe de travail a ainsi débuté le caractérisent, afin d’éviter au maximum les biais et
une réflexion centrée sur les procédures préanalytiques et permettre les transferts d’échantillons de laboratoire à
la protéomique. Il faut noter en premier lieu que ce sujet laboratoire. Pour cela nous ressentons la nécessité de dis-
est particulièrement important à l’heure du développement poser d’un codage général des variables liées à ces étapes
de la protéomique clinique et d’autres instances que la préanalytiques.
SFBC sont en pleine réflexion à ce sujet. C’est en particu-
lier le cas de l’organisation internationale HUPO (human
proteome organization) [11] et du réseau « Biomarqueurs Analyse des données protéomiques,
d’états pathologiques » formé initialement sous l’égide du index et algorithmes
Réseau national des génopoles (RNG). Plusieurs membres Les technologies d’analyse protéomique évoquées dans
de notre groupe de travail sont d’ailleurs membres de ce les paragraphes précédents (2D, LC-MS, SELDI...) génè-
réseau. L’importance du sujet à également conduit l’Insti- rent une très grande quantité de données brutes dont le
tut national du cancer (INCa) et la Haute autorité de santé traitement nécessite des moyens bio-informatiques adap-
(HAS) à lancer un appel d’offre tourné vers cette problé- tés et maîtrisés, extrêmement puissants et coûteux [12].
matique. Ces outils d’analyse informatique sont souvent intégrés
À l’issue de ces premières réflexions notre groupe aux appareils (SELDI-TOF) ou fournis séparément sous
exprime les opinions suivantes : forme de logiciels de traitement des données (ex. logiciels
→ Les variations dues aux procédures préanalytiques déjà d’analyse des gels ou des chromatogrammes complexes
observées dans les analyses protéomiques (SELDI, MS...) pour la 2D en gel ou en phase liquide). Il faut mentionner
sont telles qu’il semble illusoire d’utiliser pour la recher- également les indispensables logiciels de traitement des
che de nouveaux biomarqueurs des échantillons de biothè- données peptidiques permettant l’interrogation des ban-
ques déjà constituées, pour lesquels l’homogénéité pré- ques de données accessibles sur Internet et le traitement
analytique ne serait pas garantie (types de prélèvement, de des informations qui en sont extraites. Ainsi, la bio-
tube, mode de conservation...). Ceci est d’autant plus vrai informatique constitue un partenaire obligatoire des tech-
que les recherches de biomarqueurs par des approches nologies protéomiques.

