‫دع ـ ـ ـ ـ ـاء‬

‫اللهم ال تجعلنا نصاب بالغرور إذا نجحنا و ال باليأس إذا أخفقنا و ذكرنا‬

‫أن اإلخفـاق هو التجربة التي تسبق النجاح‪.‬‬

‫اللهم إذا أعطيتنا نجاحا فـال تأخذ تواضعنا و إذا أعطيتنا تواضعا فـال تأخذ‬

‫اعتزازنا بكرامتنا‪.‬‬

‫اللهم اختم بالسعادة آجالنا و حقق بالزيادة أمالنا و اقرن بالعافية‬

‫غرورنا وأعمالنا‪.‬‬

‫ربنا تقبل منا يا رب العالمين‪.‬‬

 REMERCIEMENTS

Tout d’abord, je tiens à remercier Dieu le Tout Puissant de m’Avoir Donné

le courage, la volonté et la patience durant notre cursus universitaire.

Ce travail a été réalisé au sein du laboratoire d’Obtention de Substances

Thérapeutiques (LOST) dirigé par Mme le Professeur KABOUCHE Zahia. Je

tiens à la remercier pour m’avoir accueillie si chaleureusement au sein de

l’équipe de recherche ainsi que pour sa disponibilité.

Je remercie le docteur D. BERREHAL pour m’avoir proposé ce sujet ainsi

que pour son soutien et ses conseils tout au long de ces mois.

Nous remerciements également aux membres du jury Dr.

A.KHALFALLAH, Dr. D. BERREHAL, Dr .N. BOUTAGHANE d’avoir

accepté de juger ce travail malgré leurs multiples obligations.

Je remercie l’ensemble de l’équipe de recherche pour leur sympathie et leur

expérience qui m’ont aidée afin de réaliser ce travail surtout Monsieur Hicham

SERAA et mesdemoiselles Sara BECHKRI, Merci aussi à tous mes collègues et

amis du laboratoire qui ont sa crée l’atmosphère, et que j’ai eu la chance de les

côtoyer particulièrement mes sœurs Kenza et Nadia.

Je remercie toutes les personnes qui ont contribué d’une façon ou d’une autre

à l’aboutissement de ce travail

Nous remercions grandement nos amis pour leur soutien qui fut très important

pour moi.
 Dédicaces
Je dédie ce mémoire :
A Mes Très Chers Parents qui ont toujours été là pour moi
et qui m’ont donné un magnifique modèle de labeur et de
persévérance. J’espère qu’ils trouvent dans ce travail toute ma
reconnaissance et tout mon amour.

A mes frères (Walid et Abdallah) et ma sœur(Yasmine).

Et mon mari (seif Eddine) et sa famille.
Et particulièrement : à mes meilleures amies Kenza, Nadia
Hanane, Sara
A mes oncles et chères tantes et leurs enfants, chacun par son
nom.
A toute la famille Boukerzaza, à mes ami(e)s, chacun(e) par
son nom.
A tous ceux qui m’ont aidée de prés ou de loin dans
l’accomplissement de ce mémoire.

Hadjer
 Abréviations et symboles
CC : chromatographie sur colonne
CCM : chromatographie sur couche mince
CD3OD : méthanol deutéré
d : doublet
dd : doublet des doublet
DMSO : diméthylsulfoxyde
DPPH : 1,1-diphénol-2-picrylhydrzyl
DO : densité optique
D: dilution
g :gramme
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
Hz : hertz
J : constante de couplage
m : masse
ml : millilitre
mg : milligramme
mn: minute
nm : nano maitre
P : produit
ppm : partie par million
Rf: rapport frontal
RMN 1H: Résonance magnétique nucléaire du proton
SI : système d’élution I
SII : système d’élution II
UV : ultra violet
V : volume
λ: longueur d’onde
Na2CO3 : carbonate de sodium
 Liste des figures
N° Titre
Chapitre I : aperçu bibliographique
Figure 1 Lés déférent types de la famille des Asteraceae.

Figure 2 Inflorescence en capitule.

Figure 3 Quelque Espèces de genre Evax.

Figure 4 Squelette de base des flavonoïdes.

Figure 5 Représentation des principales class et sous-groupes des flavonoïdes au niveau de

l’hétérocycle.
Figure 6 Les deux bandes d’absorption des flavonoïdes.

Chapitre II : Etude phytochimique d’une plante du gerne Evax.

Figure 1 Protocole d’extraction de la plante.

Figure 2 Le profile HPLC de la phase acétate.

Figure 3 Organigramme de séparations chromatographiques effectuées sur l’extrait acétate

d’éthyles de la plantes.
Figure 4 Série spectrale UV –Visible de produit P1.

Figure 5 Spectre RMN-H1 (500MHz, CD3OD) du produit P1.

Figure 6 Spectre RMN-H1 (500MHz, CD3OD) du produit P1.

Figure 7 La co -chromatographie des sucres libérés des composées p1, p2.

Figure 8 Série spectrale UV –Visible de produit P2.

Figure 9 Spectre RMN-H1 (500MHz, CD3OD) du produit P2.
Figure 10 Spectre RMN-H1 (500MHz, CD3OD) du produit P2.
N° Titre
Chapitre I : matière et méthodes
Figure 1 Réduction du DPPH par le phénol.

Figure 2 Schéma simplifié de la méthode de l’antibiogramme.

Chapitre II : Résultats et discussion

Figure 1 La courbe d’étalonnage de l’acide gallique.

Figure 2 Courbe de pourcentage d’inhibition du DPPH par l’extrait Acétate d’éthyle.

Figure 3 Histogramme représentatif du pourcentage d’inhibition du DPPH par l’extrait

acétate d’éthyle en présence de standard (quercétine).
Figure 4 Effet de l’extraits acétate d’éthyle sur la culture de streptococus anterococcus SH, et
Pseudomananas aeruginosa SH
 Liste des tableaux
Partie phytochimique :

N° Titre
Chapitre I : aperçu bibliographique.
Tableau 1 Classification systématique botanique des Asteraceae.
Tableau 2 Position systématique du genre Evax
Tableau 3 La relation entre Rf et la structure flavonique.
Tableau 4 Position des bandes I et II en fonction de types de flavonoïdes.
Tableau 5 Principaux déplacements des bandes I et II En présences de divers réactifs.
Tableau 6 Déplacements chimiques et constantes de couplages des protons du noyau A.
Tableau 7 Déplacements chimiques et constantes de couplages des protons du noyau B.

