L’étude de l’activité anti-nociceptive et anti-inflammatoire du

Diclofénac de sodium sur des modèles expérimentaux induits chez

les souris NMRI

Slimani Radia* Bouriche Ibtissem1, Boussadia Nadjiba Imene2 Hassaiem Amira3, Mouloud Fettouma4,
Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene
a
Département de biologie cellulaire et moléculaire Faculté des sciences biologiques, Université des sciences de la technologie Houari
Boumediene, Bab Ezzouar, Alger, Algérie

KEYWORDS ABSTRACT

In vivo Les études pharmacologiques in vivo réalisées sur des modèles animaux vivants permettent de suivre
plusieurs processus biologiques, telles que les réactions inflammatoires, et les effets pharmacologiques de
Diclofénac de sodium plusieurs molécules thérapeutiques.

AINS Le Diclofénac de sodium est un anti-inflammatoire non stéroïdien AINS, connu par son effet anti-nociceptif
et anti-inflammatoire, dont son mode d’action n’est pas entièrement déterminé mais qui semble inhiber la
Carraghénine synthèse des Prostaglandines en interférant l’action des deux iso formes de la cyclo-oxygénase1 et 2 (cox-1
et cox-2).
Acide acétique
Ce qui fait l’objectif de cette étude réalisée sur des souris NMRI où ces deux effets pharmacologiques ont
Inflammation aigue été testés sur deux modèles expérimentaux induits par des agents chimiques, le premier modèle induit par
l’acide acétique (facteur de douleur) injecté par voie Inra Péritonéale afin d’étudier l’effet antalgique du
Œdème
Diclofénac de sodium .

Douleur
Le deuxième modèle induit par la Carraghénine connue par son immunogénicité injectée par voie Intra
Plantaire afin d’étudier l’effet anti-inflammatoire du Diclofénac de sodium sur l’œdème plantaire, suivie
Anti- nociceptive
d’un dosage biochimique du No à partir des pattes enflammées.

Anti- inflammatoire

Introduction A) L’activité anti-nociceptive du Diclofénac de

sodium (Cramping Test)
L’inflammation est un mécanisme de défense de première ligne
face à une agression. Elle a pour objectif de reconnaître, détruire Objectif
et éliminer toutes les substances qui lui sont étrangères. La
détection de l'agression par l'organisme entraine une arrivée L’étude de l’activité anti-nociceptive du Diclofénac de sodium sur
massive de cellules immunitaires sur le site endommagé. Pour la douleur induite par 100 ml d’acide acétique injecté par voie
cela, les vaisseaux sanguins de la zone se dilatent et les cellules intra-péritonéale par visualisation des crampes chez des souris
immunitaires sur place produisent des molécules qui activent et NMRI.
attirent leurs congénères en fonction de la menace identifiée. C'est
ce qui cause les rougeurs, gonflements « l’œdème », douleurs et Matériel et Méthodes
sensation de chaleur souvent présente sur le site de l'inflammation.
Matériel biologique
La présente étude a pour objectif d’étudier l’effet anti-
inflammatoire et anti-nociceptif du Diclofénac de sodium sur 19 Souris NMRI de poids moyen de 25g, fournies par l’animalerie
l’œdème plantaire induit par la Carraghénine et la douleur au de la FSB-USTHB
niveau de la cavité péritonéale induite par l’acide acétique
(cramping test), respectivement chez les souris NMRI. Réactifs

Le principe de cette étude consiste à évaluer l’activité du Acide acétique (v=100 µl pour chaque souris)
Diclofénac de sodium tout en suivant l’évolution de l’œdème
plantaire, et la visualisation de douleur (cramping test par l’acide Diclofénac de sodium (1,1 mg/kg et 2,2 mg/kg) dissous dans NaCl
acétique) en présence et en absence de l’AINS.
Eau physiologique 9 pour mile
Equipements de laboratoire Batches Pain inhibition %
Seringue (à insuline), sonde à gavage et tube flacon Positive control 0%
Dose 1 69%
Dose 2 74%
Tableau 02 : Pain inhibition pourcentage chez les lots
témoins positifs, dose01 et dose 02

Calcul des pourcentages d’inhibition de douleur :

86 représente 100% de douleurs (pas d’inhibition de douleur car

les souris ne sont pas Prétraitées par le Diclofénac de sodium)

On cherche tout d’abord le % de douleur chez les deux lots dose01

et dose02 : (réglé de trois)

Lots essai deose01 : 27 représente 31% de douleur, donc

100-31=69% d’inhibition de douleur.

