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Acide nucleique

Biomolécules B (Université Claude-Bernard-Lyon-I)

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Les acides nucléiques

I- Historique
II- Les nucléotides
1) Les phosphates
2) Les bases azotées
3) Les riboses
4) Assemblages en nucléosides et nucléotides
III- L’ADN
1) La double hélice d’ADN
2) La condensation de l’ADN
3) L’ADN mitochondrial
4) L’ADN chez les procaryotes
IV- Les ARN
1) Les ARN messager
2) Les ARN de transfert
3) Les ARN ribosomiques
4) Les petits ARN
V- Métabolisme des nucléotides
1) La réplication
2) La transcription
3) La traduction
VI- Méthodes d’analyse
1) Dosage spectrophotométrique
2) Electrophorèse
3) La réaction de polymérisation en chaîne
4) Observation microscopique
5) Hydrolyse chimique et enzymatique

I- Historique
1 ère théorie cellulaire (XIXème siècle) : « Tous les êtres vivants, animaux et végétaux, sont constitués de cellules
» (Schleiden et Schwann, 1839)

Cellule : unité de base du monde vivant, pas de vie sans cellule (virus non-vivants)

« omni cellula e cellula » : toute cellule provient d’une autre cellule

En 1937, Chatton classe les cellules en procaryotes (sans noyau) et eucaryotes (avec noyau)

Comment la vie se transmet-elle d’une cellule à une autre ?

XIXème siècle : Mendel définit comment les gènes se transmettent d’une génération à l’autre

1902 : Garrod fait la 1 ère relation entre un gène et une protéine l'alcaptonurie serait due au déficit héréditaire
d'une enzyme des voies azotées

Mais structure et chimie du gène encore inconnues

Structure de la double hélice d’ADN : Modèle de James Watson et

Francis Crick (1953) - Prix Nobel (1962) (Purification de l’ADN ;
Cristallisation ; Diffraction des rayons X)

Dogme central de Crick : flux orienté de

l’information génétique

II- Les nucléotides

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1) Les phosphates

Structure générale :

– Base azotée

– Sucre

– Phosphate(s)

Motifs de variation :

– Base azotée : purine ou pyrimidine

– Sucre : ribose ou désoxyribose

– Nombre de phosphates

Les acides nucléiques sont constitués de nucléotides, des molécules complexes

Phosphate = 1 atome de phosphore + 4

atomes d’oxygène

 Le phosphore engage 5 liaisons

Phosphate inorganique (Pi ) :

Les phosphates donneront leur charge aux acides nucléiques

2) Les bases azotées

Les nucléotides sont aussi constitués de bases pyrimidines et purines

→ Les bases pyrimidines :

→ Les bases purines : Pyrimidines attachées à un second cycle

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3) Les ribosomes

C‘ : carbones du sucre C : carbones de la base

Le désoxyribose est + stable que le ribose, en

particulier en conditions alcalines

ADN : molécule la plus précieuse de la cellule

4) Assemblages en nucléosides et nucléotides

Les nucléotides : des nucléosides phosphorylés

Plusieurs nucléotides en fonction :

- de la base  A, T, C, G et U

- du sucre  ribose ou désoxyribose

- du nombre de P  1, 2 ou

Exemple de nucléoside avec l’adénine et le ribose

Les nucléosides :

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Exemple de nucléotide avec une base et le désoxyribose :

Les nucléotides de l’ARN :

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RESUME :

L’adénosine triphosphate (ATP) : la principale monnaie énergétique :

III- L’ADN
Polynucléotides : polymères de nucléotides

 Liaison entre un groupe 5’phosphate et un groupe 3’ OH

 A partir d’un nucléotide triphosphates

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Pourquoi séquence des bases suffisante ?