Tableau 8 Déplacements chimiques de protons anomeriques de sucres de flavonols

monoglycosiles.
Tableau 9 Déplacements chimiques de protons anomeriques de sucres flavonoïdes di
glycosylés.
Chapitre II : Etude phytochimique d’une plante du gerne Evax.
Tableau 1 Les masses des extraits.
Tableau 2 Résultats du fractionnement du mélange extraits Acétate d’éthyles
Tableau 3 Regroupement final des fractions de la colonne.
Tableau 4 Résultats de la séparation par chromatographie sur colonne de la fraction F7
Tableau 5 Données de la série spectrale UV-Visible du produit p1
Tableau 6 Données spectroscopiques RMN-H1 (500MHz, CD3OD) de P1.
Tableau 7 Données de la série spectrale UV-Visible du produit p1, après hydrolyse.
Tableau 8 Données de la série spectrale UV-Visible du produit p2
Tableau 9 Données spectroscopiques RMN-H1 (500MHz, CD3OD) de P2
Tableau 1O Données de la série spectrale UV-Visible du produit p2, après hydrolyse.
Partie biologique :

N° Titre
Chapitre I : matière et méthodes
Tableau 1 Les différentes concentrations des extraits.
Chapitre II : Résultats et discussion
Tableau 1 la densité optique de l’extrait
Tableau 2 Les pourcentages des poly phénols calculés de la phase acétate.
Tableau 3 les pourcentages d’inhibition de l’extrait AcOEt du DPPH en comparaison avec la
quercétine
Tableau 4 Les différentes dilutions avec les concentrations finales.
Tableau 5 les zones d’inhibition des différentes dilutions de l’extrait acétate.
Sommaire
I. Introduction………………………………………………………………………………….1

Référence bibliographie………………………………………………………………………..2

Partie phytochimique

Chapitre I : aperçu bibliographique

I. Introduction sur les Asteraceae ............................................................................................... 5

I .1.place dans la classification systématique botanique ........................................................ 5
I.2. Caractères généraux de la famille des Asteraceae ........................................................... 5
I.2.1.Appareil reproductif ................................................................................................... 6
I .3 .Donnes phytochimique et pharmacologiques ............................................................. 6
I. 3.1.Utilisations et intérêts économiques des Asteraceae ............................................... 6
III.1. Présentation du genre Evax ........................................................................................... 7
III.1.1. Description botanique ............................................................................................... 7
III. 2. Position systématique du genre Evax ........................................................................... 7
II. Les flavonoïdes ...................................................................................................................... 8
II.1. Généralité........................................................................................................................ 8
II.2. Définition et structure chimique ..................................................................................... 8
II.3. Classification des flavonoïdes ........................................................................................ 9
II.4. Localisation et Distribution .......................................................................................... 10
II.5. Intérêts biologiques des flavonoïdes et composés phénoliques .................................... 11
II.5.1.Effet antioxydants ................................................................................................... 11
II.5.2.activité anti microbienne des flavonoïdes............................................................... 12
II.5.3.activité antibactérienne des flavonoïdes ................................................................. 12
II.6. Les techniques d’identification structurale ................................................................... 13
II.6.1. Facteur de retardement et comportement chromatographique .............................. 13
II.7. Identification spectrale ................................................................................................. 14
II.7.1. La coloration sous UV ........................................................................................... 14
II.7.2. Spectrophotométrie UV- Visible ........................................................................... 14
II.7.3. Le spectre UV en présence de réactifs :................................................................. 15
II.7.3. à. L’addition d’AlCl3 et AlCl3 + HCl : .................................................................. 15
II.7.3.b. L’addition de NaOH et de NaOAc : ................................................................... 16
II.7.3. c. L’addition de NaOAc + H3BO3 : ....................................................................... 16
Ortho-di-OH sur B. .......................................................................................................... 17
 II.8. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) : ........................................ 18
II.9. L’hydrolyse acide des glycosides : ............................................................................... 20
Référence bibliographie………………………………………………………………………20

chapiter II: Etude phytochimique d'une plante du gerne Evax

I- Etude phytochimique de la plante: ....................................................................................... 27

I.1. Récolte du matériel végétal : .......................................................................................... 27
I.2. Extraction de la plante : ................................................................................................. 27
I.3 Séparations et purification : ............................................................................................ 29
I.3.1. Test chromatographique : ........................................................................................... 29
I.3.2. Séparation sur colonne : .......................................................................................... 29
II.1.1. Etude de la fraction F7 .......................................................................................... 29
III. Résultats et discussion :...................................................................................................... 33
III.1. Identification de produit P1 : ........................................................................................ 33
a. Comportement chromatographique : ............................................................................ 33
b. Données spectrométrie : ............................................................................................... 33
III.2.Identification de produit P2 : ......................................................................................... 38
a. Comportement chromatographique : ............................................................................ 38
b. Données spectrométrie : ............................................................................................... 38
Partie biologique

Chapitre I : matière et méthodes

Introduction : ............................................................................................................................ 40
I. Dosage des polyphénols :...................................................................................................... 40
I.1. Principe du dosage : ....................................................................................................... 40
I.2. Protocole expérimental : ................................................................................................ 40
II. Activité anti radicalaire : ..................................................................................................... 41
II.1. Définition : .................................................................................................................... 41
II.2. Les radicaux libres : ...................................................................................................... 46
II.3. Inhibition du radical stable DPPH. : ............................................................................. 46
II.4. Méthode : ...................................................................................................................... 47
a. Préparation de la solution DPPH.: ................................................................................ 47
b. Préparation des solutions mères de concentration 5mg/ml : ........................................ 47
c. Préparation des dilutions de l’extrait : .......................................................................... 47
III. Activité antibactérienne :.................................................................................................... 48
III.1. Méthodes de détermination de l’activité antibactérienne :.......................................... 48
a. Principe de la méthode Antibiogramme : ..................................................................... 49
III.2. Détermination de l’effet bactériostatique ou bactéricide : .......................................... 49
III.3 Evaluation de l'activité antibactérienne de l’extrait acétate d’éthyle : ......................... 50
référence bibliographique…………………………………………………………………….46