Lots essai dose02 : 23 représente 26% de douleur, donc

100-26=74% d’inhibition de douleur.

80%
70%
60%
50%
Fig1 : souris et matériel utilisé 40% 74%
69%
30%
Protocol
20%
Le travail a été effectué sur 4 lots de souris qui sont les suivants : 10%
0% 0%
Lot témoins négatif (4 souris) : 100µl Na Cl, gavage gastrique.
TEMOIN + DOSE1 DOSE2
Lot témoins positif (5 souris) : 100µl acide acétique (injection
IP) + 100µl Na Cl, gavage gastrique. % inhibition lots Colonne1 Colonne2

Lot essai dose 01(5 souris) : 100µl de dico à 1,1 mg/kg, gavage
gastrique (15 min avant l’injection d’acide acétique) +100µl
Fig2 : les pourcentages d’inhibition de douleur chez le lot
d’acide acétique (injection IP)
non prétraité par le Diclofénac de sodium et chez 2 lots
Lot essai dose 02 (5 souris) : 100µl de dico à 2,2 mg/kg, gavage prétraités par deux doses de Diclofénac de sodium (1.1 mg/kg
gastrique (15 min avant l’injection d’acide acétique) +100µl et 2.2 mg/kg)
d’acide acétique (injection IP)
Interprétation de la fig. 2
Visualisation et mesure de douleur :
Lot témoin + : pas d’inhibition de douleur car pas prétraité par
La douleur se présente sous forme de torsions abdominales car le Diclofénac de sodium.
l’acide acétique agit à l’extérieur de l’estomac. Compter pour
chaque souris le nombre de crampes abdominales pendant 30 Lot dose1 : inhibition de douleur est de 69%
minutes juste après visualisation de la première crampe.
Lot dose2 : inhibition de douleur augmente jusqu’à 74%
Résultats
Le Diclofénac de sodium inhibe la douleur de façon dose
dépendante.

Tableau1 : montre que les moyennes de crampes sont très et plus

Batches Cramps mean ± sd importantes chez le groupe témoin +, que chez les groupes
Positive control 86 ±13 ,34 prétraités avec le Diclofénac de sodium (1.1 mg/kg et 2.2 mg/kg)
ces dernières diminuent de façon dose dépendante chez les deux
Dose 1 27 ±10 ,41
groupes dose 1 et dose 2.
Dose 2 23±10,24
Tableau 01 : Cramps mean±sd dans les lots témoins positif,
dose 01 et dose 02
B) L’activité anti-inflammatoire du Diclofénac de 2 Dosage biochimique du NO
sodium et dosage biochimique de NO
a Dosage du NO sérique :

Objectif L’étude expérimentale de l’activité anti- Les souris sont euthanasiées avec une concentration Sub –létale
inflammatoire du Diclofénac de sodium sur l’œdème plantaire
de chloroforme, le sang est ensuite prélevé rapidement en
résultant d’une inflammation aiguë induite par Carraghénine à
effectuant des pontions cardiaques avec une seringue imprégnée
1% injectée par voie intra-plantaire au niveau de la patte droite
postérieure des souris NMRI. d’EDTA dans des tubes eppendorfs étiquetés contenant de
l’EDTA.

Matériel et Méthodes Le sang est centrifugé à 2500rpm pendant 10 min à 4c°, puis les
plasmas sont récupérés minutieusement dans des tubes étiquetés
Matériel biologique et conservés a -20c° pour le dosage ensuite.

10 Souris NMRI de poids moyen de 25g, fournies par b Dosage du NO tissulaire

l’animalerie de la FSB-USTHB.
Les pattes enflammées sont coupées et conservées à -20c° dans
Réactifs des tubes étiquetés contenant u NaCl à 0.9 % à 4c°.