– Orientation / convention 5’-3’

– Répétition du squelette (P-sucre)n

ADN et ARN sont de longues molécules linéaires

non ramifiées et orientées

1) La double hélice d’ADN

La double hélice : Rappels historiques

→ 1953 : double hélice

→ 1940 : règle de Chargaff : A=T et C=G (soit A + G = T + C) mais 35 < % G/C < 75 selon
ADN
→ Ø = 2 nm (> 2 chaînes nucléotidiques) => hypothèse des liaisons H entre A/T et G/C

2 brins d’ADN associés, qui tournent autour du même axe

Orientation anti-parallèle

Adénines et Thymines associées ; Cytosines et Guanines associées

Règle de Chargaff (1940): A=T et C=G (soit A + G = T + C)

Si 20% d’adénine, alors : - 20% de thymine

- 30% de cytosine

- 30 % de guanine

La double hélice d’ADN :

→ Diamètre : 2 nm
→ Bases séparées de 0,34 nm
→ Pas de l’hélice : 10 nucléotides = 3,4 nm
→ Rotation de 36° d’un nucléotide à un autre
→ Les bases s’associent par des liaisons hydrogènes

Les sillons de l’ADN :

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2) La condensation de l’ADN

Taille des génomes : pas nécessairement proportionnelle à la complexité de l’organisme

Génome humain :

 Humains : 3,4 x 109 bases

 2 mètres d’ADN dans une cellule de 10 µm, dans un noyau d’1 µm

 Séquencé en 2004 par un consortium international et une société privée, Celera Genomics

 Budget de 2,8 milliards de dollars

 En France séquençage du chromosome 14 : 10 millions de dollars

2 à 3% de l’ADN codant :

- Environ 25000 gènes

- Gènes uniques (25-50%)

- Gène répétés en tandem :- ARNr - ARNt - ARNsn – ARNm

Plus de 95% de l’ADN non codant :

- Régions similaires mais non identiques

- Variations dans la répétition à la base de l’empreinte génétique

1er niveau de compaction : les nucléosomes = ADN + histones H1,

H2A, H2B, H3 et H4

→ Cœur octamérique 2 x (H2A, H2B, H3 et H4)

→ Environ 150 pb d’ADN
→ H1 bloque la structure

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Apparence en collier de perles

ADN + histones = chromatine 11nm de diamètre

Nucléosomes : utilisés pour identifier les cellules programmant leur mort

Les cellules dégradent leurs constituants

Les cellules dégradent leur ADN par des endonucléases (ADN

normalement toujours préservé)

2ème niveau de compaction : la chromatine compactée

Fibres de 30 nm de diamètre

Ces régions ne sont plus disponibles pour la transcription

3ème niveau de compaction :

La chromatine surenroulée et les chromosomes : 23 paires de chromosomes chez le

caryotype de l’homme

Mitose :
Prophase ;

Métaphase ; Anaphase ; Télophase

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3) L’ADN mitochondrial

Les mitochondries sont les

descendants de procaryotes ayant été
phagocytés par les cellules eucaryotes

1 seul chromosome circulaire présent en 2 à 10 copies

37 gènes sur 16500 pb codant pour 13 protéines, 22

ARNt et 2 ARNr

Transfert progressif des gènes du chromosome

mitochondrial vers le génome nucléaire

Protéines de la chaîne respiratoire

Toutes ces protéines font partie de la chaîne respiratoire mitochondriale

Maladies génétiques mitochondriales : myopathies et neuropathies

Une région non codante : d-loop, très variable = outil d’investigation  utilisée pour :

- Origine populations

- Recherche filiation

- Enquêtes policières

4) L’ADN dans la cellule procaryote

Les cellules procaryotes contiennent un compartiment unique, le

cytoplasme, contenant

- Un chromosome, le plus souvent circulaire, que l’on appelle le

nucléoïde [ou corps nucléaire, corps de chromatine, région

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nucléaire (pas de noyau)], Ce

chromosome est parfois unique, parfois
en plusieurs exemplaires car le matériel
génétique est dupliqué plus vite que
division)
- Des plasmides : unités réplicatives
autonomes ADNds

Empaquetage malgré absence d’histones ;

ADN enroulé sur lui-même pour compaction

- Topoisomérases I et II

- ADN gyrase

IV- Les ARN

β-D-ribose dans les ARN

ARNs moins stables que l’ADN

ARN totalement hydrolysés en nucléotides à pH alcalin

Bases purines identiques ADN et ARN

Bases pyrimidines diffèrent

ARNs généralement simples brins

Même orientation 5’ → 3’

Mais il existe des ARNs en doubles brins !!!

