Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Fiches Techniques

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biotechnologie
Licence L3 Biotechnologie microbienne Semestre1
 T.P. N°01
 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Etude du métabolisme glucidique (fermentation des sucres par les bactéries)

 Protocole :

 Principe:
 Méthodologie (succincte) :
1-L’auxanogramme : étude d’une gamme de sucres dégradables par la bactérie (en
milieu liquide).En pratique on utilise un milieu de base fournissant tous les
micronutriments nécessaires à son développement à l’exception de tout substrat
carboné, celui-ci est rajouté sous une forme biochimique bien définie.
But
Déterminer la capacité de la bactérie à dégrader un sucre donné mis dans un milieu de
base, et ce, en produisant de l'acide.
Technique
- A partir d'un bouillon de culture, ensemencer des tubes contenant différents sucres
et un indicateur de pH.
Le milieu utilisé contient :
 Peptone 15g
 NaCl 5g
 Glucide à étudier avec une concentration finale de 1% (glucose, lactose, saccharose,
xylose, arabinose, mannose, galactose, fructose…)
 Indicateur de pH (1%) le rouge de phénol 5ml
Interprétation
 Réaction positive: pH acide, virage au jaune du rouge de phénol et donc la bactérie a
dégradé le sucre présent dans le milieu et qualifiée GLUCIDE +.
 Réaction négative: pH alcalin, virage au rouge pourpre de l’indicateur de pH et
donc la bactérie a utilisé la peptone du milieu et qualifiée de GLUCIDE - .
2- Mise en évidence de la voie d’attaque des glucides
Le métabolisme fermentatif, favorisé par l'anaérobiose, engendre de nombreux
produits acides que l'on pourra détecter grâce à un indicateur de pH.
Le métabolisme oxydatif ne donne naissance qu'à de petites quantités d'acides et
uniquement lorsque seront présentes de bonnes conditions d'oxygénation.
Opérer le plus possible en aérobiose
Utiliser des milieux:
 Peu peptonés (pour restreindre le métabolisme protéique)
 Peu tamponnés
 Gélosés (pour limiter la diffusion des composés acides).
Deux milieux répondent à ces exigences:
 Milieu de HUGH et LEIFSON (HL)
 Milieu MEVAG (Milieu d'Etude de la Voie d'Attaque des Glucides).
Technique
- Régénérer le milieu au bain-marie bouillant (20 min à ébullition).
- Attendre le refroidissement.
 - Ensemencer par piqûre centrale à l'aide d'une pipette Pasteur ou d'un fil droit
chargé de culture à étudier.
- Etuver à 37°C en ne revissant pas à fond le bouchon.
- Lire les résultats après24h de culture ou plus, pour les bactéries oxydatives ou
fermentatives à croissance lente.

3-Dégradation de l’amidon
Dans ce cas, c’est la disparition du substrat que l’on met en évidence : l’amidon
réagissant avec l’iode, l’attaque de l’amidon peut être mise en évidence par la
disparition de la coloration caractéristique dans une gélose.
But :
Le but de cette gélose est de rechercher l'hydrolyse de l'amidon par l’amylase,
Composition du milieu

Eléments g/L Rôles

Peptones 5 Source de Carbone, d'azote, et d'énergie, et d'acide

aminés.
Amidon (1%) 10 Source de Carbone et d'énergie

Agar 10 Gélifiant qui permet au milieu de

devenir solide
Les composants sont solubilisés dans un litre d’eau distillée.

Technique
- Ensemencer par stries ou spots la gélose par la bactérie à tester.
- Incuber pendant 48hà la température optimale.
- Après incubation, inonder la boite avec lugol et interpréter les résultats.

T.P. N°02
 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Les milieux glucidiques complexes : (TSI /KIA), L’utilisation du citrate

(citrate de Simmons), Mannitol mobilité

 Protocole :

 Principe:
 Méthodologie (succincte) :
1- Milieu TSI et KIA :

La gélose TSI (Triple SugarIron) permet l’identification des entérobactéries par la mise
en évidence rapide de la fermentation du lactose, du glucose (avec ou sans production
de gaz), du saccharose et de la production de sulfure d’hydrogène.
 Composition du milieu

Composant Qté (g/L)

Peptones de caséine 15
Peptones de viande 5
Extraits de viande 3
Peptones de levure 3
NaCl 5
Lactose 10
Saccharose 10
Glucose 1
Citrate ammoniacal de Fer 0,5
Thiosulfate de sodium 0,5
Rouge de phénol 0,024
Agar 12