Chapitre II: résultats et discussion

I. Dosage des poly phénols :..................................................................................................... 47

II. Activité anti radicalaire : ..................................................................................................... 48
II.1.Etude de l’extrait Acétate d’éthyle : .............................................................................. 48
a. Détermination de la valeur CI50 : .................................................................................. 49
III.1. Interprétation des résultats : ........................................................................................ 57
Conclusion……………………………………………………………………………………53
Introduction générale
 Introduction générale

Les plantes sont depuis toujours une source essentielle de médicaments. Aujourd’hui
encore une majorité de la population mondiale, plus particulièrement dans les pays en voie de
développement, se soigne uniquement avec des remèdes traditionnels à base de plantes.
En effet, l’industrie pharmaceutique moderne elle-même s’appuie encore largement sur
la diversité des métabolites secondaires végétaux pour trouver de nouvelles molécules aux
propriétés biologiques inédites.
Les plantes sont extrêmement complexes du point de vue de leur composition chimique.
On estime qu’elles sont formées de plusieurs milliers de constituants différents, dont
quelques-uns seulement (ou parfois un seul) sont (ou est) responsable(s) de l’effet
thérapeutique ou de l’effet toxique. Il est donc indispensable de connaître les principes actifs
des plantes médicinales afin d’étudier leur efficacité, leur mode d’action et bien entendu leurs
effets secondaires sur la santé humaine [1].
Le chemin qui mène de la plante à ses constituants purs est très long et nécessite un
travail d’équipes pluridisciplinaires (botanistes, chimistes, etc.….), le travail de phytochimiste
concerne essentiellement l’isolement, la purification et enfin la détermination structurale du
produit isolé quoique ce dernier a tellement évolué ces dernières années.
La flore algérienne qui fait partie de la flore africaine, estimée à plus 3000 espèces dont
15% endémiques [2] appartenant à des familles variées,
Dans le cadre de ce travail, nous allons valoriser une espèce proliférant dans notre
région (Constantine), appartenant à la famille des Asteraceae et au genre Evax, et qui n’a
jamais fait l’objet d’étude. Nos investigations visent l’étude phytochimique et biologique de
l’espèce.
Ainsi, ce manuscrit est divisé en deux parties :
La première partie bibliographique, comporte deux chapitres dont :
Le premier comporte une brève présentation des flavonoïdes suivie d’une description
botanique de la famille des Asteraceae et du genre Evax, en plus des travaux phytochimiques
antérieurs relatifs aux métabolites secondaires les plus courants, particulièrement les
flavonoïdes. On y reporte également les résultats relatifs aux activités biologiques de ce genre.
Le deuxième chapitre est consacré à la description de ces travaux d’étude phytochimique
du genre Evax comprenant la séparation et l’identification des produits séparés.
Une deuxième partie, biologique, divisée en deux chapitres :
Le premier chapitre a été consacré à la description des méthodes utilisées dans le dosage
des polyphénols, les activités antioxydante et anti-radicalaire. Le deuxième, comporte les
résultats et discussion.
Le manuscrit se termine par une conclusion générale.
1
[1] Hostettmamn,K.O.Potteray and J.L.Wolfender (1998) The potential of higer plantes as
yource of now drugs chimie ,S2,P10-17.
[2] Quezel et samter. (1962), Nouvelle flore de l’Algérie.

2
Partie Phytochimique

3
 Chapitre I :

Aperçu bibliographique

4
Chapitre I Aperçu bibliographique

I. Introduction sur les Asteraceae

La famille des Asteraceae est une vaste famille du monde végétal, elle est connue par sa
richesse en métabolites secondaires bioactif, elle est repartie dans plusieurs régions du monde.
I .1.place dans la classification systématique botanique
La place des Asteraceae dans la classification systématique APG II (Angiospern
Phylogeny Group) est la suivante (Tableau 1)
Tableau1 : classification systématique botanique des Asteraceae [1 ,2]
Embranchement Spernoptytes
Sous_ Embranchement Gymnospermes, Angiospermes
Sous-classe Gamopétales
Classe Dicotyledonae
Sous-classe Gamopétales
Ordre Asterales
Famille Asteraceae

I.2. Caractères généraux de la famille des Asteraceae

La famille des Asteraceae est une importante famille de plantes dicotylédones
qui comprend près de 24 000 espèces réparties en 1600 genres [3]. Le sol algérien
compte environ 109 genres et plus de 408 espèces [4].
Les Asteraceae, surtout représentées dans les régions tropicales et subtropicales
semi arides et au région tempérées [5], sont principalement des herbes, vivaces ou non, mais
aussi des arbustes ou sous-arbrisseaux, parfois des herbes, rarement des plantes
aquatiques ou des plantes grimpantes ou encore des épiphytes. Les feuilles sont le plus
souvent alternes, mais aussi opposées ou radiales, simples ex stipulées [6].
Selon Gaussen, les Asteraceae sont réparties en fonction de la forme de leurs fleurs en
deux types : l’un ayant des fleurs à corolles ligulées et l’autre à corolles tubulées [7].