1) Les ARN messagers

→Messager entre un gène et une protéine

→Fabrication de l’ARNm : transcription de l’ADN

2) Les ARN de transfert

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Associent un AA à une protéine en fonction d’un codon d’ARNm

Forme de trèfle due à 4 segments doubles brins

Anticodon : séquence de 3 nucléotides complémentaire au

codon d’un ARNm

Association anticodon/codon antiparallèle !

Dihydrouridine déstabilise les ARN

ARN plus souples

Inosine en 1ère position des anticodons

Interagit avec la 3ème position des codons

Peut interagir avec plusieurs bases

Génère un autre groupe donneur de

liaison hydrogène

Stabilise les interactions avec les aminoacyl transferases

3) ARN ribosomiques

Les ARN les plus abondants dans la cellule (80%)

Complexes ARN-protéines : ARN 60% de la masse d’un ribosome

Ribosome : lieu de la synthèse protéique, 2 sous-unités

Svedberg (S) : unité de la vitesse de sédimentation lors d’une centrifugation

ARN ribosomiques :

→ utilisés pour vérifier que des ARN sont non

dégradés
→ systématique après extraction des ARN
→ électrophorèse des ARN
→ coloration au bromure d’éthidium

Grandes quantités des mêmes

ARNr

Gènes codant pour les ARNr

répétés en tandem

ARNr transcrits sous la forme d’un « grand » ARN précurseur qui est ensuite coupé

4) Les petits ARN

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Découverte de nouveaux petits ARN autour des années 2000

En particulier les microARN (miARN) et les ARN interférents (siARN pour small interfering)

Impliqués dans l’inhibition de la traduction des ARN messagers

Les micro ARN

Les siARN

ARN courts introduits dans la cellule par l’expérimentateur pour inhiber une
expression protéique

Approche de thérapie génique qui repose sur la dégradation d’un ARN

messager précis

Les snARN :

Petits ARN nucléaires

ARN de 60 à 500 nucléotides

Associés à des protéines dans des petites ribonucléoprotéines ou snRNP

Participent notamment à l’épissage des ARN messagers et à la maturation des ARN ribosomiques

Les snoARN :

Petits ARN nucléolaires

Nucléole : lieu du noyau où se produit la transcription des ARN

ribosomiques

snoARN guident les modifications chimiques des ARN ribosomiques

Méthylation des riboses

Isomérisation d’uridines en pseudouridines

Fonctions encore mal comprises

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V- Métabolisme des nucléotides

1) La réplication

Copie à l’identique d’un ADN double-brin

Lors de la division cellulaire

2 mécanismes possibles : réplication conservative ou semi-conservative

Expérience de Meselson et Stahl (1958)

Bactéries Escherichia coli cultivées pendant plusieurs générations dans

du milieu avec azote « lourd » 15N (1 neutron en +)

 ADN « lourd »

Ensuite bactéries - Cultivées dans du milieu avec 14N

- Centrifugation à chaque nouvelle génération

 Réplication semi-conservative

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Synthèse d’une amorce d’ARN par une primase

Synthèse d’ADN de 5’ vers 3’ par des ADN polymerases

Synthèse continue pour le brin précoce (leading strand)

Synthèse discontinue sur le brin tardif (lagging strand)

Génère des fragments d’Okazaki (environ 100 pb)

ADN polymerase a une activité RNAse

Élimination des amorces d’ARN

ADN ligase attache l’ADN en formation avec un fragment d’Okazaki

Chez la bactérie Escherichia coli

 Depuis une origine de réplication

 Réplication bidirectionnelle
 Jusqu’à un site de terminaison

Environ 40 minutes pour 4,6 x 106 paires de bases

Soit environ 1000 nucléotides par seconde pour chaque ADN

polymerase

2) La transcription

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1-Fixation de l’ARN polymerase sur une séquence promotrice

