Rapport de TP de Pesticide et Phyto-Protection :

Etude du mode d’action de l’atrazine et de sa détoxication

Bonne Katia ; M1 VRV ; Di Pascoli Thomas

Mots clés : Détoxication ; herbicide ; atrazine ; glutathion-S-transferase ; Zea Mays ; Spinacia

oleracea ; photosystème II ; Transport d’électrons.

L’atrazine (2-chloro-4-éthylamine-6-isopropylamine-s-triazine) est un herbicide appartenant à la

famille chimique des triazines (caractérisées par un cycle s-triazine). C’est une substance interdite dans
l’Union Européenne depuis 2004. Elle a longtemps été utilisée pour lutter contre la flore adventice dans les
grandes cultures comme le maïs, c’est cette utilisation prolongée qui a entrainé l’apparition de plantes
résistantes à cet herbicide.
Différentes résistantes existent, une mutation en position 264 sur le gène psbA(une sérine remplacée
par une thréonine) entraîne une résistance chez Solanum tuberosum L. Cette mutation change le site de
fixation de l’atrazine qui est la quinone QB de la chaine de transport d’électrons du photosystème II (PSII)
dans les chloroplastes.
Un autre mécanisme de résistance plus important encore et d’autant plus étudiée est le mécanisme de
détoxication de la glutathion-S-transférase (GST) qui complexe le glutathion (GSH) avec l’herbicide ou le
xénobiotique par le soufre de la cystéine du GSH. Ce mécanisme a été décrit chez Abutilon theophrasti puis
chez d’autres plantes comme le maïs ou le sorgho, ces plantes sont devenues résistantes en augmentant ou
améliorant ses capacités de fixation et de détoxication de l’atrazine par le GST. De nombreuses GST ont été
identifiées, les isozymes responsables de la détoxication de cet herbicide sont chez les plantes de la classe
thêta et de type I (pour le maïs).
C’est ce mécanisme de détoxication que nous avons étudié durant ces TP, ainsi que le mode d’action
de l’atrazine sur le transport des électrons dans les chloroplastes. Pour se faire nous avons dans un premier
temps cherché à déterminer le I50 de cet herbicide pour en déterminer la toxicité dans une plante sensible
qu’est l’épinard (Spinacia oleracea), et dans une plante résistante qu’est le maïs (Zea Mays). Puis dans un
second temps nous avons cherché à déterminer l’activité enzymatique de la GST dans le maïs afin de
calculer sa capacité à détoxiquer l’herbicide et ce avec deux protocoles différents pour les comparer.

Matériels et méthodes :

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Résultats :
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! - Dosage des chlorophylles : Après préparation des chloroplastes nous avons pu doser les
chlorophylles
! présentes dans notre solution par spectrophotométrie à 645 et 663nm. Nous obtenons les
résultats suivants :
! A = 0,243
645
! A663 = 0,615 CTot = CA + CB = 9,84 µg/mL
! CA = (12,7 A663 – 2,69 A645) = 7,15µg/mL CTot = 196,9 µg/mL dans la solution mère.
CB = (22,9 A645 – 4,68 A663) = 2,68µg/mL

- Détermination du I50 : Nous avons grâce à ce dosage testé différentes concentrations d’atrazine
(avec toujours 30 µg/mL) sur le transport d’électrons. Ceci se fait par le biais de la réduction du DCPIP dans
la solution qui est dosée par spectrophotométrie à 600nm, plus la concentration d’atrazine est élevée, moins
le DCPIP est réduit et donc moins l’absorbance est élevée. On obtient la courbe page suivante en figure 1.
L’absorbance du témoin à l’obscurité est de 0,614 ce qui nous permet de calculer la concentration pour une
absorbance de 0,307 et on obtient I50 = 0,162µM pour l’épinard. Grâce aux donnés des autres groupes nous
obtenons une moyenne du I50 :
I50(Epinard) = 0,182 µM I50(Maïs) = 0,226 µM
Ces concentrations d’atrazines sont celles nécessaires pour inhiber 50% du transport d’électrons chez ces
plantes.
I50R/I50S = 1,24

