Génomique Le clonage M1 biotech Micr

L a Technologie de l’ADN recombinant qui est autrement dite « CLONAGE » des gènes ou clonage
moléculaire, est un terme général qui comprend plusieurs protocoles expérimentaux aboutissant
au transfert de l’information génétique (ADN) d’un organisme à une autre. Il n’y a qu’une seule
méthode utilisée pour atteindre cet objectif, cependant les technique de recombinaison d’ADN ont
souvent le format suivant

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Figure 1 : technique de clonage par vecteur plasmidique

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Pour le clonage, les deux sources d’ADN, celui qui contient le gène cible et le vecteur de clonage,
les deux doivent être clivés par les enzymes de restriction. Il n’été possible de faire le clonage
moléculaire qu’après la découverte de ces ciseaux moléculaires.

L’ADN cible :

L’ADN cible doit subir une digestion pour but d’isoler le gène ou bien le fragment qu’on veut
cloner. La digestion se fait avec les enzymes de restriction, avec connaissance de l’emplacement du
gène ainsi que les enzymes convenables.

Après la digestion, une électrophorèse sur gel d’agarose est réalisée pour but d’isoler le fragment
ou les fragments voulus. Ces fragments sont excisés du gel, puis traités par de multiples procédures
pour purifier l’ADN de l’agarose et du bromure d’éthidium contaminants afin de lui insérer dans un 15
vecteur.

E
E

Plasmide
E X
avec gène X
E
E

B E E E E E B

E B E

E E

E E
X
E E

E E

Figure 2 : Digestion d’un plasmide par deux enzymes de restriction

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Les plasmides comme vecteurs de clonage :

Les premiers vecteurs utilisés vers le mileu des années soixante-dix, étaient des plasmides bactériens
extraits d’E.coli. Les plasmides sont de petites molécules extra-chromosomiques circulaires, d’une
taille de 2 à 200 kb environ, et existent en de multiples copies (jusqu’à quelques centaines) dans les
cellules d’E.coli. Ils contiennent une origine de réplication (ori), qui leur permet de se répliquer
indépendamment, bien que les polymérases nécessaires pour cette opération soient de la cellule
hôte.

Ils portent généralement :

 Le gène de résistance ampr, qui code pour

l’enzyme β-lactamase, qui dégrade les 16
antibiotiques de la famille de la pénicilline
comme l’ampicilline
 Le gène Tetr, qui code pour une pompe
transmembranaire capable d’éliminer la
4361 pb
tétracycline de la cellule.
 Des sites de restriction uniques pour des
enzymes de restriction bien connus.

Ligation de l’ADN :
Pour insérer un fragment d’ADN cible dans un
vecteur, il est essentiel que les molécules se lient Figure 3: plasmide pBR322
d’une façon covalente. Des enzymes (ADN ligases)
remplissent cette fonction, ces enzymes réparent les cassures qui se trouvent sur l’un des deux brins
d’ADN à condition que l’extrémité 5’ soit dotée d’un phosphate.
Si la cible a été préparée par digestion avec EcoRI, le fragment peut alors être ligaturé dans un
vecteur digéré avec la même enzyme.
Cette réaction de ligature pour engendrer plusieurs produits, le résultat dépend de la
concentration des fragments ainsi que de certaines conditions. Les produits d’intérêt sont les
molécules circulaires ayant intégré le fragment cible au niveau du site de restriction de la molécule
vectrice (avec n’importe quelle orientation), afin de former une molécule recombinante.

Transformation
Les plasmides recombinants et non recombinants étant mélangés, ils doivent ensuite être isolés
les uns des autres et répliqués (clonés) par transfert dans un organisme hôte. Les hôtes les plus
utilisées pour les expériences de clonages simples sont des souches d’E.coli qui possèdent des
propriétés génétiques spécifiques. Une des conditions est l’absence de système de modification-
restriction.
Il a été démontré que es cellules d’E.coli traitées avec des solutions contenant les ions de Ca+2
deviennent susceptibles d’intégrer un ADN exogène, processus appelé « transformation ». Les
cellules prétraitées avec Ca+2 sont appelées cellules compétentes.
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Les cellules ensuite sont incubées dans un milieu de culture afin d’avoir des colonies distinctes qui
sont le résultat d’une division cellulaire à partir d’une seule souche.

Sélection
La sélection se fait en générale comme suit :
 Digestion enzymatique des vecteurs (ou généralement une double digestion) afin de séparer
les fragments issu, ça nous donne une idée sur le polymorphisme qui existe entre les vecteurs ;
 Résistance à l’antibiotique, si un fragment d’ADN cible est ligaturé à l’intérieur de la région
codante de l’un des gènes de résistance, le gène subit une inactivation d’insertion. La présence
du produit recombiné est déterminée par la résistance à l’antibiotique.
 Dépistage bleu-blanc : la procédure la plus sophistiquée qui vise à dépister la présence des
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plasmides recombinants est effectuée à l’aide d’une seule plaque de transformation, elle est
appelée « criblage bleu-blanc ». Elle implique l’inactivation d’un gène qui est dans ce cas-là le
gène lacZ, qui code pour la galactosidase, cette dernière qui est capable de dégrader un
produit synthétique qui est le (X-Gal) donnant un produit bleu