Introduction à la Biochimie

I. Généralités sur les Molécules en biochimie

 Organisme Humain : H2O = plus Grande Masse

60 – 65 % → Adulte
78 % → Nouveau-Né
70 % → Nourrisson

 Biochimie : Centrée sur le Carbone

Permet de constituer 100'000 molécules chez l’Homme
50% Poids sec du corps Humain

 4 Liaisons : Simples (saturées) CH4

Doubles (insaturées) O = C = O
Triples (insaturées) H – C = C – H

 Les Molécules sont de 2 types :

 Simples (assez inertes) : Carbone + Hydrogène (linéaire, ramifié ou cyclique)

 Complexes (réactives ++) : H remplacé par N, P, O, S [plus électro-réactifs]
 Augmentation polarité, solubilité et réactivité des molécules

Groupement
Phosphate Aldéhyde Cétone Sulfhydryl

Façon d’activer/désactiver
une fct° protéique
Ajout = Kinase
Suppr = Phosphatase

Molécules simples (monomère)  Complexes (polymères / macromolécules)

Glucose Glycogène

 4 Familles : Lipides (Acides Gras, Triglycérides, Cholestérol, …)

Glucides (oses simples [glucose], polysaccharoses [glycogène])
Acides Aminés, Peptides, Protéines
Nucléosides, Nucléotides
 II. Liaisons entre Atomes

Fortes énergie = > 100 [Link]-1

Faible énergie = < [Link]-1

A. Liaisons Covalentes

 Moyenne : 400 [Link]-1 (fortes)

 Partage : d’un ou plusieurs e- (ex C – C)

 Règle de l’octet : stabilisation de sa couche ext d’e-
 1 à 3 paires d’e- entre 2 atomes (1 à 3 liaisons) [de + en + solide]
 Pas de 4 liaisons entre 2 atomes en bio Hum

 Molécules Polaires / Apolaires :

 Si Liaison avec Atomes + électronégatif (O & N) : dipôle (δ+ et δ-)
 Molécule polaire δ+ δ-
 Grande réactivité chimique C=O

 Si pas de déséquilibre (surtout avec C & H) alors Apolaire (peu réactives)

Polaire : Hydrosoluble : pas transporteur dans le sang (Glucose)

Apolaire : Non Hydrosoluble : transporteur sanguin (lipides se lient avec apoprotéines)

 Ionisation : tellement de déséquilibre  Rupture électrolytique

 Na – Cl  Na+ (cation) & Cl- (cation)

 Radicaux Libres : Rupture de liaison homolytique

 O = O  2 O°
 Electrons non Appariés = très instable !

 Altération d’autres molécules : Acides Nucléiques, Lipides, …

Mutations ADN Peroxydation lipidique

 TOXIQUES
Cancérisation Mort CellR, Vieillissement

 Dérivés Réactifs de l’Oxygène (DRO) :

 Radical hydroxyde HO° Stress Oxydant
 Radical Alkoxyle RO° (si plus d’oxydants que d’antioxydants)
  Lutte Enzymatique :
 Superoxyde dismutique, catalase, péroxyrédoxine, lactoperoxydase,
glutathion peroxydase

 Antioxydant :
 Glutathion, Vit E & C (intracell ++)
 Acide urique (extracell)

B. Non Covalente

 Pas de mise en commun d’e- donc :

 Moins forte que covalente (10x moins)
 Reformation facile

 Liaison Ionique (en solution) :

 Entre un atome + et atome –
 Liaison hétéro-polaire / « pont de sel »
 4 [Link]-1 / si même atomes mais état solide ([Link]-1)

 Liaison Hydrogène : 40 [Link]-1

Quand H lié avec atome fortement électronégatif (O ou N)
 H : petite charge positive
 Peut interagir avec atome avec petite charge négative
 Et aussi entre et avec molécules d’eau

 Liaisons de Van Der Waals : 10 [Link]-1 (en moy)

 Quand déséquilibre = formation temp de dipôle élec
 2 molécules dipolaires = rapprochement / même moment
Orientation appropriée

Faible attraction de Van der Waals

 Liaison H : type particulier de liaison de Van der Waals incluant H

 Interaction hydrophobe :
 Hydrophobes : éviter le contact avec l’eau
 III. Acides Aminés
A. Introduction
 Cadre des protéines : grec protos = premier, + important, car :
 Cellule : > 50% des molécules (poids sec)
 Structure liée au code génétique
 Molécule induisant formation d’autres molécules (enzymes)