- Dosage des protéines : Nous avons ensuite voulu doser les protéines présentes dans les racines et
dans les feuilles de plantules de maïs pour ensuite calculer l’activité enzymatique de la GST. Nous avons
fait une gamme étalon avec du BSA (Figure 2) à 595nm.
L’équation de la droite nous permet d’obtenir les concentrations en protéines suivantes :
Racine (protocole 1) = 0,58 µg/µL Feuille (protocole 1) = 1,19 µg/µL
Racine (protocole 2) = 1,24 µg/µL Feuille (protocole 2) = 5,97 µg/µL
 Figure  1:  Mesure  de  l'intensité  de  transport  
d'électrons  selon  la  concentration  en  atrazine  
0,7  
0,6  
0,5  
A600nm  

0,4  
0,3  
0,2   y  =  0,1207ln(x)  +  0,5265  
R²  =  0,86368  
0,1  
0  
0   0,2   0,4   0,6   0,8   1   1,2  
Concentration  en  atrazine  µM  

Figure  2  :  Gamme  étalon  de  protéines  à  595nm  

0,6  
0,5  
0,4  
A595nm    

0,3  
0,2   y  =  0,0102x  
R²  =  0,91108  
0,1  
0  
0   10   20   30   40   50   60  
μg  de  protéines    

- Détermination de l’activité enzymatique GST : Celle ci a été faite en mesurant par spectrométrie à
340nm la formation de complexes CDNB-glutathion en fonction des GST présentes dans les différents
extraits. Nous obtenons les pentes suivantes :
Racine (protocole 1) = 0,0857 dA/min Racine (protocole 2) = 0,333 dA/min
Feuille (protocole 1) = 0,0375 dA/min Feuille (protocole 2) = 0,166 dA/min
Témoin (protocole 1) = 0,012 dA/min Témoin (protocole 2) = 0,000 dA/min

On peut ainsi en déduire l’activité enzymatique par les calculs suivants :

!"#$"∗!!"∗!"!
Protocole 1 : AE (nmoles de complexes formés/min/mg de protéines) =  
!∗!∗!,!"#∗   !"#$é!"#
!"#$"∗!!"∗!"!
Protocole 2 : AE (nmoles de complexes formés/min/mg de protéines) =  
!∗!∗!,!∗   !"#$é!"#

Avec 1mL et 3mL les volumes totaux des solutions ; L la longueur de la cuve (1cm) ; ε le coefficient
d’extinction molaire du CDNB (9,6mM-1.cm-1) ; 103/0,025 et 103/0,1 les facteurs de dilutions. On obtient
ainsi les résultats suivants :
AE(GST)Racine (protocole 1) = 615,66 nmoles de complexes formés/min/mg de protéines
AE(GST)Racine (protocole 2) = 839,96 nmoles de complexes formés/min/mg de protéines
AE(GST)Racine (moyenne) = 727,81 nmoles de complexes formés/min/mg de protéines
AE(GST)Feuille (protocole 1) = 131,30 nmoles de complexes formés/min/mg de protéines
AE(GST)Feuille (protocole 2) = 86,89 nmoles de complexes formés/min/mg de protéines
AE(GST)Feuille (moyenne) = 109,09 nmoles de complexes formés/min/mg de protéines

Discussion :

L'atrazine est donc un produit phytosanitaire longtemps utilisé en Europe puis interdit depuis 2004 pour des
raisons de toxicité pour l'environnement en plus de sa phytotoxicité.

L’atrazine, cette molécule découverte par la société Ciba-Geigy à la fin des années 50, a pendant
longtemps eut des mécanismes d’action inconnus. C’est l’arrivée de plantes spontanément résistantes à cet
herbicide qui a permit la compréhension de ses mécanismes d’action.
C’est une molécule qui a la capacité de
se fixer compétitivement sur le site actif de la
protéine D1 de la plastoquinone B dans la
membrane des thylakoïdes. Elle inhibe donc la
photosynthèse en empêchant les transports
d’électrons dans le photosystème II (PSII), ce
blocage entraine une accumulation d’électrons
dans le chloroplaste, bloquant ainsi toute la
machinerie du PSII et donc de la
photosynthèse, entrainant la mort de la plante.
Cette cible peut être modifiée par la plante par
une mutation du gène psbA (codon 264
AGTà ACT) entrainant une résistance. Cette
molécule peu être absorbée au niveau des [6]  Figure  3  :  Mode  d’action  de  l’atrazine  au  sein  des  plantes  
feuilles mais est généralement absorbée par
les racines et transportée ensuite par les vaisseaux de xylème, la concentration d’atrazine à la surface du sol
doit donc être suffisante pour inhiber toutes les protéines D1 pendant une période plus ou moins longue
selon l’effet désiré.
La toxicité de l’atrazine a put être mesurée expérimentalement durant ces TP, grâce à la détermination
du I50, cette valeur exprime la concentration nécessaire pour inhiber 50% de la photosynthèse (du transport
d’électrons pour être plus précis). Plus cette concentration est faible, plus la plante est sensible, on peut ainsi
voir que l’épinard est sensible à cet herbicide puisque son I50 est de 0,182µM alors qu’une plante résistante a
un I50 de l’ordre de 3 µM.
Nous avons pu calculer ces concentrations grâce au 2,6-dichlorophénolindolphénol (DCPIP) qui est un
accepteur artificiel d’électrons, plus il y a d’atrazine, plus le transport des électrons est bloqué, et donc
provoque une accumulation de ces derniers qui sont alors capable de réduire le DCPIP en un produit
incolore par la réaction suivante :

