Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez

les rats Wistar

REPUBLIQUE DU BENIN
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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI
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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI
**********
DEPARTEMENT DE PRODUCTION ET SANTE ANIMALES
**********

Pour l’obtention du diplôme de Licence Professionnelle en Production et Santé Animales

THEME

Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de

Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Rédigé et soutenu par :

Yannick Sèna AYIHOU

Président du jury :
Pr Souaïbou FAROUGOU, Professeur Titulaire des Universités (CAMES),
Enseignant-Chercheur à l’EPAC/UAC

Membre du jury: Superviseur :

Dr Serge AHOUNOU, Assistant à Dr Philippe SESSOU, Maître-Assistant des
l’EPAC/UAC Universités (CAMES), Enseignant-
Chercheur à l’EPAC/UAC

11ème promotion
Année académique 2017-2018
 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

DEDICACES

Je dédie ce travail à :

 mon père Florent M. AYIHOU, vous n’avez ménagé aucun effort pour me donner une
meilleure éducation. Vous avez su créer en moi l’amour du travail bien fait. Vous m’avez
guidé avec rigueur mais aussi avec amour. Vous avez été toujours là quand j’avais besoin
de vous et sans vous, je ne serais pas devenu ce que je suis aujourd’hui. Je vous aime papa.
Puisse l’Eternel vous récompenser et vous garder longtemps !

 ma mère Léontine A. KPATINDE, malgré votre santé et votre âge, vous ne cessez de vous
battre sous le soleil et sous la pluie, jour et nuit, pour que je ne manque pas du nécessaire,
que j’ai moi aussi, un avenir meilleur. Je vous aime maman. Que Dieu vous fortifie et vous
accorde une longue vie, afin que vous soyez à mes côtés pour me prodiguer toujours de
sages conseils et nourrir mes pensées de paroles prophétiques !

Yannick S. AYIHOU/UAC/EPAC/PSA/2018 i
Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

HOMMAGES

Je rends mes respectueux hommages :

à mon superviseur, Docteur Philippe SESSOU, Maître-Assistant des Universités

(CAMES), Enseignant-Chercheur et Chef du Département de Production et Santé
Animales (PSA) de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC). Sa disponibilité, sa
rigueur, ses compétences et ses sages conseils m’ont permis d’être à ce niveau aujourd’hui.
Il avait accepté de superviser ce travail sans aucune hésitation malgré ses nombreuses
occupations. Que Dieu Tout-Puissant lui accorde la santé, le bonheur et une longue vie ;

 au Président du jury, pour avoir accepté, malgré ses nombreuses occupations, de juger ce
travail en y apportant ses critiques constructives ;

 aux Membres du jury, pour le grand honneur qu’ils m’ont fait en acceptant de juger ce
modeste travail et d’y apporter leurs critiques constructives malgré leurs multiples
occupations.

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REMERCIEMENTS

Je tiens à adresser mes sincères remerciements à:

 Dieu, le Père Tout-Puissant, le miséricordieux, qui m’a donné la santé, la force et le courage
de venir à bout de ce travail. Que sa bénédiction et sa protection demeurent à jamais,
Amen !

 Professeur Souaïbou FAROUGOU, Professeur Titulaire, Enseignant- Chercheur à l’Ecole

Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC) et Responsable de l’Unité de Recherche sur les
Maladies Transmissibles (URMAT) pour m’avoir accueilli dans son unité ;

 Docteur Cyrille BOKO, Maître de Conférences des Universités (CAMES), Enseignant-

Chercheur au Département de Production et Santé Animales (DPSA) à l’Ecole
Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), qui a œuvré pour que ce stage soit effectif ;

 Docteur Maximin SENOU, Maître de Conférences des Universités (CAMES), Enseignant-

Chercheur à la Faculté des Sciences et Techniques de l’Université Nationale des Sciences
Technologies, Ingénierie et Mathématiques (UNSTIM), pour sa contribution inestimable ;

 tous les enseignants de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), en particulier

ceux du Département de Production et Santé Animales (DPSA), pour avoir été présents
durant tout mon parcours universitaire et pour n’avoir jamais cessé de me guider au cours
de ma formation ;

 messieurs Justin ADINCI, Rodrigue TOWANOU et Ignace DOTCHE pour leur

contribution inestimable à la réalisation de ce travail ;

 Monsieur François DOSSA, sa disponibilité, sa simplicité, sa collaboration et la patience

dont il a fait preuve, ont donné à ce travail toute sa valeur ;

 Docteur Nestor NOUDEKE, pour son soutien et ses sages conseils durant mon parcours
universitaire ;

 Docteurs Eric YESSINOU, Camus ADOLIGBE, Kévin KASSA, Serge AHOUNOU et

Gabriel ADJIBODE, pour leur soutien moral ;

 messieurs et mesdames Nestor Oscar AGUIDISSOU, Arétas TONOUHEWA, Gwladys

KOMAGBE, Prudencio SOSSA-MINOU, Bruno Ayaovi YAOVI, Elisabeth

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HOUESSOU et Prudence AGO pour leurs conseils et moments conviviaux passés

ensemble ;

 mes frères et sœurs Lucrèce, Joviale et Roland, pour leur soutien moral et pour m’avoir
toujours encouragé durant mon cursus universitaire.

 tous mes camarades de la 11ème promotion de Licence Professionnelle pour ces années
passées ensemble ;

 tous ceux qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à la réalisation de ce travail, que
le Seigneur les bénisse et les comble de ses bienfaits.

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TABLE DES MATIERES

Dedicaces .................................................................................................................................... i

Hommages .................................................................................................................................. ii

Remerciements .......................................................................................................................... iii

Table des matières…………………………….………………………………………………..v

Liste des tableaux .................................................................................................................... viii

Liste des figures ........................................................................................................................ ix

Liste des sigles et abreviations ................................................................................................... x

Résumé ...................................................................................................................................... xi

Abstract .................................................................................................................................... xii

Introduction ................................................................................................................................ 1

PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR LE STAGE ................................................ 3

1. Généralités sur le stage ........................................................................................................... 4

1.1 Contexte du stage ................................................................................................................. 4

1.2 Période du stage ................................................................................................................... 5

1.3 Présentation de l’URMAT ................................................................................................... 5

1.3.1 Historique et objectifs de l’URMAT ................................................................................. 5
1.3.2 Forces et faiblesses ............................................................................................................ 6
1.3.2.1 Forces ............................................................................................................................. 6
1.3.2.2 Faiblesses ....................................................................................................................... 7

DEUXIEME PARTIE : ACTIVITES MENEES ET DIFFICULTES RENCONTREES

................................................................................................................................................ …8
2.1 Activités menées………………………………...........…………………………....………9
2.1.1 Sur le terrain . …………………………………………………………………………….9
2.1.2 A l’étable de l’URMAT . ………………………………………………………………...9
2.1.3 Au laboratoire de l’URMAT ............................................................................................. 9
2.1.3.1 Dénombrement de certaines flores dans les aliments investigués……...……………….9

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2.1.3.2 Détermination du profil de sensibilité ou de résistance aux antibiotiques des principales

espèces pathogènes présents dans les aliments ........................................................................ 14
2.2 Difficultés rencontrées et solutions envisagées .................................................................. 16

TROISIEME PARTIE : EVALUATION DE LA TOXICITE AIGUË DE L’HUILE

ESSENTIELLE DE AEOLLANTHUS PUBESCENS CHEZ LES RATS WISTAR ....... 17

3.1 Généralités sur l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens ............................................ 18

3.1.1 Description botanique de la plante .................................................................................. 18
3.1.2 Utilisation traditionnelle de la plante .............................................................................. 18
3.1.3 Composition chimique de l’huile essentielle .................................................................. 19
3.1.4 Activités biologiques de l’huile essentielle ..................................................................... 19
3.1.5 Toxicité............................................................................................................................ 19
3.2 Matériels et méthodes......................................................................................................... 19
3.2.1 Matériels .......................................................................................................................... 19
3.2.1.1 Matériel biologique ...................................................................................................... 19
3.2.1.2 Matériel végétal ............................................................................................................ 20
3.2.1.3 Matériel de laboratoire ................................................................................................. 20
3.2.2 Méthodes ......................................................................................................................... 20
3.2.2.1 Préparation des rats ...................................................................................................... 20
3.2.2.2 Pesée et répartition des rats .......................................................................................... 21
3.2.2.3 Prélèvement du sang..................................................................................................... 21
3.2.2.4 Administration de l’extrait d’huile essentielle de Aeollanthus pubescens. .................. 22
3.2.2.5 Suivi des paramètres comportementaux et de la croissance pondérale des rats........... 22
3.2.2.6 Techniques d’analyse des paramètres sanguins ........................................................... 23
3.2.2.6.1 Paramètres biochimiques………….………………………………….....………….23
3.2.2.6.2 Paramètres hématologiques…...………….………………..………………………..23
3.2.2.7 Etude histologique ........................................................................................................ 23
3.2.2.7.1 Dissection des rats ..................................................................................................... 23
3.2.2.7.2 Examens histologiques……......…………………………………………………….26
3.2.2.8 Analyse statistique........................................................................................................ 28
3.3 Résultats ............................................................................................................................. 29
3.3.1 Suivi des paramètres comportementaux et du poids des rats à j0 et j14 ......................... 29
3.3.2 Evolution des paramètres biochimiques .......................................................................... 31
3.3.3 Evolution des paramètres hématologiques ...................................................................... 33

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3.3.4 Effets de l’huile essentielle sur les structures hépatiques et rénales des rats expérimentaux
.................................................................................................................................................. 35
3.3.4.1 Histologie hépatique ..................................................................................................... 35
3.3.4.2 Histologie rénale .......................................................................................................... 35
3.4 Discussion .......................................................................................................................... 37
Conclusion, suggestions et perspectives .................................................................................. 41
Références bibliographiques .................................................................................................... 42

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LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Résultats du suivi des paramètres comportementaux ........................................... 30

Tableau II : Poids corporel en fonction du temps ................................................................... 30
Tableau III : Effets de l’HE de A. pubescens sur les paramètres biochimiques des rats. ....... 32
Tableau IV : Effets de l’HE de A. pubescens sur les paramètres hématologiques des rats. ... 34

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LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Photo de l’URMAT .................................................................................................. 6

Figure 2 : Mise en évidence de la production d’indole ........................................................... 12
Figure 3 : Illustration de la production ou non de la catalase.................................................. 12
Figure 4 : Illustration des présumés Salmonelles sur gélose TSI ............................................ 13
Figure 5 : Photo d’une galerie API 20E après incubation ...................................................... 13
Figure 6 : Lecture des diamètres d’inhibition ......................................................................... 15
Figure 7 : Photo de Aeollanthus pubescens (Yovo, 2017) ...................................................... 18
Figure 8 : Peson ....................................................................................................................... 21
Figure 9 : De la gauche vers la droite, tubes hématocrites, tubes EDTA et tubes secs ........... 22
Figure 10 : Photo montrant une canule (a) et le gavage des rats (b) (Ayihou, 2018) .............. 22
Figure 11 : Découpage de la peau à l’aide de de la sonde cannelée (Ayihou, 2018) .............. 24
Figure 12 : Découpage de la peau au niveau des pattes (Ayihou, 2018) ................................ 24
Figure 13 : Finition de l'ouverture du rat (Ayihou, 2018) ....................................................... 25
Figure 14 : Histologie hépatique ; agrandissement 400x (Ayihou, 2018)............................... 35
Figure 15 : Histologie rénale ; agrandissement 400x (Ayihou, 2018) .................................... 36

