Intza LABARRIERE GCGP 2
Louise MARNET A2
TP DE BIOCHIMIE
Etude des molécules azotées dans de la matière
organique
Date de début : 20/10/2022
Date de fin : 20/10/2022
Introduction : Ce tp est va être scindé en deux parties la première aura comme
objectif d’étudier les molécules azotées que l’on retrouve au sein des protides et
des acides nucléiques de trois manières différentes.
En effet, nous effectuerons dans un premier temps un dosage de l’azote total par
méthode Kjeldahl : cela nous permettra de calculer le taux de protéines dans un
échantillon de lait afin de voir si celui-ci correspond aux valeurs théoriques.
Dans un second temps, nous effectuerons un dosage des protéines dans le lait grâce
à la méthode Bradford : ce qui nous permettra d’obtenir rapidement la
concentration de protéine dans des petits échantillons de lait.
Nous pourrons alors comparer les deux méthodes précédemment citées.
Enfin, nous ferons une extraction d’ADN afin de quantifier puis d’analyer
celui-ci.
La seconde partie, elle, aura comme but l’extraction, la purification et le dosage
semi-quantitatif de l’ADN de thymus de veau. Nous allons utiliser cette partie de
veau car elle présente un nombre important de brins d’ADN. Dans un premier temps
nous allons extraire puis purifier l’ADN pour pouvoir, à la fin, étudier ses
caractéristiques tel que son absorbance.
Nous allons porté tout le long de ce Tp des EPI (Equipements de Protection
Individuel) composé de :
Avant de détailler nos manipulations et nos résultats nous allons étudié les
produits utilisés :
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Produits utilisés Pictogramme Précautions à prendre
Lait / /
Sulfate de cuivre (poudre) Port des EPI
Sulfate de cuivre à 5% (en
solution)
Port des EPI
Acide Sulfurique concentré Port des EPI et
manipulations sous hotte
Port des EPI
Acide Borique
Indicateur de Tashiro Port des EPI
Carbonate de sodium Port des EPI
Bleu de Bromophénol / /
Port des EPI
BSA
Port des EPI
Réactif de Bradford
Tampon extraction Port des EPI
Mélange Port des EPI et
Chloroforme/3 manipulations sous hotte
Methyl-1-Butanol
Tampon élution Port des EPI
Ethanol glaciale (-20°C) Port des EPI
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Partie 1 : Dosage des protéines dans le lait, comparaison des
méthodes de Kjeldahl et Bradford.
Objectif : Dans cette partie, l'objectif premier sera de déterminer la
concentration en protéine d’un même lait de deux manières différentes. La
première sera par la méthode de Kjeldahl et la deuxième par la méthode de
Bradford. Nous pourrons ensuite comparer ces deux dernières.
Sous partie 1 : Dosage de l’azote total par méthode de Kjeldahl.
Objectif : Comme dit précédemment, le but sera de déterminer la
concentration de notre lait possédant les caractéristiques suivantes :
Matériels et méthodes : La manipulation afin de doser l’azote total se fait
en trois parties.
En effet, dans un premier temps il s’agira de la minéralisation. Puis dans
un second temps, nous effectuerons une alcalinisation grâce à l’ajout de
soude puis une distillation du NH3.
Enfin, nous ferons un dosage avec de l’acide fort. ( dosage acide/base )
1/ Minéralisation
Nous avons mélangé dans un tube de minéralisation, 5 mL de lait avec du
sulfate de potassium, du sulfate de cuivre à 5% et de l’acide sulfurique
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concentré. Puis nous avons laissé ceci sur la rampe de minéralisation sous
la hotte pendant 2h.
2/ Alcalinisation
Après avoir effectué la minéralisation, nous avons placé notre tube dans le
distillateur de Kjeldahl. Nous avons ajouté de l’azote jusqu’à apercevoir
un changement de couleur bleu, puis nous avons distillé pendant 4min tout
en receuillant l’ammoniaque dans un erlenmeyer contenant un indicateur
coloré ainsi que de l’acide borique, préalablement préparé.
3/ Dosage par de l’acide fort
Dans cette dernière partie,nous avons tout d’abord étalonné l’acide
sulfurique que nous allions par la suite utiliser afin d’effectuer le
dosage acide/base.
Pour cela, nous avons peser une certaine masse calculée au préalable de
Na2CO3, puis à l’aide d’un indicateur coloré, nous avons effectué un dosage
par de l’acide sulfurique.
Ainsi, nous avons pu déduire la concentration réelle de l’acide sulfurique.
