L’antibiogramme
1- Le but de l’antibiogramme
Le choix de l’antibiotique est réalisé de maniére très empirique dans la plupart des infections banales
débutantes : le médecin prescrit, en fonction de l’examen clinique, la molécule dont l’efficacité lui paraît la plus
probable (antibiothérapie dite probabiliste). Ce n’est que dans les infections graves, récidivantes ou les échecs
thérapeutiques que l’on fait appel au laboratoire qui réalisera une culture et un antibiogramme.
Un antibiogramme permet de tester sur milieu de culture, l’action de molécules antibiotiques sur une souche
bactérienne.
Il donnera donc des indications sur l’efficacite IN VITRO de ces antibiotiques.
2- Quelques définitions
Quatres notions sont à connaître avant de faire un antibiogramme :
- La CMI ou Concentration Minimale Inhibitrice. Il s’agit de la concentration de l’antibiotique
la plus faible pour laquelle la croissance bactérienne est inhibée (pas de croissance de la
population ; 100% de survivants)
- La CMB ou Concentration Minimale Bactéricide. C’est la concentration de l’antibiotique la
plus faible permettant de détruire 99.99% des bactéries présentes au départ (soit une bactérie
survivante sur 10000). Si CMB < 5 CMI l’antibiotique est très efficace.
Au contraire si CMB > 10 CMI, on le considère peu efficace.
La mesure de la CMI permet de déterminer si une souche est sensible ou résistante à l’antibiotique testé. Pour
chaque antibiotique, on a pu mesurer les concentrations sériques obtenues chez le patient (humain) dans le cadre
d’une posologie normale. Pour que l’antibiotique soit efficace, il faut que la concentration sérique ou
tissulaire obtenue chez le malade soit supérieure à la CMI.
Pour chaque antibiogramme, deux valeurs sont retenues comme références :
- CC ou concentration critique supérieure représentant la concentration maximale moyenne
habituellement obtenue chez le patient.
- Cc ou concentration critique inférieure représentant la concentration minimale moyenne
habituellement obtenue chez le malade.
On peut globalement considérer que, chez le patient et pour la posologie habituelle, la concentration de
l’antibiotique varie entre la concentration critique inférieure et la concentration critique supérieure.
En fonction de ces données, les rapports de la bactérie responsable de l’infection avec l’antibiotique peuvent être
ainsi définis :
la souche est dite RESISTANTE si la CMI est supérieure à CC, c’est à dire « qu’elle n’est pas atteinte
par un traitement réalisé à l’aide de cet antibiotique » (traitement usuel).
la souche est dite SENSIBLE si la CMI est inférieure à Cc, c’est à dire « qu’elle est atteinte par un
traitement usuel réalisé à l’aide de cet antibiotique » (posologie habituelle).
La souche est dite INTERMEDIARE si la CMI est comprise entre Cc et CC, c’est à dire « qu’elle
n’est atteinte par un traitement réalisé à l’aide de cet antibiotique que si la posologie est fortement
augmentée ».
Remarque : Dans le cas d’une souche intermédiaire, augmenter la posologie n’est réalisable en pratique que dans les cas où l’antibiotique
est peu ou pas toxique, de traitement local (plaie, otite) ou d’excrétion sous forme active dans l’organe infecté ‘par exemple pour soigner
une infection du tractus urinaire si excrétion rénale)
3- Interaction entre antibiotiques
Outre le fait que certaines molécules inhibent ou au contraire exacerbent l’effet des antibiotiques (acide, sucre,
thymine, etc…), les différents antibiotiques peuvent interagir entre eux. Quatres grands types d’interactions
peuvent être définis :
- La synergie : chaque antibiotique voit son action augmentée par l’autre.
- L’antagonisme : les effets des deux antibiotiques se contrarient
- L’indifférence : que l’on utilise chaque antibiotique séparement ou en association, le résultat
est le même.
Au laboratoire, l’effet de l’association peut être testé de la facon suivante :
Une culture est réalisée comme pour un antibiogramme par la méthode des disques. On dispose
perpendiculairement deux bandes de papiers imprégnées chacune d’une quantitée adéquate d’antibiotique. Après
mise en culture, on examine les effets dans la zone où les deux antibiotiques sont présents en les comparant aux
zones témoins :
4- Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
Afin de pouvoir conclure sur la sensibilité d’une souche à un antibiotique donné, il faut déterminer sa CMI vis à
vis de cette molécule. Plusieurs méthodes sont à la disposition du laboratoire. On différencie :
- les techniques en milieu liquide (en tube, en microplaque)
- la technique en milieu solide gélosé (Etest)
A les méthodes en milieu liquide
Une solution mère d’antibiotique est diluée de 2 en 2. Le diluant est le bouillon de Mueller-Hinton. La solution
mère est préparée à partir d’une poudre commerciale de titre connu dans un volume adéquat d’eau distillée pour
obtenir la concentration souhaitée (1024 ou 2048 g.mL-1) L’innoculum est préparé à partir d’une culture de 24
heures en milieu liquide. Elle est diluée en bouillon de Mueller-Hinton jusqu'à l’obtention d’une opacité de Mac
Farland 0.5 (ce qui correspond à 10 8 CFU par mL) ensuite cette suspension est à nouveau diluée au 1/1000 pour
donner l’inoculum.