2-Séparation de l’ADN sur 14 paires de base autour du point +1

3-1ère liaison phosphodiester

4-Avance de 3’ en 5’ sur le brin matrice Polymérise dans le sens

5’ -> 3’ Environ 1000 nucléotides par minute

5-Séquences spécifiques de terminaison

La

maturation de l’ARNm :

Les ARNm eucaryotes subissent une maturation avant la traduction

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La coiffe :

Liaison 5’-5’ avec un GMP

Méthylation de la guanine et des 2 riboses voisins (CH3)

Protection de l’ARN contre les nucléases et export dans le cytoplasme

La queue :

Une endonucléase se fixe sur un site AAUAAA et coupe l’ARN

Poly-A polymerase ajoute jusqu’à 250 A

Protection contre les nucléases

L’épissage :

Seulement chez les eucaryotes

Plusieurs conséquences possibles :

 Fonctions complètement différentes (1 gène -> 2

protéines indépendantes)
 Fonctions un peu différentes ( 1 gène -> 2 protéines qui
participent à la même fonction biologique)
 Fonctions opposées ( 1 gène -> 2 protéines qui ont des
fonctions opposées)
 Dans les fibroblastes : participe à l’ancrage des cellules à la
matrice extracellulaire (EIIIB et EIIIA)
 Dans les hépatocytes : libérée dans la circulation sanguine,
participe à la réparation tissulaire

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Structure d’un ARN messager mature

3) La traduction

Transcription : ADN => ARN sans changement de langue

(nucléotides  nucléotides)

Traduction : ARN => protéines avec changement de

langue (nucléotides  acides aminés)

Code génétique : dictionnaire pour traduire d’une langue à

l’autre

L’ADN contient l’information nécessaire à la synthèse protéique

L’ARNm transmet les instructions codées dans l’ADN

Les protéines exécutent la plupart des instructions biologiques

Code génétique : un codon de 3 nucléotides porte

l’information pour un acide aminé

Traduction de l’ARNm :

Les ribosomes (protéines + ARNr) se déplacent le long de l’ARN messager

Les ARNt se fixent les uns après les autres sur les codons de l’ARNm
par leurs anticodons

Les ARNt transfèrent leur acide aminé sur la protéine en fabrication

(liaison peptidique)

3 sites sur les ribosomes : Site A : site de fixation de l’AA de l’ARNt

Site P : site de fixation de la protéine sur

l’ARNt

Site E : site « exit », sortie des ARNt

Traduction s’effectue en 3 étapes : 1- Initiation 2- Elongation

3- Terminaison

1- Initiation

Codon initiateur : AUG

situé à environ 100 pb de l’extrémité 5’

code pour une méthionine

Fixation de la petite SU du ribosome sur l’ARNm

Chez les procaryotes :

 Sur la séquence de Shine et Dalgarno

 AGGAGGUAA

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Chez les eucaryotes :

 Sur la séquence de Kozak

 GCCRCCAUGG

Fixation de l’ARNt-Met sur le codon AUG

La grande SU du ribosome forme la 1ère liaison

 activité peptidyltransferase
2- Elongation

Translocation du ribosome

 Le 1er ARNt se déplace vers le site E

 Le 2ème ARNt se déplace vers le site P
 Le site A devient disponible pour un 3ème AA
3- Terminaison

Terminaison

 Quand codon stop UAA, UAG ou UGA

 Coupure entre la protéine et l’ARNt

La traduction d’une protéine eucaryote moyenne

demande 30-60 secondes

Un même ARNm peut être traduit par plusieurs ribosomes

VI- Méthodes d’analyse

1) Dosage spectrophotométrique

Phosphates et riboses n’absorbent pas la lumière

Les bases absorbent la lumière vers 260 nm

Coefficient d’extinction molaire moyen ε = 10 000 M-1 cm-1

Loi de Beer Lambert A = ε x L x C

Applicable aux nucléotides, pas à l’ADN ou à l’ARN pour lesquels une concentration en mol.L-1 n’est pas applicable

1 unité d’absorbance à 260 nm :