Carraghénine à 1% (v=50µl) Homogénéisation des pattes

Diclofénac de sodium (v=500µl, c=2.2 mg/kg) -Ajouter 2ml de Tpp etTX100 à chaque échantillon

Eau physiologique Na Cl (v= 500µl) - Homogénéiser les pattes (3 cycles d 15 sec à 9000tr/min avec
une pause de 10 sec entre chaque cycle)
Chloroforme CHCL3
-Effectuer des cycles de congélation et de décongélation (3 cycles)
Réactif de GRIESS (0.1% N-1 naphtylne diamine dihydrochloride
1% aminobenzene- sulfonamide dans 2.5 % H3PO4) - Sonication 3 cycles de 15 sec avec une pause de 10 sec entre
chaque cycle.
Equipements de laboratoire
-Centrifuger à 10000rpm pendant 10 min.
Seringue (à insuline), micropipette, microplaque, lecteur de
microplaque (spectrophotomètre), sonde à gavage et tube flacon, -Récupérer les surnageants pour le dosage biochimique et
centrifugeuse, aiguilles, broyeur, trousse de dissection, plaque de éliminer les culots.
styromousse enroulée par papier d’aluminium, tubes eppendorfs,
pied à coulisse (déjà représentés dans la fig1) Dosage de monoxyde d’azote (surnageant et sérum)

Protocol Déprotéinisation des échantillons :

-Ajouter 1 volume de méthanol à 1 volume d’échantillon (sérum

1 mesure de l’œdème plantaire et surnageant) (100µl) dans des tubes eppendorfs.

L’étude a été effectuée sur 3 lots de souris qui sont les suivants : -Centrifuger à 90000 rpm pendant 10 min et récupérer les
surnageants.
Lot témoin (3 souris) : 500µl NaCl, gavage gastrique + injection
Inta-plantaire de 50µl de NaCl (30 min après gavage). -Ajouter 50µl de réactif de Griess à 50µl du surnageant à l’aide
d’une micropipette pour chaque échantillon.
Lot Carraghénine (3 souris) : 500µl NaCl, gavage gastrique +
injection Inta-plantaire de 50µl de Carraghénine à 1% (30 min -Mettre chaque échantillon dans un puis de la microplaque (96
après gavage). puis).

Lot Carraghénine/Diclofénac (4 souris) : gavage gastrique de -Incuber la microplaque à l’obscurité pendant 10 min.
500 µl de Diclofénac à 2.2 mg/kg 30 min avant l’injection Inta-
plantaire de 50µl de Carraghénine à 1% (30 min après gavage). -Effectuer la lecture à une longueur d’onde = 550nm à l’aide d’un
lecteur de microplaques.
NB : des mesures de V0 ont été effectuées pour chaque souris de
chaque lot avant toutes injections. NB : Le blanc = 50µl de réactif de Griess.

- Mesure des V1 (t1=15 min), V2 (t2= min), V3 (t3=45 min) pour Résultat
chaque souris à l’aide d’un pied à coulisse.
t
-Calcul des D (V1-V0), D (V2-V0), D (V3-V0) pour chaque mice 0min 15min 30min 45min
souris et leur moyenne dans chacun des 3 lots. 1 0.2
0.2 cm 0.2 cm 0.2 cm cm
-Tracer DV=f(t) 2 0.2
0.2 cm 0.2 cm 0.2 cm cm
-Calculer le pourcentage d’inhibition à t3 d chez le lot prétraité et 3 0.2
le lot Carraghénine. 0.2 cm 0.2 cm 0.2 cm cm
 Tableau 03 : mesure de l’œdème plantaire chez le lot témoin Tableau 08 : DV du Carraghénine/Diclofénac et leur
avant et après injection de NaCl moyenne.

D D D D Mean
mice (v1-v0) (v2-v0) (v3-v0) Batches D (v1-v0) D (v2-v0) D (v3-v0)
1 Témoin (-) 0 mm 0 mm 0 mm
0mm 0mm 0mm 0mm
2 car 1.4 mm 2.23 mm 1.2 mm
0mm 0mm 0mm 0mm Car+Dic
3 1.075 mm 0.775 mm 0.725 mm
0mm 0mm 0mm 0mm Tableau 09 : moyennes générales des DV aux niveaux des 3
Tableau 04 : DV du lot témoin et leur moyenne. lots dans t1, t2 et t3.

