CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SUR COLONNE

I) Introduction :

La chromatographie liquide sur colonne est divisée en fonction des principaux

phénomènes de séparation il s’agit de :
- chromatographie de partage ou chromatographie liquide – liquide.
- chromatographie d’adsorption ou chromatographie liquide – solide.
- chromatographie par échange d’ions.
- chromatographie d’exclusion ou chromatographie sur gel.

Les premières chromatographies en phase liquide sur colonne y compris les

travaux de Tswett ont été effectuées sur des colonnes en verre dont le diamètre
interne variait entre 1et 4cm, et la longueur entre 15 et 20cm et parfois plus.
Le diamètre des particules constituant la phase stationnaire était compris entre
150 et 200m.
Elle utilisait principalement la gravité pour faire couler la phase mobile sur les
colonnes remplies de phases stationnaires.
Les séparations étaient longues dépassant souvent plusieurs heures.
Cette méthode appelée actuellement chromatographie classique sur colonne.

La chromatographie liquide sur colonne utilisait actuellement de nos jours se

distingue de la chromatographie classique par les points suivant :
- diamètre interne plus petit 2 à 8mm.
- phases stationnaires de granulométrie fines et régulière 3 à 10m.
- pression d’entrée élevée qui nécessite l’utilisation d’une pompe.
- contrôle du débit de la phase mobile.
- introduction de faible quantité de substances.
- détecteurs spécifiques et sensibles.
- rapidité des analyses.
- résolution élevée.

En raison de ces différentes caractéristiques, cette nouvelle technique a été

appelée chromatographie liquide à haute pression, ou chromatographie liquide à
haute résolution, ou chromatographie liquide à haute performance ( C.L.H.P),
En anglais H.P.L.C (High performance liquide chromatographie).

Le terme général de chromatographie liquide (C.L) est actuellement adopté.

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II) Appareillage :

L’appareillage utilisé en H.P.L.C doit être capable de supporter les pressions

élevées imposées par la très fine granulométrie des phases stationnaires. Il est
pour cela en acier inoxydable résistant à la corrosion chimique des phases
mobiles.

Une installation d’HPLC comprend différents modules :

- un réservoir à solvant contenant la phase mobile.
- un système de pompage (chromatographie haute pression).
- un injecteur (introduction de l’échantillon).
- une colonne (contenant la phase stationnaire).
- un détecteur.
- un système d’acquisition des données.

Les différents modules sont reliés par des canalisations courtes et de très faible
diamètre interne (0,1 mm).

Les différentes parties de l’appareillage en contact avec la phase mobile sont

généralement construites en acier inoxydable qui présente l’avantage de
résister à la pression et d’une bonne résistance à la corrosion chimique.

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Les canalisations sont soit en acier inoxydable soit en polymère de type PEEK
(polyether-etherketone) qui est un polymère souple plus économique que l’acier
et pouvant résister aux solvants sous des pressions élevées jusqu’à 400 bars.

CHAINE H.P.L.C
Une installation HPLC comporte divers modules intégrés dans un même
châssis pour gagner de l’espace (moins encombrant).

a) Réservoir de phase mobile :

- un ou plusieurs réservoirs de phase mobile.

- Des réservoirs de 0,5 à 2litres équipent en général les appareils les plus
courants pour des chromatographies analytiques.

- Des volumes importants qui peuvent aller jusqu’à 10 litres sont réservés aux
chromatographies préparatives (appareillage différents dans ce cas).

- les réservoirs doivent être étanches afin d’éviter l’évaporation des solvants ou
leur contamination par la vapeur d’eau de l’atmosphère.

- La phase mobile doit être filtrée et dégazée pour chasser les gaz dissous et en
particulier l’oxygène afin d’éviter la perturbation de la chromatographie et les
systèmes de détection par les bulles formées par ce gaz.