Suite à cela, nous recueillons l’erlenmeyer rempli d’ammoniaque et nous le
dosons par l’acide sulfurique de concentration connue jusqu’à observer un
changement de couleur. Nous relevons les volumes équivalents correspondant.
Fig 1 : Dosage de l’azote total par Kjeldahl
Résultats obtenus :
Fig 1 : Dosage Kjeldahl
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Résultats obtenus :
Dosage afin d’étalonner l’acide sulfurique :
Essai Essai 1 Essai 2
Volumes équivalents 19,1 mL 19,2 mL
Dosage par l’acide fort :
Essai Essai 1 Essai 2
Volumes équivalents 9,4 mL 10 mL
Analyse des résultats :
Calcul de la concentration réel de la solution d’acide sulfurique :
Pour cela, nous avons calculé notre masse théorique de NA2CO3:
n Na2CO3 = Cacide sulfurique x Veq
= 0,1 x 20 x 10-3
= 2 x 10-3 moles
Donc m = n x M
= 2.10-3 x 106
= 0,212 g
Après avoir effectué les dosages, nous avons pu calculer la concentration
réelle de l’acide sulfurique :
Nous avions pesé les masses exactes suivantes : 0,2119 g et 0,2120 g
Nous pouvons donc faire la moyenne des masses de Na2CO3 pesées ⇒
(0,2119 + 0,2120)
2
donc,
m moyenne = 0,21195 g
(19,1+19,2)
La moyenne de Volume équivalent obtenu est de 2
donc,
Veq moyen = 19,15 mL
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Grâce à ces deux moyennes nous pouvons donc calculer la vrai concentration
d’acide sulfurique présent dans la burette.
Etant donnée que nNA2CO3 = nAcide sulfurique alors,
𝑚 𝑚𝑜𝑦𝑒𝑛𝑛𝑒
𝑀𝑁𝑎2𝐶𝑂3
= Cacide sulfurique x Veq
𝑚 𝑚𝑜𝑦𝑒𝑛𝑛𝑒
Cacide sulfurique = 𝑀𝑁𝑎2𝐶𝑂3
𝑉𝑒𝑞 𝑚𝑜𝑦𝑒𝑛
0,21195
( )
Cacide sulfurique = 106
−3
19,15 .10
Cacide sulfurique=0,104 mol/L
Calcul de la concentration massique de protéines dans le lait :
Pour commencer :
nazote = n2H+
nazote= Créelle acide sulfurique x Vessai 2 H+ x 2
Sachant que nazote = mazote / Mazote alors,
mazote = (C x Vessai 2 H+ ) xMazote
= ( 0,104 x 10 x 10-3 x 14 ) x 2
= 0,0292 g pour 5 mL de lait
( Nous prenons le volume équivalent de l’essai 2 car l’essai 1 n’avait
pas totalement fini de réagir )
Sachant que pour 5 mL de lait la masse d’azote est de 0,0292 g alors
pour 1 mL la masse vaut 0,292/5 = 0,0584 g
Soit une concentration de 5,84 g/L.
De ce fait, nous pouvons en déduire la concentration en protéine :
Sachant que 5,84 représente 15,67% alors pour 100% nous avons : 5,84 x
100/15,57 = 37,27 g/L de protéines.
Interprétation :
Grâce au calcul ci dessus, nous pouvons comparer la valeur obtenue en
protéines avec la valeur tabulée. En effet, directement sur la
bouteille de lait utilisée nous pouvons lire que la teneur en protéines
est de 3,33g pour 100 mL soit 33,3 g/L.
Nous pouvons donc dire que notre valeur trouvée est légèrement
supérieure, cela vient du fait que la concentration en protéines
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tabulée ne prend pas en compte les protéines contenues dans l’ADN et
l’ARN contrairement à nous, mais surtout des erreurs de
manipulations.En effet, le volume équivalent fait beaucoup varier notre
concentration en protéines.
Sous partie 2 : Dosage des protéines par méthode de Bradford
Objectif : Le but de cette partie sera de déterminer la concentration
de notre lait par la méthode Bradford.
Matériels et méthodes : Pour effectuer le dosage par la méthode de
Bradford, nous avons commencé par effectuer une gamme étalon dans des
tubes d’eppenford contenant une solution de BSA à 2 mg/mL, et de l’eau
distillée.