Calcul du pourcentage d’inhibition de l’inflammation à t3

pour l lot car et car/diclo
time 0min 15min 30min 45min
mice 1.2 représente 100% de la douleur, dont (par règle de trois)
1 2mm 3mm 3.8mm 3mm 0.725 représente 60.42% de douleur (pour le lot prétraité).
2 1.8mm 3.2mm 4.8mm 3.2mm
3 2mm 3.8mm 4.5mm 3.2mm De ce fait le pourcentage d’inhibition est = 100-60.42= 39.58%
Tableau 05 : mesure de l’œdème plantaire chez le lot témoin approximativement 40%.
avant et après injection de le Carraghénine à 1%.

%inhibition aprés 45 min dans le lot car et lot

50% car/diclo

mice D (v1-v0) D (v2-v0) D (v3-v0) 40%

1 1mm 1.2mm 1mm
2 1.4mm 3mm 1.4mm 30%
3 1.8mm 2.5mm 1.2mm
Mean 1.4mm 2.23mm 1.2mm 20%
Tableau 06 : DV du lot Carraghénine et leur moyenne.
10%

0%
Mice 0 min 15 min 30 min 45 min car car/diclo

1 2 mm 3,1 mm 2,8 mm 2,8 mm %inhibition

Fig03 : le pourcentage d’inhibition de l’inflammation de

2 2 mm 3,4 mm 3 mm 2,9 mm
l’œdème plantaire après 45 min chez le lot Carraghénine et le
lot prétraité par le Diclofénac de sodium à 2.2 mg/kg.
3 2 mm 3,2 mm 2,8 mm 2,5 mm

4 2,5 mm 3,3 mm 3 mm 2,9 mm

Tableau 07 : mesure de l’œdème plantaire chez le lot

Carraghénine/Diclofénac avant et après injection de le
Carraghénine à 1%.

mice D (V1-V0) D (V2-V0) D (V3-V0)

1 1,1 mm 0,8 mm 0,8 mm

2 1,2 mm 1 mm 0,9 mm Fig04 : la courbe d’étalonnage DO=f ([NO]), DO mesurée à

550nm, concentration en µm/µL
3 1,2 mm 0,8 mm 0,8 mm

4 0,8 mm 0,5 mm 0,4 mm

mean 1,075 mm 0,775 mm 0,725 mm

 Sérum Souris Souris2 Souris3 Souris4
1
Témoin 4.8 6 4.8
Carraghénine 4.8 8.4 16.4
Diclo/Carr 8 6.4 5.6 7.6
Tableau10 : Les concentrations du NO sérique (µm/µl) dans
chaque souris des 3 lots
homogénat Souris 1 Souris2 Souris3 Souris4
Témoin 4.6 2.8 5.6
Carraghénine 4 6.8 3.2
Diclo/Carr 8.4 8.8 10.4 12.8
Tableau11 : Les concentrations du NO tissulaire (µm/µl)
dans chaque souris des 3 lots

Fig07 :l’évolution de l’œdème plantaire chez les 3

lots de souris, mDV=f(t)

Interprétation

Évolution de l’œdème et pourcentage d’inhibition de

l’inflammation

Fig7 : lot Carr : l’œdème atteint une taille maximale de 2.23 mm,
cette dernière chez le lot prétraité est de 1.075 mm.

Lot témoin : le V de la patte reste le même (pas d’œdème).

Fig3 : lot Carr : pas d’inhibition de l’inflammation, lot prétraité :

Fig05 : les concentrations du No au niveau de l’œdème
une inhibition de l’inflammation d’approximativement 40%
plantaire en µm/µl chez les 3 lots de souris
Conclusion : le Diclofénac de sodium fait diminuer la taille de
l’œdème de façon significative, il inhibe l’inflammation induite
par Carraghénine de l’œdème de 40% et de fonçons temps
dépendante (tableau 9) chez le lot prétraité par rapport au lot
Carraghénine.