Figure1. Les déférents types de la Fleurons des Asteraceae

5
Chapitre I Aperçu bibliographique

I.2.1.Appareil reproductif
 L’inflorescence
L’inflorescence des Asteraceae est : le capitule.
Un capitule comprend un réceptacle plan ou plus moins bombé sur lequel sont insérés de
l’extérieur vers l’intérieur, en ordre spirale :
D’abord des bractées stériles vertes (parfois écailleuses, à crochets ou épineuses)
forment un involucre .ensuite des petites bractées fertiles non vertes ou paillettes, axillant
chacune une fleur. L’ensemble forme une inflorescence composée, d’où l’ancien nom de la
famille.
Les capitules sont parfois isolés (pâquerette), mais, plus généralement ils sont à leur
tour diversement regroupes : en grappe, en épi, en cyme, ou encore en corymbe chez le
groupe des radiées, voir en capture

Figure 2 .inflorescence en capitule

Les fleurs sont regroupées en capitules qui peuvent compter centaines de fleurs.
Les capitules sont parfois réduits à quelques fleurs (Genre Achillea) voire,
exceptionnellement à une seule fleur (Genre Echinops) [8].
Fruits ce sont des akènes (fruits secs indéhiscents inséminés) possédant , le plus
souvent, un Pappus provenant du développement du calice après la fécondation.
Graines : elles sont ex albuminées.
I .3 .Donne phytochimique et pharmacologiques
Un grand nombre de composés chimiques ont déjà été isolés à partir des Asteraceae, et
ces derniers appartiennent à des groupes phytochimique très variés : glucides, terpènes,
alcaloïdes, flavonoïdes, acides phénols et tanins. Certains de ces composés sont utilisés en
thérapeutique pour leurs propriétés antiseptique, insecticide, anti-inflammatoire,
antipaludique. D’autre se sont révélés cytotoxiques ou toxiques.
I. 3.1.Utilisations et intérêts économiques des Asteraceae
Cette vaste famille est économiquement importante, elle fournit des plantes
alimentaires: La laitue est la plante la plus cultivée de la famille, suivie de l'artichaut, de
l'endive, du salsifis, de la chicorée, de l'estragon et du tournesol. De nombreuses autres

6
Chapitre I Aperçu bibliographique

espèces ont une utilisation ornementale, telle que la marguerite, le dahlia, le zinnia, le
cosmos, le chrysanthème et l'aster.
Plusieurs espèces sont utilisées en pharmacie: l’Arnica (Arnica montana L.), la
camomille (Matricariachamomilla L. et Anthemisnobilis L.), le pied de chat
(AntenariadjiocaGartn), le tussilage (Tussilagofarfara L.). Certains comme le genre
Pyrethrum fournissent un insecticide, d'autres (genre Artemisia) sont utilisés comme
plantes médicinales et dans la fabrication de liqueurs comme l'absinthe ou le génépi [9].
Une des propriétés typiques de la famille des Asteraceae est sa richesse en
composés naturels divers. On y trouve des terpenoïdes, des flavonoïdes et des alcaloïdes
[10]. C’est une famille très riche en lactones ses qui terpéniques qui représentent des
principes amers typiques de cette famille [9].
III.1. Présentation du genre Evax
III.1.1. Description botanique
Capitules hétérogames, multiflores, discoïdes. Bractées de l'involucre sur 1-2 rangs,
non carénées ou obscurément carénées; elles le sont nettement dans Evacidium et
Filago, laineuses ou scarieuses. Réceptacle plus ou moins nettement bombé, paléacé au
moins sur les bords. Fleurs marginales femelles et sur plusieurs rangs, disposées à
l'aisselle de paillettes (non ainsi dans Evacidium); celles du disque généralement stériles
et peu nombreuses. Anthères caudées ou sagittées. Akènes comprimés, sans aigrette ou
à fausse aigrette, à poils courts, papilliformes (les fleurs mâles peuvent, toutefois,
avoir des akènes abortifs avec ou sans aigrette). Petite plante pubescente ou laineuse,
annuelle. Capitules réunis en glomérules terminaux généralement involucrés par des
feuilles florales rayonnantes.

III. 2. Position systématique du genre Evax

Tableau 2 : Position systématique du genre Evax
Régne Plantae
Division Magnoliophyta

Classe Magnoliopsida
Ordre Asterales

Famille Asteraceae

Genre Evax

7
Chapitre I Aperçu bibliographique

En Algérie, il existe six espèces du genre Evax : argentea Pornel, crocidion Pornel,
discolor (Guss.) DC, heldreichii (ParI.) BaU, mauritanica Pornel, pygmaea (L.) Brot [6]
(Figure 3).

Figure 3. Quelques espèces de genre Evax [6, 11].

II. Les flavonoïdes

II.1. Généralité
Le nom flavonoïde proviendrait du nom latin flavus signifiant "jaune" [12, 13],
cependant d'autres auteurs supposaient que le terme flavonoïde a été plutôt prêté du terme
flavedo, désignant la couche externe des écorces d'orange [14].
Les flavonoïds ont été isolés par le scientifique E. Chervreul en 1814, mais n’ont été
réellement découverts qu'en 1930 par Albert Szent-Györgyui, désignés sous le nom de
vitamine P, en raison de leur efficacité à normaliser la perméabilité des vaisseaux sanguins,
cette dénomination fut abandonnée lorsqu'on se rendit compte que ces substances ne
correspondaient pas à la définition officielle des vitamines [15].
Les flavonoïdes ont constitué un intérêt global croissant pendant la dernière décennie et,
en raison de cette croissance dans la recherche, le nombre de flavonoïdes connus a augmenté
considérablement. En effet, au début des années 1990, le nombre de structures de flavonoïdes
reportées était d’environ 4000 [16], durant cette dernière décennie, ce nombre avoisine les
6500 structures différentes [17].

II.2. Définition et structure chimique

Les flavonoïdes représentent une classe de métabolites secondaires largement
répandus dans le règne végétal. Ce sont des pigments quasiment universels des végétaux qui
sont en partie responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles. On

8
Chapitre I Aperçu bibliographique

attribue à ces flavonoïdes de différentes propriétés variées. Ils sont également connus pour
moduler l’activité de plusieurs enzymes ou de récepteurs cellulaires [18].
Les flavonoïdes ont tous la même structure chimique de base, ils possèdent un squelette
carbone de quinze atomes de carbones constitué de deux cycles aromatiques (A) et (B) qui
sont reliés entre eux par une chaine en C3 en formant ainsi l’hétérocycle (C) [19].
Généralement, la structure des flavonoïdes est représentée selon le système C6-C3-C6
[18], en formant une structure de type diphényle propane dont des groupements
hydroxyle, methoxyle, méthyle, etc.… ou des sucres peuvent être attachés sur les
noyaux de cette molécule [14, 20] possèdent tous un même squelette (Figure 4).