Fig 2 : préparation de la gamme étalon
Puis dans un second temps, nous avons mélangé dans des cuves de
spectrophotométrie du réactif de Bradford ainsi que les différentes
solutions à analyser ( Gamme étalon, lait dilué, eau distillée, lait
non dilué ). Enfin, nous avons mis ces microcuves au spectrophotomètre
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afin de lire leur absorbance et ainsi de tracer la courbe d’étalonnage.
Fig 3 : Dosage en Bradford
Pour cette manipulation, nous avons travaillé avec les équipements
suivants : Gants, Lunettes, Blouse et Chaussures de sécurité.
Résultats obtenus :
Nous avons obtenu les absorbance suivantes :
Essais Absorbances
Bradford + 50 μL eau distillée 0
Bradford + 200 μL de BSA 0,104
Bradford + 400 μL de BSA 0,152
Bradford + 600 μL de BSA 0,196
Bradford + 800 μL de BSA 0,233
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Bradford + 1000 μL de BSA 0,295
Bradford + 50 μL lait dilué 0,143
essai 1
Bradford + 50 μL lait dilué 0,145 ( moyenne des deux essais
essai 2 0,144 )
Bradford + 50 μL lait non dilué Impossible à lire
essai 1
Bradford + 50 μL lait dilué Impossible à lire
essai 2
Analyse des résultats :
Grâce aux valeurs recueillies dans le tableau suivant, nous pouvons tracer
la courbe des concentrations en protéine en fonction de l’absorbance
mesurée.
Tout d’abord nous allons calculer les concentrations en protéine dans
chacun des tubes étalons :
Soit : concentration en protéine tube 1 avec 200 μL de BSA :
Cprot = 2 x 1/( Vtot/Vbsa )
= 2 x 1/(1000/200)
= 0,4 mg/mL
Ce qui nous donne le tableau suivant :
tube étalon Concentration en protéines ( mg/
mL )
200 μL de BSA 0,4
400 μL de BSA 0,8
600 μL de BSA 1,2
800 μL de BSA 1,6
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1000 μL de BSA 2
Nous pouvons à présent tracer la courbe d’étalonnage.
Fig 4 : Courbe d’étalonnage
Grâce à cette courbe ainsi qu’à l’équation de droite nous avons déterminé
la concentration en protéine dans le lait dilué.
Soit : 0,144 = 0,116x + 0,057
Donc concentration en protéine = ( 0,144-0,057 )/0,116
= 0,75 mg/mL
Sachant que le lait à été dilué par 50, alors la concentration réelle dans
le lait non dilué vaut : 0,75 x 50 = 37,5 mg/mL
Conclusion :
En conclusion, nous avons pu voir grâce à ces deux manipulations deux
méthodes afin de déterminer la concentration dans le lait.
Premièrement, la méthode de Kjeldahl. Celle-ci est une méthode efficace
afin de déterminer les protéines dans des aliments avec des quantités
raisonnables ( 5 mL de lait ici ). De plus, cette méthode est précise et
les manipulations sont abordables et simples.
Cependant, elles possèdent certains inconvénients. En effet, celle-ci nous
donne la concentration en azote total et non en protéine. De plus,la durée
de manipulation est conséquente et les réactifs ( notamment l’acide
sulfurique concentré ) sont dangereux.
Deuxièmement, nous avons vu la méthode de Bradford. Cette méthode, est elle
aussi efficace et plus précise cependant elle nécessite de diluer certains
aliments afin de pouvoir être lu et analyser le spectrophotomètre. Ces
dilutions augmentent les incertitudes et les risques d’erreur sur notre
valeur finale de concentration en protéines.
Pour finir sur cette méthode, nous pouvons ajouter que contrairement à la
méthode de Kjeldahl, la méthode de Bradford nous donne directement la
concentration en protéines mais aussi rapide.
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Enfin,nous pouvons dire que ces deux méthodes ont été concluantes car elles
nous ont donné une concentration en protéines proche de la valeur tabulée
sur la bouteille ( 37,27 mg/mL et 37,5 mg/mL Vs 33,3 mg/mL ).
Partie 2 : Extraction, purification et dosage semi-quantitatif de
l’ADN de thymus de veau.
Objectif : Dans cette partie nous allons extraire de l’ADN présent dans un
thymus de veau. Pour cela nous allons dans un premier temps broyer et
effectuer une lyse cellulaire. Puis dans un second temps nous allons
déprotéiner notre échantillon. Ensuite, nous allons exécuter une
précipitation et une solubilisation de l’ADN pour enfin finir par analyser
l’ADN de notre morceau de thymus.
Sous partie 1 :Broyage et lyse cellulaire.