Concentrations tissulaires et sériques du NO

Courbe d’étalonnage (fig04) : Y=0.0025X et r2= 1, calcul des

concentrations où [No]= DO/0.0025.

Fig05 : représente les concentrations du NO tissulaires en fonction

des 3 lots dont le lot témoin représente les concentrations les plus
basses de No au niveau des pattes non enflammées.

Le lot prétraité par le Diclofénac de sodium représente les

concentrations les plus élevées (que le lot car et lot témoin) qui
attentent 12.8µm/µL, à la différence de 50% du lot Carraghénine
Fig06 : les concentrations sériques du NO en µm/µl chez les 3 lots de souris
avec une concentration maximale de 6. 8 µm/µl.

-Le Diclofénac de sodium à un effet anti-inflammatoire qui

augmente les taux du NO au niveau de l’œdème plantaire de 50%
chez le lot prétraité en activant les macrophages et induisant
l’expression d’iNOS, ce qui fait augmenter les concentrations du
NO par la suite (anti-inflammatoire).

Fig06 : représente les concentrations du NO sérique en fonction

des 3 lots qui inversement à la fig5 montre que : les concentrations
sériques du NO chez le lot prétraité avec le Diclofénac sont moins
importantes de 50%que celles du lot Carraghénine alors qu’elles
le sont au niveau tissulaire ce qui explique les résultats de la figure respectivement, qui ont montré l’effet remarquable du Diclofénac
5 (par superposition), les concentrations du NO dans le lot de sodium sur les taux du NO au niveau du site de l’inflammation
Carraghénine sont à l’origine de la réaction inflammatoire de en augmentant l’infiltration des macrophages et des PN vers le site
l’organisme. d’inflammation et leur activation va booster l’expression des
INOS et donc par la suite la production des taux importants du NO
-Le Diclofénac de sodium agit sur le plan local de l’inflammation, anti-inflammatoire,
induisant l’infiltration importante des PN et des macrophages, qui
vont par la suite sécréter des concentrations élevées du No anti- Par opposition les taux du No sériques vont être moins importants
inflammatoire au niveau tissulaire qu’a niveau sérique. au niveau sérique, ces données définissent l’effet ANTI-
INFLAMMATOIRE du Diclofénac de sodium, objectif à
Discussion confirmer dans cette étude expérimentale.

Il a été bien montré dans la partie A de l’étude (cramping test) que Il est à savoir que L'oxyde nitrique (NO) joue un rôle important
le Diclofénac de sodium avait bien un effet anti-nociceptif dans la médiation de nombreux aspects des réponses
(antalgique) de façons très significative et dose dépendante chez inflammatoires. Le NO est une molécule effectrice de la lésion
les lots prétraités avec cet AINS à des doses différentes, cela cellulaire et peut agir comme antioxydant. Il peut moduler la
confirme que le Diclofénac de sodium est un AINS avec effet libération de divers médiateurs inflammatoires à partir d'un large
antalgique et anti-nociceptif puissant qui par son action sur le éventail de cellules participant aux réponses inflammatoires (par
métabolisme de l’acide arachidonique assuré par la phospholipase exemple, les leucocytes, les macrophages, les mastocytes, les
A2 qui est inhibée dans ce cas-là . cellules endothéliales et les plaquettes). Il peut moduler le flux
sanguin, l'adhésion des leucocytes à l'endothélium vasculaire et
Les taux en acide arachidonique vont baisser (substrat de cyclo- l'activité de nombreuses enzymes, qui peuvent toutes avoir un
oxygénase 2 et 1), il est à savoir qu’à partir de l’acide impact sur les réponses inflammatoires. Ces dernières années, des
arachidonique : La COX 1 une enzyme constitutive synthétise des médicaments libérant du NO ont été développés, généralement
PGE2 (prostacuclines) au niveau de l’estomac qui inhibent la sous forme de dérivés d'autres médicaments, qui présentent des
sécrétion d’acide gastrique, des PGI rénaux ainsi que la effets anti-inflammatoires très puissants.
thromboxane A2 qui est un facteur d’agrégation plaquettaire, une
fois cette COX 1 inhibée l’AINS va avoir un effet délétère sur la Conclusion
muqueuse gastro-intestinale.
Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) sont une classe
La COX 2 une enzyme inductible (cas d’une inflammation) de médicaments étendue, comprenant de nombreuses molécules
synthétise des cytokines ainsi que des PG inflammatoires qui sont telles que l’ibuprofène. Ils agissent en bloquant la formation des
à l’origine de la sensation de douleur et de l’inflammation, et en prostaglandines, les substances responsables de l’inflammation et
inhibant cette dernière, les PG ne seront plus synthétisées ce qui de la douleur. Ils ont des propriétés ANTI-NOCICEPTIVES
représente l’effet ANTI-NOCICEPTIF du Diclofénac de sodium. (contre la douleur), antipyrétiques (contre la fièvre) et, à des doses
plus élevées, ANTI-INFLAMMATOIRES tel le Diclofénac de
sodium étudié dans ces deux modèles expérimentaux.