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Régime isocratique
- Lorsque la phase mobile conserve pendant toute la durée de la
chromatographie la même composition on parle de régime isocratique.
Elle peut être préalablement préparée et déposée dans un seul réservoir. Certains
appareils permettent cependant de l’obtenir instantanément par mélanges de
solvants provenant de réservoirs différents. La proportion de chaque liquide est
alors réglée par des vannes dont l’ouverture est réglable.

Gradients de polarité ou programmation de solvant

- La modification de la polarité de la phase mobile nécessite la présence des
systèmes munis de dispositifs de programmation qui permettent de faire varier
dans le temps la composition des mélanges de solvant qui constituent la phase
mobile et d’établir ainsi des gradients de polarité ou programmation de solvant,
et ceci pour augmenter les possibilités séparatives.

b) Pompes :
- élément important de chromatographie liquide.
- la pompe a pour rôle de provoquer dans la colonne un écoulement de la phase
mobile compatible avec la séparation chromatographique.
- ces pompes doivent être très puissantes car la viscosité des solvants et la très
fine granulométrie des phases stationnaires entraînent une différence de pression
ou perte de charge entre le sommet et l’extrémité de la colonne qui peut parfois
être importante (50 ou 100bars).
- les plus usuelles permettent d’obtenir des pressions de 420bars et peuvent aller
jusqu’à 600bars. On distingue deux sortes de pompes :
 Pompes à pression constante : ce sont des pompes pneumatiques qui par
l’intermédiaire d’un gaz inerte imposent une pression constante à la phase
mobile.
Simples peu coûteuses, mais leur utilisation est limitée, elles sont
réservées actuellement aux remplissages des colonnes.

 Pompes à débit constant : la régularité des débits qui peuvent aller de

0,01ml à 10ml/min est une condition essentielle à la reproductibilité des
chromatographies et très souvent obligatoire pour certains systèmes de
détection.
Le modèle le plus simple est de type seringue, dans lequel le déplacement
d’un piston refoule le liquide à vitesse constante.
L’avantage fondamental de ces systèmes est de permettre une bonne
répétabilité des Volumes et des temps d’élution.

N.B : les pompes des équipements actuels sont pilotées par informatique
(bien utile lors de l'utilisation de gradient d'élution).

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c) Systèmes d’injection : introduction des échantillons

L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de la colonne doit se

faire en un temps très bref afin de ne pas perturber le régime d’écoulement de la
phase mobile qui doit être stable de la colonne au détecteur.
La difficulté consiste à introduire en tête de colonne un volume d’échantillon là
ou la pression atteint plusieurs dizaines de bars.
On utilise pour cela une vanne haute pression à plusieurs voies (vanne à boucle
d’échantillonnage).
Ce type de vannes peut être utilisé soit manuellement soit commandé par un
passeur automatiques d’échantillons (injecteurs automatiques).

Procédé par boucles = vanne à boucle d’échantillonnage

C’est la méthode d’introduction la plus courante en H.P.L.C utilisant des

boucles d’échantillonnage.
Ils permettent l’injection de volumes variables allant du microlitre au millilitre
et peuvent fonctionner sous de fortes pressions, jusqu’à 600bars.

L’échantillon est introduit à la pression ordinaire dans une boucle, petit volume
clos, qui peut être mis en communication par un système de vannes avec le
réservoir de phase mobile et avec la colonne.

Le principe de fonctionnement est le suivant :

1) la boucle est isolée par la fermeture des vannes de l’ensemble de

l’appareil.
2) on introduit l’échantillon à la pression atmosphérique dans la boucle à
l’aide d’une seringue (position chargement ou load).
3) on ouvre les vannes par simple translation pour permettre à la boucle
d’être en communication avec le système chromatographique et son
contenu est entraîné dans la colonne (position inject).

Ce système évite les brusques variations de pression dans l’appareil, et en

diminuant les irrégularités des injections, augmente la reproductibilité.

La quantité introduite dans la colonne étant obligatoirement celle du volume de

la boucle.
Le volume prélevé avec la seringue est toujours supérieur à celui de la boucle
L’excès du volume est évacué par le trop plein (évent).