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LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

m : Micromètre
Alat : Alanine aminotransferase
API : Analytical Profile Index
Asat : Aspartate aminotransferase
CAMES : Conseil Africain et Malgache pour l’Enseignement Supérieur

CMB : Concentration Minimale Bactéricide

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

Créat : Créatinine
DPSA : Département de Production et Santé Animales
ENEAM : Ecole Nationale d’Economie, d’Administration et de Magistrature
EPAC : Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi
FAO : Food and Agriculture Organization
FSS : Faculté des Sciences de la Santé
HE : Huile Essentielle
ISBA : Institut des Sciences Biomédicales Appliquées
LARBA : Laboratoire de Recherche en Biologie Appliquée
LERCA : Laboratoire d’Etude et de Recherche en Chimie Appliquée
NFS : Numération Formulaire Sanguine
OCDE : Organisation pour Coopération et Développement Economiques
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
UAC : Université d’Abomey- Calavi
URMAT : Unité de Recherche sur les Maladies Transmissibles

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RESUME

Le présent stage de fin de formation en Licence Professionnelle a été effectué de juillet 2018 à
janvier 2019 au sein de l’Unité de Recherche sur les Maladies Transmissibles (URMAT) du
Département de Production et Santé Animales (PSA). Durant cette période, nous avions mené
plusieurs activités en vue de renforcer nos compétences en microbiologie et pathologies
animales. Par ailleurs, nous avions évalué d’une part, la toxicité aiguë de l’huile essentielle de
Aeollanthus pubescens dont l’activité antimicrobienne a été prouvée in vitro par des études
antérieures et d’autre part, étudié les effets de cette huile essentielle sur les paramètres
biochimiques (Alat, Asat, urée, créatinine et cholestérol), hématologiques et histologiques chez
les rats Wistar soumis à l’action de cet extrait. Pour ce faire, neuf (09) rats Wistar tous des
mâles, âgés de 12 semaines et ayant un poids supérieur à 140 g ont été répartis en trois lots de
trois (03) rats chacun : le lot 1 est constitué de rats témoins normaux, le lot 2 de rats normaux
ayant reçu l’extrait de A. pubescens par gavage à une dose de 2000mg/kg de poids corporel et
enfin le lot 3 constitué de rats normaux ayant reçu l’extrait de A. pubescens par injection intra
musculaire à une dose de 2000mg/kg de poids corporel. La durée de l’expérimentation était de
14 jours. A l’issue de cette étude, l’huile essentielle de A. pubescens n’a entrainé aucune
mortalité chez les rats expérimentaux, ce qui dénote que l’extrait ne présente pas une toxicité
aiguë à cette dose. Les analyses biochimiques et hématologiques n’ont révélé aucun effet
néfaste (p>0,05) sur les bilans hépatique (Alat et Asat), rénal (urée, créatinine), lipidique
(cholestérol) et les paramètres hématologiques dosés chez ces animaux. L’examen histologique
n’a montré aucune altération des structures hépatiques et rénales. Cette huile pouvant être
considérée GRAS (Generally Recognized as Safe) à la dose expérimentale peut être
valablement utilisée dans la lutte contre les pathologies d’origine bactérienne.

Mots-clés : Aeollanthus pubescens ; Toxicité aiguë ; huile essentielle ; Rats Wistar ;

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ABSTRACT

Current training course in professional license was conducted from July to October 2018 to the
Research Unit of Transmitted Diseases (URMAT), Department of Animal Production and
Health (PSA). During this period, there were several activities to strengthen our theoretical
skills in animal production and health. On one hand, we assessed the acute toxicity of the
essential oil of Aeollanthus pubescens, whose antimicrobial activity has been proven by
previous studies in this unit, and on the other hand, we assessed the effects of this essential oil
on biochemical parameters (Alat, Asat, urea, creatinine and cholesterol), hematological and
performed histopathological examination of organs such as liver and kidneys in Wistar rats. For
this purpose, nine (09) Wistar rats, all males, 12 weeks old and weighing more than 140 g were
distributed in three lots of three (03) rats each (lot 1: normal control rats, lot 2: normal rats
receiving A. pubescens extract by gavage at a dose of 2000 mg / kg body weight and lot 3:
normal rats receiving A. pubescens extract by intramuscular injection at a dose of 2000 mg / kg
body weight) for 14 days of experimentation. At the end of this study, the essential oil of A.
pubescens did not cause any mortality, which therefore revealed a lethal dose of 50% (LD50)
greater than 2000 mg / kg of body weight. Biochemical and hematological analyzes show that
the essential oil has no effect (p> 0.05) on the hepatic assessment (Alat and Asat), the renal
balance (urea, creatinine), the lipid profile (cholesterol) and the hematological parameters
measured in these animals. Histopathological examination confirmed the biochemical and
hematological analyzes which also showed no alteration of the hepatic and renal structures
showing that the essential oil of Aeollanthus pubescens exhibits neither toxic effects on the liver
and kidneys, nor a Acute toxicity at 2000 mg / kg body weight in Wistar rats. This oil recognized
GRAS (Generally Recognized As Safe) having no toxic effect can be validly used in the
endogenous fight against bacterial pathologies.

Keywords: Aeollanthus pubescens; Acute toxicity ; Essential oil ; Rats Wistar;

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez
les rats Wistar

Introduction
L’élevage est un pilier très important pour l’alimentation et l’économie des pays du tiers monde
et constitue un secteur en plein essor en Afrique de l’Ouest. Les modes de production actuels,
permettant une plus grande productivité, ont considérablement introduit des facteurs de risque
et les performances de ce secteur sont freinées par plusieurs obstacles d’ordre sanitaire dont les
pathologies (Abdel-Aziz, 2007 ; DE, 2018). Face à ces pathologies, les moyens de lutte des
éleveurs reposent essentiellement sur l’utilisation des molécules de synthèse notamment les
antibiotiques. L’utilisation abusive de ces molécules de synthèse, a entraîné une augmentation
inquiétante du nombre de souches pathogènes multirésistantes (Sessou et al., 2018 ;
Aguidissou, 2019). L’antibiorésistance est devenue une préoccupation majeure dans le monde
et grève lourdement l’économie mondiale du fait des pertes économiques liées à la baisse de la
productivité provoquée par les pathologies et l’augmentation du coût des traitements (OMS,
2016). Dès lors, la médecine traditionnelle et la pharmacopée africaine apparaissent de plus en
plus comme une alternative thérapeutique dans les systèmes de santé (OMS, 2013). En Afrique,
le recours à la médecine et à la pharmacopée traditionnelle est une pratique très courante dans
les campagnes et même dans les villes et plus de 90% de la population des pays y ont recours
pour leur soin de santé primaire et leur subsistance (Jiofack et al., 2010). L’exploitation
rationnelle de la médecine traditionnelle africaine peut contribuer à résoudre les problèmes
d’accessibilité géographique et économique de la majorité des populations à des médicaments
efficaces contre les souches multirésistantes (Scimeca et Tétau, 2005 ; Beddou, 2015). Malgré
ce vaste attrait, les produits de la médecine traditionnelle notamment les extraits de plantes sont
douteux à cause du manque de preuves scientifiques quant à leurs propriétés pharmacologiques
et leur innocuité (Albericio et al., 2010). Dans les études récentes, des extraits de plusieurs
plantes ont été investigués et ont montré des propriétés antivirales, antibactériennes, anti-
inflammatoires, antipaludiques, antifongiques intéressantes in vitro. Parmi ces plantes, figure
Aeollanthus pubescens. L’huile essentielle de cette plante a présenté in vitro une forte activité
antimicrobienne vis-à-vis de E. coli et de Salmonella isolées chez les poulets (Sessou et al.,
2018 ; Aguidissou, 2019) et contre Staphylococcus aureus, Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus à coagulase négative et Klebsiella pneumoniae ATCC 818 E isolés chez les
humains (Yovo, 2017). Etant donné que l’efficacité d’une molécule thérapeutique prend en
compte ses potentialités in vitro et in vivo et son innocuité, il est donc important d’évaluer la
toxicité de cette huile essentielle et ses propriétés in vivo afin de mieux valoriser cette ressource.
C’est dans ce contexte que s’inscrit le présent travail qui a pour objectif principal d’évaluer la

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez des rats Wistar. De façon
spécifique, il s’est agi de:

o évaluer la toxicité aiguë apparente de l’huile essentielle de A. pubescens chez les rats
Wistar;
o étudier les effets de cette huile essentielle sur certains paramètres biochimiques sérique de
la fonction hépatique, rénale et lipidique ainsi que sur certains paramètres hématologiques ;
o faire un examen histologique du foie et des reins des animaux soumis à cet extrait pour
apprécier les différentes altérations structurales au niveau de ces organes.

Le présent rapport est structuré en trois parties : la première porte sur les généralités du stage,
la deuxième présente les activités menées et les difficultés rencontrées au cours du stage et la
troisième est consacrée à l’évaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollenthus
pubescens chez les rats Wistar.

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Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Première partie :

Généralités sur le stage

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

1. Généralités sur le stage

1.1 Contexte du stage
L’Etat Béninois dispose de plusieurs établissements publics de formations techniques et
professionnelles qui ont pour mission de former des cadres supérieurs pour le développement
de sa nation. Parmi ces établissements, figure l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi
(EPAC) de l’Université d’Abomey- Calavi (UAC), créée par le décret N°2002-551 du 16
décembre 2002, modifié par décret N°2005-078 du 25 février 2005 portant création,
attribution, organisation et fonctionnement de l’EPAC. C’est un établissement public
d’enseignement supérieur, de formations techniques et professionnelles, à caractère de grande
école dotée d’une autonomie financière et d’un règlement pédagogique. L’EPAC dispose de
deux grands secteurs d’enseignements : le secteur industriel et le secteur biologique.
Le secteur biologique est composé de cinq (05) départements dont le département de Génie de
Biologie Humaine (GBH) ; le département de Génie d’Imagerie Médicale et de Radiobiologie
(GIMR); le département de Production et Santé Animales (PSA); le département de Génie de
l’Environnement (GEn) et le département de Génie de la Technologie Alimentaire (GTA).
Le secteur industriel est composé de sept (07) départements dont le département de Génie Civil
(GC) ; le département de Génie Électrique (GE) ; le département de Génie de Maintenance
Biomédicale et Hospitalière (MBH) ; le département de Génie Informatique et
Télécommunication (GIT) ; le département de Génie Mécanique et Énergétique (GME) ; le
département de Génie de Chimie des Procédés et le département des Sciences fondamentales.
Dans le cadre de la professionnalisation de l’enseignement supérieur, la formation en licence
professionnelle a été instaurée dans le secteur biologique depuis l’année académique 2005-
2006. Cette formation se renforce aujourd’hui avec les réformes en cours sur le LMD
(Licence-Master-Doctorat) dans le REESAO (Réseau pour l’Excellence de l’Enseignement
Supérieur en Afrique de l’Ouest). La formation en licence professionnelle à l’EPAC dure
t r o i s ( 0 3 ) ans répartis en six (06) semestres dont cinq (05) sont destinés aux cours
théoriques et aux travaux pratiques et un (01) aux stages de fin de formation en entreprise. Au
cours de la formation, des stages d’un mois sont organisés et considérés comme des Unités
d’Enseignement (UE). Dans le cadre de la préparation du rapport de fin de cycle pour
l’obtention du diplôme de licence professionnelle en Production et Santé Animales, l’Ecole
Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC) a prévu un stage pratique de trois (03) mois à l’issue
duquel l’étudiant rédige et soutient un rapport.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

C’est dans ce cadre que nous avons effectué notre stage pratique de fin de formation à l’Unité
de Recherche des Maladies Transmissibles (URMAT) qui est en collaboration avec le
Laboratoire d’Etude et de Recherche en Chimie Appliquée (LERCA), afin de renforcer nos
connaissances acquises au cours des trois années de formation.