L’effet anti-inflammatoire du Diclofénac a été étudié dans le

modèle expérimentale d’inflammation aigue induite par la
Carraghénine, où il avait un effet très significatif sur la diminution
de la taille de l’œdème de 40% observé chez les lots prétraités par
le Diclofénac de sodium par gavage gastrique, suite à son
inhibition de la COX2.

Un dosage biochimique des concentrations tissulaires et sériques

du No a été effectué à partir des pattes enflammées
MTT test, coloration de May-Grunwald Giemsa sur des
splenocytes isolées des souris NMRI
Introduction 6- Rincer les lamelles avec de l’RPMI dans une boîte de pétri et
récupérer la suspension qui s’écoule.
Un splenocyte est une cellule immunitaire du tissu splénique.
7- Prélever la suspension récupérée avec une seringue puis la faire
Un splenocyte peut évoluer vers n’importe quel type de globule passer à travers des aiguillés en allant de 18G, 22G, et enfin 26G
blanc lorsqu’il quitte la rate. La fusion d’un spleenocyte avec une (pour éliminer toutes les jonctions cellulaires, et avoir une
cellule lymphoïde, donne un hybridome, ces derniers sont utilisés suspension unicellulaire de splenocytes).
dans les techniques d’immunohistochimie pour la production
8- Transférer la suspension dans un tube 15 ml, rincer la boîte de
d’anticorps monoclonaux.
pétri avec de l’RPMI.
Pour obtenir une suspension unicellulaire de cellules spléniques,
9- Répartir la suspension récupérée dans 3 tubes eppendorfs et
une technique de culture primaire a été utilisée, qui consiste à
centrifuger à 1600 rpm à 4°c pendant 10 min, puis jeter le
isoler des cellules non immortalisées, c’est-à-dire des cellules qui
surnageant et récupérer les 3 culots une fois la centrifugation est
ne prolifèrent pas indéfiniment in vitro, à partir de la rate d’une
terminée.
souris NMRI pour but de réaliser un test de viabilité des cellules
MTT test, ainsi que la coloration des frottis de suspensions 10- Dissoudre dans le même tube eppendorfs les 3 culots dans
cellulaires et de tissus splénique par la technique de May- 500µl de PBS et mélanger à l’aide d’une micropipette,
Grunwald Giemsa. Ces cellules, comparées aux autres, ont un centrifuger, récupérer le culot, le faire dissoudre dans 500µl d’eau
nombre de divisions cellulaires limité et ainsi, sont plus physiologique.
représentatives de l’état physiologique in vivo que les cellules
immortalisées. 11- Dans un tube eppendorf mettre 20µl de la suspension
cellulaire obtenue à la fin de l’étape précédente et rajouter 20µl de
Objectif bleu de typant avec 500µl de PBS (ou eau physiologique),
mélanger à l’aide d’un agitateur (vortex) et laisser pendant 15 min.
L’objectif de cette étude consiste à l’obtention de splenocytes en
suspension à partir de la rate, réaliser le test viabilité, compter le Principe de coloration au Bleu de Trypan :
nombre de spleenocytes dans une suspension et d’observer en
Le bleu de Trypan est un colorant soluble dans l’eau, utilisé pour
microscopie photonique le tissu splénique et la suspension
le test d’exclusion de colorant pour la viabilité des cellules.
cellulaire après coloration MGG.
Il permet de distinguer les cellules viables et non viables en
Test MTT
s’infiltrant dans les membranes plasmiques endommagées des
cellules non viables les faisant apparaitre en bleu.
Matériel
12- Verser 20µl du mélange dans les chambres de comptage de la
Matériel biologique : Souris NMRI de poids moyen de 25g, cellule de Malassez sur laquelle on a placé la lamelle.
fournies par l’animalerie de la FSB-USTHB.
13- Observation au microscope photonique, et comptage des
Equipements de laboratoire : Trousse de dissection, une pince, cellules réfringentes (blanches=vivantes) dans 8 à 10 rectangles
lame et lamelle en verre, boite de pétri, des seringues avec quadrillés au hasard.
différents diamètres, des aiguilles, tube flacon de 15ml, une
plaque recouverte de papier d’aluminium, agitateur (vortex), NB : les cellules qui apparaissent en bleu sont des cellules mortes.
centrifugeuse, tubes eppendorfs, microscope photonique, cellule
de Malassez, micropipettes. Résultat

