Nom
: hanou
Prénom : lyna
TP N4 : la coloration simple Matricule :212131092350
Section et groupe : k1
C’est une coloration d’orientation elle permet d étudier la taille, la forme et
le mode de regroupement des cellules bactérienne, une seul colorant est
généralement utilisé, ces renseignements peuvent être fournis par une
simple préparation a l état frais ou a l état tué
Plan de travail :
I. La coloration vitale :
C’est la coloration des cellules vivante on empreignent les bactéries sans
les tue d’un seul colorant
1. La préparation de l étalement :
On utilisant des lames de verre stérilisé a L’eau de javel ou dans l alcool
puis rincées et séchées on prélève par la pipette pasteur flambé et
refroidie une petite quantité de culture et on dépose une goute sur la
lame
2. La coloration :
Après avoir ajouté une goute de colorant a la suspension bactérienne on
couvre la lame d une lamelle et on observe au microscope
II. La coloration des bactéries tue : elle permet l’obtention de préparation
qui peuvent être conservées .les germe dont tue et les contaminations
par pathogènes sont évité
1. La préparation de l étalement :
2. La fixation : ce temps a pour bute de tuer les bactéries ce qui rend la
membrane plus imperméable aux colorants, de fixer leur structure
cytologique et de les faire adhérer a la lame
a) La fixation par la chaleur
b) La fixation par l’alcool
3. La coloration :
La coloration double ou coloration de gram : C’est une coloration différentielle
elle permet dès le début de l’examen bactériologique de cataloguer les
bactéries en deux grand groupe distincts basé sur les propriétés de coloration :
les grams positive et les grams négative
I. Les caractéristiques des bactéries :
1. Gram positive : ont une structure qui s’organise on trois parties :
a) La couche du peptidoglycane
b) L’espace périplasmique
c) La membrane plasmique
Exemple de bactéries gram positive : staphylococcus, lactococcus, micrococcus
2. Gram négative : on une structure qui s’organise on trois grandes
parties :
a) La membrane externe
b) L espace periplasmique et le peptidoglycane
c) La membrane plasmique
Exemple de bactéries gram négative : Escherichia coli, Vibrio cholerae
II. Principe de la coloration de gram :
après fixation des bactéries par passage de la lame dans la flamme au bec
de bunsen la lame est recouverte d’un premier colorant le violet de gentiane
qui va traverser les parois et la membrane des bactéries pour se fixer dans le
cytoplasme
La lame est ensuite est traité au lugol ou diode en solution qui sert de
mordant en renforcent le violet de gentiane contenu dans le cytoplasme
bactérien
On chasse ensuite le violet de gentiane avec une solution d’alcool à 96
Dégrée
La lame après avoir été rincée est plongé dans un deuxième colorant de
contraste, la fuchsine ce colorant traverse toute les parois et membrane
et va colorer en rose toute les bactéries qui ont été décolorées durant l
étapes précédant
La lame est récupérée, rincée et séchée puis observer au microscope
optique a l’objectif x100
Les bactéries gram positive : vont être coloré on violet
Les bactéries gram négative : vont être coloré on rose
III. Mécanisme de la coloration de gram :
IV. Méthodes de la coloration de gram :
1. Les réactifs utilisés :
le violet phénique (colorant primaire)
Liquide de lugol (mordant)
Alcool 96 dégrée (agent de décoloration)
Solution de fuchsine ou de safranine (colorant de contraste)
2. Technique :
préparer la lame et les échantillons bactériens à examiner, issus de
yaourt et dune culture de pseudomonas sp. comme pour un état frais
1) Etalement : il doit se faire en couche mince et régulière avec une
pipette pasteur sur une lame propre dégraissée
2) Dessiccation : laisser sécher a l aire libre ou approcher la lame a 15 /20
cm au dessus de la flamme du bec bensen
3) Fixation : consiste a tue les bactéries, a rendre les membranes plus
perméables, a fixer les structure sans les altérer et a faire adhérer le
frottis a la lame.
Passé 3fois rapidement dans la flamme la face de la lame opposée a l
étalement on la tenant avec une pince
4) La coloration de gram :
a) coloration primaire : couvrir la lame de violet de gentiane et laisser
agir 2minutes. jeter l excès de colorant
b) Mordançage : égoutter sans rincer et faire 2 bains de lugol dont chacun
dure 45seconde
c) Décoloration : égoutter et plonger la lame dans l’alcool 96 dégrée
durant 30 secondes exactement
Arrêter la différenciation par un lavage doux et abondant à L’eau distillé
d) Coloration secondaire : recolorer les germes décolorer par le
différenciateur en faisant agir sur la préparation un colorant de
contraste la fuchsine ou la safranine filtrée pendant 2minutes
Laver à l’eau distillée et sécher la lame au dessus de la flamme
Observer à l’objectif à immersion et dessiner les bactéries se trouvent
dans un champ microscopique moins riche dans la périphérie de la
préparation
Les bactéries qui one garder leur premier coloration sont violettes et sont
appelées gram positives
Les celles qui ont été décolorées par l’alcool se présentent roses et sont
appelées gram négative