1.2 Lieu et période du stage

Dans le cadre de notre stage de troisième année devant conduire à l’obtention de la Licence
Professionnelle au département de Production et Santé Animales de l’EPAC, nous avons choisi
l’Unité de Recherche sur les Maladies Transmissibles (URMAT) aux fins d’approfondir les
notions reçues en microbiologie et pathologies animales et d’évaluer la toxicité aigüe de l’huile
essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar. Ce stage a été effectué du 02 juillet
2018 au 02 janvier 2019.

1.3 Présentation de l’URMAT

1.3.1 Historique et objectifs de l’URMAT

L’URMAT est une unité de recherche créée et intégrée au Laboratoire de Recherche en Biologie
Appliquée (LARBA) le 03 avril 2009. Elle est dirigée par Monsieur Souaïbou FAROUGOU,
Professeur Titulaire des Universités (CAMES). Ce dernier est assisté d’une équipe constituée
de Professeurs Titulaires, de Maîtres de Conférences (CAMES), de Maîtres-Assistants
(CAMES) et des Assistants. Cette unité accueille des mémorants et des doctorants pour leur
stage de fin de formation. Le laboratoire réunit des spécialistes en pathologies animales, en
parasitologie, en microbiologie, en zootechnie, en normes et contrôle de la qualité des aliments
et en génétique animale. Le domaine de compétences de base de cette unité est le contrôle de
la qualité des aliments, la microbiologie, les pathologies infectieuses, la parasitologie et les
maladies transmissibles. Le programme de recherche de l’URMAT est centré autour des
thématiques ci-dessous :
- amélioration génétique des animaux domestiques ;
- tiques du bétail et pathologies transmises ;
- qualité microbiologique des aliments ;
- conservation des aliments ;
- pathologies infectieuses des animaux domestiques.
Cette unité possède un laboratoire d’acarologie mis en service en mai 2015 et spécialisé dans
la recherche des méthodes de lutte endogène contre les tiques résistantes aux acaricides de
synthèse utilisés sur le bétail.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Figure 1 : Photo de l’URMAT

1.3.2 Forces et faiblesses

1.3.2.1 Forces

L’URMAT est conduite par un personnel dynamique et qualifié qui assure sa bonne marche.
Cette unité de recherche, à travers son responsable, s’est dotée de deux bâtiments. Le premier,
destiné à la biologie moléculaire, à la microbiologie, à l’immunologie et aux pathologies
infectieuses, est équipé de matériels et consommables dont les principaux sont : trois (03)
étuves, deux (02) spectrophotomètres, un (01) autoclave, un (01) bain-marie, quatre (04)
centrifugeuses, un (01) four à micro-onde, deux (02) microscopes photoniques (Olympus), deux
(02) microscopes stéréoscopiques, une (01) hotte à flux laminaire, une (01) balance
électronique, un (01) agitateur de type vortex, quatre (04) réfrigérateurs, un (01) congélateur,
deux (02) ordinateurs de bureaux, un (01) ordinateur portatif, deux (02) thermocycleurs, un (01)
dispositif pour l’électrophorèse en gel d’agarose, des consommables pour la parasitologie, la
microbiologie, la biologie moléculaire et des ouvrages didactiques et de recherche (collections
d’articles). Le deuxième bâtiment mis en service en mai 2015, dispose d’un (01) laboratoire en
acarologie, d’une (01) étable, d’une (01) salle polyvalente et des bureaux pour les assistants.
En plus de ces matériels, l’URMAT dispose d’une connexion WIFI internet qui permet aux
étudiants et aux différents chercheurs de réaliser leurs travaux dans de meilleures conditions.
Les recherches dans cette unité de recherche se font en partenariat avec le Laboratoire d’Etude
et de Recherche en Chimie Appliquée (LERCA), le Centre International de Recherche
Développement sur l’Elevage en zone Subhumide (CIRDES) basé au Burkina-Faso, la Faculté
de Médecine Vétérinaire de Liège (Belgique), l’Institut de Médecine Tropicale Prince Léopold
d’Anvers (Belgique) et l’Ecole Vétérinaire de Lyon (France).

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

1.3.2.2 Faiblesses

L’URMAT est un laboratoire très bien équipé et très organisé, mais elle présente également des
insuffisances telles que l’inexistence de groupe électrogène et de forage pour l’alimentation du
laboratoire en cas de coupure d’électricité et d’eau. Le manque de réactifs et d’équipements
pour des travaux de sérologie font partie des faiblesses de cette unité.

Yannick S. AYIHOU/UAC/EPAC/PSA/2018 7
Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Deuxième partie :
Activités menées et difficultés rencontrées

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

2.1 Activités menées

Plusieurs activités ont été menées sur le terrain, à l’étable et à l’URMAT tout au long de notre
stage.
2.1.1 Sur le terrain
Sur le terrain, nous avions participé à la collecte d’échantillons d’aliments vendus en
restauration collective dans des centres commerciaux de quatre campus (campus de Calavi,
ENEAM, FSS, campus d’Adjarra) de l’Université d’Abomey-Calavi. Ces échantillons étaient
essentiellement constitués d’aliments solides (« atchèkè », akassa + « monyo »,
pain+ « adohouè », « wassa- wassa ») et d’aliments liquides (jus de bissap, jus d’ananas,
« akpan », « dèguè »).
Nous avions également participé à une étude épidémiologique rétrospective des cas cliniques
de rage déclarés de 2012 à 2017. Cette étude a été réalisée auprès des cabinets vétérinaires, des
services sanitaires, des directions départementales de l’agriculture, de l’élevage et de la pêche
(DDAEP), de la direction de l’élevage (DE) et auprès de la population dans les villes
d’Abomey-Calavi, Cotonou et Ouidah.

2.1.2 A l’étable de l’URMAT

A l’étable, les activités menées étaient principalement le service d’aliment et d’eau aux rats
avec un aliment complet standard sous forme granulés, provende ‘mère lapereaux’ et de l’eau
de forage ; le nettoyage quotidien des cages, des mangeoires et abreuvoirs et de l’environnement
d’élevage ; le suivi et les observations quotidiens des animaux au cours de l’expérimentation.

2.1.3 Au laboratoire de l’URMAT

Au cours de notre stage, nous avions participé au dénombrement et/ou recherche de la flore
aérobie mésophile totale, des levures et moisissures, des coliformes totaux et fécaux, des
anaérobies sulfito-réducteurs (ASR), de Staphylococcus aureus et Salmonella dans les
échantillons d’aliments collectés sur les campus universitaires d’Abomey-Calavi.

2.1.3.1. Dénombrement de certaines flores dans les aliments investigués

Réalisation des dilutions décimales successives

La première dilution (10-1) a été obtenue en mélangeant 25 ml ou 25g de l’échantillon et 225
ml d’eau peptonée tamponnée (OXOID CM0509). Une quantité équivalente (25 ml) a
également été mélangée à 225 ml d’eau peptonée tamponnée pour la recherche de Salmonella
spp. Les différentes dilutions décimales ont été réalisées à partir de la première dilution,
conformément à la norme NF ISO 6887-1 : 2017. Nous avions prélevé 01 ml de cette dilution
Yannick S. AYIHOU/UAC/EPAC/PSA/2018 9
 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

dans 09 ml de diluant (Tryptone sel) stérilisé, contenu dans un tube à essai. Après
homogénéisation avec un vortex, la dilution 10-2 a été obtenue. Des dilutions successives ont
été ainsi réalisées jusqu’à la dilution 10-6.

Flore aérobie mésophile totale

Le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale a été fait sur la gélose Plate Count Agar
(PCA OXOID CM0463) suivant la Norme NF EN ISO 4833-2 : 2013. 1 ml de la suspension
mère de chaque échantillon et 1 ml de chacune de ses dilutions ont été prélevés à l’aide d’une
pipette graduée stérile et transférés dans leurs boîtes de Pétri respectives. Ensuite, 10 à 15 ml
du milieu PCA ont été coulés dans chaque boîte préalablement inoculée puis homogénéisée
immédiatement et délicatement. Après solidification, les boites de Pétri ont été incubées à 30
°C pendant 72 heures. Seules les boîtes de Pétri contenant entre 30 et 300 colonies ont été prises
en compte lors du dénombrement.

Levures et moisissures
Dans le cas des levures, la gélose Sabouraud Dextrose agar (OXOID CM 0041) additionnée de
chloramphénicol (1g/l) a été pré-coulée dans les boîtes de Pétri. 0,1 ml de chacune des
différentes dilutions a été étalé dans les boites pré-coulées. Les boîtes ont été incubées à 25 °C
pendant 5 jours puis les levures et moisissures ont été dénombrées conformément à la norme
NF ISO 21527-1 : 2008 et NF ISO 215272 : 2008.

Coliformes totaux et fécaux

Les coliformes totaux et fécaux ont été dénombrés sur le milieu Brillance E. coli Agar (OXOID
CM01046) respectivement suivant les normes NF ISO 4831 : 2006 et NF V08-060 : 2009. 0,1
ml de la suspension mère et 0,1 ml de chacune des dilutions 10-1, 10-2 et 10-3 a été prélevé à
l’aide d’une pipette graduée stérile et ensemencé dans différentes boîtes de Pétri stériles
contenant le milieu pré-coulé.
La lecture a été faite après 24 heures d’incubation à 37 °C pour les coliformes totaux et après
24 heures d’incubation à 44 °C pour les coliformes fécaux.