Ces dispositifs font généralement partie intégrante de l’appareillage HPLC

moderne utilisés actuellement.

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Vannes à boucles d’échantillonnage

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d) Colonne = le cœur d’un chromatographe

Les colonnes utilisées en H.P.L.C se caractérisent par leur géométrie et par la

nature des phases stationnaires qu’elles contiennent.
Elles sont en acier inoxydables de diamètre interne 2 à 8mm, la longueur est
comprise entre 5 et 30cm. Capables de résister aux fortes pressions.
La colonne probablement la plus utilisée a une longueur de 25cm, un diamètre
interne de 4,6mm, la granulométrie est de 5m. Le nombre de plateaux
théoriques de ce type de colonne est compris entre 40.000 et 60.000 par mètre.

Depuis peu sont apparues sur le marché des micro colonnes à haute performance
et à grande vitesse. Leur diamètre interne est de
1à 4,6mm et leur longueur de 3 à 7,5cm. Ces colonnes qui sont remplies de
particules de 3 à 5m possèdent jusqu’à 100.000 plateaux par mètre

Ces colonnes ont l’avantage :

• de la rapidité de l’analyse,
• de consommer moins de solvant (les solvants de haute pureté pour l’HPLC
sont très coûteux),
• de conduire à une meilleure résolution de l’analyse (par suite d’une moindre
diffusion),
• de permettre de faire du couplage avec la spectrométrie de masse HPLC/MS.

Colonne de garde = pré colonne

On place souvent une courte colonne de protection avant la colonne afin d’en
augmenter la durée de vie de notre colonne par élimination des impuretés
contenus dans les solvants, et aussi des espèces qui se lient de manière
irréversible à la phase stationnaire.
La composition de la colonne de garde doit être semblable à celle de la colonne
analytique.

N.B : pour éviter les écarts de température modifiant parfois les temps de
rétention, les appareils actuels sont équipés de four permettant de thermostater la
colonne, à la fois :
- pour assurer la répétitivité des analyses.
- et aussi pour faire intervenir éventuellement la température comme paramètre
de séparation.

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COLONNE HPLC

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e) Systèmes de détections :
Ils ont pour rôle de suivre en continu la présence des composés dans la phase
mobile au fur et à mesure de leur élution.
D’une manière générale pour qu’un détecteur puisse permettre une analyse
quantitative fiable,
Il doit satisfaire à plusieurs critères :
 donner pour chaque composé une réponse proportionnelle à sa
concentration.
 fournir une réponse stable, rapide et reproductible.
 Présenter une bonne sensibilité.
 Ne pas modifier la qualité de la séparation apportée par la colonne.

Les systèmes utilisés pour la détection sont répartis en deux groupes :

- ceux qui ont un caractère universel et qui exploitent une modification par les
solutés d’une propriété de la phase mobile tel que le Réfractomètre.

- et ceux qui sont dits sélectifs parce qu’ils utilisent les propriétés
physicochimiques particulière des solutés tel que détecteurs : électrochimique,
spectrophotométrique, spectrofluorimètrique.

1) Réfractomètre : consiste à mesurer la différence d’indice de réfraction

entre la phase mobile pure qui sert de référence et les solutions éluantes
contenant les substances.
Le Réfractomètre possède une sensibilité médiocre.
Il est très sensible au changement de température (ce qui peut être évité en
le thermostatant).
Il est aussi sensible au changement du débit ce qui est le plus gênant.
Il ne peut entre autre être employé lorsque l’on utilise des gradients
d’élution, car l’indice de réfraction des mélanges varie sauf cas
exceptionnel avec leur composition.
Sa principale application est la chromatographie d’exclusion stérique.

2) Détecteur spectrophotométrique :
La détection est basée sur la loi de Beer-Lambert.
La méthode la plus employée utilise les spectres électroniques. Elle
nécessite que les phases mobiles absorbent peu aux longueurs d’ondes
auxquelles sont faites les mesures.
Les mesures dans l’UV proche étant les plus nombreuses, on se limite en
général aux phases mobiles n’absorbant pratiquement plus à des
longueurs d’ondes supérieures à 250nm.