Lecture
La gélose TSI fournit quatre renseignements principaux :
(1) Fermentation de glucose
 culot rouge : glucose non fermenté
 culot jaune : glucose fermenté
(2) Fermentation du lactose et/ou du saccharose
 pente inclinée rouge : lactose et saccharose non fermentés
 pente inclinée jaune : lactose et/ou saccharose fermenté(s)
(3) Production de gaz
 apparition de gaz dans le culot (Décollement de la gélose) .
(4) Formation d’H2S
 formation d’une coloration noire entre le culot et la pente ou le long de la piqûre.
2- Milieu citrate de Simmons :
Composants Qté
Sulfate de magnésium 0,2g
Citrate de Na+ 2g
NaCl 5g
Hydrogénophosphate d'ammonium 0,2g
Hydrogénophosphate d'ammonium monosodique 0,8g
Bleu de bromothymol 0,08g
Agar 15g
Eau distillée (qsp) 1L
Composition

Technique
Le milieu est présenté sous forme de gélose inclinée. La pente est ensemencée par une
strie longitudinale, réalisée à l'anse, à partir d'une suspension de la culture. Mettre à
l'étuve 24 heures à 37°C.

Lecture

- Virage de l'indicateur de pH au bleu : il y a eu alcalinisation du milieu et la souche est

citrate de Simmons +.

- Pas de virage de l'indicateur de pH : il n'y a pas eu alcalinisation et le milieu ne

présente pas de culture. La souche est citrate de Simmons -.

3-Milieu Mannitol Mobilité

Ce milieu permet l’étude de la dégradation du mannitol qui est un produit de
dégradation du mannose.

Composition :
Composants Qté
peptone trypsique de viande 20 g
mannitol 2g
KNO3 1
rouge de phénol 1% 4 ml
agar 4g

Technique
Ensemencer par piqûre centrale à l’aide d’un fil droit.
Incuber 24 h à T° optimale.
Lecture
L’utilisation du mannitol par la bactérie se traduit par le virage du rouge de phénol au
jaune (production d’acide).
La mobilité est interprétée par la croissance au niveau de toute la gélose molle et on
conclu que la bactérie est mobile ; la croissance autour de la piqure centrale révèle que
la bactérie est immobile.

T.P. N°03
 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Recherche des enzymes : protéase, lécithinase , catalase, oxydase et la ß –

Galactosidase

 Protocole :

 Principe:
 Méthodologie (succincte):
1-Mise en évidence d’une protéase
Caractérisé l’activité protéolytique chez les bactéries par l’hydrolyse de la caséine ,
protéine du lait.
 Composition du milieu
Le milieu utilisé est la gélose au lait, c’est une gélose nutritive additionnée à 45°C
d’un volume de lait stérile.
Technique
Ensemencer par des spots la surface de la gélose et incuber à la température optimale
pendant 24 à 48h.
Lecture
L’hydrolyse de la caséine se traduit par l’apparition d’une zone claire autour des
touches (spots), l’activité protéolytique peut être estimée en mesurant le diamètre des
halos.

2-Mise en évidence d’une lécithinase

De nombreux microorganismes peuvent hydrolyser les phospholipides, la recherche et
l’identification des bactéries lipolytique ont un intérêt dans la microbiologie
alimentaire, la lécithine purifiée étant couteuse on utilise comme source de lécithine le
jaune d’œuf incorporé dans la gélose ordinaire.
Composition
Gélose nutritive additionnée de jaune d’œuf stérile dilué au ½ en eau physiologique
(concentration finale 10% soit 2,5 ml pour 25ml de milieu).
Technique
Faire une strie à la surface du milieu et incuber pendant 24h à la température optimale.

3-Test de catalase
Ce test permet l’identification des bactéries Gram positif, cette enzyme est produite en
abondance par les bactéries à métabolisme respiratoire (aérobie stricte et aéro-anaérobie
facultatif)
Technique :
Sur une lame propre et sèche déposer une goutte d’eau oxygénée à 10 volumes.
A l’aide d’une pipette Pasteur boutonée, ajouter l’inoculum bactérien ;
Observer immédiatement.
Lecture :
Apparition de bulles, dégagement gazeux de dioxygène : catalase +
Pas de bulles : catalase -.

4-Test d’oxydase
 Cette recherche consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie testée à oxyder
la forme réduite incolore de dérivés méthylés du paraméthylène diamine, en leur forme
oxydée semi-quinonique rose violacé.
Technique
Le réactif se trouve sous la forme d’un disque pré-imprégné par le réactif ; on écrase
une effilure de pipette Pasteur une colonie de germes à étudier sur ce disque.
Lecture
Virage du disque au rose violacé indique un résultat positif= Oxydase +
Aucun changement de la couleur du disque indique un résultat négatif = Oxydase -.