Figure 4. Squelette de base des flavonoïdes.

II.3. Classification des flavonoïdes
Les différentes classes sont déterminées par le degré d’oxydation de l’unité de liaison
(C3), tandis que, les composés de la même classe sont déterminés par le point
d’hydroxylation, ou d’autre substitution, du noyau A ou B. Ils sont généralement solubles
dans l’eau [21] et stockés dans des vacuoles ainsi que dans les chloroplastes [22]. Dans la
nature, les flavonoïdes sont généralement glycosylés, ces sucres ainsi que les groupes
hydroxyles augmentent leur solubilité dans l’eau, d’autres substitutions telles que les
méthyles, rendent les flavonoïdes lipophiles [23].

9
Chapitre I Aperçu bibliographique

Les flavonoïdes se divisent en plusieures classe de molecules sont Les flavones,

flavonols, flavanones, dihydroflavonol, isoflavanones ,chalcones aurones ,anthocyanes et
tanins(figures5).

Figure 5. Représentation des principales classes et sous-groupes des flavonoïdes au niveau de

l’hétérocycle [24].

II.4. Localisation et Distribution

Les flavonoïdes sont impliqués dans de nombreuses interactions des plantes avec les
conditions biotiques et abiotiques de leur environnement, ces substances sont accumulées
dans différentes parties cellulaires et tissulaires de la plante durant l'organogénèse et sous
l'influence de plusieurs facteurs stimulants [25].
Ils sont présents dans toutes les parties des végétaux supérieurs : racines, tiges, feuilles,
fruits, graines, bois, pollens, ils peuvent aussi être rencontrés dans certaines boissons et chez
certains fourrages (ex: trèfle) [26].

10
Chapitre I Aperçu bibliographique

II.5. Intérêts biologiques des flavonoïdes et composés phénoliques

II.5.1.Effet antioxydants
L’oxygène moléculaire (O2) est à la fois toxique et indispensable à la vie .l’homme ainsi
que tout les organismes aérobies le tolèrent car, en contrepartie, ce gaz permet, en tant
qu’accepteur final d’électrons au niveau de leur chaine respiratoire, de stocker de l’énergie
Sous forme d’adénosine triphosphate (ATP) .l’oxygène permet aussi de faire fonctionner
certains systèmes enzymatique .toute fois, cette utilisation de l’oxygène entraîne la formation
d’espèces chimiques extrêmement réactives que sont les radicaux libres oxygène.
Ces espèces oxygénés réactives sont (ROS) sont utiles mais peuvent devenir toxiques
quand elles sont produites de manière excessive .cette toxicité peut être aggravée, par la
présence de façon naturelle dans l’organisme, de certains ions métalliques tels que le fer et le
cuivre.
Ces composés peuvent causer des essentiels des membranes cellulaires, des protéines et
aussi au niveau des acides nucléiques présents dans la cellule et notamment l’ADN. C’est
pour cette raison que notre organisme, lors de son évolution, a développé en parallèle des
systèmes de défense afin de le protéger contre cet effet toxique de l’oxygène [20].
Les défenses cellulaires antioxydants peuvent êtres classées en deux types de défenses ;
Les systèmes de défenses primaires et secondaires. Le système de défense primaire est
constitué de systèmes enzymatiques spécifiques tels que la super oxyde dismutase, la catalase
et la glutathion peroxydase ainsi que par une grande variété de petites molécules antioxydants.
Le système de défenses secondaire est formé, d’une part par des enzymes spécifiques tels que
la super oxyde dismutase, la catalase et le glutathion peroxydase ainsi que par une grande
variété de petites molécules antioxydants .le système de défense secondaire est formé , d’une
part par des enzymes lipolytiques et protéolytiques qui vont éviter l’accumulation de
composés oxydés résultant d’une attaque radicalaire e et autre part, par les systèmes de
réparation de L’ADN[27].
Un antioxydant est toutes substances qui, présentent à faible concentration par apport à
celle d’un substrat oxydable, retarde ou évite l’oxydation de ce substrat [28].
L’antioxydant peut agir par de nombreux mécanismes différents qui peuvent être
l’élimination directe de l’oxygène, le piégeage des espèces oxygénées ou azotées réactives
(ROS et NOS), l’inhibition de la formation de ces ROS et NOS, la chélation des ions
métalliques nécessaires à la génération des ROS ou la stimulation des défenses antioxydants
Endogènes [29].

11
Chapitre I Aperçu bibliographique

Parmi les molécules antioxydants spécialement les <<petites>> molécules antioxydants

telles : Les vitamines (α-tocophérol, acide ascorbique, est…..) mais également sur de
nombreux composés naturels extraits de plantes, notamment les caroténoïdes, les composés
phénoliques dont font partie les acides phénoliques et les flavonoïdes [30 ,31].
II.5.2.activité anti microbienne des flavonoïdes
L’activité antimicrobienne et donc anti-infectieuse des flavonoïdes a été démontrée par
de nombreuses études. Cette activité est due principalement à la capacité de ces molécules à
inhiber l’expression de l’ADN et la synthèse de certaines enzymes et protéines membranaires
des microorganismes [32].
II.5.3.activité antibactérienne des flavonoïdes
Les flavonoïdes ont une activité antibactérienne très vaste et très diversifiée. En effet, ils
s’attaquent à un grand nombre de bactéries avec une intensité différente selon le
microorganisme et l’écosystème dans lequel il de trouve : les flavonoïdes sont capables
d’inhibé la croissance de différents types de bactérie : Staphylococcus aureus [33] ;
Escherichia coli [34] ;Klebsiela pneumoniae ; et Pseudomanas aeruginosa…..ex[35].
Chaque composé agit spéfiquement sur un ou plusieurs germes. Exemple : sur plusieurs
bactéries testés l’épigénine n’à montré une faible activité que contre Staphylococcus aureus,
Toutes les autres ont été fort sensibles à ces flavonoïdes. Au contraire, la galangine n’à donné
une activité que sur Staphylococcus aureus ; les autres microorganismes se sont avérés
résistants contre cette molécules [36, 37,38].
Aussi dans certains travaux, il a été que les flavonoïdes extraits avec du méthanol 95᷁᷁ ٪
Etaient actifs sur certaines bactéries, alors que ceux extraits avec du méthanol 𝟔𝟎 ٪ de la
même plantes ne l’étaient pas, comme c’était le cas des flavonoïdes de linum capitatum
contre Staphylococcus aureus [37].
La diffusion radiale souvent demeure utilisée pour mettre en évidence l’activité
antimicrobienne in vitro. Même si la mesure par le biais de cette méthode est parfois difficile
à cause des zones di fusionnelles [38].bien que le mécanisme d’action des flavonoïdes sur le
microorganisme demeure encore imprécis, certaines études ont commencé à donner un début
d’explication de leur activité antibactérienne en citant des exemples bien explicites : comme
celui de la quercétine censée agir sur l’ADN gy rase d’Escherichia coli [39].
EN effet, selon les travaux de Dadi et ses collaborateurs, la quarcétine serait capable
d’inhiber la gy rase bactérienne par deux mécanismes :