Réactifs : On a réalisé le comptage sur deux cellules de Malassez (2

échantillons) où on a trouvé 59 cellules dans le premier et 60
-PBS (phosphate Buffer Saline)/Chloroforme et eau cellules dans le 2eme échantillon
physiologique/ Bleu de typant /RPMI.
-On calcul la concentration des cellules (nombre des cellules /ml)
Protocol selon la formule suivante :

1- sacrifier l’animal (euthanasie avec chloroforme). n*100*1000*facteur de dilution

2- placer le sur une table de dissection et asperger l’animal avec [(59+60)/2]*100*1000*(540/20)= 160650000 cellule par ml
de l’alcool 70%
Conclusion :
3- Inciser la cavité abdominale et retirer la rate
Dans la suspension unicellulaire de splenocytes préparée, on a
4- Découper la rate de la souris en 3 morceaux. 160650000 cellules par ml de RPMI.

5- Écraser les petites pièces de la rate entre 2 lames en verre.

 Résultats

Fig1 : observation de la suspension cellulaire des spleenocytes

au MP, après coloration au bleu de Trypan (CV= cellule
viable et VNC=cellule non viable) prise par 4Boussadia nadjiba
Imene USTHB-FSB

Coloration MGG des frottis

Fig2 : Observation du frotti tissulaire au MP, après coloration
Matériel MGG, (L=lymphocyte, E=éosinophile), prise par 4Boussadia
nadjiba Imene USTHB-FSB
Equipements de laboratoire : une pince, lamelles en verre, boite
de pétri, microscope photonique, micropipette.

Réactifs : MyGrunwald / eau distillée / colorant Giemsa

Protocol

Réalisation des frottis :

Observation de la suspension cellulaire : Une goutte de la

suspension cellulaire (récupérée dans du RPMI après avoir écrasé
les morceaux de rate entre les deux lames en verre, et faire passer
la suspension à travers des aiguilles en allant de 18G, 22G, et26G)
est étalée sur la lame puis séchée.

Observation du tissu splénique : une des lames utilisées pour

écraser les morceaux de la rate est séchée.

Coloration MGG :

1-mettre du MyGrunwald sur les deux lames chacune dans un plat

de pétri et laisser pendant 2 min.

2-Ajouter de l’eau distillée, et laisser pendant 1 min.