A-1 Macrométhode
Reporter dans une série de tubes stériles 1 mL de
chaque dilution de l’antibiotique. Ajouter dans tous
les tubes le même volume d’inoculum. Incuber 24
heures à la température optimale de la souche à
tester. Observer les tubes après incubation : la CMI
sera la concentration en antibiotique la plus faible
pour laquelle il n’y a pas de croissance visible. En
fait, elle est comprise entre le tube correspondant à
cette définition et le premier tube dans lequel une
croissance est observée.
A-2 Microméthode
Des microplaques à fond en U (plaque à
microtitration) sont utilisables pour la
détermination des CMI. Une plaque 96 puits permet
la détermination de la CMI de 8 antibiotiques vis-à-
vis de la même souche. Dans les cupules des
colonnes 1 à 12, introduire, à l’aide d’une pipette
automatique à embout stérile, 50 l de bouillon
Mueller-Hinton. Introduire 50 l de la solution
d’antibiotique à la concentration de 256 g.mL-1
dans la cupule 1. Reporter de la cupule 1 à la cupule
11 (dilution de 2 en 2), à l’aide d’un microdiluteur
stérile, 50 l de mélange. Les dilutions ainsi
obtenues vont donc de 128 à 0.125 g.mL-1.
Ajouter 50 l d’inoculum (les dilutions seront alors
de 64 à 0.0625 g.mL-1). Incuber 24 h à la
température optimale de la souche. Observer la
plaque est une éventuelle pousse dans chaque
cupule (ou un dépôt au fond de la cupule). La CMI
correspond a la concentration de la cupule ne
présentant pas de croissance.
B La méthode en milieu gélosé
C’est la méthode la plus précise car donnant une valeur vraie de la CMI et non un encadrement de celle-ci. Elle
est connue sous le nom commercial de Etest®.
Une bandelette est imprégnée de quantités croissantes d’antibiotiques. Elle est placée sur une gélose pour
antibiogramme ensemencée classiquement ; l’antibiotique diffuse Contrôle Dilutions important : la zone
en formant un gradient
d’inhibition à la forme d’une ellipse et la lecture est alors directe sur la bandelette là où celle-ci rencontre la zone
d’inhibition.
Cependant connaître précisement la CMI d’une souche vis-à-vis des antibiotiques n’est pas essentiel pour le
praticien. En effet, il lui suffit de situer cette valeur par rapport aux deux concentrations critiques. On réalise
pour cela l’antibiogramme qui permet de positionner la CMI par rapport à CC et Cc.
5- L’antibiogramme
5-1 L’antibiogramme standard en milieu gélosé : méthode des disques
5-1-1 Principe général
Pour réaliser l’antibiogramme par le méthode des disques, la culture bactérienne est ensemencée à la surface
d’une gélose spécialement étudiée, la gélose de Mueller-Hinton, éventuellement additionnée de sang. Des
disques pré-imprégnés d’une dose connue d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique
diffuse à partir du disque en créant un gradient de concentration. La détermination du diamètre de la zone
d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de
résistance de la souche bactérienne en seront déduits.
Au bout de quelques heures, on peut considérer que la relation entre le diamètre de diffusion de l’antibiotique et
le logarithme de sa concentration dans le milieu est linéaire. La mesure du diamètre de la zone d’inhibition de la
bactérie peut donc être reliée à la concentration de l’antibiotique à ce niveau. Cette concentration est la CMI de
la souche pour cet antibiotique. Par ailleurs, un report sur des abaques de lecture (table de référence) permet de
situer cette CMI par rapport a CC et Cc et donc de conclure. Afin d’être dans les conditions de linéarité,
plusieurs régles sont à observer :
le milieu utilisé est le milieu Mueller-Hinton d’épaisseur 4 mm
les disques d’antibiotiques et leurs charges sont standardisés entre les fabricants
La densité de l’inoculum doit être elle aussi standardisée, le diamètre d’inhibition dépendant de l’inoculum
initial. Cette densité doit être telle que la culture obtenue après incubation présente des colonies isolées mais
jointives.