12
Chapitre I Aperçu bibliographique

Elle se fixe sur l’ADN au niveau des sites d’insertion de l’enzyme bloquant ainsi son
acticité.
Elle ploque le site de fixation de l’ATP se trouvant sur l’ADN gyrase .Dans les deux
cas l’action du flavonoïde se manifeste par le clivage de l’ADN bactérien, désormais
incapable de subir les modifications topologique nécessaires à son bon fonctionnement
II.6. Les techniques d’identification structurale
L’identification des flavonoïdes se fait généralement (comme avec d’autres
structures organiques) par l’utilisation combinée des propriétés chromatographiques des
flavonoïdes comme la fluorescence sous la lumière UV-Visible et les valeurs de leurs Rf dans
différents systèmes de solvants et les données de plusieurs techniques spectroscopiques, telles
que la spectrophotométrie UV-Visible qui reste la méthode de choix pour ce type de
composés, et qui donne des indications importantes sur la nature du flavonoïde et son mode
de substitution et la résonance magnétique nucléaire (RMN) ainsi que la spectrométrie de
masse (SM) [39,40].
II.6.1. Facteur de retardement et comportement chromatographique
Ce facteur symbolisé par Rf est défini comme étant le rapport de la distance entre la
tâche du produit et l’origine d’une part et la distance entre l’origine et le front de solvant
d’autre part.
Rf= Distance parcourue par le composé /Distance parcourue par l’éluant.

La valeur du Rf varie avec la nature du solvant utilisé (organique ou aqueux), le type de

support chromatographique (gel de silice, polyamide, cellulose), la forme du produit lui-
même (aglycone ou glycosyle), ainsi que de la disposition des différents substituant sur le
squelette flavonique. Le tableau 3 montre l’influence de la substitution du squelette
flavonique sur la valeur du Rf [39, 40].
Tableau 3 : La relation entre Rf et la structure flavonique
Structure flavonique Rf
Rf diminue dans les systèmes de solvants
Augmentation des groupes hydroxyles organiques et augmente dans les systèmes de
solvants aqueux
Rf augmente dans les systèmes de solvants
Méthylation des hydroxyles organiques et diminue dans les systèmes de
solvants aqueux
Rf diminue dans les systèmes de solvants
Glycosylation organiques et augmente dans les systèmes de
solvants aqueux

13
Chapitre I Aperçu bibliographique

II.7. Identification spectrale

II.7.1. La coloration sous UV
L’examen des flavonoïdes sous lumière UV 365 nm est très utilisé pour leur
détection. Tous les flavonoïdes apparaissent sous UV sous forme de spots colorés, permettant
d’avoir des renseignements pour déterminer leur structure [41, 42].
II.7.2. Spectrophotométrie UV- Visible
C’est la méthode la plus importante pour l’identification partielle des structures
flavoniques. Elle est basée essentiellement sur l’enregistrement d’un spectre dans un milieu
alcoolique (méthanol ou éthanol) qui sera caractérisé par deux bandes d’absorption
principales (Figure 6) [43].

Figure 6: Les deux bandes d’absorption des flavonoïdes.

 La bande I : Ayant un maximum d’absorption entre 300 et 400 nm, elle est attribuée à
l’absorption du système cinnamoyle qui résulte de la conjugaison du groupement carbonyle
avec la double liaison C2-C3 et le noyau B, elle donne donc, des renseignements sur les
variations structurales du cycle B et l’hétérocycle C.
 La bande II : présentant un maximum d’absorption entre 240 et 280 nm, elle est
attribuée à l’absorption du système benzoyle qui dérive de la conjugaison du groupement
carbonyle avec le noyau A et donne des informations sur les variations structurales du cycle A
[44].
En présence de divers réactifs : NaOH, AlCl3, HCl, NaOAc et H3BO3 et par des
réactions d’hydrolyse et de compléxation, les valeurs des déplacements des bandes I et II vont
varier ; ce qui nous donne des informations sur La nature des flavonoïdes [45].

14
Chapitre I Aperçu bibliographique

Le tableau 4 donne l’intervalle du maximum d’absorption des deux bandes en milieu

méthanolique pour quelques types de flavonoïdes :
Tableau 4 : Position des bandes I et II en fonction du type de flavonoïdes.
Type de flavonoïdes Bande I λmax (nm) Bande II λmax (nm)
Flavones 310-350 250-280
Flavonols (3-OH libre) 350-385 250-280
Flavonols (3-OH substitué) 330-360 250-280
Isoflavones 310-330 245-275
Flavanones et dihydroflavanols 300-330 275-295
Chalcones 340-390 230-370 faibles intensités
Aurones 380-430 230-370 faibles intensités
Anthocyanidines et anthocyanines 465-560 270-280