T.P. N°04
 Matière: biochimie microbienne

 Intitulé : Catabolisme des acides aminés (décarboxylases (LDC-ODC), dihydrolase

(ADH) et tryptophane désaminase)

 Protocole :

 Principe:
 Méthodologie (succincte):

1-Recherche des décarboxylases LDC et ODC ET de la dihydrolase ADH

bactériennes
 Des peptones
 De l'extrait de levure apportant des facteurs de croissance (en particulier le
pyridoxal, coenzyme des décarboxylases)
 L'acide aminé dont on veut étudier la décarboxylation (lys ou orn ou arg) en
quantité importante
 Du glucose
 Un indicateur de pH.

Exemple: le milieu de FALKOW

le milieu de MOELLER
L’indicateur de pH est le pourpre de bromocrésol, jaune en milieu acide et violet en
milieu alcalin ;il permettra de révéler dans un premier temps l’acidification due à
l’utilisation du glucose par fermentation puis dans un second temps l’alcalinisation due
à l’utilisation par décarboxylation de l’acide aminé si la bactérie en est capable.

Technique et résultats
Milieu Technique Résultats
Milieu de - Ensemencer chaque milieu avec quelques
Falkow gouttes de suspension de la culture à étudier : Témoin - virage du BCP au jaune
* Falkow témoin sans acide aminé - acidification due à la fermentation
* Falkow contenant l’acide aminé dont on veut du glucose a conditions optimales
étudier la décarboxylation. pour l’activité des décarboxylases et
pour visualiser une éventuelle
- Si le milieu est présenté en grand tube, recouvrir alcalinisation
d’huile de vaseline (sauf dans le cas d’une souche - on peut valider les résultats.
aérobie stricte).- Etuver 24h à 37°C.
 Falkow + - absence de virage du BCP et
acide aminé culture
- acidification due à la fermentation
du glucose puis réalcalinisation due
à la production d’amine par
décarboxylation de l’acide aminé
- souche DC + (LDC+ ou ODC+ ou
ADH+)

Falkow + - virage du BCP au jaune

acide aminé - acidification due à la fermentation
du glucose mais pas de
réalcalinisation due à la production
d’amine par décarboxylation de
l’acide aminé
- souche DC - (LDC- ou ODC- ou
ADH-)

2-Test Urée tryptophane

Ce milieu permet de mettre en évidence les caractères suivants :

 présence d’une uréase
 présence d’une tryptophanase
 présence d’une tryptophane désaminase (TDA)
Ce milieu est utilisé pour l’identification des entérobactéries (bacille Gram -,
oxydase -).

Composition du milieu

Composants Quantité (g/L)

-Urée20 g
-L-tryptophane 3 g
- Monophydrogénophosphate de potassium 1g
- Dihydrogénophosphate de potassium 1g
- Chlorure de sodium5 g
- Éthanol à 95 °GL 10 ml
- Rouge de phénol25 mg

Principe
 Recherche de l’uréase
L’uréase dégrade l’urée selon la réaction suivante :
Urée + H2O → 2 NH4+ CO3-2
Les ions CO3-2 vont entraîner une forte alcalinisation du milieu qui sera révélée
par un virage de l’indicateur de pH (le rouge de phénol) à sa teinte basique
(rouge).
 Recherche de la production d’indole (mise en évidence de la tryptophanase)
La tryptophanase hydrolyse le tryptophane selon la réaction suivante :
Tryptophane + H2O → indole + acide pyruvique + NH3
L’indole forme un complexe coloré en rouge en présence d’un réactif : le
réactif de Kovacs.
  Recherche de la tryptophane désaminase
La TDA dégrade le tryptophane selon la réaction suivante :
Tryptophane + H2O → acide indole pyruvique + NH3
L’acide indole pyruvique forme un précipité marron foncé en présence d’un
réactif : le chlorure de fer en solution acide.
Technique
Ensemencer avec quelques gouttes de suspension bactérienne ou avec une colonie
prélevée à
l’anse sur un milieu solide.
Incubation 24 heures à 37°C.

T.P. N°05
 Matière: Biohimie microbienne

 Intitulé : Fermentation des acides mixtes (test VP/RM) et mise en évidence de la

ß-galactosidase

 Protocole :

 Principe:
 Méthodologie (succincte):
1-Tests RM et VP
Le milieu de Clark et Lubs permet l'étude des produits de fermentation du glucose:
différenciation entre les fermentations « acides mixtes » et « butylène glycolique ».
Milieu Clark et Lubs
Composition en g/L eau distillée
Composants Quantité
Peptone trypsique 5
Glucose 5
Phosphate bipotassique 5

pH = 7

1.1 Test RM (rouge de méthyle)

Ce test permet la mise en évidence, grâce au rouge de méthyle, de la fermentation des
acides mixtes par acidification d'un milieu glucosé après fermentation du glucose.
Au cours de la fermentation, il ya formation de plusieurs acides : acide formique, acide
butyrique, acide acétique … . Ces produits sont recherchés en pratique à partir du milieu
Clarck et Lubs avec la réaction du rouge de méthyle (RM).

