Méthodes et instrumentations en

microbiologie

L3 – Microbiologie
2021-2022 Dr. Quadri
Dr.QUADRI
 Programme

Chapitre III. Méthodes et équipements utilisés pour la caractérisation des molécules

synthétisées
III.1 Les techniques chromatographiques
III.2 Les techniques spectrométriques
III.3. Les techniques spectromagnétiques

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 Matière
Biomolécule
première Extraction Extrait brut Purification
pure
(microbienne)

séparer certains Opérations visant à Quantification-

composés d’un enlever toutes les identification-
organisme (sur la base impuretés d’un extrait caractérisation de la
de propriétés brut (différence molécule
chimiques-physiques ) Dosage solubilité, taille des
selon diverses molécules, propriétés
techniques, ioniques)

Physique (choc
osmotique) Filtration
Mécanique
(congélation-
Centrifugation
décongélation,
broyage,
sonication)
Chromatographie
Chimique (solvant
organique)
L’électrophorèse
Enzymatique

3
 Extraction des molécules bioactives (biomolécules):
mécanique (Sonication)

• Les ultrasons sont beaucoup utilisés dans le

domaine d’analyse biologique.

• En fractionnant les parois cellulaires (lyse),

il est possible de libérer des molécules
intracellulaires.
Sonicateur
• Il est cependant très important d’ajuster
l’intensité des ultrasons selon l’échantillon
pour éviter la dénaturation de constituants.

Bain ultrasonique
4
 Extraction des molécules bioactives (biomolécules): chimique
Croissance (OD 600nm)
1.6 40
1.4 35
1.2 30
1 25
0.8 20
0.6 15
0.4 10
0.2 5
0 0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Temps (h)

DO (600 nm) Production

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Extraction des molécules bioactives

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Extraction des molécules bioactives

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Méthodes d’identification et de dosage des
biomolécules

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 Techniques chromatographiques

Les méthodes chromatographiques sont les méthodes les plus importantes de l’analyse
immédiate. Elles permettent de séparer les constituants d’un mélange plus ou moins
complexe. Et peut également assurer dans certaines conditions l’identification et la
détermination quantitative des substances.

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 Méthodes chromatographiques Principe

La chromatographie est une technique séparative analytique et/ou préparative.

Elle consiste à faire migrer les constituants à séparer sur une phase stationnaire
immobile, à l’aide d’une phase mobile, liquide ou gazeuse, de nature différente.

Chaque molécule sera plus ou moins rapidement entraînée selon son affinité pour,
respectivement, la phase stationnaire et la phase mobile, permettant la séparation
des différents constituants présents.

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 Méthodes chromatographiques Principe

• Le mélange à chromatographier entrainé par une phase mobile circule au contact

d’une phase stationnaire liquide ou solide.

• Des interactions physiques ou chimiques s’établissent entre la phase stationnaire et

les molécules à séparer. Des échanges rapides se produisent dans la force dépend de
la nature chimique des molécules à séparer.

• Celles-ci sont plus ou moins retenues selon l’importance de leur interaction avec la
phase stationnaire

• Les molécules sont alors entrainées plus ou moins vite en fonction de leurs
propriétés physico-chimiques, ce qui permet leur séparation.
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À partir de ce principe très général, il existe de très nombreux types de
chromatographie en fonction de la nature de la phase stationnaire, de la nature de la
phase mobile, et de la nature des interactions entre ces phases et les molécules à
purifier.

En effet, selon les cas, les facteurs physico-chimiques qui interviennent comme
critère de séparation sont totalement différents : ce peut être la masse moléculaire, la
charge, l’hydrophilie/hydrophobicité, la structure tridimensionnelle, etc.

Évidemment, le choix est effectué au cas par cas en fonction des besoins. Il n’est
d’ailleurs pas rare d’utiliser successivement plusieurs types de chromatographies
différentes au cours d’une même purification.

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Le principe de l'extraction est simple :
Soit un soluté S réparti entre 2 phases non miscibles (1) et (2).
A l'équilibre, on a :

Le coefficient (ou constante) de distribution

( K) est le paramètre physico-chimique de
base en chromatographie qui quantifie le
rapport de concentration de chaque
composé entre les deux phases en présence
avec la constante d'équilibre K = [S2]/[S1] ,
K s'appelle aussi le coefficient de partition.