 Acides Aminés (AA) : sous-unités monomériques des peptides / protéines

 Liaison peptidique
 Protéine > peptide > AA

Acide Aminé : Nom général dû à leur structure (Fct° COOH / NH2)

Forte Conservation entre Eucaryote et Procaryote

 Les Bactéries peuvent produire des protéines humaines ( « Recombinantes » )

Production ADNC Humain de l’Insuline  Diabète de type 1

Bactérienne Hormone de Croissance  Retard de Croissance Osseux

 2 Grandes Familles : Appartenance non exclusive

1) A.A. à Rôle Protéinogène

 Synthèse peptidique/protéique (250-300g par jour chez l’H)

 20 A.A. historiques
 Retrouvés identiques ou modifiés (modif post traduc) dans structure peptidique/protéique

+ 2 AA rajoutés :
 Sélénocystéine : homme/bactérie
Sélénium prend la place du soufre dans la cystéine (mais formée à partir sérine)
Sert product° Glutathion peroxydase (lutte DRO)
Thioréduxine réductase / désiodase (métabolisme hormone thyroïdienne)

 Pyrolysine = archéobactérie méthanogène

Méthyl-transférase

2) A.A. à Rôle Non Protéinogène

 300 AA

 Précurseur de molécules complexes : Glycine → Hème → Hémoglobine

 Réserve d’énergie : Créatine – Phosphate (vertébrés)

liaison type Phospho – Amidine
Arginine – Phosphate (invertébrés)
 Précurseur Hormonal :

Dérivé iodé de tyrosine / hormone thyroïdienne

Mono-Iodotyrosine (MIT) / Di-Iodotyrosine (DIT)

T3 (tri-iodotyrosine : MIT + DIT) / T4 (tétra-iodotyrosine : DIT + DIT)

 Coagulation Sanguine : γ Carboxy-Glutamate (liaison Ca2+)

 Neurotransmission (excitateur / inhibiteur)

Glutamate (+)
Glycine (-)
Acide γ aminobutyrique (GABA) : dérivé Glutamate (-)

 Métabolisme : A.A. Glucoformateur (néoglucogenèse)

Métabolisme, transport et élimination de l’azote

 Production du monoxyde d’azote (NO)

B. Structure / Propriétés Physico-Chimiques

1) Structure

 Fonction Acide Carboxylique

 Fonction amine primaire (basique)
Sauf Proline : amine secondaire (α imino-acide / acide α iminé)
 Groupe R : Radical Latéral
 Responsable des propriétés chimiques et physiques
 Carbone α : porteur COOH, NH2, H et R (donc n°2)
Autres carbones β (3), γ (4), δ (5), ε (6) α

2) Propriétés Physiques

 Présence d’un Carbone asymétrique

 17 AA = 1 C*
 2 AA = 2 C* (Thréonine / Isoleucine)
 Glycine = 0 C*

 Convention de Fischer / Modèle Glycéraldéhyde

 L : laevus (gauche) / D : Dextra (droite)

  Si 2 C*

D (α = D & β = L) D-Allo (α & β = D)

L (α = L & β = D) L-Allo (α & β = L)

Ex : L-Allo-Isoleucine (maladie des urines à odeur de sirop d’érable)

 l et d : Même propriétés chimiques et physique SAUF déviat° de la lumière polarisée

d (dextrogyre) → + / l (lévogyre) → –
Pas de lien avec D ou L

Mélange équimolaire (dit racémique) = aucun pouvoir polarisant

 A.A. Humaine de type L (homochiralité humaine)

Lors du décès des cellules = racémisation progressive L <=> D
Datation de la date du décès avec ration L/D

 Bactérie : présence peptides à A.A. de type D (D alanine & D glutamine paroi bactérie)
 Insensibilité L-peptidase humaine

3) Radical Aromatique : tryptophane, Tyrosine, Phénylalanine

Absorption à 280nm (Trp > Tyr > Phe)

Tryptophane : λ = 280nm A =1 seul dont le pic est à 280

Tyrosine : λ = 275nm A = 0,2 Oscillation entre les 2 produits

Tyrosinate : λ = 295nm A = 0,2 donc absorption à 280nm

Phénylalanine λ = 257nm A = 0,02

A.A. pas d’absorption dans la lumière visible (solution incolore)

