Protocole : Détection antigène par ELISA
Introduction
L'immunologie est l'étude du système immunitaire et la manière dont le corps se protège contre les
maladies. Il y a plus de 100 ans, les biologistes ont découvert que le système immunitaire interne des
animaux répondait aux invasions « d'entités étrangères » ou d'antigène. Quand un corps étranger
pénètre le corps, il provoque une réponse immunitaire qui commence par la production de protéines
appelées anticorps. Les anticorps agissent en cherchant et en s'attachant aux entités étrangères
(antigène). Cela permet de mettre les antigènes en évidence et donc de les faire détruire par d'autres
cellules du système immunitaire. L'antigène étranger peut être n'importe quelle molécule étrangère
du corps telles des bactéries, des virus, des champignons. Aujourd'hui, les anticorps sont devenus un
outil scientifique vital utilisé dans la recherche en biotechnologie et dans le diagnostic de maladies. Le
nombre d'anticorps dans la circulation sanguine a été estimé entre 106 et 1011 anticorps différents, de
sorte qu'il y a habituellement un anticorps prêt à fonctionner pour n'importe quel antigène. En fait, les
anticorps représentent jusqu'à 15% des protéines totales du sérum sanguin. Les anticorps sont
vraiment spécifiques, chaque anticorps ne reconnaît qu'un seul antigène.
Vous êtes sur le point de réaliser une ELISA (Enzyme- Linked-Immunosorbant-Essay). Le principe de l’
ELISA se base sur la reconnaissance d'antigène provenant d'échantillon liquide par les anticorps. Parce
qu'il se base sur les anticorps, la technique de l’ELISA est appelée immuno-essai. La technique ELISA
peut détecter de minuscules quantité d'agents étrangers dans des échantillons comme des fluides
corporel ( bien avant que le corps n'ait une chance de déclencher une réponse immunitaire). Le virus
de la variole est un exemple de maladie qui peut être détecté à l'heure actuelle par ELISA. Si l'exposition
au virus est détectée et traitée avec un vaccin endéans 2 à 3 jours, le patient ne développera pas la
variole. Il existe d'autres applications pour l’ELISA tels que la détection du virus du West Nile, les
protéines du HIV, le virus du SRAS, les spores de l'anthrax, la détection d'hormones de grossesse tel
que la hCG, la présence illégale de stéroïdes dans les tests médicamenteux, la présence de bactéries
dans la nourriture et la présence d'OGM dans de la nourriture ne devant pas en contenir.
Mise en situation
Avec les étudiants de 2e AIB, vous êtes allé faire une sortie de terrain durant laquelle vous avez voyagé
en transport en commun. Lors d'un communiqué de presse, il a été révélé qu’une personne
contaminée par le virus de la variole était présente dans ce train. Etant donné que le contact potentiel
avec cette personne contaminée est inférieur à 3 jours, il est pertinent de vous tester pour la
contamination au virus de la variole. En effet si cela fait moins de 3 jours que vous avez été contaminé,
vous pourriez recevoir une dose de vaccin. Cette injection vous permettrait de ne pas développer les
symptômes de la maladie. Cependant un vaccin est coûteux et nous voulons nous assurer de ne
l'injecter qu’aux personnes étant positive au virus de la variole. Pour ce faire, vous allez réaliser un test
Elisa sur l'ensemble des membres de la classe de 2e AIB.
Préparation des réactifs
1. Matériel pour 12 binômes
1 flacon : Antigen, chicken gamma globulin, freeze-dried
1 Flacon : Primary antibody, rabbit anti-chicken polyclonal antibody, freeze-dried
1 Flacon : Secondary antibody, goat anti-rabbit antibody conjugated to HRP, freeze-dried
1 Bouteille : HRP enzyme substrate (TMB)
1 Bouteille : 10x phosphate buffered saline (PBS)
1 bouteille : 10% Tween 20
2. Méthode
2.1 Préparation des tampons
Pour la préparation des tampons, un cylindre gradué de 100 ml et un cylindre gradué d’1L sera
nécessaire. 1 L d’eau stérile doit aussi être utilisé.