3-Se débarrasser du colorant, en rinçant les deux lames avec de Fig3 : Observation du frotti de la suspension cellulaire au MP,
l’eau distillée. après coloration MGG, (L=lymphocyte=macrophage
m=monocyte), prise par 4Boussadia nadjiba Imene USTHB-
4-Ajouter le colorant Giemsa dilué au 1/20ème, et laisser 15 min. FSB

5-Rincer sous l’eau de robinet. Conclusion

6-Observation des lames sous microscope photonique. Le Protocol adopté nous a permis d’avoir une suspension
unicellulaire (splenocytes séparées) représentée dans la fig3 après
Principe de coloration MGG :
coloration MGG, cette dernière a mis en évidence le tissu
Le principe repose sur l’action combinée de deux colorants splénique représenté dans la fig2.
neutres : Le May-Grunwald, contenant un colorant acide, l'éosine,
et un colorant basique, le bleu de méthylène. Le Giemsa,
contenant lui aussi de l'éosine, et un colorant basique, l'azur de –
Discussion 3- On utilise le double marquage car seules les mast/stem cells
représentent deux marqueurs (CD117 et FcεRIα) à la fois à leur
La technique utilisée a permis d’avoir une suspension surface.
unicellulaire de splenocytes isolées à partir de la rate d’une souris
NMRI, permettant de réaliser une primo-culture, ainsi qu’un test Le CD117 seul peut être présent à la surface des cellules
MTT a révélé la concentration cellulaire par ml d’RPMI. intestinales, mélanocytes. Le FcεRIα seul quant à lui est aussi
détectable à la surface des éosinophiles, basophiles, cellules
L’observation au Microscope Photonique des cellules isolées de epidermales de Langerhans.
la rate murine après coloration MGG a révélé la présence de
différentes cellules différenciées, les cellules de l'immunité innée La présence des deux en même temps à la surface cellulaire ne
et adaptative telles que les lymphocytes, les macrophages, les révèle que l’identité d’une mast/stem cell.
monocytes et les éosinophiles chargées de reconnaître et détruire
tout élément étranger agressant l’organisme, Les cellules Références
dendritiques les meilleurs présentateurs d’Antigènes se situent au
niveau de cet organe. Todd, P.A., Sorkin, E.M. « Diclofenac sodium ». Drugs 35 ,244-
285 (1988)
Cette observation permet d’étudier les caractéristiques
morphologiques des cellules impliquées dans plusieurs processus Vicent Richard (30/10/2021). « Anti-inflammatoires non
physiologiques comme la réaction anti-inflammatoire. stéroïdiens ». Pharmacomedicale.Org.

Questions

1-Non, car le western blot vu son principe (détection de protéines

spécifiques dans un mélange de protéines sur une membrane de
nitrocellulose), permettra d’avoir une idée sur le type de
récepteurs (protéines membranaires) présents sur les membranes
plasmiques de cellules en suspension (après éclatement des
cellules, centrifugation, séparation des microsomes, détachement
des protéines membranaires par action enzymatique/détergents,
électrophorèse et toutes autres étapes qui suivent)

Cela ne permettra que d’avoir une idée sur seulement le type de

marqueurs présents à la surfaces des cellules (ckit ou cd34 ou
FcεRIα ou CD13), cela permettra de détecter la présence des
marqueurs (comme cd117 ou FcεRIα mais jamais les 2 en même
temps à la surface d’une cellule donnée, qui les deux sont présents
à la surface d’autres cellules comme éosinophiles, macrophages
etc, autres que les mastocytes). On ne saura jamais s’ils sont
présents sur les mêmes cellules ou sur des cellules différentes.

Ainsi que cette détection se réalise sur une membrane de

nitrocellulose et pas sur la membrane plasmique cellulaire.

Le western blot donc ne permet pas l’identification des

mastocytes, on ne saura jamais si c’est PMC ou BMC, ou si c’est
autres cellules que les mastocytes.

DOUBLE STAINING FACS reste la meilleure et la plus fiable

technique pour l’identification des mastocytes.

2- Oui, les lignées de mastocytes sont des immortalisées (où on a

bloqué le phénomène d’apoptose) et qui au fur et à mesure qu’on
avance dans l’expérimentation [l’étude] ces cellules vont perdre
leur caractéristiques, donc travailler sur des mastocytes
péritonéaux (primo-culture) reste plus avantageux vu que
l’attitude des cellules va être plus proche de celle dans leur milieu
originaire.

NB : l’utilisation des lignées peut être plus avantageuse de point

de vue que les cellules vont vivre plus longtemps que les cellules
moralisées.