Loi de Beer Lambert / coefficient d’extinction molaire ε

Dosage peptides et protéines si Trp et/ou Tyr

260nm (ADN,ARN)
Rapport 280nm (protéines)

Si > 1,8 (pureté de l’extraction nucléique pour utilisation ADN et ARN)

DO : Densité Optique
A : Absorbance
L : longueur de la cuve
I : intensité lumineuse

DO = A = log(I0/I) = ε.c.l
ε et l fixes donc : A = K (constance) . [c]
 4) Propriétés Acido-Basiques

 AA comporte au moins deux fonctions ionisables : groupement acide COO-

groupement Basique NH3-
Molécule Amphotère

 pK du groupement ionisable : pH pour lequel ce groupement se trouve à 50% ionisé

et 50% non ionisé

 AA a au moins deux pK : acide pKa et basique pKb

 Point isoélectrique : pH où somme des charges intramoléculaires est nulle pas de

migration dans un champ électrique

pI = pH AAneutre = pHi = ½ (pKa + pKb)

 Existence trois formes en équilibre selon pH :

pH < pHi (pH acide) pH = pHi (pH neutre) pH > pHi (pH basique)
Nombreux H+ Nombreux OH-
AA capte les H+ « Zwittérion » AA libère des H+
COO- → COOH (sel interne) COOH → COO-
NH3- prédomine NH3- → NH2
AA Chargé + Pas de Migration Acide chargé -
AA migre vers la cathode AA migre vers l’anode
(pôle -) (pôle +)
AA = cation AA = anion

Conséquences Biologiques :
 pH Physiologique Cellulaire : nbx AA ionisés / liaisons électrostatiques

 Analytique :
 électrophorèse des AA : pH fixe (tampon) s/ acétate de cellulose
1) Dépôt, 2) Migration et 3) Révélation ninhydrine (bleu-violet)

 Base principale des Chromatographies échangeuses d’ions :

Utilisation des différents signes et amplitudes de charges
électriques des AA en fonction du pH et des concentrations de sel
  Groupement anionique fixé : échangeuse de cations :

Ex : polysulfurisés / Résine – SO3- – Na+ + RNH3+ → Résine – SO3- – RNH3+ + Na+

1) Fixation des AA par échange avec Na+ et RNH3+ (pH acide)

2) Elution des A avec augmentation de pH et de concentration en sels (acide vers basique)

 Groupement Cationique Fixé : échangeuse d’anions :

Ex : polyaminés / Résine – NH3+ – Cl- + RCOO- → Résine – NH3+ – RCOO- + Cl-

1) Fixation des AA par échange avec Cl- et RCOO- (pH basique)

2) Elution des AA avec diminution de pH et augmentation de concentration en sels
(basique vers acide)

5) Hydrophobie / Polarité

 Hydrophobie / Hydrophilie : varie en fct° du pH

 Permet de séparer avec chromatographie de partage : phase stationnaire

hydrophile, solvant hydrophobe (ou inverse), donc :
 AA hydrophobes restent dans solvant
 AA hydrophobes migrent vers phase stationnaire

 Selon polarité, 3 types pour 20 AA protéinogènes :

 R à chaine latérale apolaire (9)
 R à chaine polaire non-chargée (6)
 R à chaine polaire chargée (5)

Soit : 9 AA apolaires / 11 AA polaires

15 AA neutres / 5 acides ou basiques

C. Nomenclature
1) A.A. Apolaires (9)

# 5 AA Aliphatiques :

Aleiphas = gras (grec) / ancrage bicouche lipidique (phospholipides)

Radical avec H et C / hydrophobe (repliement dans espace privé d’eau)

~ Glycine (Gly / G)

Pas de C* donc achirale

Flexibilité structurale / encombrement stérique minimal

Hyperglycinémie sans cétose : maladie métabolique du complexe protéique de dégradation de

la Glycine (protéines P, T, H, L)
→ Augmentation [Gly] dans urine, sang et LCS
~ Alanine (Ala / A) ~ Valine (Val / V)

~ Leucine (Leu / L)

Résidus dans structure Protéique de liaison à l’ADN :