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Les types d’appareils qui équipent les chromatographes sont :
Photomètre à filtre dont la source est une lampe à vapeur de mercure (à basse
pression détection en UV 254nm ou à pression moyenne donnant une raie à
280nm).
Spectrophotomètre à prisme ou à réseau dont la source couvre toute
La gamme UV/visible de 200 à 800nm utilisant soit des détecteurs classiques,
soit de Plus en plus des détecteurs à barrettes de diodes (D.A.D),
Ces derniers peuvent fournir un chromatogramme en trois dimensions 3D
(absorbance, longueur d’onde, et temps de rétention.)

Les détecteurs spectrophotométriques présentent un certains nombre

d’avantages :
- Ils sont spécifiques.
- Ils sont cent fois plus sensibles que les réfractomètres.
- Leur réponse est peu influencée par les variations de température ou de
débit de phase mobile.
- Ils peuvent être employés lorsque l’on utilise le gradient d’élution.
- Couplés à une informatique, ils permettent :
 De rendre une identification plus spécifique et de vérifier la pureté
des échantillons,
 De rendre possible le dosage de produits d’altération dans des
préparations médicamenteuses,
 De faire une analyse simultanée de plusieurs principes actifs dans
un produit.

Présentation d’un chromatogramme 3D

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 3) Détecteur à fluorescence = (spectrofluorimètre)
Ce mode de détection est spécifique aux composés qui présentent une
fluorescence lorsqu’ils sont excités par une radiation lumineuse.
Ce détecteur est caractérisé par :
- Sa grande sélectivité
- Et sa grande sensibilité.

Le domaine d’application de la spectrofluorimètrie peut être élargi par la

synthèse de dérivés fluorescents soit avant l’injection dans le système
chromatographique, soit en sortie de la colonne.

Par ailleurs, afin d’améliorer les sensibilités la technologie actuelle tend à

remplacer la source d’excitation (lampe) par un faisceau laser (parfaitement
monochromatique et d’intensité stable).

4) Détecteur électrochimique =
Ne s’adresse qu’aux composés douées de propriétés oxydo-réductrices. Leur
fonctionnement est basé sur l’ampérométrie, la polarographie, et la coulomètrie.
Son application peut être élargie par la mise en œuvre de réactions chimiques de
transformation à l’aide de marqueurs électroactifs.

5) Couplage entre méthodes chromatographiques et méthodes

spectrales :

Le couplage constitue actuellement l’un des outils les plus puissants pour
l’analyse des mélanges complexes.

- spectrométrie de masse : C.L/SM.

- spectrophotométrie d’absorption infrarouge : C.L/ IR

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III) choix du procédé chromatographique :

La connaissance des poids moléculaires, des polarités et des caractères ioniques

des solutés va orienter le choix du procédé chromatographique à mettre en
œuvre pour réaliser leur séparation.

1) Chromatographie d’adsorption ou chromatographie liquide – solide :

C’est la plus ancienne des méthodes chromatographiques.
Elle met à profit (expérience de Tswett), la propriété que possèdent certaines
substances en solution d’être retenues par la surface d’une phase stationnaire
très finement divisée appelée adsorbant.
Les phases stationnaires utilisées en chromatographie liquide – solide sont :
la silice et l’alumine.
La chromatographie liquide – solide s’adapte particulièrement aux composés
non polaires de masse molaire inférieure à 2000.
Les phases mobiles utilisées sont par ordre de polarité croissante :
L’hexane, l’isooctane, le dichlorométhane, les éthers isopropylique et
éthylique, le méthanol, et l’acétonitrile.
Les solvants sont rarement utilisés seuls. Sous réserves de leur miscibilité et de
leur compatibilité avec le système de détection pour obtenir de bonnes
séparations, on emploie des mélanges binaires ou tertiaires.