DCPIP  oxydé  (Bleu,  λmax  =  600nm)   DCPIP  réduit  (incolore)  

[7]   Figure  4  :  Réaction  de  réduction  du  DCPIP.  

La question peut se poser sur le fait que le I50 du maïs que nous avons obtenu est tout aussi faible que
le I50 de l’épinard (0,226µM) alors que le maïs est une plante résistante. Une étude de Gronwald et Al. ont
observé le même résultat, ceci est due à la méthode d’analyse utilisée, en effet la décoloration du DCPIP est
due à l’accumulation d’électrons dans la solution, or ils ont montré que la protéine D1 (la cible) n’avait pas
de tolérance particulière pour l’atrazine car le facteur de tolérance entre une plante sensible et résistante était
de seulement 0,18µM. Cette observation nous permet de dire le maïs n’est pas résistant par une mutation du
site de fixation de l’atrazine comme pour le mutant de Solanum tuberosum analysé par Smeda et Al. Le maïs
a donc développé un autre moyen de détoxiquer cet herbicide.
Cette technique alternative de lutte est la détoxication par la glutathion-S-transférase = GST, une
enzyme de détoxication par formation de complexes entre le glutathion (GSH) et le xénobiotique (ici
l’atrazine). Cette conjugaison confère une nouvelle conformation au xénobiotique empêchant ainsi sa
fixation sur D1 et empêchant l'inhibition compétitive avec la plastoquinone. Il existe 5 classes de GST
(alpha, mu, pi sigma et thêta), selon leurs spécificités de substrats, leurs réactivités immunologiques
croisées, et leur structures primaires. Le site actif de ces enzymes est constitué d’un site de liaison au
glutathion (site G) et un site de fixation au xénobiotique (site H), toutes les GST des plantes sont de la classe
thêta, la première analysée provenait du sorgho. C’est la GST-I qui chez le maïs a une activité de
détoxication notable contre l’atrazine. Le maïs possède une très forte activité GST contrairement à l'épinard,
mais chaque plante est plus ou moins résistante ou sensible selon les composés, c'est donc un mécanisme
spécifique de tolérance. Le 2,4 dinitrochlorobenzène (CDNB) qui est un substrat artificiel des GST, a été
utilisé durant ce TP afin de mesurer l’activité GST du maïs, un des avantages de cette substance est qu’elle
est dosable par spectrophotométrie car possède un maximum d’absorbance à 340nm.

A   B  
[3]  Figure  5  :  Substrats  utilisés  pour  mesurer  l’activité  GST.  
Les  sites  d’attaques  de  la  GSH  sont  représentés  par  une  flèche.    
A  :  CDNB  (R1=  Cl  ;  R2=  NO2)  ;  B  :  Atrazine.  

Nous avons pu observer une plus forte activité enzymatique dans les racines que dans les feuilles (7x
plus) alors qu'il s'agit d'un herbicide agissant sur la photosynthèse. Ceci s'explique par le fait que cet
herbicide est systémique ascendant. Il entre par les racines pour être transporté vers les parties aériennes de
la plante. En inhibant son transport au niveau des racines, la plante se protège bien plus efficacement car le
nombre de protéine D1 bloquées sera moindre due à la détoxication de l’herbicide durant son absorption et
sa migration dans la plante. C'est pourquoi une plus forte activité GST dans les racines s'avère plus
qu’essentielle.
Nous pouvons aussi remarquer que le protocole 2 nous donne de meilleurs résultats pour les racines
mais pas pour les feuilles, ces expériences aurait due être moyennées pour avoir des résultats significatifs de
chaque protocole mais dans l’ensemble on peut dire que les 2 protocoles se valent même si le second a
l’avantage d’utiliser moins de matériel végétal pour un résultat équivalent, l’étape critique du protocole 2 est
la reprise du surnageant après la première centrifugation qui du fait de son volume trop petit rend difficile le
prélèvement de l’extrait brut de protéines, une étape préalable de filtration pourrait être très fortement utile
mais les résultats ne serait pas forcement au rendez-vous, donc une piste à tester.

