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Réaction de polymérisation en chaine (PCR)
Dr A.ABBAS IV/- Amplification de 'ADN par la réaction de polymérisation en chaine (Polymerase
Chain Reaction (PCR):
IV.1/- Définition
C'est une méthode d’ amplification enzymatique in vitro, rapide et puissante, elle permet de
synthétiser de multiples copies d'une séquence d’ADN cible.
Cependant il faut connaitre une partie de la séquence cible aux deux extrémités de la région &
copier permettant la construction de deux amorces oligo-nucléotidiques complémentaires, qui
hybrident des sites complémentaires situés en orientation inversse sur les deux brins
«’ADN et qui encadrent ta région que l'on veut amplifier (elles vont délimiter la longueur du
fragment & amplifié)
séquence a amplifier
5 ‘Sequence sens
bili 5
amorce sens amorce antisens
, Fae
sequence antisons 5
IV.2/- Déroulement de la PCR.
amplification de la séquence cible se fait par plusieurs cycles
Chaque cycle comporte 3 étapes
a/- Dénaturation : consiste & séparer les deux brins d’ADN en augmentant la température
(30s & 1 minute/ 90 495°)
W/- Hybridation (Annealing): consiste a hybrider les amorces complémentaires aux
extrémités du fragment a amplifier en diminuant la température progressivement (30s 42 min/
50.260 °)
d/- Elongation (Extension) : consiste A copier les deux brins de la séquence cible par une
enzyme Taq polymérase &72° pendant 30s a1 min,
a =
¢ _—=
=. —
3 SSF cermturation Annealing Extension
~
°| Le
onAminee ~ es
eto — Milieu réactionnel
L’amplification par PCR se fait dans un thermo-cycleur qui est programmé pour effectuer
différents cycles (Icycle = dénaturation+ Hybridation+ Elongation). Le nombre de cycles
varie de 28 a 35 selon I ADN a amplifier (@ chaque cycle la quantité d’ ADN est multipliée)
Ainsi, chaque cycle est composé d'une succession de paliers de température prédéterminée, et
une durée bien définic. Ces deux paramétres, température et temps, dépendent de la taille de
la séquence A amplifier de Ia taille et de la composition en désoxyribonucléotides des
amorces,
L’appareil coatient un bloc chauffant o0 I’on insére les tubes contenant notre mélange pour la
réaction de PCR ct oi la température peut varier ts rapidement et trés précisément de °C &
100°C.
chaque micro tube de réaction doit contenir :
‘+ ADN servant de matrice : I’ ADN est extrait & partir de I"échantillon que on veut
analyser (salive, cheveux, cellules, fossile...). Cet extrait purifié, contenant le
fragment d’ADN que ’on souhaite amplifier, peut tre utilisé en PCR
© Deux amorces : Ce sont des fragments courts d’ADN, capables de s‘hybrider de fagon
spécifique, grace 4 la complémentarité des bases, sur l'un des deux brins d:ADN.
Les amorces sont choisies de fagon A encadrer 1a séquence dADN a amplifier. La
taille de ces amorces est généralement d'une vingtaine de désoxyribonucléotides
© Des ANTPs : (Désoxyribonucléotides-Tri-Phosphates) sont des molécules de base, qui
constituent I’ ADN, utilisés par la Taq polymérase pour la synthése du nouveau brin
«'ADN complémentaire.
* Taq polymérase (thermostable) : C’est est une polymérase thermostable capable de
synthétiser un nouveau brin d’ADN complémentaire et antiparalléle & un brin d’ADN
matrice, en partant dune amoree.
© Un tampon contenant du MgCh : qui catalyse la réaction et définit un milieu avec un
pH optimal et une concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de
enzyme. 1V.3/- Applications de Ia PCR :
Elles sont nombreuses, en effet, il existe plusicurs variantes de la PCR, avec des buts
différents, nous citons
- Etude des mutations ponctuelles : ADN amplifié utilisé pour la recherche des mutations
ponctuelles, par les techniques RFLP (recherche des mutations par les enzymes de restriction)
ou par southern blot (recherche des mutations par hybridation de 'ADN_ cible avec une
sonde).
- Séquengage direct des fragments amplifiés
- Diagnostic ces agents infectieux
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