5-1-2 Technique
En pratique, on réalise à partir de l’isolement (souche pure) une suspension bactérienne d’opacité 2 sur l’échelle
de Mac Farland puis on dilue celle-ci en tenant compte du type bacterien :
- pour les bacilles Gram négatif non exigeant (Enterobacteriacea, Pseudomonas) : 1 goutte dans 5
mL d’eau stérile ;
- pour Staphylococcus et Bacillus : 2 gouttes dans 5 mL d’eau distillée stérile ;
- Streptococcus, Haemophilus,etc…: 10 gouttes dans 5 mL d’eau distillée stérile ou pure.
On inonde ensuite la boîte entière avec 3 à 5 mL de la dilution bactérienne en inclinant la boîte dans toutes les
directions. On laisse reposer 2 minutes puis on aspire l’excès soigneusement. On sèche ensuite la boîte à l’étuve
à 37°C pendant 10 à 15 minutes, couvercle légèrement ouvert. On dispose ensuite les disques d’antibiotiques et
on place à l’incubateur. Au bout de 24 h, on lit les différents diamètres d’inhibition et on peut conclure en
comparant ceux-ci aux abaques de lecture.
5-1-3 Interprétation
Les abaques de lecture se présentent sous forme de bandes présentant deux données inversément
proportionnelles : un diamètre d’inhibition en millimètre et la concentration en antibiotique. Pour des
commodités de lecture, seuls sont indiqués les diamètres correspondants aux deux concentrations critiques, ce
qui délimite les zones SENSIBLE, INTERMEDIAIRE et RESISTANTE. Un report du diamètre mesuré sur la
boîte permet de conclure rapidement.
Exemple : 3 souches bactériennes sont testées vis a vis de l’ampicilline. On mesure les diamètres d’inhibition
suivants : souche A 8 mm, souche B 25 mm et souche C 15 mm
B 25 mm C 15mm A 8 mm
Sensible Int. Resistante
La souche A est donc RESISTANTE, la souche B SENSIBLE et la souche C est déclarée INTERMEDIAIRE.
5-2 Antibiogramme en milieu liquide : méthode des deux concentrations critiques
5-2-1 Principe général
La galerie ATB, développée par BioMérieux ®, utilise un principe différent de celui de l’antibiogramme classique
par le méthode des disques. Deux cupules par antibiotiques permettent la réalisation du test pour les deux
concentrations critiques. Chaque cupule contient l’antibiotique sous forme déshydratée. La remise en suspension
est effectuée avec la suspension microbienne réalisée dans du milieu Mueller-Hinton légèrement gélosé.
La pousse dans l’une, les deux ou aucune des cupules permet de conclure quant à la sensibilité de la couche vis-
à-vis de l’antibiotique.
5-2-2 Technique
L’antibiogramme ne peut être réalisé qu’à partir d’une souche pure. A partir de l’isolement, réaliser une
suspension microbienne d’opacité équivalente à 0.5 de l’échelle de Mac Farland. Transférer, sans faire de bulles,
dans le milieu ATB-Médium ou pour Streptococcus, en ATB-S-Médium :
-10 l dans le cas des bacilles Gram négatif
-50 l dans le cas des Staphylococcus et Bacillus
-100 l dans le cas des Streptococcus, Haemophilus, etc…
Inoculer la galerie avec le milieu ATB ensemencé avec 135 l par cupule. Eviter absolument les bulles. Mettre le
couvercle puis incuber 24 h à 37°C.
5-2-3 Interprétation
Vérifier la croissance des cupules témoins. Rechercher pour chaque cupule la présence d’une culture visible. Une
croissance montre que l’antibiotique est inactif sur la souche. Interpréter :
Cc CC
croissance dans les deux cupules : CMI > CC donc souche RESISTANTE
absence de croissance dans les deux cupules : CMI< Cc donc souche SENSIBLE
croissance dans la cupule CC seulement : Cc<CMI<CC donc souche INTERMEDIAIRE
croissance dans la cupule Cc seulement : probleme technique ou contamination.
5.3 Transposition pour le praticien
En se souvenant que les concentrations utilisées pour lire l’antibiogramme sont les concentration sériques
obtenues chez l’humain en bonne santé après injection parentérale de la dose appropriée, les messages découlant
des résultats de l’antibiogramme pour le praticiens sont :
- souche résistante : la probabilité d’obtenir une concentration suffisement élevée in vivo pour contrer
la bactérie est nulle ;
- souche sensible : la probabilité d’obtenir une concentration suffisement élevé in vivo pour contrer
la bactérie est excellente (cela ne signifie pas que l’animal guerrira d’office, car un ensemble
d‘autres paramètres interviennent) ;
- souche intermédiaire : la probabilité d’obtenir une concentration suffisement élevée pour contrer la
bactérie est faible si on ne peut augmenter de manière significative la dose administrée.