Anaérobies sulfito-réducteurs (ASR)

Le dénombrement des ASR a été fait suivant la norme NF V 08-061 : 2009. Le milieu utilisé
pour ce dénombrement est le Trypticase-Sulfite-Neomycine Agar (TSN Biokar 001HA). 1 ml
des inocula ont été répartis dans des tubes stériles. Ces tubes ont été mis au bain-marie à 80 °C
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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

pendant 10 minutes pour le dénombrement des spores des germes Anaérobies Sulfito-
Réducteurs (ASR). Ensuite, le milieu TSN a été coulé en deux couches dans les tubes inoculés
puis, après solidification complète, ils ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures.
La lecture des colonies nettement noires dont la taille varie en fonction de l’espèce a été faite
après 24 heures d’incubation à 37 °C.

Staphylocoques présumés pathogènes

La numération a été faite sur le milieu Baird Parker (BP OXOID CM09761) suivant la norme
NF EN ISO 6888-3 : 2003. La gélose de Baird Parker additionnée du plasma de lapin et du
fibrinogène (RPF) a été coulée et refroidie dans des boîtes de Pétri. Après solidification, 0,1 ml
de la solution mère et des différentes dilutions a été étalé sur toute la surface des boîtes.
L’incubation a été faite à 37 °C pendant 24 à 48 heures. Après cette période, des colonies noires,
brillantes, convexes de 1,5 mm, entourées d’une zone opaque et d’un halo clair ont été
dénombrées.

Salmonelles
La recherche des Salmonelles a été faite en quatre étapes suivant la norme NF EN ISO 6579-1:
2017 sur les géloses Hektoen (OXOID CM0419) et XLD (OXOID CM0469) :
o le pré enrichissement a été effectué en incubant la solution mère (25 ml ou 25 g d’aliment
+ 225 ml d’Eau Peptonée Tamponnée (OXOID CM0509)) pendant 18 à 24 heures à 37 °C
;
o l'enrichissement : les bouillons Rappaport-Vassiladis (RV) et MKTTn ont été utilisés. 0,1
ml et 1 ml du milieu pré-enrichi ont été transférés respectivement dans un tube chacun
contenant au préalable 10 ml du milieu RV et 10 ml de MKTTn. Les tubes ensemencés ainsi
que le témoin ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures pour le MKTTn et 41,5°C pour le
Rappaport Vassiliadis;
o l'isolement : les milieux Hektoen (OXOID CM0419) et XLD (OXOID CM0469) ont servi
à l’isolement. Ainsi, une oëse du milieu enrichi a été prélevée puis ensemencée dans des
boîtes de Pétri contenant au préalable le milieu Hektoen ou XLD. Les boîtes ont été incubées
à 37 °C pendant 24 heures.
o l’identification des colonies présumées Salmonella au moyen des galeries biochimiques
d’identification après quelques tests d’orientation tels que la coloration de Gram, la mise en
évidence de la production d’indole, le test de catalase et le test aux trois sucres (TSI).

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Test de production d’Indole

Pour le test d’indole (figure 2), une colonie isolée a été prélevée de la gélose nutritive et
introduite dans de l’Eau Peptonée exempte d’indole et incubée à 37 °C pendant 24 heures.
Après ajout d’une goutte du réactif de KOVACS, l’obtention d’un un anneau de couleur rose
indique la production d’indole par le microorganisme. .

Figure 2 : Mise en évidence de la production d’indole

Test de catalase
La catalase est une enzyme respiratoire qui catalyse la libération de molécules d'eau et
d'oxygène à partir de peroxyde d'hydrogène selon la réaction suivante :

Pour mettre en évidence cette enzyme, une partie de la colonie suspecte a été mise au contact
d’une goutte d’eau oxygénée (H2O2) sur une lame de verre. L’obtention d’une effervescence
(Figure 3) indique une réaction positive.

Figure 3 : Illustration de la production ou non de la catalase

Culture des présumés salmonelles sur la gélose TSI

A partir d’une colonie suspecte prélevée sur un milieu d’isolement sélectif (Hekteon), nous
avions ensemencé le milieu TSI (Triple Sugar Iron) préalablement réparti en pente dans des

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

tubes par piqûre centrale et la surface inclinée par des stries serrées. Après 24 heures
d’incubation à 30 °C, la fermentation du glucose se traduit par une coloration jaune du culot
coloré contrairement au lactose et au saccharose. Par ailleurs, on note également la production
de gaz et la formation du sulfure d’hydrogène (H2S) (figure 4).

Figure 4 : Illustration des présumés Salmonelles sur gélose TSI

Identification biochimique des souches pathogènes

La galerie API 20E est un système pour l'identification des entérobactéries et autres bacilles à
Gram négatif. Elle comporte 20 microtubes contenant des substrats déshydratés. Ces substrats
ont été inoculés avec la suspension du germe à identifier (E. coli, Salmonella spp). Après
incubation à 37°C pendant 24 heures, les réactions sont traduites par des changements
spontanés de coloration révélés par l’addition ou non des réactifs. La lecture a été faite à l’aide
du catalogue analytique API 20E et du logiciel d’identification Abis Online.
L’identification des présumés S. aureus a été faite à l’aide de la galerie API 20S et de la galerie
Microbact 12S de marque OXOID conformément aux instructions des fabricants de chaque
galerie.

Figure 5 : Photo d’une galerie API 20E après incubation

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

2.1.3.2. Détermination du profil de sensibilité ou de résistance aux antibiotiques des

principales espèces pathogènes présents dans les aliments.
La sensibilité ou la résistance des souches isolées à 11 antibiotiques a été évaluée suivant la
méthode de diffusion sur disque sur la gélose Mueller Hinton conformément aux
recommandations du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Les 11 antibiotiques
commercialisés par BIORAD testés sont : Amoxicilline + acide clavulanique (AMC, 20/10
µg) ; Céfotaxime (CTX, 30 µg) ; Ampicilline (AMP10 µg) ; Gentamicine (GMN, 10 µg) ;
Aztréonam (ATM, 30 µg) ; Chloramphénicol (CHL, 30 µg) ; Ciprofloxacine (CIP, 5 µg) ;
Cephalotine (CEF, 30 µg) ; Tétracycline (TET, 30 µg) ; Céfoxitine (FOX, 30 µg) ; Sulfonamide
(SSS, 300 µg). La méthode a consisté à ensemencer les boites de Pétri contenant la gélose
MHA avec un inoculum puis à déposer les disques et enfin interpréter les résultats obtenus
après incubation.
Inoculum et ensemencement
A partir d’une culture pure de 24 heures sur gélose nutritive, une colonie bien isolée a été
prélevée à l’aide d’une anse de platine stérile et mise en suspension dans du bouillon Brain
Heart Infusion (BHI) pendant 2 heures. Cette suspension a une charge approximative de l’étalon
0,5 de l’échelle de Mc Farland. Enfin, l’inoculum a été ensemencé sur la gélose Mueller-Hinton
préalablement coulée dans des boîtes de Pétri.
Dépôt de disques d’antibiotique et incubation
A l’aide d’une pince stérile, des disques d’antibiotiques ont été délicatement déposés à la
surface de la gélose. Les boîtes ont été laissées à la température ambiante (25°C) pendant
15min, puis incubées à 37°C pendant 18 à 24 heures.
Lecture et interprétation
Le diamètre de la zone d’inhibition a été mesuré à l’aide d’un pied à coulisse. Il a été ensuite
comparé aux diamètres de référence d’inhibition de disques d’antibiotiques. Cette comparaison
a permis de classer les souches en trois catégories (résistantes, intermédiaires ou sensibles).

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Figure 6 : Lecture des diamètres d’inhibition

2.2 Difficultés rencontrées et solutions envisagées

Au cours de notre stage, la bonne partie de nos travaux s’est déroulée dans de bonnes
conditions, ce qui nous a permis d’obtenir des résultats fiables. Néanmoins, nous avions été
confrontés à quelques difficultés parmi lesquelles, nous pouvons citer les coupures fréquentes
du courant électrique et d’eau, les conditions climatiques qui nous empêchaient de réaliser par
moment les enquêtes sur le terrain, les difficultés d’accès à l’information auprès des cabinets
vétérinaires et de la population au cours de l’enquête sur la rage.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

2.3 Problèmes identifiés

L’utilisation abusive des molécules de synthèse notamment les antibiotiques, a entraîné
l’émergence inquiétante de nombreuses souches pathogènes multi-résistantes notamment les
souches de Escherichia coli et de Salmonella dans les élevages. Ces souches ont acquis
progressivement les gènes de résistance aux antibiotiques majeurs utilisés tant en médecine
vétérinaire qu’en médecine humaine et laissant craindre la perspective d’impasse thérapeutique
pour les infections les plus sévères. A l’Unité de Recherche sur les Maladies Transmissibles
(URMAT), plusieurs travaux ont été menés, s’inscrivant dans la recherche des moyens de lutte
endogène contre ces pathogènes. C’est ainsi que l’huile essentielle de A. pubescens a présenté
in vitro une forte activité antimicrobienne vis-à-vis de E. coli isolée chez les poulets (Sessou et
al., 2018), Staphylococcus aureus, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus à coagulase
négative, Klebsiella pneumoniae ATCC 818 E isolées chez l’homme (Yovo, 2017) et des
souches de E. coli et de Salmonella multirésistantes isolées des élevages de poules pondeuses
(Aguidissou, 2019). Cependant, ces études n’avaient pas pris en compte le profil toxicologique
de cette huile en vue de mettre au point une molécule thérapeutique susceptible de lutter
efficacement contre ces pathogènes. C’est dans ce contexte que, au cours de notre stage, nous
avions choisi d’évaluer la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez
les rats Wistar en vue de mieux valoriser cette ressource naturelle et de permettre aux éleveurs
du Bénin de contrôler les pathologies et à moindre coût.

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Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Troisième partie :
Evaluation de la toxicite aiguë de l’huile essentielle

de Aeollanthus pubescens chez les rats wistar

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

3.1 Généralité sur l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens

3.1.1 Description botanique de la plante
 Famille : Lamiaceace
 Synonyme : Aeollanthus buettneri, Aeollanthus chevalieri
 Noms vernaculaires : (Yoruba) Iko, yiye, nindi
Aeollanthus pubescens est une plante herbacée annuelle très odorante appartenant à la famille
des Lamiaceae. C’est une plante répertoriée dans plusieurs pays de l’Afrique de l’Ouest
notamment au Nigéria, dans les savanes et sur les zones montagneuses du Togo, ainsi qu’au
Bénin où elle pousse généralement sur les affleurements rocheux (Alitonou et al., 2006 ; Yovo,
2017). La tige est quadrangulaire de 30 à 90 cm de hauteur, généralement très ramifiée, souvent
ligneuse à la base, de couleur rougeâtre et plus ou moins pubescente. Les feuilles, longues de 6
cm et larges de 2,5 cm en moyenne, sont opposées, pétiolées, oblongues ou lancéolées et
arrondies à l’apex. Le limbe est pourvu de nombreux poils glanduleux (Yovo, 2017).
L’inflorescence est composée d’épis denses terminaux, formant une panicule. La fleur est
réduite à une petite corolle bilabiée de couleur bleue, violette ou rose (Alitonou et al., 2006 ;
Yovo, 2017).