« Leucin Zipper » / Glissière à Leucine

Permet à des protéines d’interagir sur des sillons de l’ADN

~ Isoleucine (Ile / I)

2 C*

Augmentation Val, Leu, Ile

+ Leucinose (détectable dans le sang & urines)
Apparition allo-Isoleucine (L) Maladie des urines à odeur de sirop d’érable :

Déficit en céto-acide décarboxylase des acides α-cétoramifiés (Val, Leu, Ile) ou thiamine
(cofacteur) [dégradation tellement lente, considérée inefficace]

# 1 AA Soufré :

~ Méthionine (Met / M)

R avec chaine thio-éther (S – CH3)

Rôle : Complexe d’initiation biosynthèse protéique
Donneur de radical méthyl (méthylation ++)

# 2 AA Aromatiques :

~ Phénylalanine (Phe / F)

Alanine substituée par Phényl

Pathologie : Phénylcétonurie

Normalité :

Phénylalanine-hydroxylase

Phénylalanine Tyrosine

(cofacteur) BH4 BH2

Phénylcétonurie (PCU / PKU) :

 Absence (mineure/majeure) de Phénylalanine-hydroxylase

et/ou
 Déficit en Tétrathydrobioptérine (BH4)
et/ou
 Absence enzyme qui restaure le BH2 en BH4 cofacteur : la dihydrobioptérine réductase

La nature essai d’éliminer la Phe en la transformant en Ac Phényl-Pyruvique

 Biologie : accumulation de Phe sanguine

D’acide Phénylpyruvique (cétone) dans les urines (d’où le nom de Phénylcétonurie)

 Clinique : Accumulation de Phe dans cerveau

→ mort neuronale non réversible

Retard mental si non prise en charge

→ l’idiotie Phénylpyruvique
Anomalie de production des neurotransmetteurs
→ nervosité, fatigabilité, troubles de concentration
→ Problèmes de mémorisation
→ diminution des performances intellectuelles

Effets Inhibiteurs de la Phénylalanine sur la production de neurotransmetteurs

- Tryptophane → 5-Hydroxy-Tryptophane → Sérotonine

Phénylalanine → Tyrosine → DOPA

- DOPAMINE

XXX → Neurotransmetteur NORADRÉNALINE

- Inhibition de la formation ADRÉNALINE

 Dépistage Néonatal : Test de Guthrie (dosage Phe sang bébé / talon)

1/17'000 naissance en France

 Traitement : Régime sans Phénylalanine

 Principe du TEST de Guthrie (historique)

Bactérie qui :
 Pousse inhibée par la L-β2-thiénylalanine
 Pousse Stimulée par Phénylalanine (malgré la L-β2)
 [Phe] en corrélation avec la pousse bactérienne

Maintenant, c’est un dosage biochimique

 5 Maladies dépistées en France à la Naissance + Surdité (Juin 2012)

 Phénylcétonurie (1972) / aug [Phe] → 1 / 17 k

 Hypothyroïdie congénitale (1978) / aug [TSH] → 1 / 3,5 k
 Hyperplasie Congénitale surrénales (95) / aug [17-OH-Progestérone] → 1 / 19 k
 Mucoviscidose (2002) / aug Trypsine Immuno-réactive (TiR) → 1/4k
 Drépanocytose (69) / HbS au lieu de HbA

Test au Talon : Assoc Fr pour le Dépistage et la Prévention des Handicap de l’Enfant

Test à faire après au moins 72H de naissance (J3 / 4e jour de vie min)

~ Tryptophane (Trp/W)

Hétérocycle indole
A l’origine de :
 Mélatonine : alternance jour/nuit (circadien)
 Sérotonine : satiété, sommeil, humeur
 Kynurénine (tics psychiatriques)

# 1 A.A. Cyclique

~ Proline (Pro/P)

Présence de Fonction amine II

Noyau Pyrole / cycle pyrolidine
Peut devenir α-iminé avec N = C(α)

Rôle de Structure 3D particulière :

Ex : Collagène : → Rigidité Protéique (pas de rotation entre amine et C(α)

→ Casse les hélices α
→ Permet des coudes (changement direction au sein de protéine)
→ Réticulation si hydroxylé : 4-OH Proline
 2) A.A. Polaires NON Chargés

# Groupement Hydroxyl (OH)

 Permet estérification avec acide phosphorique : activation / désactivation protéique