Conclusion :
Grâce à cette étude nous pouvons conclure que l’atrazine est un herbicide systémique ascendant qui
est majoritairement absorbé par les racines mais qui agit sur le transport d’électrons dans le photosystème II
en bloquant le site de fixation de la plastoquinone B sur la protéine
D1. C’est cette compétition entre l’atrazine et QB qui est la base du
mode d’action de cet herbicide et c’est pourquoi il était utilisé
jusqu’en 2004 contre la plupart des plantes adventices, mais
uniquement sur des cultures de plantes résistantes telles que le
maïs ou le sorgho. Cette dernière a notamment été interdite pour sa
toxicité croisée sur les insectes, et les animaux avec des pollutions
durables des eaux et des sols. Différentes stratégies existent
désormais pour dépolluer cet herbicide par phytorémédiation ou [6]   Figure  6  :  Forme  conjuguée  de  
par des organismes bactériens. l’atrazine  au  glutathion,  non  toxique.  
La phytotoxicité de cette molécule mesurée par son I50 n’est
pas représentative, puisque le maïs est une plante résistante mais son I50 est équivalent à celui de l’épinard
qui lui y est sensible. Il faut donc faire l’analyse du I50 et en plus de l’activité GST de la plante, puisque 2
grands modes de résistance existent, une modification du site de liaison de l’atrazine pour obtenir une
tolérance plus élevée, ou bien une augmentation de l’activité GST et de GSH pour détoxiquer la molécule.

[2]   Figure  7  :  Compétition  sur  le  site  de  la  protéine  D1  entre  la  plastoquinone  B  et  l’atrazine.  
A  :  Site  de  liaison  de  la  plastoquinone  B  à  la  protéine  D1  ;  B  :  site  de  fixation  de  l’atrazine  sur  la  protéine  D1.  
NB  :  SER  264  =  codon  muté  chez  Solanum  tuberosum  AGTàACT  qui  donne  résistance  à  l’atrazine.    

Ce système est assez efficace pour l’atrazine puisque les racines ont une activité enzymatique qui
permet de former environ 1mmole de complexes atrazine/GSH par jour et par mg de protéines. Cependant
ce système n’a pas la même efficacité pour tous les herbicides et des mutants résistants de la flore adventices
apparaissent très rapidement lorsque les produits phytosanitaires sont utilisés à grande échelle et sans turn-
over de type d’herbicide telle l’adaptation des bactéries aux antibiotiques.

Références :

 [1] Atrazine resistance in a velvetleaf (Abutilon theophrasti) biotype due to enhanced

glutathione S-transferase activity.
MP. Anderson ; JW. Gronwald - Plant physiol. (1991) 96 : 104 – 109.
 [2] Atrazine resistance in a velvetleaf (Abutilon theophrasti) biotype due to enhanced atrazine
detoxification.
MP. Anderson ; JW. Gronwald ; C. Yee – Pesticide biochemistry and physiology. (1989) 34/2 : 149 – 163.
 [3] Taxonomic distribution of plant glutathione S-transferases acting on xenobiotics.
S. Pflugmacher ; P. Schröder ; H. Sandermann Jr. – Phytochemistry (2000) 54 : 267- 273.
 [4] Structures of herbicides in complex with their detoxifying enzyme glutathione S-transferase
- Explanations for the selectivity of the enzyme in plants.
L. Prade ; R. Huber ; B. Bieseler – Structure with Folding & design (1998) 6/11 : 1445 – 1452.
 [5] A serine-to-threonine substitution in the trazine herbicide-binding protein in potato cells
results in atrazine resistance without impairing productivity.
RJ. Smeda ; PM. Hasegawa ; PB. Goldsbrough ; NK Singh ; CS Weller – Plant physiol. (1993) 103 : 911 –
917.
 [6] Fate of atrazine in environment a review.
S. Canard (2003) http://oatao.univ-toulouse.fr/839/1/andro_839.pdf
 [7] http://fr.wikipedia.org/