Objectif : Dans cette première sous-partie, nous allons prélever un
échantillon d’une partie du corps d’un veau qui est très riche en ADN,
récupérer son ADN, le diluer et le conserver pour plutard.
Matériels et méthodes :
Fig. 4: Représentation du broyage et la dilution de l’ADN de thymus d’un veau
Pour cette première manipulation nous avons peser une masse de thymus pour
pouvoir par la suite la broyer. Pour avoir un broyage optimal il a fallu
qu’on rajoute une pincée de sable de fontainebleau afin de casser le plus
de cellules possible. Lorsque nous avons liquéfié au plus le mélange nous
avons ajouté un tampon afin de rendre le mélange visqueux et qu’on puisse
récupérer le filtrat. Ce filtrat a été, par la suite, versé dans un
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erlenmeyer et agité un certain temps afin de l'homogénéité. Une fois ce
temps écoulé nous avons prélevé une quantité de celui-ci. Cette quantité a
été versée dans un eppendorf qui contenait déjà une quantité d’eau
distillée.Nous appellerons cet échantillon E1, nous le laisserons à une
température de 4°C et nous allons le réutiliser dans la sous-partie
suivante.
Sous partie 2 :Déprotéinisation de l’ADN.
Objectif : Dans la sous-partie précédente nous avons réussi à récupérer
l’ADN présent dans une partie du corps d’un veau. Cependant nous avons
récupéré l’ADN mais également les protéines et tous ses constituants. De ce
fait, dans cette sous-partie nous allons centrifuger nos échantillons afin
d’enlever ces constituants non nécessaire à l’analyse de l’ADN.
Matériels et méthodes :
Fig. 5: Représentation de la déprotéinisation de l’ADN
Par la suite, nous avons récupéré le filtrat (récupéré et agité dans la
sous-partie 1) et nous avons ajouté un volume de Chloroforme/3
Methyl-1-Butanol. Attention, il faut toujours veiller à manipuler sous la
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hotte car ce mélange a des propriétés inflammables et très toxiques. Une
fois ce mélange ajouté au filtrat nous avons boucher leur contenant,
l’erlenmeyer, puis ajouté un certain temps. En parallèle de cela, nous
avons analysé E1. Pour cela, dans une cuve à quartz nous avons ajouté un
volume de E1 et un volume d’eau distillée. Nous analyserons l’absorbance de
cette cuve pour 3 longueurs d’ondes (230 nm, 260 nm, 280 nm). Avant chaque
mesure nous avons du faire “le blanc” c’est a dire mesurer l’aborbance
d’une cuve contenant seulement de l’eau distillée afin de calibrer
l’appareil. Nous allons placer un bécher dans un cristallisoir avec des
glaçons et de l’eau pour plus tard. Une fois les mesures prises et le temps
d’agitation du mélange écoulé nous verser le mélange dans un tube de Falcon
puis centrifugé celui-ci. Une fois la centrifugation faite, nous avons la
partie haute du mélange, la phase aqueuse, pour pouvoir la transférer dans
un nouveau tube de Falcon. Dans ce nouveau tube de Falcon nous avons ajouté
le même volume de Chloroforme/3 Methyl-1-Butanol qu’il n’y a de phase
aqueuse. Une nouvelle fois nous avons centrifugé ce tube. Une fois la
centrifugation finie nous avons à nouveau récupéré la phase aqueuse et nous
l’avons versé dans une éprouvette. Dans un eppendorf nous avons ajouté un
volume de la solution présente dans l’éprouvette et un volume d’eau
distillé. Nous noterons cet eppendorf E2 et nous le conserverons à 4°C pour
la sous-partie 4.
Résultats obtenus :
Pour E1 nous obtenons les résultats suivants:
Longueur d’onde 260 280 230
(nm)
Absorbance 0,133 0,283 0,415
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Sous partie 3 :Précipitation et solubilisation de l’ADN.
Objectif : Après avoir déprotéiné l’ADN nous allons dans cette avant
dernière sous-partie précipiter et solubiliser celui-ci.
Matériels et méthodes :
Représentation de la m
Fig. 6: Représentation de la précipitation et de la solubilisation de l’ADN
Dans cette sous-partie nous avons récupéré la phase aqueuse du dernier
Falcon centrifugé et nous lui avons ajouté un volume de Sodium
acétate.Ensuite, nous avons versé ce mélange dans le bécher préparé
préalablement dans le cristallisoire. Dans un second bécher ajouté un
volume de tampon d’élution que l’on va utiliser par la suite. Dans le
bécher présent au sein du cristallisoire versé un volume d’éthanol glacial
tout en effectuant des petits mouvements circulaire avec une baguette de
verre afin d’enrouler le plus de filaments d’ADN possible. Nous avons
ensuite dissous ces filaments dans le bécher de tampon d’élution préparé
préalablement.Nous appellerons donc le bécher contenant les filaments d’ADN
dissous et la solution de tampon d’élution E3.