Ann Biol Clin, vol. 65, n° 5, septembre-octobre 2007 469

revue générale

La bio-informatique peut permettre, en outre, d’appliquer Conclusion

le concept de protéomique clinique (évaluation globale et
simultanée d’un ensemble de protéines participant à un
L’application de l’analyse protéomique au diagnostic bio-
même processus physiopathologique) à des mesures mul-
médical est une perspective technologique majeure pour
tiples de paramètres biologiques obtenues, soit par des
nos laboratoires. Le travail réalisé par le groupe SFBC a
techniques classiques, soit en multiplex. Pour cela, il
permis de faire un état des lieux de cet ensemble de tech-
convient d’appliquer aux données produites avec des
niques et son positionnement actuel en biologie (recherche
moyens routiniers une analyse bio-informatique afin de
et clinique). La diffusion de cette nouvelle technologie
définir des profils et des index qui permettent ensuite une
dans le cadre du diagnostic biologique se fera prioritaire-
catégorisation clinique (diagnostique, pronostique...).
ment par les techniques multiplex (en phase solide ou
Conceptuellement, l’idée est que la combinaison de mar-
liquide). Il convient maintenant de préciser voire d’éva-
queurs peu spécifiques ou sensibles peut produire une
luer : 1) les conditions préanalytiques appliquées aux
information clinique utile. Le concept est ancien et plu-
échantillons biologiques afin de permettre leur analyse par
sieurs exemples historiques existent : ainsi l’indice
la technologie protéomique ; 2) l’intérêt « bioclinique »
gamma, rapport calculé de deux dosages dans le LCR et
des combinaisons de biomarqueurs proposées par les
de ces mêmes dosages sanguins permettant d’évaluer une
industriels. Ces deux thèmes, associés à une veille techno-
synthèse intrathécale d’immunoglobulines, ou bien encore
logique et à une réflexion sur les choix de panels protéo-
le rapport IgA/transferrine permettant d’évaluer deux
miques pertinents pour les applications cliniques, feront
aspects différents du dysfonctionnement hépatique lors
l’objet de réflexions supplémentaires au sein de la SFBC.
des cirrhoses. Mais la nouveauté réside dans la possibilité
de combiner désormais un grand nombre de marqueurs
par des relations mathématiques complexes. Un exemple
démonstratif de cette approche est celui du « Fibrotest® »
utilisé pour estimer le niveau de fibrose hépatique sur la Références
base du dosage de cinq paramètres biologiques classiques
et d’un algorithme protégé par un brevet [13]. De même, 1. Kiechle FL, Zhang X. The postgenomic era : implications for the cli-
des analyseurs au lit du malade (type Triage®) peuvent nical laboratory. Arch Pathol Lab Med 2002 ; 126 : 255-62.
rendre un score de risque calculé avec un algorithme en 2. Vitzthum F, Behrens F, Anderson NL, Shaw JH. Proteomics : from
lieu et place d’un dosage classique. basic research to diagnostic application. A review of requirements &
Notons qu’en utilisant des méthodes d’analyse de type needs. J Proteome Res 2005 ; 4 : 1086-97.
multiplex, qui seront certainement de plus en plus propo-
3. Reynès C, Roche S, Tiers L, et al. Comparison between surface and
sées sur le marché, nous risquons d’obtenir une multitude bead based MALDI profiling technologies using a single bioinformatics
de résultats dont certains correspondront à des paramètres algorithm. Clin Proteomics 2007 ; sous presse.
biologiques validés, mais beaucoup d’autres à des paramè-
tres non validés cliniquement... Seule la bio-informatique 4. Dupuy AM, Lehmann S, Cristol JP. Protein biochip systems for the
permettra d’extraire une information pertinente dans cette clinical laboratory. Clin Chem Lab Med 2005 ; 43 : 1291-302.
avalanche de données issues de la protéomique clinique.
5. Apple FS, Christenson RH, Valdes R, et al. Simultaneous rapid
→ Si historiquement la génomique, puis actuellement la measurement of whole blood myoglobin, creatine kinase MB, and car-
protéomique, sont en plein développement pour des diac troponin I by the triage cardiac panel for detection of myocardial
applications cliniques, une vraie évolution de notre pra- infarction. Clin Chem 1999 ; 45 : 199-205.
tique est à attendre des outils bio-informatiques qui
6. Fitzgerald SP, Lamont JV, McConnell RI, Benchikh el O. Develop-
traiteront et mettront en relation toutes ces données. ment of a high-throughput automated analyzer using biochip array tech-
→ Une réflexion et un positionnement des biologistes et nology. Clin Chem 2005 ; 51 : 1165-76.
de leurs sociétés savantes paraissent nécessaires face au
7. Shovman O, Gilburd B, Barzilai O, et al. Evaluation of the BioPlex
développement probable, dans les prochaines années,
2200 ANA screen : analysis of 510 healthy subjects : incidence of
d’algorithmes de décision clinique. Doit-on accepter natural/predictive autoantibodies. Ann N Y Acad Sci 2005 ; 1050 :
d’utiliser des calculs dont on ignore les caractéristiques ? 380-8.
Quelles sont les conséquences en termes de responsabilité
professionnelle pour le biologiste qui rendra ce type de 8. Bruneel A, Labas V, Mailloux A, et al. Proteomic study of human
umbilical vein endothelial cells in culture. Proteomics 2003 ; 3 : 714-23.
résultat ? Comment le biologiste (ou les sociétés savantes
comme la SFBC) peuvent-elles participer à l’établisse- 9. Soldi M, Sarto C, Valsecchi C, et al. Proteome profile of human urine
ment de ces algorithmes ? Ces derniers points soulèvent with two-dimensional liquid phase fractionation. Proteomics 2005 ; 5 :
des problèmes éthiques qui devront être abordés. 2641-7.