2.2 Réhydratation des antigènes, anticorps primaires et secondaires
Retirer précautionneusement les bouchons des 3 réactifs lyophilisés et utiliser une micropipette pour
ajouter 0.5 mL de PBS dans chaque flacon. Refermer les bouchons et mélanger vigoureusement.
Ces solutions sont 50x concentrées OU solutions stock.
2.3 Dilution des solutions stocks
Annoter une bouteille/tube de 30 mL pour chacune des solutions diluées ci-dessous. Pour les
solutions « étudiant A » et « étudiant B », un tube de 15 mL sera suffisant.
Utiliser une micropipette (nouveaux tips) pour ajouter le volume nécessaire de solution stock dans sa
bouteille correspondante.
Antigène étudiant A
Antigène étudiant B
2.4 Répartition des réactifs par binôme
Procédure ELISA
3. Matériel
4. Méthode
1) Annoter chaque tube jaune avec les initiales d’un membre du binôme.
2) Annoter une série de 12 puits avec les chiffres de 1 à 12
3) Annoter l'extérieur de chaque puits. Les 3 premiers puits sont des contrôles positifs. Les 3 puits
suivants sont des contrôles négatifs. Sur les puits restants annoter les initiales de chaque
étudiant du binôme.
4) Utiliser une pipette pour transférer 50 µL de PBS du tube jaune « PBS » dans les puits
numérotés 2 à 12.
5) Ajouter 100 µL du tube jaune « 1.000 ng/mL AG » dans le puit numéroté « 1 »
6) Réaliser une série de dilution de la sorte :
a. Prélève 50 µL du puit « 1 » et transférer le contenu dans le puit « 2 ». Aspirer et
relâcher le contenu du puit « 2 » trois fois pour homogénéiser son contenu.
b. En utilisant la même pipette, transférer 50 µL du puit « 2 » dans le puit « 3 » et
mélanger le contenu du puit « 3 »
c. En utilisant la même pipette, transférer 50 µL du puit « 3 » dans le puit « 4 » et
mélanger le contenu du puit « 4 »
d. Répéter ces étapes de transfert et de mélanger jusqu’au puit « 11 ».
e. Jeter 50 µl du puit 11, de sorte qu’il y ait le même volume dans tous les puits
7) Liaison de l'antigène aux puits:
a) utiliser une pipette pour transférer 50 µlitres du contrôle positif à partir du tube violet
dans les 3 puits +.
b) utiliser une pipette pour transférer 50 µlitres du contrôle négatif à partir du tube bleu dans
les 3 puits -.
c) utiliser une pipette pour chacun des échantillons et transfère 50 µlitres de chaque
échantillon dans les puits aux initiales correspondantes. 3 réplicats
8) Attendre 5 min que les protéines des échantillons puissent se lier aux puits.
9) Nettoyer les échantillons non liés:
a) retourner les lignes de microplaque tête en bas sur un papier absorbant pour éliminer
le reste de l'échantillon, ensuite tapoter les lignes quelquefois sur le papier. Il faut
éviter que l'échantillon retourne dans les puits.
b) Jeter le papier absorbant.
c) Utiliser une pipette pour transférer du tampon de nettoyage à partir du Berlin dans
chaque puit en évitant les éclaboussures dans les puits suivants. Tu peux aussi utiliser
la micropipette multichannel. La même pipette peut être utilisée pour toutes les
étapes de nettoyage.
d) retourner la ligne de microplaques sur un papier absorbant pour éliminer le tampon
de lavage, ensuite tapoter la ligne quelques fois sur le papier absorbant.
e) Jeter le papier absorbant.
10) Répéter une fois l'étape 5 de nettoyage avec le tampon de lavage.