2) Chromatographie de partage ou chromatographie liquide – liquide :

Des quatre méthodes de chromatographie liquide, la plus utilisée est sans aucun
doute la chromatographie de partage (environ 80% des analyses).
La chromatographie de partage peut être divisée en :
- Chromatographie liquide – liquide
- Chromatographie liquide – phase greffée.

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La différence entre ces techniques réside dans la manière de fixer la phase
stationnaire aux particules qui constituent le support.
En chromatographie liquide – liquide, la phase stationnaire est retenue à la
surface du support par adsorption physique,
En chromatographie liquide – phase greffée, la phase stationnaire est fixée au
support par liaison chimique. Ce qui permet d’augmenter la stabilité des phases
stationnaires.
Les premières chromatographies de partage étaient exclusivement du type
liquide – liquide, actuellement celles-ci présentent certains inconvénients
comme la dissolution de la phase stationnaire dans la phase mobile qui nécessite
une régénération périodique du support.

Ainsi la chromatographie liquide – phase greffée est devenu prédominante.

Colonnes de chromatographie liquide – phase greffée :

Les supports de la majorité des matériaux de remplissage en chromatographie
liquide – phase greffée sont préparés à partir de silice ou de dérivés à base de
silice. Schéma (1)

La plupart des supports à phase greffée sont constitués de siloxanes

(Si – O – Si) formés par réaction entre la surface hydrolysée et un

organochlorosilane. Par exemple, on a :

CH3 CH3

- Si – OH + Cl – Si – R - Si – O – Si - R

CH3 CH3

Sur le dérivé obtenu, on fixe ensuite des groupements R de polarité variables.

La plupart du temps, le groupement R du siloxane est une chaîne en C8

(n-octyle) 8atomes de carbones, ou en C18 (n-octyledecyle) 18 atomes de

carbones. Schéma (2).

Le taux de greffage se situe entre 25 et 40% selon les phases commercialisées.

Recouvrement final : End capping

Substitution des groupements OH libre par traitement avec du TMCS

( triméthylchlorosilane) pour éviter les interactions hydrophiles parasites.

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 Schéma (1)

Silice greffée contenant des gpts silanol Si-OH libre

Schéma(2): silice greffée par un alkyl à 18 atomes de carbones C18

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Support à phase normale et à phase inversée :
On peut distinguer deux types de chromatographie de partage selon les polarités
relatives des phases mobile et stationnaire.
Les premiers travaux de chromatographie liquide utilisaient des phases
stationnaires très polaires telles que le tri éthylène glycol ou l’eau adsorbés sur
de la silice ou de l’alumine ;
Et des phases mobiles non polaires tel que l’hexane ou l’éther isopropylique. Ce
type de chromatographie est appelé actuellement chromatographie en mode
normal.

L’autre mode de chromatographie est appelé :

Chromatographie en mode inversé ou à phase inversée ou la phase
stationnaire est non polaire, alors que la phase mobile est polaire comme l’eau,
le méthanol, ou l’acétonitrile.

En chromatographie en mode normal, le constituant le moins polaire est élué le

premier, (phase mobile moins polaire)
Par contre dans la méthode en mode inversé, le constituant le plus polaire est
élué le premier, (phase mobile polaire).

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Les supports à phase greffées sont classés en mode inversée lorsque la phase
greffée au support est non polaire, colonne R.P C8 (Octyl) et colonne R.P C18
(Octadecyl) et en mode normal, lorsque la phase greffée contient des
groupements fonctionnels polaires (amino ou cyanopropyl).
R.P : en anglais reversed phase.

Plus de 75% de la chromatographie liquide est effectuée en mode inversée.

(R.P)

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Choix de la phase mobile en H.P.L.C:

La phase mobile est constituée d’un Mélange eau/solvant organique en

proportions variables.