Figure 7 : Photo de Aeollanthus pubescens (Yovo, 2017)

3.1.2 Utilisation traditionnelle de la plante
Au Bénin, peu de renseignements sont donnés sur l’utilisation traditionnelle de cette plante
(Yovo, 2017). Cependant, au Togo les feuilles de A. pubescens sont des légumes bien connues
et très appréciés par les autochtones (Mawussi, 2008). Ils l’utilisent en médicine traditionnelle
pour le traitement de la diarrhée et des infections du tractus respiratoire (Alitonou et al., 2013).

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3.1.3 Composition chimique de l’huile essentielle

Des études ont porté sur la composition chimique des huiles essentielles des organes de cette
plante. L’analyse des huiles essentielles des organes (fleurs, tige feuillée et partie entière) de
Aeollanthus pubescens a révélé que ces huiles contiennent majoritairement de thymol, d’acétate
de thymyle, de cymène, de terpinène et de carvacrol (Sohounhloue et al., 2002 ; Alitonou et al.,
2013). L’huile essentielle des feuilles de Aeollanthus pubescens contient aussi de fenchone
(Koba et al., 2004).

3.1.4 Activités biologiques de l’huile essentielle

Les huiles essentielles extraites des fleurs, de la tige feuillée et de la plante entière de A.
pubescens ont exercé une forte activité antimicrobienne vis-à-vis de Staphylococcus aureus,
Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus à coagulase négative et Klebsiella pneumoniae
ATCC 818E avec des CMI et CMB variant entre 0,13 et 0,80 mg/ml (Yovo, 2017). L’huile
essentielle de Aeollanthus pubescens possède également une propriété insecticide contre les
insectes Hypothenemus hampei (Mawussi et al., 2009). Par ailleurs, cette huile présente
d’intéressantes activités antibactériennes contre les souches de Escherichia coli et Salmonella
multirésistantes isolées dans les élevages de poules pondeuses au Bénin (Aguidissou, 2009).

3.1.5 Toxicité
A des concentrations de 50 à 1500 μg.ml-1, aucune activité cytotoxique de l’huile essentielle de
Aeollanthus pubescens n’a été observée sur la lignée cellulaire épidermique humaine HaCat,
mais à une concentration se situant entre 1700 à 3000 μg.ml-1, une toxicité élevée a été observée
(Koba et al., 2007).

3.2 Matériels et méthodes

3.2.1 Matériels
Il est constitué du matériel biologique, du matériel végétal et du matériel de laboratoire.
3.2.1.1 Matériel biologique
Le matériel biologique est constitué essentiellement des rats Wistar, de sexe masculin et de
poids corporel compris entre 145g et 220g. Ces animaux ont été placés dans des cages et ont un
accès libre à une alimentation standard et à l’eau. Les animaux ont été mis en acclimatation
pendant sept (07) jours avant le début des expérimentations.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

3.2.1.2 Matériel végétal

Il est constitué de la partie entière de la plante de Aeollanthus pubescens récoltée à Dassa-
Zoumé dans le département des Collines. Elle a été envoyée au Laboratoire d’Etude et de
Recherche en Chimie Appliquée (LERCA), pour l’extraction de l’huile essentielle qui a été
obtenue par la technique d’hydrodistillation au moyen d’un appareil de type Clevenger au

3.2.1.3 Matériel de laboratoire

Il est constitué essentiellement d’un peson de portée allant jusqu’à 50 kg et d’une précision de
 0.08 kg pour la pesée des animaux, des tubes hématocrites pour le prélèvement sanguin par
capillarité, des tubes sans anticoagulant et avec anticoagulant pour le prélèvement sanguin,
d’automates et de spectrophotomètre, respectivement pour le dosage des paramètres
hématologiques et biochimiques, de centrifugeuse, d’un bocal expérimental pour rongeur et
d’une boite à dissection.

3.2.2 Méthodes
Les études de toxicité aiguë ont été menées conformément à la Directive de l'OCDE
(Organisation pour Coopération et Développement Economiques, Guideline-423, adopté le 17
décembre 2001).

3.2.2.1 Préparation des rats

L’expérience a été réalisée sur neuf (09) rats mâles Wistar de 12 semaines d’âge, de poids
supérieur à 140g. Le choix de ce modèle animal a été fait pour les raisons suivantes :
 les rats sont des animaux dociles et faciles à manipuler ;
 ils sont peu agressifs ;
 ils sont les modèles d’animaux les mieux adaptés et les plus utilisés dans des études
similaires citées par la littérature.
Les rats ont été répartis selon l’homogénéité de leurs poids et de leurs âges en 3 lots
expérimentaux de trois (03) rats chacun. L’élevage des animaux ainsi que les différents tests
ont été réalisés à l’URMAT. En effet, les animaux ont été hébergés dans des cages qui ont été
nettoyées quotidiennement. Ils ont été nourris à base d’aliment complet standard sous forme
granulés, provende ‘mère lapereaux’ fourni par le Groupe Véto Service S.A. (G.V.S.) et
maintenu à température ambiante (25°C) et alimentés ad’libitum en eau de forage. Un éclairage
artificiel faisant alterner des séquences de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité a été
assuré.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Les animaux ont été choisis au hasard, puis marqués individuellement à dessein d’identification
et ont subi une période d’adaptation de sept (07) jours avant l'administration du traitement, afin
qu'ils s'acclimatent aux conditions du laboratoire.

3.2.2.2 Pesée et répartition des rats

Le poids des rats a été pris à l’aide d’un peson. Neuf (09) rats mâles ont été utilisés et ils ont
été répartis en 3 lots de trois (03) rats chacun :
Lot 1 : Rats témoins normaux n’ayant reçu aucun extrait.
Lot 2 : Rats normaux ayant reçu l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens par gavage à une
dose de 2000mg/kg de poids corporel.
Lot 3 : Rats normaux ayant reçu l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens par injection intra-
musculaire à une dose de 2000mg/kg de poids corporel.

Figure 8 : Peson

3.2.2.3 Prélèvement sanguin

Le prélèvement sanguin a été effectué suivant la méthode décrite par Costa-Silva et al., (2008),
à l’aide de tubes hématocrites à travers le sinus rétro-orbital au niveau de l’œil, avant et 14 jours
après l’administration de l’extrait. Les rats ont été anesthésiés avec de l’éther par inhalation
pendant 2 à 3 minutes sous un bocal expérimental pour rongeur de laboratoire hermétiquement
fermé. Le sang a été recueilli dans deux différents tubes, un tube sec pour le dosage des
paramètres hématologiques (NFS) et un second tube EDTA pour le dosage de certains
paramètres biochimiques. Chaque tube a été numéroté pour faciliter l’identification tout au long
du processus d’analyse.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Figure 9 : De la gauche vers la droite, tubes hématocrites, tubes EDTA et tubes secs

3.2.2.4 Administration de l’extrait d’huile essentielle de Aeollanthus pubescens.

Tous les animaux ont été privés de nourriture 12 heures avant les tests. Après cette période de
jeûne, ils ont été pesés, puis l’huile essentielle de A. pubescens leur a été administrée. La dose
a été calculée en fonction du poids corporel à jeun de chaque animal. L’huile essentielle a été
administrée par gavage (per os) à l'aide d'une canule pour intubation appropriée aux rats du lot
2 et par injection intra musculaire à l’aide d’une seringue à insuline aux rats du lot 3. L’huile
essentielle de Aeollanthus pubescens a été administrée en une seule et unique dose à raison de
2000mg/kg de poids corporel.

a b

Figure 10 : Photo montrant une canule (a) et le gavage des rats (b) (Ayihou, 2018)

3.2.2.5 Suivi des paramètres comportementaux et de la croissance pondérale des rats

expérimentaux
La croissance pondérale ainsi que les paramètres comportementaux des rats ont été suivis avant
et durant 14 jours après l’administration de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens. La
peau, les poils, les yeux, les muqueuses, la respiration, l’activité motrice et le comportement

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

des rats expérimentaux ont été observés minutieusement durant les six premières heures (06h)
ayant suivi l’administration de l’extrait puis chaque jour jusqu’au quatorzième (14e) jour. Le
poids a été mesuré à l’aide d’une balance en gramme.

3.2.2.6 Techniques d’analyse des paramètres sanguins

La mesure des paramètres biochimiques a été réalisée par le spectrophotomètre (BioLabo
Diagnostics, Kenza Max, Biochemistry) et le dosage des paramètres hématologiques par
l'automate d'hématologie (Auto Hematology Analyzer, RT-7600, Rayto). Ces analyses des
paramètres biochimiques et hématologiques ont été réalisées au laboratoire JaCRoP de l’ONG
Vision Future.

3.2.2.6.1 Paramètres biochimiques

 Dosage de la cholestérolémie :
La teneur en cholestérol a été déterminée par spectrophotométrie suivant la méthode cinétique
décrite par Gabriela et al. (2005).

 Dosage d’Aspartate Amino Transférase (ASAT ou TGO) et d’Alanine Amino

Transférase (ALAT ou TGP), de l’urée et de la créatinine :
Les transaminases (Asat et Alat), l’urée et la créatinine ont été déterminés par
spectrophotométrie suivant la méthode décrite par Sangare et al. (2012).

3.2.2.6.2 Paramètres hématologiques

Les teneurs moyennes du sang en nombre de globules blancs (GB), lymphocytes (Lymph),
granulocytes (Gran), hémoglobine (HGB), globules rouges (GR), hématocrite (HCT), volume
globulaire moyen (VGM), teneur moyenne en hémoglobine (TMH), concentration
corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH), plaquettes (PLT) ont été les principaux
différents paramètres évalués chez ces rats. Ils ont été évalués à l’aide d’automate
hématologique suivant la méthode décrite par Sangare et al. (2012).

3.2.2.7 Etude histologique

La méthodologie utilisée est celle décrite par Ahossi (2016). Elle a été précédée d’une étape
préliminaire consistant à la dissection des rats réalisée au laboratoire de l’Unité de Recherche
sur les Maladies Transmissibles (URMAT).

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

3.2.2.7.1 Dissection des rats

A l'aide des aiguilles, le rat soumis à une anesthésie générale a été accroché au bac de dissection
au niveau des pattes. Cette étape facilite le déroulement de la dissection.
 La boutonnière
La boutonnière a été faite au-dessus de l'appareil uro-génital afin d'y introduire la sonde
cannelée. Il est important de signaler que seule la peau de l’animal a été pincée afin de ne pas
endommager les organes situés en dessous.
 Découpage de la peau au niveau de l’abdomen
A ce niveau, la sonde cannelée a été insérée avec précaution dans la boutonnière puis remontée
le long de l'abdomen tout en la gardant inclinée vers le haut. La peau a été ensuite découpée à
l’aide d’une paire de ciseau le long de la cannelure de la sonde.

Figure 11 : Découpage de la peau à l’aide de de la sonde cannelée (Ayihou, 2018)

 Découpage de la peau au niveau des pattes

Pour les pattes postérieures, la peau a été découpée à partir de la boutonnière jusqu'à la cheville
pour chacune des pattes tout en dessinant un Y à l'envers. Pour les pattes antérieures, la même
technique a été adoptée en partant du thorax.