L’addition de divers réactifs au flavonoïde permet de localiser les substituant sur le

squelette flavonique où en général la présence d’un hydroxyle libre provoque un effet
bathochrome (déplacement vers les grandes longueurs d’ondes). Pour une méthylation ou
glycosylation des positions 3, 5 et 4’ hydroxylées, un déplacement hypsochrome est noté par
la bande I.
II.7.3. Le spectre UV en présence de réactifs :
Les réactifs souvent utilisés sont : NaOH, NaOAc, NaOAc + H3BO3, AlCl3 et
AlCl3+HCl. Certains d’entre eux forment des complexes tels qu’AlCl3 et NaOAc.
II.7.3. à. L’addition d’AlCl3 et AlCl3 + HCl :
L’addition de AlCl3 à la solution du flavonoïde dans le méthanol mène à la formation
de complexes entre les hydroxyles ortho, l’hydroxyle en 3 et le groupement carbonyle et
l’hydroxyle en position 5 et le groupement carbonyle [6] ; Ce qui entraîne un effet
bathochrome de la bande I mais l’addition de HCL provoque la disparition des
complexes instables et le maintien des complexes stables (hydroxyle et carbonyle).
Ceci se manifeste par un déplacement hypsochrome de la bande I par rapport à celui en
présence d’AlCl3 et bien évidement un effet bathochrome moins important par rapport au
spectre dans le méthanol, pris comme référence.

15
Chapitre I Aperçu bibliographique

II.7.3.b. L’addition de NaOH et de NaOAc :

 NaOH :
L’addition de NaOH indique le nombre et la position des hydroxyles libres sur le
squelette flavonique essentiellement les OH des positions 7, 4’ et 3 par effet bathochrome de
la bande I.
 NaOAc :
Ce réactif sert à détecter les groupements hydroxyles essentiellement celui de la position
7 par un léger effet bathochrome de la bande II, il ionise les OH les plus acides comme les
hydroxyles des positions 3,7 et 4’ [46]. Le tableau 4 donne les informations obtenues des
spectres en présence de réactifs [44, 46].
II.7.3. c. L’addition de NaOAc + H3BO3 :
Le H3BO3 est additionné à l’échantillon en présence de NaOAc et les informations
apportées indiquent l’existence ou l’absence d’hydroxyle ortho sur le cycle B ou sur le
cycle A (6, 7 ou 7, 8) à cause des complexes formés, l’effet qui se manifeste est un effet
bathochrome de la bande I par rapport au spectre dans le méthanol [47] .
 Addition des réactifs (série spectrale UV) :

16
Chapitre I Aperçu bibliographique

Tableau 5: Interprétation des déplacements des maximums des bandes I et II après addition
des réactifs.

λ max (nm)
Les réactifs Interprétation
Bande I Bande II
304-350 250-280 Flavone
MeOH 352-385 250-280 Flavonol-3OH
328-357 250-280 Flavonol 3-OR
+45 à +65
stable / MeOH OH en 4’
NaOMe diminution d’intensité OR en 4’et OH en 3
(NaOH) L’intensité diminue 3’,4’ OH ou
avec le temps Ortho-di-OH sur A
(décomposition) ou Ortho-di-OH sur B
Nouvelle bande/MeOH entre 320 à 335 7-OH
+5 à +20
déplacement diminue
en présence d’un 7-OH
substituant en 6 ou 8.
NaOAc
Pas de déplacement ou 7-OR
très faible.

Spectre qui se 5, 6, 7-tri-OH

décompose avec le ou 5, 7, 8-tri-OH
temps.
+12 à +36 Ortho di-OH sur B
NaOAc+H3BO3 +05 à +10 Ortho di-OH sur A
(6,7) ou (7,8).
Une seule bande entre Ortho-di-OH sur B
AlCl3 420-430. avec 5-OH

+17 à +20 5-OH avec une

oxygénation en 6.
MeOH / +35 à +55 5-OH et 3-OMe
(AlCl3 + HCl)
+50 à +65 OH en 3 avec ou sans
OH en 5
-20 à -40 avec un Ortho-di-OH sur B.
AlCl3 / sommet ou
(AlCl3+HCl) épaulement entre
[350-360].
-20 à -25 Ortho-di-OH sur A
et ortho-di-OH sur B ou
tri-OH sur B.

17
Chapitre I Aperçu bibliographique

II.8. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) :

C’est une méthode très précise et très efficace, elle est couramment utilisée et permet
entre autre, la localisation des protons de la molécule [48].
o La détermination du nombre, de la nature et la position des sucres [49,50].
o L'identification des liaisons C-(et O-) sucres.
o L’identification des substituant acylés et leur sites d’acylation.
o L’identification des substituant oxygénés.
1. Protons aromatiques
 Protons du noyau A :
Selon les substitutions possibles, les résonances et les multiplicités des protons H-5, H-6
et H-8 sont résumées dans le (tableau6).
Tableau 6 : Déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau A.

Protons du noyau A (H-5) (H-6) (H-8)

Nature du flavonoïde δ, ppm J, Hz δ, ppm J, Hz δ, ppm J, Hz
5, 7 – OH _ 6.0-6.2 d 2.5 6.3-6.5 d 2.5
5-OH, 7OR (R=Gluc.) _ 6.2-6.4 d 2.5 6.5-6.9 d 2.5
7-OR (R=H, sucre) 8.0 d 9 6.7-7.1 dd (9.0 ; 2.5) 6.7-7.0 d 2.5
5, 6, 7-OR R=H, sucre _ 6.3 s 6.3 s
5, 7, 8-OR

 Protons du noyau B :
Les protons de ce noyau apparaissent dans l’intervalle {6.7-8.1 ppm}, le déplacement
chimique est basé sur les substituant sur le noyau B et le degré d’oxydation du noyau C
(tableau 7) [51].
Tableau 7 : Déplacements chimiques et constantes de couplage des protons du noyau B.
Protons du noyau B (H2’, H6’) ( H3’, H5’)
δ, ppm J, Hz δ, ppm J, Hz
Flavone (4’-OR) 7.7-7.9 d 8.5 6.5-7.1 d 8.5
Flavonol (4’-OR) 7.9-8.1 d 8.5 6.5-7.1 d 8.5

 Protons du noyau C :
Le proton H3 dans la flavone, résonne sous forme d'un singulet dans l’intervalle {6.20-
6.40 ppm} [52], mais dans le cas des flavonols il disparait.
2. Protons aliphatiques :
 Protons methoxyle :
Ils se présentent sous la forme d’un signal singulet dans l’intervalle entre 3.4 et 3.9ppm [53].