11) Utiliser une nouvelle pipette pour transférer 50 µlitres de l'anticorps primaire (PA) à partir du
tube vert dans les 12 puits de la ligne de microplaques.
12) Attendre 5 min que l'anticorps primaire ait le temps de s'accrocher aux antigènes.
13) Nettoyer les anticorps primaires non liés hors du puit en utilisant les étapes de lavage du point
« 5 ». Répéter l'étape une 2e fois.
14) Utiliser une nouvelle pipette pour transférer 50 microlitres d'anticorps secondaire (SA) du tube
orange dans les 12 puits de la ligne de microplaques.
15) Attendre 5 min que les anticorps secondaires se lient.
16) Laver l'excédent d'anticorps secondaire hors des puits en répétant les étapes nettoyage.
Répéter 3 fois.
17) Utiliser une nouvelle pipette pour transférer 50 µlitres du substrat à partir du tube brun dans
les 12 puits de la ligne de microplaques.
18) Attendre 5 min.
19) Réaliser une première étape d'observation des résultats à l'œil nu.
20) Passer ensuite au lecteur de plaque à 655 nanomètres.
Analyse quantitative
Principe
Utiliser une série de dilution pour générer une série de concentration connue en antigène. Avec
l’augmentation de concentration en antigène, l’intensité de la coloration bleue augmentera aussi. La
couleur bleue absorbe la lumière à une longueur d'onde spécifique, et cette absorbance peut être
mesurée avec un lecteur microplaque. Vous devrez comparer vos échantillons personnels à la série de
dilution pour calculer la concentration en antigène de vos échantillons. la lecture se fera avec un filtre
de 655 nanomètres. De cette manière une courbe standard sera générée et il sera possible par
extrapolation de déterminer la concentration des différents échantillons.
Analyse des résultats
La concentration du tube jaune « 1X antigène » est de 1 µg/mL. De ce fait, les concentrations des
protéines dans les puits servant à la série de dilution sont de :
Pour l'utilisation du lecteur de microplaques, insérer votre ligne de microplaque dans son support,
sécurisez la plaque dans le lecteur de microplaques, fermer le couvercle et réaliser une lecture avec
un filtre à 655 nanomètres.
Le lecteur de microplaques mesure la quantité de lumière à une longueur d'onde spécifique. Dans
cette expérience le lecteur de microplaques mesure la quantité de lumière absorbée par le liquide dans
les puits. L'absorption de lumière par le tampon est directement proportionnelle à l'intensité
lumineuse produite dans les puits. Cette corrélation est aussi liée à l'activité enzymatique. L'activité
enzymatique quant à elle, correspond à la quantité d'antigène qui se sont liés au puits.
Réaliser une courbe de standard en faisant correspondre les concentrations connues de chaque puit
sur l'axe des x avec l’absorbance correspondante donnée par le lecteur de microplaques sur l'axe des
y. La courbe résultante aura une allure logarithmique qui nécessitera une linéarisation. (cette
linéarisation peut se faire directement dans un tableau Excel, ou bien un tableau de conversion est
donner sur la page suivante (fig.2)). Pour stopper la réaction, un ajout d’acide sulfurique (0.18 M) dans
les puits peut être effectué. Les solutions deviendront jaunes et la lecture se fait alors à 450 nm (pas
de filtre de 450 nm à la HEPN). Cependant, cette étape rendrait une lecture plus linéaire des
échantillons.
Figure 1: exemple de courbe standard à partir d'une série de dilution de 1000ng/mL à 1ng/mL lu à 655 nm
N.B. : La lecture de la microplaque doit se faire dans les 15 min après l'ajout de substrat. la réaction
enzyme-substrat perd la corrélation entre la concentration de l'antigène et la valeur de l'absorbance
lorsque le substrat non oxydé devient rare soit en raison d'un antigène trop concentré ou après un
temps de réaction trop long.
Figure 2: Graphique semi-logarithmique pour effectuer une analyse manuelle
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