𝐶𝑠 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑢 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡é 𝑑𝑎𝑛𝑠 𝑙𝑎 𝑝ℎ𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑡𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛𝑛𝑎𝑖𝑟𝑒

𝐾 = =
𝐶𝑚 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑢 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡é 𝑑𝑎𝑛𝑠 𝑙𝑎 𝑝ℎ𝑎𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑒

Les valeurs de cette constante sont très variables.

Plus elles sont élevés, plus le soluté est retenu
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Schéma simplifié de la chromatographie

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Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation
au cours du temps d’un paramètre relié à la concentration ou
à la quantité du soluté en sortie de la colonne.

Le chromatogramme est obtenu à partir des variation en

fonction du temps d’un signal électrique envoyé par le
détecteur

La séparation est complète entre 2 composés quand le

chromatogramme présente deux pics chromatographique
revenant chacun à la ligne de base.

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Un constituant est caractérisé par son temps de
rétention tR, qui représente le temps écoulé entre
l’instant de l’injection et celui qui correspond sur le
chromatogramme au maximum du pic qui lui est lié.

Plus le temps de rétention est élevé, plus le pic est

large.

Un constituant non retenu sort de la colonne au

temps tM , appelé temps mort t0

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 Classification des chromatographies

Il existe plusieurs classifications des chromatographies

1. Classification basée sur les phénomènes physicochimiques à la base de séparation

(partage, adsorption, échange d’ions, exclusion-diffusion, affinité )

2. Classification fondée sur l’état physique des deux phases

(chromatographie gaz-liquide, gaz- solide, liquide-liquide, liquide-solide)

3. Classification fondée sur la nature de la phase mobile

(liquide, gazeuse)

4. Classification fondée sur les modalités adoptés pour immobiliser la phase stationnaire
(sur papier ou couche mince, sur colonne)

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Classification basée sur les phénomènes physicochimiques
à la base de séparation

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 Le phénomène repose sur le fait qu’en principe deux corps différents ne se partagent pas
Partage de façon identique entre deux phase.
Les rapports de leurs solubilités dans les deux phases , c-à-d leurs coefficients de partage
ne sont pas égaux

L’adsorption est l’accumulation des substances à la surface d’une des deux phases.
Adsorption Elle est du à des forces de cohésion et aux interactions polaires.

La phase stationnaire a des propriétés d’échangeurs d’ions. C’est une macromolécules ou

Echange
résine portant des groupements fonctionnels acides ou basiques qui permettent l’échange
d’ions de certains de leurs ions avec ceux de même signe du mélange à chromatographier

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 La phase stationnaire est un gel ou un réseau
Exclusion-
macromoléculaire exerçant un véritable de tamis vis-à-vis de
diffusion
grosses molécules, celles- ci migrant plus vite que les
molécules de faible poids moléculaire.

C’est une chromatographie d’adsorption dans laquelle les

Affinité causes d’interactions entre substance chromatographiée et
phase fixe sont connes, ce sont des interactions spécifiques.

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 • Méthodes chromatographiques

Types de chromatographie

il existe de très nombreux types de chromatographie en fonction de la nature de la

phase stationnaire, de la nature de la phase mobile, et de la nature des interactions
entre ces phases et les molécules à purifier.

- Chromatographie planaire (ex: CCM)

- Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
- Chromatographie en phase liquide

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 • Méthodes chromatographiques CCM

Chromatographie sur couche mince (CCM)

(en anglais TLC : Thin layer chromatography)

Il s’agit d’une chromatographie planaire peut être utiliser pour :

- Caractériser certaines substances (chromatographie analytique)

- Purifier (chromatographie préparative)

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• Méthodes chromatographiques CCM

Elle comprend :

- une phase stationnaire : une couche mince de

matériel adsorbant (usuellement du gel de silice, de
l'oxyde d'aluminium ou de la cellulose)

- une phase liquide : dite phase mobile ou éluant : un

solvant ou un mélange de solvants qui va entraîner les
composés à se séparer le long de la phase
stationnaire.

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• Méthodes chromatographiques CCM

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• Méthodes chromatographiques CCM

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• Méthodes chromatographiques CCM

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• Méthodes chromatographiques CCM/Bioautographie

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• Méthodes chromatographiques CCM/Bioautographie

Séparation des produits actifs Révélation microbiologique par

CCM bioautographie

254 nm 366 nm

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 Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

C’est une technique très répandue. Son développement est du à sa grande sensibilité, à sa polyvalence,
à la rapidité et aux possibilité d’automatisation.

Principe

La CPG repose sur l’équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire et une phase
mobile gazeuse.