40 µg/ml d’ARN

50 µg/ml d’ADN double brin

33 µg/ml d’ADN simple brin

Effet hyperchrome ou hyperchromicité : Abs + élevée après dénaturation

Dénaturation : séparation réversible des 2 brins d’ADN

Lors de la réplication et de la transcription (hélicases)

Par NaOH 0,5 M

Par la température (rupture des liaisons hydrogène)

Température de fusion (Tm, pour melting) : T à laquelle la

moitié de l’ADN est dissocié en monobrins

La Tm est fonction : de la longueur de l’ADN

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du % de GC (coefficient de Chargaff)

Renaturation : complète si refroidissement lent

Hybridation: association de
2 brins complémentaires (ADN-ADN,
ADN-ARN ou ARN-ARN)

1 unité d’absorbance à 260 nm :

50 µg/ml d’ADN double brin 33 µg/ml d’ADN

simple brin

Quand on extrait de l’ADN, on cherche à

déterminer la contamination protéique

Mesure du rapport A 260/A280 (protéines absorbent à 280 nm)

ADN considéré pur quand : 1,8 < A260/A280 < 2

2) Electrophorèse

Gels les plus simples et les plus courants : agarose

 Liquide à forte température
 Gel à température ambiante
1- Préparation du gel d’agarose

2- Dépôt des échantillons avec un

colorant

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3- Electrophorèse 50-100 V

4- Incubation du gel avec du bromure d’éthidium

5- Observation sous UV

Exemple d’application :
 pour vérifier que des ARN sont non dégradés
 systématique après une extraction d’ARN
 ARN ribosomiques : 80% des ARN et structures doubles brins
 Pour mettre en évidence l’apoptose
 Après extraction de l’ADN de cellules ou d’un tissu
 Distance de migration inversement proportionnelle avec la taille
 Relation non linéaire entre la distance de migration et la taille
 Il faut tracer log (taille) = f (distance de migration)

3) Observation microscopique
 Pour observer l’ADN
 Pour observer les noyaux, les cellules
 Coloration au DAPI (4’,6-diamino-2-phenylindole)
 Se lie aux bases A et T  Émet une fluorescence bleue
 Observation des noyaux en microscopie à fluorescence
Coloration bleue de l’ADN avec le DAPI
Coloration verte des microtubules

4) La réaction de polymérisation en chaîne

PCR : polymerase chain reaction

 Méthode mise au point par Kary Mullis en 1985 (prix Nobel de chimie en 1993)
 Permet d’obtenir rapidement de grandes quantités d’un fragment d’ADN donné
 Chaque région, chaque gène, sur un chromosome est unique dans la cellule
 Besoin de davantage d’ADN pour nombre d’applications
 Séquençage
Tests de paternité Criminologie Dépistages Contrôles agroalimentaires…
 Génération d’OGM
 Thérapie génique

Une 1ère réaction à 95 °C pendant 5 minutes pour dénaturer tout l’ADN et homogénéiser le milieu réactionnel
Puis 3 étapes qui se répètent à la chaîne

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PCR en temps réel

 Détermination de la
quantité d’ADN après
chaque cycle
 Par incorporation dans
l’ADN d’une sonde
fluorescente

5) Hydrolyse
chimique
enzymatique

Hydrolyse alcaline pH 11-12 :

- ADN résistant

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- ARN totalement hydrolysés en nucléotides (présence du OH en 2’)

Hydrolyse acide :

- ADN et ARN sont dégradés en un mélange de phosphates, oses et bases

Les nucléases (DNases ou RNases) :

- Coupent spécifiquement ADN ou ARN

- Exo ou endonucléases
- Spécifiques de la séquence

Les enzymes de restriction :

- DNases
- Libèrent une extrémité 5’phosphate et une extrémité 3’OH
- Endonucléases spécifiques d’une séquence d’ADN

Utilisées en biologie moléculaire :

- Purifiées à partir de bactéries (protègent leur ADN par méthylation)

- Depuis les années 1960

Enzyme EcoRI d'Escherichia coli souche R, 1ère enzyme isolée

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