Figure 12 : Découpage de la peau au niveau des pattes (Ayihou, 2018)

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 Finition de l'ouverture de la peau

A l'aide d'une pince et du scalpel, la peau a été dégagée délicatement de la paroi musculaire en
retirant les adhérences. Une fois les adhérences complètement retirées, la peau a été accrochée
au bac de dissection à l'aide des aiguilles.

Figure 13 : Finition de l'ouverture du rat (Ayihou, 2018)

 Mise en place de l'ouverture de la paroi musculaire

Pour l’ouverture de la paroi musculaire, la même procédure pour l’ouverture de la peau a été
adoptée. En effet, une boutonnière a été réalisée dans la paroi musculaire tout en faisant
attention aux organes sous-jacents. Ensuite, la sonde cannelée a été insérée tout en la gardant
toujours orientée vers le haut.

 Découpage de la paroi musculaire

La paroi musculaire a été découpée à l'aide d’une paire de ciseaux en suivant la cannelure de la
sonde. Quatre échancrures ont été ensuite réalisées, deux au niveau postérieur et deux justes en
dessous de la cage thoracique.

 Découpage du plastron thoracique

Pour observer les organes situés dans la région antérieure de l'organisme, il est nécessaire de
retirer la cage thoracique. Ainsi à l'aide d’une paire de ciseaux, les côtes de l'animal sur les
côtés ont été découpées et les organes de la cage thoracique ont été mis à nu. Le diaphragme
découpé tout en faisant attention aux adhérences pour garder l'animal propre (à cause du sang
risquant de couler si des vaisseaux sont sectionnés). Les reins et le foie ont été isolés pour
observer les changements histologiques éventuels.

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3.2.2.7.2 Examens histologiques

L’examen histologique a été réalisé à l’Institut des Sciences Biomédicales Appliquées (ISBA)
de la Faculté des Sciences de la Santé (FSS) de l’Université d’Abomey-Calavi.

 La préparation des cassettes

Les organes issus de l’autopsie (foie et reins) ont été lavés plusieurs fois avec de l’eau
physiologique puis tous les tissus adipeux adjacents et les éléments sanguins ont été retirés. Ces
différents organes ont été découpés en petits morceaux puis déposés dans des casettes spéciales
à parois trouées afin de permettre le passage des liquides pour la fixation.

 La fixation des tissus

Le fixateur utilisé est le formol à 10% tamponné. La conservation a été faite dans cette solution
pendant environ deux mois.

 La circulation
Elle consiste à faire séjourner les pièces de tissus dans une série de liquides afin de leur
conférer une rigidité favorable à la coupe ; cette circulation s’est déroulée en trois phases : la
déshydratation, l’éclaircissement et l’imprégnation.
En ce qui concerne la déshydratation, nous avions utilisé comme agent déshydratant, l’éthanol
car il présente une grande miscibilité à l’eau et permet un bon durcissement des tissus. La
déshydratation a été progressive, par passage des pièces de tissus dans les bains d’alcool de
concentrations croissantes, pour éviter la distorsion des structures tissulaires. Nous avions
utilisé sept bains d’éthanols de concentrations croissantes. Les pièces ont séjourné pendant une
heure dans chacun de ces bains puis dans trois bains de méthanol.
Pour ce qui concerne l’éclaircissement, nous avions utilisé trois bains de xylène qui constitue
un agent éclaircissant donnant au tissu une certaine transparence pour l’éclaircissement. Nos
manipulations ont été faites sous une hotte chimique. Dès que le premier bain de xylène
commence à devenir trouble (ce qui traduit une déshydratation incomplète de la pièce), nous
retirons immédiatement le tissu que nous plongeons dans un nouveau bain d’éthanol absolu.
Les pièces ont séjourné environ une heure dans chacun des bains.
Enfin, pour l’imprégnation, nous avions utilisé trois bains de paraffine chauffée au préalable
pour l’imprégnation des tissus ; car sous cette forme, la paraffine pénètre facilement les tissus.
Les pièces ont séjourné pendant une heure dans chacun de ces bains.

 L’enrobage

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Les tissus ainsi imprégnés ont été enrobés de paraffine en vue de la confection des blocs. Pour
ce faire, ils ont été déposés et orientés dans des modules métalliques de façon à en faciliter
l’étude ultérieure. Ainsi, de la paraffine fondue a été coulée dans des modules qui ont servi de
supports aux blocs qui sont formés. Enfin, l’ensemble bloc module a été mis à refroidir dans un
réfrigérateur. Une fois le bloc paraffine solidifié, nous l’avons séparé de son module et il est
alors prêt pour être coupé au microtome.

 La coupe au microtome
Les blocs de paraffine contenant les pièces enrobées ont été débités en tranches de 5 µm
d’épaisseur sur un microtome rotatif. Pour cela, le bloc introduit dans la pince à objet a été
immobilisé au moyen de la vis de blocage et orienté à l’aide des vis de réglages en veillant à ce
que les faces inférieure et supérieure du bloc soient parallèles aux tranchants du rasoir. Après
avoir vérifié le parallélisme entre le bloc et le rasoir, la roue motrice du microtome a été tournée
à l’aide de la manivelle. Les rubans obtenus à la coupe ont été récupérés à l’aide de pinceaux et
étalés sur une plaque chauffante à fond noir préchauffée à 50 °C.

 L’étalement
L’étalement des coupes sur lame porte-objet a été fait sur une plaque chauffante. Pour ce faire,
des lames portes objets et gravées ont été recouvertes d’eau glycérinée. Des segments de rubans
les mieux réussis ont été alors sélectionnés à l’aide de lancettes et déposés sur les lames portes
objets. L’ensemble a été déposé sur la plaque chauffante et on laisse les rubans s’étirer. A l’aide
de deux lancettes, nous avions tiré sur les bords des tissus pour éliminer les plis persistants.
L’excès de liquide a été absorbé avec un papier buvard et on laisse les rubans adhérer aux lames.
Celles-ci ont été ensuite placées dans une étuve à 40°C pendant une heure après leur séchage ;
enfin, les lames ont été refroidies pendant au moins 15 minutes. La préparation est alors prête
pour la coloration.

 La coloration
La coloration faite dans le cadre de notre travail est celle à l’hématéine éosine. Cette coloration
topographique met à la fois en valeur les structures dites basophiles (hématéine) qui comporte
donc des entités acides, et les structures acidophiles (éosine) qui présente des entités basiques.
Elle permet en l’occurrence de mettre en évidence le noyau, le cytoplasme et le collagène dans
les tissus. L’hématéine est un colorant basique qui se fixe sur les structures nucléaires tandis
que l’éosine est un colorant acide ayant une affinité pour le cytoplasme et les fibres de
collagène.

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 Montage des lames

Le montage des lames a été réalisé par apposition des lamelles portes objets sur la lame
histologique au moyen de la colle Eukitt®.

 La lecture
L’observation au microscope est ici couplée à la photomicrographie. Nos observations ont été
faites sur un microscope photonique muni d’une caméra. Les images ont été transférées sur un
logiciel de traitement d’images (Adobe Photoshop Image) grâce à un numériseur qui transforme
l’image analogique en image numérique. Les coupes ont été observées aux grossissements
adéquats ; les images ont été captées suivant l’objectif souhaité et ont été transférés en format
JPEG.

3.2.2.8 Analyse statistique

Les données biochimiques et hématologiques obtenues ont été traitées à l’aide du logiciel SAS
(Statistical Analysis System, 2013). L’analyse de variance à un critère de classification a été
réalisée. Le lot a été le facteur de variation considéré. La procédure des modèles linéaires
généralisés (Proc GLM) a été utilisée pour l’analyse de variance. Le test de F a été utilisé pour
déterminer la signification du facteur lot et les moyennes ont été comparées deux à deux par le
test de t de student.

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3.3 Résultats
3.3.1 Suivi des paramètres comportementaux et du poids des rats à j0 et j14
Les tableaux I et II présentent respectivement les résultats du suivi des paramètres
comportementaux et la croissance pondérale chez les rats investigués. L’analyse du tableau I
révèle que, après administration par voie orale et par injection intramusculaire de l’huile
essentielle de Aeollanthus pubenscens à 2000 mg/kg aux rats expérimentaux, aucune mortalité
n’a été enregistrée. Par ailleurs, aucun signe d’animaux morbides ou moribonds n’a été
également observé tout au long des 14 jours d’expérimentation. De même, aucun changement
de comportement et de modifications de la peau, des poils, des yeux, des muqueuses ainsi que
de l'appareil respiratoire, aucun signe physique ou comportemental de toxicité comme le
sommeil, l'hyperactivité, l'agitation, un male respiratoire ou des convulsions n’a été constaté.
Cependant, des cas d’inflammation au point d’injection chez les sujets du lot 3 ayant été soumis
à une injection intramusculaire à 2000mg/kg de poids corporel ont été notés. Il a été noté
également des boiteries chez ces mêmes sujets. Il ressort de ces résultats que l’huile essentielle
de A. pubescens n’a aucun effet toxique (pas de mortalité) après son administration à
2000mg/kg de poids corporel, ce qui implique que la dose létale DL50 est supérieure à
2000mg/kg de PC.
En ce qui concerne l’évolution de la croissance pondérale (tableau II), l’administration par voie
orale et par injection intramusculaire de l’huile essentielle de Aeollanthus pubenscens à 2000
mg/kg aux animaux n’a provoqué aucune altération de l’état pondéral des deux lots
expérimentaux. On note une évolution graduelle du poids chez les rats expérimentaux (186,66g
 11,54 à 233,33g  14,43 pour le témoin, 180,00g  30,41 à 230,00g  36,05 chez les rats
gavés et 191,66g  30,13 à 231,66g  31,75 chez les rats soumis à une injection). L’analyse
statistique des valeurs moyennes pondérales révèle qu’il n’existe aucune différence
significative entre les poids des animaux des trois lots aux jours 0 et 14.

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Tableau I : Résultats du suivi des paramètres comportementaux

Observations

Lot 1 Lot 2 Lot 3

Paramètres Chaque Chaque Chaque
6h 6h 6h
jour jour jour

Peau N N N N N N
Poils N N N N N N
Yeux N N N N N N
Muqueuses N N N N N N
Respiration N N N N N N
Activité motrice N N N N B N
Comportements N N N N N N
Salivation N N N N N N
Somnolence N N N N N N
Diarrhée N N N N N N

Légende : N = Normal ; B = Boiterie

Tableau II : Poids corporel en fonction du temps

Poids corporel (g) ± écarte type

Lots
J0 (N=3) J14 (N=3)

Lot 1 186,6611,54a 233,3314,43a

Lot 2 180,0030,41a 230,0036,05a

Lot 3 191,6630,13a 231,6631,75a

Lot 1 : Rats témoins normaux ; Lot 2 : Rats normaux ayant reçu l’extrait de A. pubescens par
gavage ; Lot 3 : Rats normaux ayant reçu l’extrait de A. pubescens par injection intra musculaire
; J0 : Jour 0 ; J14 : Jour 14 ; Les valeurs de la même colonne suivies des mêmes lettres ne sont
pas significativement différentes au seuil de 5%. Les valeurs de la même ligne suivies des
mêmes lettres ne sont pas significativement différentes au seuil de 5%.

