5-2 les techniques moléculaires :
Hybridation in situ en fluorescence F.I.S.H :
Cette technique de reconnaissance de macromolécules est considérée comme une nouveauté
dans le domaine de la cytologie ; elle a été initialement développée au début des années 1980
comme un outil de cartographie physique pour délimiter les gènes dans les chromosomes(1).
Les techniques FISH ont été utilisées pour augmenter considérablement la sensibilité de
l'analyse du caryotype afin de détecter de petites anomalies sous-microscopiques telles que
des micro délétions/duplications et les déséquilibres ou les réarrangements télomériques (2,3)
et peuvent être utilisées sur des préparations chromosomiques et sur les chromosomes obtenus
après culture (FISH métaphasique), ou sur noyaux cellulaires (FISH interphasique). La FISH
interphasique peut être réalisée sur les tissus frais ou congelés. Un résultat peut donc être
obtenu sans culture cellulaire. Le plus grand inconvénient de la FISH est son caractère ciblé. I
Son principe repose sur la complémentarité possible entre l’ADN d’un patient et un fragment
d’ADN marqué d’une sonde fluorescente, après dénaturation thermique et hybridation en
utilisant un microscope à fluorescence.
Les plus utilisées sont les sondes « locus spécifique » qui permettent de tester une hypothèse
diagnostique, soit clinique, soit après analyse du caryotype (hypothèse chromosomique,
comme par exemple un doute sur une délétion télomérique). (4) (figure)
Etapes de la technique de FISH :
Préparation des solutions :
40 ml de 2 * SSC (saline citrate de sodium) / 4 ml de 20 * SSC + 36ml de H2O stérile.
Préparation de lame d’échantillon :
Je vous ai déjà dit de pas rediger sous cette forme, faites des phrases
L’échantillon Déposé sur une lame propre, attendant le séchage.
Plonger la lame dans 2 * SSC pendant 2 min a température ambiante sans agitation.
Déshydratation dans une série de bains d’éthanol (70%, 85%, 100%), 2 min dans chaque bain
à température ambiante
- Laisser sécher.
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Pre dénaturation :
La sonde Retirée du congélateur été préchauffer T° ambiante. Puis Bien homogénéiser la
sonde en pipetant plusieurs fois
10 µl était prélever de la sonde et placé sur l’échantillon, couvrir avec une lamelle. Sceller
avec du rubber cément et laisser sécher.
Dénaturation :
En plaçant la lame sure une tine laque chauffante a 75°C avec humidification du papier au-
dessous de lame. Dénaturation pendant 3 min.
Hybridation :
Incubation de la lame pendant 24h a 37°C à l’abri de la lumière et dans une chambre humide.
Lavage post-hybridation :
Après élimination de toutes traces de rubber cément, les lames seront laver par une tampon
0,4 * SSC (ph 7.0) a 72°C pendant 2 min. un 2nd lavage dans un tampon 2 * SSC, 0,05%
Tween-20 (ph 7.0) a T° ambiante pendant 30 min.
Sur la lamelle et appliquer 10µl de DAPI. La lamelle sera assemblée sur la lame = apparition
de coloration pendant 10 min.
Visualisation par microscope a fluorescence.
Pourquoi vous mettez un protocole ici ??????
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Figure 1Figure 1 Analyse FISH en métaphase avec des exemples de
sondes sub-télomériques des bras du chromosome 11p (orange) et q
(vert), et du chromosome 18p (aqua) et du centromère 18 (jaune)
Figure 2 Figure 1 Analyse FISH en métaphase avec des exemples de sondes sub-télomériques des bras du chromosome
11p (orange) et q (vert), et du chromosome 18p (aqua) et du centromère 18 (jaune)
1. Ratan ZA, Zaman SB, Mehta V, Haidere MF, Runa NJ, Akter N. Application of Fluorescence In Situ
Hybridization (FISH) Technique for the Detection of Genetic Aberration in Medical Science. Cureus
[Internet]. 9 juin 2017 [cité 6 janv 2023];9(6). Disponible sur:
https://www.cureus.com/articles/7529-application-of-fluorescence-in-situ-hybridization-fish-
technique-for-the-detection-of-genetic-aberration-in-medical-science
2. Martin CL, Warburton D. Detection of Chromosomal Aberrations in Clinical Practice: From
Karyotype to Genome Sequence. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16(1):309-26.
3. Mahler Zneimer S. Integrated chromosome and FISH analyses. In: Cytogenetic Abnormalities
[Internet]. California: John Wiley & Sons, Ltd; 2014 [cité 1 janv 2023]. p. 231-41. Disponible sur:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/9781118412602.ch15
4. Dimassi S, Tilla M, Sanlaville D. Anomalies chromosomiques. J Pédiatrie Puériculture. 1 nov
2017;30(5):249-70.