 O-Glycosylation (réaction enzymatique, volontaire)
(≠ glycation non enzymatique, non volontaire : réaction chimique)
→ à l’origine de l’hémoglobine glyquée : marqueur sanguin du diabète (HbA1C)
 Enzyme OH → O- : site catalytique (substrat +)

~ Sérine (Ser/S)

Alcool I (CH2 – OH)

Sérine utilisée par la Sélénocystéine-synthétase pour
fixer un atome Se issu du grpmt donneur
SélénoPhosphate

~ Thréonine (Thr/T)

2 C*
Fonction Alcool II

~ Tyrosine (Tyr/Y)

 Présence d’un groupement phénol (AA aromatique)

 Mise en équivalence fonction phénol utilisée dans dosage protéique des liquides bio.
(réaction chimique, pas spectrale)

 Origine :
 Des hormones Thyroïdiennes
 De la DihydroxyPhénylalanine (DOPA) → Dopamine
 Intermédiaire d’autres catécholamines
 Neuromédiateur des neurones dopaminergiques du SNC / locus niger
(touché par Parkinson)
 Implication réaction émotionnelle, apprentissage et mouvement fins
 Si déficit → maladie de Parkinson / Traitement par L-DOPA

 De la mélanine (mélanocytes) par tyrosinase :

 Mélanine : protection contre les UV
 Albinisme : cheveux décolorés / yeux très clairs
Problèmes dermato / oculaire
Hypersensibilité aux UV
# Fonction Amide (CO – NH2)

Transport sanguin de l’azote

Phénomène de N-glycosylation (≠ N glycation)

~ Asparagine (Asn/N)

~ Glutamine (Gln/Q)

[c] sanguine la plus importante des 20 AA

(Culture Ȼ : milieu de culture enrichi en Gln)

A l’origine du glutathion (détoxification / lutte contre les DRO)

# Soufré

~ Cystéine (Cys/C)

Fonction Thiol : pont disulfure / liaison covalente

Au sein d’une même chaîne ou entre chaînes
(SH + SH = S – S)

Cys – Cys = Cystine dans glutathion

Implication dans réaction d’oxydo-réduction

3) A.A. Polaires Chargés

# A.A. Dicarboxyliques : caractère acide net / Chargé négativement (COO-)

~ Acide Aspartique / Aspartate (Asp/D)

A.A. le plus acide des 20

~ Acide Glutamique / Glutamate (Glu/E)

Origine γ-carboxy-Glutamate (coagulation)

Coagulation anormalement élevée = Thromboses, embolies

# A.A. Basiques : Chargés positivement (NH3+)

~ Histidine (His/H)

Noyau Imidazole → imidozalium (NH3+)

Site catalytique enzymatique (proton)

→ Interaction avec substrat chargé -

Origine de l’histamine

~ Lysine (Lys/K)

Butyl-Amine → Butyl-Ammonium (NH3+)

Permet synthèse Carnitine

(entrée AG dans mitochondrie → β-oxydation)

5-OH lysine : structuration du Collagène

~ Arginine (Arg/R)

Guanidine → Guanidium (NH3+)

Donneur NO (vasodilatateur / Nobel 1998)

4) A.A. Essentiels / Non Essentiels

 Dépend des espèces

 Organisme incapable de les produire à partir de composés intermédiaires

→ tributaire apport exogène (alimentation ++)

 8 Essentiels :
→ Val, Leu, Ile, Mét, Phe, Trp, Thr, Lys

 2 Semi-Essentiels :
→ His, Arg [grossesse, croissance]
 D. Réactions liées au Groupe Carboxylique des A.A.
1) Activation des A.A.

 Incorporation des AA dans protéine : nécessité d’activation

→ Activation = liaison à ARNt

 ARNt : adaptateur (bras anticodon avec ARNm + bras AA, terminé par l’AA à
incorporer)

 Liaison entre OH en 3’ de l’ose et COOH de l’AA

 Formation d’acyl ARNt (amino-acyl ARNt synthétase)

AA + ARNt + ATP → AA – ARNt + AMP + PPi (pyrophosphate)

2) Formation de sels
R – COOH → RCOO- Cat+

→ APARTÉ SUR LES ENZYMES ←

Enzyme :