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3.3.2 Evolution des paramètres biochimiques

Plusieurs paramètres biochimiques tels que les transaminases (Asat et Alat) l’urémie, créatinine
et le cholestérol ont été dosés afin d’apprécier l’effet de l’huile essentielle de A. pubescens sur
le fonctionnement des organes vitaux chez les animaux. Le tableau III présente les teneurs
moyennes des paramètres supra-indiqués au niveau des lots expérimentaux en fonction du
temps. . Il ressort de l’analyse de ce tableau qu’aucune différence significative (p>0,05) n’a été
observée entre les teneurs de ces paramètres au jour 0 et jour 14 dans les trois lots. Toutefois,
les teneurs en Alat au jour J14 des rats des trois lots étaient légèrement inférieures à celles
obtenues au jour J0. Par contre, une augmentation beaucoup plus marquée (p0,05) des teneurs
en Asat au jour J14 par rapport au jour J0 dans les lots 1 et 3 a été notée. L’administration de
l’huile essentielle étudiée par gavage aux animaux est la mieux indiquée pour réguler les teneurs
en Asat des animaux. .
En ce qui concerne le taux de cholestérol, nous avions remarqué une augmentation non
significative (p0,05) au jour J14 par rapport au jour J0 dans les trois lots, mais cette
augmentation est beaucoup plus marquée dans le lot 1 que dans les lots 2 et 3 (Tableau III).
L’administration de l’huile aux animaux permettrait de réguler leur taux de cholestérol.
Quant aux teneurs d’urée et de créatinine des animaux, les résultats ont révélé qu’il n’y a pas
eu de variations significatives (p0,05) entre le jour 14 et le jour 0. Toutefois, on note une légère
diminution du taux de créatinine au jour J14 dans le lot 1 et une légère augmentation du taux
de l’urée au jour 14 dans le lot 2 (Tableau III).

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Tableau III : Effets de l’HE de A. pubescens sur les paramètres biochimiques des rats.

Lot 1 Lot 2 Lot 3

Seuil de
significativité
Variables J0 J14 J0 J14 J0 J14 DSR

N Moyenne N Moyenne N Moyenne N Moyenne N Moyenne N Moyenne

Alat (UI/L) 3 61,00a 3 46,85a 3 62,00a 3 60,29a 3 60,10a 3 57,87a 16,99 NS

Asat (UI/L) 3 141,00a 3 188,32a 3 170,67a 3 173,51a 3 152,67a 3 198,47a 41,96 NS
Urée (g/L) 3 0,52a 3 0,47a 3 0,46a 3 0,60a 3 0,44a 3 0,42a 0,10 NS
Créat (mg/L) 3 14,19a 3 11,74a 3 12,64a 3 12,93a 3 10,52a 3 11,66a 1,92 NS
Chol (g/L) 3 0,19a 3 0,44a 3 0,39a 3 0,53a 3 0,36a 3 0,40a 0,13 NS

Lot 1 : Rats témoins normaux ; Lot 2 : Rats normaux ayant reçu l’extrait de A. pubescens par gavage ; Lot 3 : Rats normaux ayant reçu l’extrait de
A. pubescens par injection intra musculaire ; J0 : Jour 0 ; J14 : Jour 14 ; Alat : Alanine aminotransferase ; Asat : Aspartate aminotransferase ; Chol :
Cholestérol total ; Créat : Créatinine ; NS : Non Significatif ; Les valeurs de la même colonne suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement
différentes au seuil de 5%. Les valeurs de la même ligne suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% ; HE :
huile essentielle.

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3.3.3 Evolution des paramètres hématologiques

Plusieurs paramètres hématologiques ont été évalués afin d’apprécier l’effet de l’huile
essentielle de A. pubescens sur le fonctionnement des organes vitaux chez les animaux. Les
teneurs moyennes sanguines en globules blancs (GB), lymphocytes (Lymph), granulocytes
(Gran), hémoglobine (HGB), globules rouges (GR), hématocrite (HCT), volume globulaire
moyen (VGM), hémoglobine (TMH), concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine
(CCMH), Plaquettes (PLT) ont été les différents paramètres déterminés chez ces rats. Le tableau
IV résume les différents résultats obtenus quant aux teneurs moyennes de ces paramètres.
D’après l’analyse de ce tableau, on constate que les taux de globules blancs (GB) et
lymphocytes (Lymph) ont connu une augmentation non significative (p0,05) dans les trois lots
contrairement aux taux des granulocytes qui ont baissé au jour 14 par rapport au jour 0.
Concernant les globules rouges (GR), l’hématocrite (HCT) et l’indice de distribution des
globules rouges (IDR-CV), leurs taux ont subi une diminution non significative (p0,05) dans
le lot 1, mais une augmentation dans les lots 2 et 3. Quant aux taux d’hémoglobine (HGB), du
volume globulaire moyen (VGM), de la teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine (TMH),
de la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH) et d’indice de distribution
des globules rouges (IDR-DS), on note une légère augmentation non significative (p0,05) dans
tous les lots au jour J14. Cependant, il n’y a pas de différence significative entre les trois lots
comparés (p0,05). S’agissant des plaquettes (PLT) et du plaquettocrite (PCT), leurs taux ont
diminué (p0,05) dans le lot 1, mais ont augmenté dans les lots 2 et 3 au jour 14. Par ailleurs,
l’indice de distribution plaquettaire (IDP) a subi une diminution non significative dans les lots
1 et 3, mais une légère augmentation dans le lot 2. Pour ce qui est du volume moyen plaquettaire
(VMP), une légère augmentation a été notée dans le lot 1, mais une légère diminution non
significative dans les lots 2 et 3. Néanmoins, il n’y a pas de différences significatives entre les
trois lots comparés (p0,05). Malgré les quelques variations notées au niveau de chaque lot,
les analyses statistiques ont révélé qu’il n’y a pas de différences significatives (p0,05) entre
les paramètres hématologiques des rats ayant reçu l’huile essentielle A. pubescens et les rats
témoins et 'il n'y a pas également de variations significatives de ces paramètres entre le J0 et
J14 au niveau de chaque lot.

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Tableau IV : Effets de l’HE de A. pubescens sur les paramètres hématologiques des rats.

Lot 1 Lot 2 Lot 3

Seuil de
Variables J0 J14 J0 J14 J0 J14 DSR
significativité
N Moyenne N Moyenne N Moyenne N Moyenne N Moyenne N Moyenne
9
GB (10 /L) 3 11,07a 3 12,07a 3 8,23a 2 11,35a 3 12,93a 3 14,07a 3,86 NS
Lymph (109/L) 2 6,55a 3 7,23a 2 4,05a 2 6,70a 2 5,30a 3 8,20a 2,73 NS
Gran (109/L) 2 4,50a 3 4,07a 2 2,85a 2 3,85a 2 5,00a 3 4,87a 2,40 NS
% Lymph 2 53,80a 3 59,73a 2 54,75a 2 58,05a 2 46,90a 3 58,07a 30,10 NS
% Gran 2 34,95a 3 34,20a 2 38,05a 2 34,65a 2 45,25a 3 34,50a 13,67 NS
HGB (g/dL) 3 12,87a 3 13,47a 3 12,77a 2 14,90a 3 12,27a 3 14,03a 3,98 NS
GR (109/L) 3 6986,67a 3 6760a 3 6706,67a 2 6940a 3 6360a 3 6760a 3,97 NS
HCT (%) 3 39,50a 3 38,80a 3 37,93a 2 42,45a 3 36,57a 3 40,80a 10,58 NS
VGM (fL) 3 56,63a 3 57,47a 3 56,60a 2 61,30a 3 57,50a 3 60,50a 23,19 NS
TMH (pg) 3 18,40a 3 19,87a 3 18,97a 2 21,40a 3 19,20a 3 20,73a 7,71 NS
CCMH (g/dL) 3 32,57a 3 34,67a 3 33,60a 2 35,05a 3 33,50a 3 34,33a 10,22 NS
IDR-CV (%) 3 18,00a 3 17,87a 3 16,70a 2 17,80a 3 16,03a 3 18,23a 8,86 NS
IDR-DS (fL) 3 34,80a 3 35,53a 3 32,87a 2 37,15a 3 31,90a 3 37,17a 3,4 NS
PLT (109/L) 3 501,33a 3 411,33a 3 446,33a 2 664,00a 3 567,67a 3 686,33a 3,77 NS
VWP (fL) 3 8,77a 3 8,87a 3 8,60a 2 8,45a 3 8,47a 3 8,40a 3,50 NS
IDP 3 14,60a 3 14,43a 3 14,57a 2 14,65a 3 14,70a 3 14,60a 8,11 NS
PCT (%) 3 0,44 3 0,36a 3 0,38a 2 0,56a 3 0,48a 2 0,51 0,08 NS
Lot 1 : Rats témoins normaux ; Lot 2 : Rats normaux ayant reçu l’extrait de A. pubescens par gavage ; Lot 3 : Rats normaux ayant reçu l’extrait de A. pubescens par injection
intra musculaire ; J0 : Jour 0 ; J14 : Jour 14 ; GB : Globules blancs ; Lymph : Lymphocytes ; Gran : Granulocytes ; HGB : Hémoglobine ; GR : Globules rouges ; HCT :
Hématocrite ; VGM : Volume globulaire moyen ; TMH : Teneur moyenne en hémoglobine ; CCMH : Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine ; PLT : Plaquette ;
Les valeurs de la même colonne suivies des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes au seuil de 5%. Les valeurs de la même ligne suivies des mêmes lettres ne
sont pas significativement différentes au seuil de 5%. ; HE : huile essentielle.

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3.3.4 Effets de l’huile essentielles sur les structures hépatiques et rénales des rats
expérimentaux
3.3.4.1 Histologie hépatique
L’examen histologique du foie des rats Wistar traités avec 2000mg /Kg de poids corporel à
l’huile essentielle de A. pubescens révèle qu’aucune altération des structures hépatiques n’a été
observée au niveau des animaux expérimentaux. En effet, chez les rats gavés (figure 14B) et
les injectés à l’extrait (figure 14C), le parenchyme hépatique a l’aspect typique observé chez
les rats contrôles (figure 14A). Les hépatocytes (flèches) sont sans atypies visibles et sont bien
rangés en rayons radiaires autour des veines centro-lobulaires (VC). Entre ces hépatocytes, les
sinusoïdes (S) sont bien visibles. L’étude histologique du foie n’a révélé aucun cas
d’inflammation ni de nécrose cellulaire hépatique.