470 Ann Biol Clin, vol. 65, n° 5, septembre-octobre 2007

 Protéomique clinique, actualité

10. Domon B, Aebersold R. Mass spectrometry and protein analysis. 12. Fung ET, Weinberger SR, Gavin E, Zhang F. Bioinformatics approa-
Science 2006 ; 312 : 212-7. ches in clinical proteomics. Expert Rev Proteomics 2005 ; 2 : 847-62.
11. Rai AJ, Gelfand CA, Haywood BC, et al. HUPO plasma proteome 13. Ngo Y, Munteanu M, Messous D, et al. A prospective analysis of the
project specimen collection and handling : towards the standardization of prognostic value of biomarkers (FibroTest) in patients with chronic hepa-
parameters for plasma proteome samples. Proteomics 2005 ; 5 : 3262-77. titis C. Clin Chem 2006 ; 52 : 1887-96.

Professeur Baudin Bruno } 01 49 28 20 13

Laboratoire de biochimie A, Hôpital Saint-Antoine, 184, rue du Fbg Saint-Antoine 75571 Paris Cedex 12 @ [email protected]

Professeur Beaudeux Jean-Louis } 01 42 16 21 87

Service de biochimie métabolique, Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, 83, Boulevard de l’Hôpital, @ [email protected]
75013 Paris

Professeur Berger François } 04 76 76 56 25

Inserm Unité 318 Pavillon B, CHU Albert Michallon, BP 21738043, Grenoble Cedex 09 @ [email protected]

Docteur Briand Gilbert } 03 20 62 68 99

Laboratoire de biochimie-biologie moléculaire, CHRU-Site Eurasanté, 59037 Lille Cedex @ [email protected]

Docteur Chwetzoff Serge } 01 40 01 13 23

Inserm U, Faculté de Médecine, CHU Saint-Antoine, 27, rue de Chaligny, 75012 Paris @ [email protected]

Professeur Dastugue Bernard } 04 73 17 81 80

Faculté de médecine, 28, Place Henri-Dunant - BP 38, 63001 Clermont-Ferrand Cedex @ [email protected]

Professeur Dine Gérard } 03 25 49 47 21

Laboratoire d’ingénierie en biotechnologies et santé, École centrale de Paris, Grande Voie des Vignes, @ [email protected]
92295 Chatenay Malabry

Docteur Dupuy Annie } 04 67 33 79 61

Laboratoire de biochimie, Hôpital Lapeyronie, 34295 Montpellier Cedex 5 @ [email protected]

Docteur Gonzalo Philippe } 04 72 72 26 45

Institut de biologie et chimie des protéines, UMR 5086-CNRS/Université Lyon 1, @ [email protected]
IFR 128, 7, passage du Vercors 69367 Lyon Cedex

Professeur Lehmann Sylvain et docteur Roche Stéphane } 04.67.33.71.23

Laboratoire de biochimie, Hôpital Saint Eloi, 80 avenue A. Fliche,3 4295 Montpellier Cedex 5 @ [email protected]

Docteur Peoc’h Katell } 01 49 95 64 40

Service de biochimie et biologie moléculaire, Hôpital Lariboisière, 2, rue Ambroise Paré, 75475 Paris @ [email protected]
Cedex 13

Docteur Quillard Muriel } 02 32 88 81 19

Laboratoire de biochimie médicale, CHU de Rouen, 1, rue de Germont, 76031 Rouen Cedex @ [email protected]

Docteur Seve Michel } 04 76 76 54 84

Centre d’Innovation en biologie, CHU Grenoble, BP 217, 38043 Grenoble Cedex 09 @ [email protected]

Professeur Siest Gérard } 03 83 68 21 70

Inserm U525, Equipe 4, Faculté de pharmacie, UHP Nancy 1, 30, rue Lionnois, 54000 Nancy @ [email protected]

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