LU3SV611 – Devoir “à la maison” du 20 mai 2020
RAPPELS :
UTILISER LA COPIE DE DEVOIR TÉLÉCHARGEABLE SUR MOODLE POUR VOS
RÉPONSES ET LA REMISE DU DEVOIR.
INDIQUEZ SUR VOTRE COPIE DANS LES LIGNES PRÉVUES À CET EFFET ET POUR
CHAQUE SUJET VOTRE NUMÉRO D’ÉTUDIANT, AINSI QUE VOTRE SECTION ET
NUMÉRO DE GROUPE DE TD.
SUJET DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
Afin de comprendre la régulation de l’expression du gène humain OC, celui-ci a été cloné et sa
structure a été analysée. Ce gène est transcrit sous la forme d’un ARN messager unique de 3 kb et
il comprend 2 exons, le 1er exon de 800 nucléotides est séparé du second par un intron de 15 kb. Cet
ARN messager a été purifié puis hybridé à un fragment d’ADN contenant le gène OC après que celui-
ci ait été dénaturé 10 minutes à 100°C.
Question 1 : Dessinez l’hybride obtenu en indiquant de manière claire la nature de chaque
extrémité et en différenciant bien ADN et ARN.
L’expression du gène OC est étudiée lors de la différentiation cellulaire. Des cellules indifférenciées
sont incubées avec un inducteur permettant une différenciation des cellules en 24 heures.
L’expression du gène OC a été analysée par northern blot et par western blot. (Figure 1).
Figure 1 : analyse par northern blot (A) et par western blot (B) des extraits de cellules traitées par l’inducteur.
Pour le northern blot, des sondes OC et actine ont été utilisées. Pour le western blot, un anticorps anti-OC et
un anticorps anti-actine ont été utilisés. Les résultats obtenus après 24H de traitement sont identiques à ceux
obtenus après 16H.
Question 2 : Identifiez les contrôles et précisez leur rôle dans cette expérience.
Question 3 : Interprétez cette expérience en indiquant comment pourrait être régulée
l’expression de OC.
Le promoteur du gène OC a été identifié (Figure 2). Une première analyse montre que le promoteur
minimal est compris dans une région de 200 paires de bases située entre les sites pour les enzymes
de restriction EcoRI et BamH1 (fragment EB)
Figure 2 : A : carte de restriction du promoteur de
transcription du gène OC. Le promoteur minimal
(boite noire) a été localisé dans le fragment EcoRI-
BamH1 (EB). Le site d’initiation de la transcription est
indiqué par une flèche.
B : plasmides recombinants utilisés dans les
expériences décrites dans la figure 3.
Question 4 : Quelle est la fonction du promoteur minimal ?
Les fragments de restriction HindIII-BamH1 (HB) et EcoRI-BamH1 (EB) ont été clonés dans un vecteur
P_prom_less_Luci, contenant uniquement la partie codante du gène luciférase (Figure 2-B). Les
plasmides recombinants sont introduits dans des cellules indifférenciées ou totalement
différenciées et l’activité luciférase est évaluée 24 heures après transfection (Figure 3).
Figure 3 : activité luciférase mesurée à partir des extraits de cellules
transfectées avec l'ADN de chacun des plasmides.
T : vecteur P_prom_less_Luci vide. p.OC_EB_Luc, vecteur contenant le
fragment EcoRI-BamHI du promoteur OC. p.OC_HB_Luc, vecteur
contenant le fragment HindIII-BamHI du promoteur OC.
Question 5 : Quel est le but de cette expérience ? Question 6 : Interprétez les résultats obtenus.
Question 7 : Quelles informations supplémentaires cette expérience apporte-t-elle sur le mode
de régulation de l’expression du gène OC au cours de la différenciation ?
Une analyse par gel retard a été réalisée avec des extraits de cellules traitées pendant 16H avec
l’inducteur de différenciation. Trois sondes différentes ont été utilisées (Fragment HE, HA ou AE ;
Figure 4)
Figure 4 : autoradiographie du gel obtenu dans
l’expérience de gel retard décrite ci-dessus.
Les cellules ont été incubées avec l’inducteur et des
extraits protéiques à différent temps après addition de
l’inducteur.
Les sondes utilisées sont indiquées à droite des
autoradiographies. T : sonde seule sans extrait
cellulaire.
Question 8 : Rappelez le principe d’une expérience de retard sur gel. Donnez le but de cette
expérience dans le cas du gène OC.
Question 9 : Interprétez les résultats obtenus. Sont-ils compatibles avec vos hypothèses
précédentes ?
Question 10 : faites un schéma récapitulant la régulation du gène OC durant la différenciation.