Responsable de réaction enzymatique : Substrat Produit

 Partie de l’enzyme : 3D / Site catalytique (lieu unique)

 Terminée par -ase mais aussi code :

 EC : syst numérique de la connaissance des enzymes

 W : indique la réaction catalysée (1-6)
 X : indique le substrat général (ou groupe de substrat) impliqué
 Y : indique le substrat spécifique (grp substrat) ou la coenzyme
 Z : le numéro de série de l’enzyme

Ex : oxydase de glucose EC 1. 1. 3. 4

 Notion de cofacteurs :
 Non protéique
 Simple : atome ionisé (Zn2+), molécule d’eau
 Complexe : coenzyme (ex : Vit du groupe B)

K1 K3
 Cinétique enzymatique : équation Michaelis – Menten
K2

 Mesure activité enzymatique : unité internationale (UI) / Katal (Kat)

 3) Décarboxylation

Transformation enzymatique visant à enlever un COOH : L – Amino-Décarboxylase

Co-Facteur : phosphate de pyridoxal (forme active Vit B6)

Hydrosoluble (comme Vit A, D, E, C, K)
Need 2 mg / j

Histidine → Histamine : par histidine décarboxylase

o Neurotransmetteur
o Médiateur allergique :
 mastocytes → vasodilatation capillaire, inflammation
 Flore bactérienne, intoxicat° alimentaire (poisson cru mal préparé/pourri)

o Sécrétion gastrique (+) → récepteurs sur estomac (sécrétion HCl), ulcération

o Médicament anti-histaminiques → anti-allergie / anti-ulcéreux
(récepteur Histaminique) Anti RH1 Anti RH2

Synthèse des Catécholamines : Enzyme / Cofacteur

Tyrosine
Adrénaline

Tyrosine BH4
Hydroxylase Phényléthanolamine
BH2 N-Méthyl Transférase

L-DOPA
Noradrénaline

Phosphate de Vit C
Décarboxylase Pyridoxal Dopamine
des A.A. Hydroxylase
Aromatiques

Dopamine

Absence Dopamine
→ maladie de Parkinson (locus niger)

1e et 3e étapes = hydroxylation / 2e étape = décarboxylation

Adrénaline : hormone de Stress / réponse rapide
Aug glycémie (Glycogénolyse) / stimule lipolyse (TG en AG libérés)
Oriente flux sanguin vers organes « nobles » : cœur, cerveau, muscles
Aug rythme cardiaque / aug pression artérielle / dilatation bronchique

E. Réactions dues au groupement Amine

1) Transamination

 Nécessité de formation de base de Schiff !

o Réaction entre NH2 d’AA et aldéhyde aromatique (phosphate de pyridoxal)
o Passage du phosphate de pyridoxal en phosphate de pyridoxine

 2 enzymes importantes en bio Humaine (échanges entre AA et AcCétonique)

~ Alanine Amino-Transférase (ALAT/SGPT) (Cytoplasme)

Alanine (AA1) + α-Céto-Glutarate ↔ L-Glutamate (AA2) + Pyruvate

~ Aspartate Amino-Transférase (ASAT/SGOT) (Mitochondries)

L-Aspartate (AA1) + α-Céto-Glutarate ↔ L-Glutamate (AA2) + Ac Oxaloacétique

 Intérêts dosage lors Nécrose Hépatique (hépatite) :

Si augmentation ALAT : Atteinte Cytoplasmique
Apparition ASAT : Atteinte mitochondriale

2) Désamination

 3 enzymes : désaturante / non oxydative / oxydative

 Production de NH3 / toxicité sauf foie (cycle de l’urée)

3) N-Alkylation / N-Arylation / N-Acylation

 Substitution par R d’un H du groupement amine : IR → IIR

 R = groupement aliphatique (alkylation), aromatique (Arylation)

Groupement formyl, acétyl ou carbobenzoxyl (Acylation)
 4) Condensation avec Ninhydrine

 2 molécules de ninhydrine réaction avec :

o Amino-acides : couleur pourpre (bleu-violet) → appl. Empreinte digitale
o Imino-acides (proline) : couleur jaune

 Destruction de l’Acide Aminé

 Intensité de coloration proportionnelle à la concentration d’AA (dosage Beer Lambert)

 Détection : 1 nano (10-9) mol.L-1 (fluorexamine 1 pico (10-12) mol.L-1)