: hépatocytes ; VC : veines centro-lobulaires ; S : sinusoïdes ; A : histologie hépathique des

rats témoins ; B : histologie hépathique des rats ayant reçu l’extrait de A. pubescens par
gavage; C : histologie hépathique des rats ayant reçu l’extrait de A. pubescens par injection
intra musculaire.
Figure 14 : Histologie hépatique ; agrandissement 400x (Ayihou, 2018)

3.3.4.2 Histologie rénale

Les reins des rats soumis à l’huile essentielle de A. pubescens ne présentent pas de modifications
au niveau de leur parenchyme. En effet, le parenchyme rénal des rats gavés (figure 15B) et des
rats injectés à l’extrait (figure 15C) a l’architecture typique observée chez les rats contrôles
(figure 15A). Les glomérules (G), les tubes proximaux (TP), les tubes distaux (TD) et les canaux
collecteurs (CC) ont un aspect normal.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

G : glomérules ; TP : tubes proximaux ; TD : tubes distaux ; CC : canaux collecteurs ; A :

histologie rénale des rats témoins ; B : histologie rénale des rats ayant reçu l’extrait de A.
pubescens par gavage; C : histologie rénale des rats ayant reçu l’extrait de A. pubescens par
injection intra musculaire.
Figure 15 : Histologie rénale ; agrandissement 400x (Ayihou, 2018)

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

3.4. Discussion
L’étude toxicologique de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens extraite par
hydrodistillation chez des rats wistar a montré que la dose létale 50% (DL50) de cet extrait
volatil est supérieure à 2000mg/kg de poids corporel. Aussi, l’essai a-t-il montré que l’huile ne
présente pas de toxicité aiguë à la dose de 2000mg/kg de poids corporel chez les rats
investigués. L’évaluation de l’effet de l’huile sur la croissance pondérale des rats a montré que
l’extrait n’influence pas la croissance pondérale normale chez les rats traités. Nos résultats
relatifs à l’influence de l’extrait sur la croissance pondérale sont similaires à ceux rapportées
par Jothy et al. (2011) qui n’ont constaté aucune variation significative sur l’évolution des poids
corporels des souris Swiss albinos soumis à une dose de 5000mg/Kg/jour d’extrait
méthanolique de Cassia fistula pendant 14 jours. Les résultats de l’évaluation des effets de
l’huile essentielle de A. pubescens sur les paramètres biochimiques des rats ont montré qu’il
n’y a pas de variations significatives entre les taux de Alat, Asat, du cholestérol, de l’urée et de
la créatinine des rats soumis à l’extrait par rapport aux témoins. L’Asat et l’Alat sont deux
enzymes hépatiques dont le rôle est de transférer un groupe amine lors des nombreux processus
chimiques qui se déroulent au niveau hépatique (Rye, 2009). Leur activité est proportionnelle
au degré de dommages hépatiques (Sacoti, 2012). Ils sont donc deux bons indicateurs de
l’hépatotoxicité (Pratt et Kaplan, 2000; Al-Habori et al., 2002 ; Shen, 2009; Song et al., 2007).
La double augmentation, voire le triple du taux de Alat, traduit une cytolyse hépatique (Zabre,
2013). Une augmentation sérique de l’activité de l’Asat traduit un état inflammatoire,
traumatique ou de dégénérescence des tissus qui en sont riches (Da Silva et al., 2010 ; Sow,
2012). La variation non significative des teneurs en Alat et observée aussi bien chez les rats
témoins que chez les rats ayant reçu l’huile essentielle de A. pubescens dénote de l’absence
d’une cytolyse hépatique, d’inflammation et de dégénérescence des tissus des rats investigués.
Par conséquent, nous pouvons dire que l’HE de A. pubescens n’a pas eu d’effet toxique sur le
foie des rats à 2000 mg/ kg de poids vif.
La cholestérolémie renseigne sur la mobilisation des réserves de graisses corporelles par
l’animal. Le cholestérol est présent dans la ration alimentaire et peut être synthétisé par le foie
selon un mécanisme soumis à une régulation métabolique très fine (Marshall et Bangert, 2005).
La baisse du cholestérol peut être liée aux conditions environnementales, à un déficit d’apport
alimentaire ou aux pathologies (Faye et al., 2004). L’augmentation de son taux serait d’origine
alimentaire. Ainsi, l’augmentation non significative notée dans les trois lots ne serait pas liée à

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

l’huile essentielle de A. pubescens, mais plutôt à l’aliment donné aux rats expérimentaux car
durant toute la période expérimentale, l’aliment a été servi à volonté aux animaux.
La fonction rénale est appréciée par le dosage de la créatinine et de l’urée sériques. L’urée et la
créatinine sont des marqueurs significatifs de la fonction rénale (Pauly, 2012). Ces métabolites,
produits finis issus du métabolisme des protéines, ont une concentration généralement constante
dans les conditions normales (Whitby et al., 1988). Leur augmentation ou leur diminution
reflète un dysfonctionnement rénal (Sirwal et al, 2004). Pritchard et al. (2009) ont montré
qu’une diminution de la concentration sérique de la créatinine peut être le signe de cachexie.
En ce qui concerne la concentration sérique de l’urée, son augmentation peut être le signe d’une
néphropathie, d’une déshydratation, d’un déséquilibre électrolytique, d’une hypo-albuminémie,
d’un catabolisme tissulaire (fièvre, traumatisme musculaire, myosite) (Pitel et al., 2006). Ces
taux n’ayant pas varié chez les rats traités par rapport aux témoins, témoignent d’un
fonctionnement rénal normal. Globalement, vu qu’il n’y a pas eu de variations significatives
des taux de l’Asat, l’Alat, l’urée, la créatinine et le cholestérol, nous pouvons dire que l’huile
essentielle de A. pubescens n’est pas toxique au foie, aux reins et n’a pas perturbé le
métabolisme des lipides chez les rats à 2000 mg/ kg de poids vif.
L’huile essentielle de A. pubescens administrée aux rats à 2000 mg/ kg de poids vif, n’a pas
entraîné de variations significatives du taux des globules blancs ni des globules rouges et des
plaquettes. Les globules blancs, étant une famille de cellules composée de granulocytes,
lymphocytes et de monocytes, jouent un rôle important dans la lutte contre les infections et dans
le développement d’une résistance à l’infection en réponse à une exposition naturelle ou à une
vaccination (OMS, 2009). En effet, leur taux est augmenté en cas d'infections (virales ou
sévères), d’inflammations, de cancer ou de leucémie et peut être diminué par certains
médicaments, au cours de certaines maladies auto-immunes, une défaillance de la moelle
osseuse, une splénomégalie, une maladie du foie (OMS, 2009). Ce taux n’ayant pas varié chez
les rats traités par rapport aux témoins, témoignent que l’HE de A. pubescens n’a pas eu d’effet
toxique sur les globules blancs des rats à 2000 mg/ kg de poids vif.
En ce qui concerne l’effet de l’huile essentielle de A. pubescens sur les globules rouges, le taux
de ces derniers n’a pas varié de manière significative face l’HE de A. pubescens. Le taux de
globules rouges diminue en cas d’anémies et augmente en cas de production exagérée ou de
pertes liquidiennes (diarrhée, déshydratation, brûlures) (Olivier, 2011). Une augmentation de
VGM, TMH et CCMH indique la présence des globules rouges normochromiques

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

macrocytaires, alors qu’une baisse de leurs taux traduit la présence des globules rouges
hypochromiques microcytaires (Agourram, 2013). Dans notre cas, il n’y a pas eu de variations
significatives de ces constantes, ce qui montre que les globules rouges des rats sont
normochromiques normocytaires, et donc, l’HE de A. pubescens n’a pas eu d’effet toxique sur
les globules rouges des rats à 2000 mg/ kg de poids vif.
L’HE de A. pubescens n’a pas fait varier le taux des plaquettes des rats de manière significative.
Le dosage des plaquettes permet de dépister un risque hémorragique ou les syndromes
infectieux ou inflammatoires après une hémorragie importante (Olivier, 2011). Ce paramètre
n’ayant pas varié dans notre cas témoigne donc que l’HE de A. pubescens n’a pas eu d’effet
toxique sur les plaquettes des rats à 2000 mg/ kg de poids vif.
Ainsi, nous pouvons dire que l’HE de A. pubescens n’a pas eu d’effet toxique sur les paramètres
hématologiques évalués. Néanmoins, les fluctuations non significatives enregistrées dans cette
étude pourraient être liées aux facteurs de variations tenant à l’individu concerné et à son
environnement (le stress induit une margination des leucocytes, par exemple), et à tous les
facteurs tenant à la variabilité cellulaire, notamment à leur durée de vie (Lecomte, 1998).
D’après l’étude histologique du foie des rats expérimentaux, on constate une architecture
normale sans aucune modification hépatique au niveau du parenchyme, des espaces portes et
même au niveau des veines centrolobulaire, ce qui confirme que les rats sont saines et ne
présentent aucune anomalie hépatique comme le témoignent les résultats du dosage des
marqueurs hépatiques, qui n’ont révélé aucune toxicité apparente. L’analyse histologique
montre que ces traitements ne causent donc aucune lésion hépatique.
L’étude histologique des reins des rats expérimentaux ne révèle aucune modification au niveau
du parenchyme rénal, des glomérules, des tubes proximaux, des tubes distaux et des canaux
collecteurs, ce qui confirme que les souris sont saines et ne présentent aucune anomalie
néphrotique.
En conclusion, ces résultats histopathologiques sont en parfaite corrélation avec les analyses
biochimiques et hématologiques réalisées confirmant le statut non toxique de l’huile essentielle
de Aeollanthus pubescens à la dose de 2000 mg/kg de poids vif.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

Conclusion et suggestions
Le présent stage effectué à l’Unité de Recherche sur les Maladies Transmissibles (URMAT)
nous a permis de développer des compétences dans le domaine de la toxicologie et de la
microbiologie notamment dans l’isolement et l’identification de certains microorganismes des
denrées alimentaires et animales. Au cours de ce stage, nous avions procédé à l’évaluation de
la toxicité aigüe de l’huile essentielle de Aeollathus pubescens chez les rats Wistar. Il ressort
de cette étude que l’huile essentielle investiguée ne présente pas une toxicité aigüe chez les rats
Wistar à une dose de 2000 mg/Kg de poids vif. De même, cette huile n’a pas eu d’effets néfastes
(p>0,05) sur les paramètres biochimiques et hématologiques indispensables au bon
fonctionnement de l’organisme. L’examen histologique qui n’a montré aucune altération des
structures hépatiques et rénales a confirmé les analyses biochimiques et hématologiques
effectuées sur les rats expérimentaux. L’essai réalisé a montré que l’huile essentielle de
Aeollanthus pubescens ne présente ni d’effets toxiques sur le foie et les reins. Par conséquent,
cette huile peut être, à travers son pouvoir antimicrobien et son absence de toxicité aigüe à
2000mg/kg de poids corporel, un excellent remède pour le traitement des infections
microbiennes à Escherichia coli et Salmonella multirésistantes sévissant dans les élevages et
peut être valablement utilisée dans la lutte endogène contre les pathologies associées à ces
micro-organismes.
En perspective, il serait important de :
- évaluer les toxicités subchronique et chronique de l’huile essentielle.
- de tester d’autres voies d’administration de l’extrait
- réaliser une étude approfondie de la toxicité pour parvenir à déterminer la DL50.

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 Evaluation de la toxicité aiguë de l’huile essentielle de Aeollanthus pubescens chez les rats Wistar

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