La séparation des analytes repose sur la différence d’affinité de ces composés pour la phase mobile
et pour la phase stationnaire.

Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renfermant une substance
liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire. Le transport se fait à l'aide d'un gaz inerte,
appelé « gaz vecteur », qui constitue la phase mobile.

Limites: seuls les composés suffisamment volatiles et thermiquement stables peuvent être analysés

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• Méthodes chromatographiques CPG

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 • Méthodes chromatographiques CPG

- Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Appareillage:

• Une source de gaz vecteur

• Un injecteur

• Une colonne placée dans

un four

• Un système de détection

• Un dispositif
d’enregistrement
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 Gaz vecteur Injecteur Détecteur
Porte d’entrée de l’échantillon Colonne
(phase mobile) Placés immédiatement à la
Fonctions: vaporiser et entrainer (phase stationnaire)
Hélium, diazote sortie de la colonne.
en tète de colonne l’échantillon Colonne remplie ou
ou dihydrogène Destiné à fournir un signal
mélangé au gaz vecteur colonnes capillaire.
dont l’exploitation conduira
au chromatogramme.
Enceinte thermostatée
Ou four, permet de chauffer la
colonne jusqu’à 400°C.

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• Méthodes chromatographiques CPG

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 • Méthodes chromatographiques CPG-MS

La chromatographie en phase gazeuse

couplée à la spectrométrie de masse

- Combine les performances de la chromatographie en phase

gazeuse, pour la séparation des composés d'un échantillon, et de
la spectrométrie de masse, pour la détection et l’identification des
composés en fonction de leur rapport masse sur charge.

- Cette technique permet d'identifier et/ou de quantifier

précisément de nombreuses substances présentes en très petites
quantités, voire en traces.
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 Méthodes chromatographiques HPLC

- chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)

une technique en chimie analytique utilisée pour séparer, d'identifier et de quantifier chacune des
composantes en mélange

- Applicables aussi sur des solutés thermolabiles et des masses moléculaires plus grandes ( comparé à
la CPG)
- Efficacité des colonnes est plus faible que celles utilisé en CPG

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 Méthodes chromatographiques HPLC

Principe

• Une pompe est utilisée pour fournir un écoulement continu d'un solvant dans lequel un
échantillon dissous est introduit.

• Une fois que l'échantillon dissous est introduit, il voyage à travers une colonne analytique
contenant la phase stationnaire et les analytes dans le mélange d'échantillon dissous sont ensuite
séparés en fonction de leur affinité pour les particules enrobées dans la colonne.

• Une fois que les composants de l'échantillon sont séparés, ils peuvent passer à travers un
assortiment de détecteurs. La réponse du détecteur et le «temps de rétention» (temps nécessaire
pour qu'un composé passe de l'injecteur au détecteur) du ou des composés d'intérêt peuvent alors
être comparés à un matériau de référence.

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 • Méthodes chromatographiques HPLC

- chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)

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 • Méthodes chromatographiques HPLC

La phase mobile est pompée à partir

d'une bouteille et parcourt en
permanence le chromatographe :
l'injecteur, la colonne dans le four et
le détecteur.

La température du four est

maintenue constante.

Le signal du détecteur est amplifié et

enregistré.

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• Méthodes chromatographiques HPLC

Elle délivre en continu la phase mobile

Le dégazage permet la désoxygénation du solvant ce qui permet d'éviter

les risques de dégradation des échantillons ou de la phase stationnaire
par oxydation.

Forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne dont le

remplissage est très compact.

Injecter un volume précis de l’échantillon en tète de colonne.

La colonne se présente comme un tube, le plus souvent en acier,

remplie avec la phase stationnaire.

Le détecteur suit en continu l'apparition des solutés. Le signal obtenu

est enregistré en fonction du temps.
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 • Méthodes chromatographiques Chromatographie d’exclusion

- tamisage moléculaire ou gel-filtration

C’est une méthode de

chromatographie en phase liquide
permettant de séparer des
macromolécules en fonction de la
masse moléculaire et le volume
hydrodynamique.

Le principe consiste à faire migrer

l'échantillon à analyser au milieu de
billes poreuses.

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• Méthodes chromatographiques Chromatographie d’exclusion

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 • Méthodes chromatographiques Chromatographie échangeuse d’ions

Principe

- Ce procédé de séparation est basé sur des processus d'échange d'ions se produisant entre les
analytes dans la phase mobile et la résine fixée sur la colonne.