Propriétés recherchées:

- Haute pureté.
- Solubilisation des échantillons.
- Compatibilité avec le détecteur.
- Faible viscosité (η↓).
- Inerte chimiquement.
- polarité.
- Prix abordable.

Il est rare de trouver une phase mobile adéquate constituée par un seul « solvant
pur »,

Généralement, l’obtention d’une bonne séparation nécessite de recourir à un

mélange d’au moins deux solvants.

En changeant la composition de la phase mobile donc sa polarité on agit par

l’intermédiaires des coefficients de distribution sur le facteur de rétention K’
des composés. (paramètre d’optimisation).

Solvants les plus courants en mode inverse:

 Eau: permet d’ajuster la polarité du milieu.

 Méthanol.
 acétonitrile.
 Tétrahydrofuranne THF.

L'utilisation de solvants en HPLC implique le respect de quelques règles

essentielles :

 Utilisation de solvants spécifiques pour l'HPLC (solvants pour analyse).

 Utilisation d'eau déminéralisée exempte de toute trace de matière
organique. Eau ultra pure
 Filtration nécessaire des solvants sur filtres spéciaux. (0,4 à 0,5 μm)
 Dégazage des solvants après filtration

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 Caractéristiques des systèmes en phases normale et inversée

Phase normale Phase inversée

Polarité de la Élevée Faible

phase
stationnaire
Polarité de la Faible à moyenne Moyenne à
phase mobile élevée
Phase mobile Heptane, chloroforme, etc. Mélange
typique additionnés de quantités méthanol/eau
variables de solvants polaires ou
acétonitrile/eau
Ordre d'élution Les moins polaires d'abord Les plus
polaires
d'abord

IV) Application de la chromatographie de partage :

L’utilisation de phases greffées en mode inverse en présence de solvants très
polaires souvent aqueux, le couplage avec les méthodes spectrales se rapproche
du système idéal universel de la chromatographie liquide.
En raison de leur vaste domaine d’application, de leur confort, et de la facilité
avec laquelle les valeurs de α et de K’ peuvent être ajustées par modification de
la nature et de la composition de la phase mobile, ces techniques sont souvent
les premières à être utilisées lors des études exploratoires de nouveaux types
d’échantillons.

Domaine d’utilisation Exemples de mélanges

Pharmaceutique Antibiotiques, sédatifs, stéroïdes,
analgésiques.
Biochimique Acides aminés, protéines, hydrates de
carbone, lipides.
Alimentaire Edulcorants artificiels, antioxydants,
aflatoxines, additifs.
Industrie chimique Aromatiques condensés, surfactants,
combustibles pour fusée, colorants.
Pollution Pesticides, herbicides, phénols, P.C.B.
Chimie légale Médicaments, poisons, alcool dans le
sang, stupéfiants.
Analyse médicale Acides biliaires, VMA et dérivés,
métabolites de médicament, extraits
d’urine, œstrogènes.

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Ultra performance liquide chromatographie : U.P.L.C

- Nouvelle invention de la chromatographie liquide (2004).

- l'UPLC améliore l'HPLC dans trois domaines :

 Résolution chromatographique.
 Vitesse d'analyse.
 Sensibilité.

-Grace à la mise sur le marché des colonnes de granulométrie réduite proposées

par de nombreux fabricants (taille inférieure à 2 μm).

-Simultanément à cette évolution des supports chromatographiques,

l’instrumentation a également été améliorée afin d’offrir une compatibilité
optimale avec les analyses rapides, tout en restant à la fois robuste et précise
pour les analyses quantitatives.

-Les nouveaux systèmes chromatographiques sont ainsi susceptibles de travailler

avec des pressions maximales de l’ordre de 600 voire 1000 bars, afin d’être
compatibles avec les colonnes remplies de petites particules.

-De plus, la plupart des systèmes analytiques sont actuellement équipés de

dispositif de thermorégulation pouvant atteindre des températures proches de
100 °C, car l’utilisation de hautes températures permet de réduire les temps
d’analyse par le biais de la diminution de la viscosité de la phase mobile.

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