Technique
Consiste à ajouter au milieu Clarck et lubs inoculé depuis 24h, 2 à 3 gouttes de solution
alcoolique de rouge de méthyle à 0,2%.
Si la coloration du milieu est jaune =Réaction négative=RM-
Si la coloration est rouge=Réaction positive= RM+
 1.2. Test VP (Vosges-Proskauer)
Ce test permet la mise en évidence de la production d'acétoïne (ou 3-hydroxy
butanone) au cours de la fermentation butylène glycolique: en présence
d'une base forte (soude ou potasse) et d'α-naphtol, l'acétoïne donne une coloration
rouge en milieu très oxygéné.

Technique
Dans un tube contenant le milieu Clarck et lubs inoculé depuis 24h, on ajoute 0,5 ml de
solution α-naphtol et 0,5 ml de KOH à 16%.
Agiter et laisser le tube en position inclinée pendant 10mn.
Aucune coloration donc Réaction négative=VP-
Coloration rouge= Réaction positive=VP+ ;

Remarque: le test VP est beaucoup plus spécifique que le test RM qui ne donne
qu'une idée globale du métabolisme. Le test VP est particulièrement intéressant
pour caractériser le groupe Klebsiella-Enterobacter-Serratia des entérobactéries.
2-Test ONPG
Ce test permet de mettre en évidence la dégradation du lactose par la ß-galactosidase, ce
test est réalisé lors de l’identification de très nombreuses bactéries. Cette enzyme est
intracellulaire et inductible il faut donc une perméase pour faire passer les molécules du
lactose et induire la synthèse de l’enzyme.
Cette enzyme inductible ne peut être synthétisée par la bactérie que lorsque celle-ci est
en présence de son substrat. La recherche de la ß-galactosidase ne peut donc se faire que
sur un milieu contenant du lactose (milieu KIA ou TSI).

Technique
On utilise un substrat synthétique : l’ortho-nitro-phényl-galactoside (ONPG) incolore de
structure proche du lactose et capable de pénétrer dans la bactérie sans perméase. Si la
bactérie possède la ß-galactosidase, on obtient du galactose et de l’ortho-nitro-phénol
(ONP) de couleur jaune.
•Faire une suspension dense en eau stérile (tube à hémolyse)
• Déposer un ½ disque d’ONPG
• Placer au bain-marie à 37°C
• Lire après 30 minutes

T.P. N°06
 Matière: Biochimie microbienne

 Intitulé : Les champignons comestibles Identification des entérobactéries par Galerie

API 20E

 Protocole :

 Principe:
 Méthodologie (succincte):
Le système API (Appareillage et Procédé d’Identification) est une version miniaturisée
et standardisée des techniques biochimiques conventionnelles pour l’identification des
bactéries.
La galerie API 20 E
Technique
 Réunir fond et couvercle d’une boite d’incubation et répartir environ 5 ml d’eau
distillée dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide.
 Déposer stérilement la galerie dans la boite d’incubation
Inoculation de la galerie.
 Remplir tubes et cupules des tests : |CIT |, |VP |, |GEL|, avec la suspension
bactérienne.
 Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.
 Créer une anaérobiose dans les tests soulignés : ADH, LDC, ODC, URE, H2S
en remplissant leurs cupules avec l’huile de paraffine.
 Refermer la boite d’incubation, coder et placer à 37 °C pendant 18-24 heures.

Lecture
Noter sur la fiche de résultat toutes réactions spontanées. Si le glucose est positif
et/ou si 3 tests ou plus sont positif : révéler les tests nécessitant l’addition de
réactifs.
-Test VP : ajouter une goutte de réactif VP1 et VP2. Attendre au minimum 10 minutes.
Une couleur rose franche ou rouge indique une réaction positive.
-Test TDA : ajouter une goutte de réactif TDA. Une couleur marron foncée indique
une réaction positive.
-Test IND : ajouter une goutte de réactif de Kovacs. Un anneau rouge obtenu en
2minutes indique une réaction positive.

La lecture de ces réactions se fait selon le profil numérique :

Après addition des réactifs nécessaires à la révélation de différents tests, la galerie
est lue conformément aux indications du fabricant et codée.