- La chromatographie d'échange d'ions est utilisée pour séparer les anions et les cations inorganiques
et organiques.

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 • Méthodes chromatographiques Chromatographie échangeuse d’ions

Principe

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• Méthodes chromatographiques Chromatographie échangeuse d’ions

• Un ou plusieurs réservoirs de phase mobile contenant

soit une base (analyses des anions) soit un acide (analyse
des cations) et de l’eau ultra pure pour les dilutions.

• Un système d'injection comportant une boucle

d'échantillonnage calibrée

• Une colonne composée d’une résine chargée

positivement pour séparer les anions et négativement pour
séparer les cations.

• Un suppresseur qui permet d’éliminer la conductivité de

l’éluant.

• Un détecteur : un conductimètre thermostaté

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Techniques spectroscopiques

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 • Méthodes spectroscopiques

Les méthodes spectroscopiques utilisent la lumière pour effectuer des études

qualitatifs et quantitatifs des molécules

La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative qui consiste à

mesurer l’absorbance (ou densité optique) d’une substance chimique en solution
limpide, en utilisant une lumière sensiblement monochromatique.

Les méthodes d'analyses spectroscopiques permettent de sonder la matière par

différentes méthodes pour obtenir des informations sur la structure des molécules
qui composent cette matière.

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 • Méthodes spectroscopiques Spectroscopie UV-visible

La spectroscopie ultraviolet-visible ou spectrométrie ultraviolet-visible est une technique de

spectroscopie mettant en jeu les photons dont les longueurs d'onde sont dans le domaine de :

• L'ultraviolet (100 nm - 400 nm)

• Visible (400 nm - 750 nm)
• Proche infrarouge (750 nm - 1 400 nm).

Soumis à un rayonnement dans cette gamme de longueurs d'onde, les molécules, les ions ou les
complexes sont susceptibles de subir une ou plusieurs transition électronique(s). Cette
spectroscopie fait partie des méthodes de spectroscopie électronique.

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 • Méthodes spectroscopiques Spectroscopie UV-visible
Principe

• L’échantillon à analyser est traversé par un rayonnement lumineux de longueur d'onde allant
de 100-800 nm.

• Les photons issus du rayonnement transfèrent aux composés analysés une énergie qui excite
les molécules, atomes ou ions traversés. Ainsi une partie du rayonnement incident est absorbé.

• L'étude du rayonnement après passage à travers la substance analysée permet d'obtenir des
informations sur sa nature.

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• Méthodes spectroscopiques Spectroscopie UV-visible

Pour chaque longueur d'onde,

l'absorbance est mesurée et les données
recueillies sont utilisées pour tracer les
variations de l'absorbance (en ordonnées)
en fonction de la longueur d'onde (en
abscisse).

Le graphique ainsi obtenu constitue un

spectre UV-visible.

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 • Méthodes spectroscopiques La spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse est une technique analytique qui permet d’identifier et de doser une
substance ou un élément chimique.

Elle apporte également des informations sur la composition, la structure et la masse

moléculaire de l’échantillon.

Principe

Elle est fondée sur la séparation et la détection d’ions formés dans une source d’ionisation ou dans
une chambre de collision.

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• Méthodes spectroscopiques MALDI-ToF MS

le MALDI-ToF MS (pour Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation – Time Of Flight, soit

désorption/ionisation laser assistées par matrice – temps de vol).

Des ions de masse et de charge différentes soumis à un

champ électrique se déplacent, et la distance parcourue
en un temps donné est fonction du rapport masse sur
charge (m/z)

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MALDI TOF MS

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 • Méthodes spectroscopiques MALDI-ToF MS

Identification des
microorganismes

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 • Méthodes spectroscopiques RMN

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique analytique
puissante qui peut révéler des informations structurelles sur de nombreuses molécules
organiques et inorganiques.
Constitue actuellement la technique la plus puissante et la plus générale d’analyse structurale
des composés organiques

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• Méthodes spectroscopiques RMN

Utilisation

•Identification de la structure chimique

•Analyse de composition chimique

•Détermination de la pureté de l'échantillon

•Assurance qualité et contrôle

•Identification et confirmation du composé

•Analyse quantitative

•Analyse du groupe d'extrémité du polymère

•Cinétique de réaction
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• Méthodes spectroscopiques RMN

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• Méthodes spectroscopiques RMN

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• Méthodes spectroscopiques RMN

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