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Sous partie 4 :Analyse de l’ADN.
Objectif : Dans cette dernière sous-partie nous allons effectuer les
analyses de E2 et E3.
Matériels et méthodes :
Fig. 7: Représentation de la mise en cuve à quartz pour analyser l’ADN
Dans cette sous-partie, nous avons versé un volume de E2 et de l’eau
distillée dans un cuve à quartz pour pouvoir mesurer l’absorbance et comme
pour la sous-partie 2 nous mesurerons l’absorbance de la cuve pour les 3
longueurs d’onde. Pour la dernière lecture d’absorbance nous allons verser
un volume de E3 une nouvelle fois dans une cuve à quartz puis mesurer son
absorbance pour les 3 longueurs d’ondes.
Résultats obtenus :
Pour E2 nous obtenons les résultats suivants:
Longueur d’onde 260 280 230
(nm)
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Absorbance 0,359 0,215 0,455
Pour E3 nous obtenons les résultats suivants:
Longueur d’onde 260 280 230
(nm)
Absorbance 0,710 0,375 0,194
Grâce à nos différents résultats obtenu lors de la lecture des absorbances
nous allons pouvoir calculer les fractions de E1, E2 et E3 grâce aux
rapport suivants:
𝐴260𝑛𝑚
Le rapport 𝐴280𝑛𝑚
nous permettra d’estimer le rendement de pureté de l’ADN
au cours de l’extraction et de la purification. Nous considérerons que
l’ADN est pur si ce rapport est compris entre 1,8 et 2. A l’inverse si ce
rapport est inférieur à 1,7, la contamination protéique est forte.
0,133 0,359
Pour E1 ⇒ 0,283
= 2, 13 Pour E2 ⇒ 0,215
= 1, 67
0,710
Pour E3 ⇒ 0,375
= 1, 89
Nous pouvons donc voir que E3 est l’échantillon avec l’ADN le plus purifié.
A l’inverse, pour l’échantillon E1, l’ADN n’est pas du tout pur, il est
même contaminé par des protéines. Ceci est cohérent avec nos manipulations.
𝐴260𝑛𝑚
Le rapport 𝐴230𝑛𝑚
nous permettra de savoir si l’échantillon a été contaminé
par les solvants. Si la valeur de ce rapport est supérieur à 2 alors notre
échantillon n’est pas contaminé par le solvant.
0,133 0,359
Pour E1 ⇒ 0,415
= 0, 32 Pour E2 ⇒ 0,455
= 0, 79
0,710
Pour E3 ⇒ 0,194
= 3, 66
Une nouvelle fois nous pouvons donc voir que E3 est l’échantillon qui est
le moins voir pas contaminé soit avec l’ADN le plus purifié. En effet, son
rapport à une valeur supérieure à 2. Alors qu' à l’inverse, l’échantillon
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E1, lui, a une valeur largement inférieur à 2, donc la solution contenu
dans E1 est contaminé. Une nouvelle fois nous pouvons affirmer que ces
résultats sont cohérents avec nos manipulations.
Echantillon Pureté Contamination par le
solvant
E1 Valeurs trop haute Oui
E2 Non Oui
E3 Oui Non
Nous pouvons donc affirmer grâce à ce récapitulatif que notre échantillon
pur et non contaminé par le solvant est E3. Donc toutes nos étapes ont été
concluantes et réussies.
Finalement, pour conclure, nous pouvons dire que ce Tp a été
réussi car en effet nos résultats sont cohérents avec nos différentes
étapes de manipulations. Le broyage nous a permis de libérer le contenu
cellulaire présent dans le thymus. Puis la filtration nous a permis de nous
débarrasser des gros déchets cellulaires, par la suite nous avons effectué
une déprotéinisation afin de délivrer l’ADN des protéines. Ensuite, grâce à
la présence de sels et de la solution d’éthanol glacial nous avons pu
précipiter l’ADN et enfin nous avons re-solubiliser l'ADN en milieu aqueux.
Nous avons effectué toutes ces étapes pour aboutir à notre objectif premier
qui était la purification de l’ADN présent dans le thymus.
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