18
 Chapitre I Aperçu bibliographique

Protons du sucre :
Les déplacements chimiques des protons anomeriques dépendent d’une part du flavonoïde et
d’autre part de la position et du type de liaison sucre- aglycone. La constante de couplage entre le
proton anomerique du sucre et celui du proton existant en 2'' a une grande importance car elle
permet de savoir le type de la liaison entre le sucre et l’aglycone, s’il s’agit d’une position α ou β.
Pour le sucre glucose, le proton anomerique donne en général un doublet et sa constante de
couplage est de l’ordre 7Hz, car il est toujours en position β d'après la biogénèse.
Pour le rhamnose, son proton anomerique donne un doublet aussi mais sa constante de
couplage est de J ≈ 2.5 Hz (position α). On peut aussi reconnaitre le sucre rhamnose par le signal du
groupement méthyle sous forme de doublet entre 0.8-1.2 ppm et avec une constante de couplage de
J ≈ 6 Hz.
Les tableaux 8 et 9 représentent les déplacements chimiques du proton anomerique de
quelques flavonoïdes mono et di-glycosyles.
Tableau 8 : Déplacements chimiques de protons anomeriques de sucres de flavonols mono
glycosyles.
Flavonoïdes δ H1’’ [ppm]
7-O- β-D-glucosyl flavonol 4.8 - 5.2
3-O- β-D-glucosyl flavonol 5.7 - 6.0
7-O- α-L-rhamnosyl flavonol 5.1 - 5.3
3-O-α-L-rhamnosyl flavonol 5.0 - 5.1

Tableau 9 : Déplacements chimiques de proton anomeriques de sucres flavonoïdes

Di glycosylés [54, 55].
Le sucre initial δ H1'' [ppm] Le sucre terminal δ H1''' [ppm]
5.72-5.75 2-O-β-D-Glucosyl 4.63-4.65
3-O-β-D-Glucoside 5.28-5.46 6-O-β-D-Glucosyl 3.96-4.02
5.40-5.66 2-O-α-L- Rhamnosyl 4.90-5.10
5.28 6-O-α-L-Rhamnosyl 4.37-4.39
5.56 2-O-β-D-Glucosyl 4.10-4.23
3-O-α–L- 5.21-5. 50 3-O-β-D-Glucosyl 4.32-4.48
Rhamnoside 5.33-5.44 3-O-β-D-Galactosyl 4.25
5.31 3-O-α-L-Rhamnosyl 4.81

19
Chapitre I Aperçu bibliographique

II.9. L’hydrolyse acide des glycosides :

Les flavonoïdes existent sous deux formes qui sont les aglycones et les glycosides, ces
derniers sont des aglycones ou un sucre (ou plusieurs) est lié soit par une liaison C-C ou CO a
l’aglycone, et pour connaitre la nature du sucre avec les O-glycosides, on a recours a
l’hydrolyse acide qui permet la rupture de la liaison entre l’aglycone et le sucre et ainsi
extraire le sucre et l’identifier par CCM, en présence de plusieurs sucres témoins à noter que
les C-glycosides sont résistants à l’hydrolyse acide.
On prend 2 ml du glycoside dans un tube à essai, auquel on rajoute le même volume
d’une solution HCl (4N), on fait chauffer dans un bain-marie à 100°C pendant 60 minutes.
Ensuite, on procède à des extractions liquide-liquide avec :
 L’éther di éthylique (3 fois).
 L’acétate d’éthyle (3 fois).
 Le n-butanol (1seule fois).
Lorsqu’on termine, la phase aqueuse doit être chassée à l’aide d’un évaporateur rotatif
sous pression réduite.
L’identification du sucre se fait par chromatographie :
Sur plaque de gel de silice aspergée avec NaH2PO4 (0.2M) puis séchée dans l’étuve a
100°C durant 1 heure, on réalise des piqures correspondant aux sucres témoins et à la phase
aqueuse de produits testés. Cette plaque est éluée dans un système : acétone/ eau (9 : 1 v/v).
Apres séchage de la plaque, on l’asperge encore par un mélange de :
 1 g d’acide malonique.
 3 ml d’acide phosphorique concentré.
 1 ml d’aniline.
 100 ml d’éthanol.
On laisse la plaque quelques minutes sur la paillasse, puis on la met dans l’étuve à
100°C pendant 5 minutes.
La comparaison des Rf des différentes taches permet d’identifie le sucre lié à la génine
(même Rf d’un sucre témoin et du sucre de la phase aqueuse du produit testé).
La réalisation d’une plaque CCM des produits testés avant l’hydrolyse et les phases
organiques obtenus après hydrolyse est très importante car le changement d’Rf indique que la
séparation est faite (dans un système d’élution polaire le Rf, après l’hydrolyse acide,
augmente).

20
Chapitre I Aperçu bibliographique

L’enregistrement du spectre UV dans le MeOH des phases organiques doit permettre

l’observation d’un déplacement bathochrome de la bande qui contient le sucre (OR devient
OH)

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Paris.
[53] Skoog, D.A., West D.M., Holler F.J. (1997). Chimie Analytique. Traduction de la 7ème
édition américaine par Buess-Hermann C., Dauchot-Weymeers J., Dumont F., De Boeck
Université. 996.
[54] Rhode, R. (1998). Extraction Liquide/Liquide. Cours du Lycée Pradeau la
Sède,Tarbes.
[55] Mekkiou Ratiba. Thèse de Doctorat. Université Mentouri-Constantine.

25
 Chapitre II :

Etude phytochimique d’une

plante du gerne Evax

26
I- Etude phytochimique de la plante:
I.1. Récolte du matériel végétal :
La plante a été récoltée dans la région de Constantine au mois de Mai 2014. Après
séchage dans un endroit sec à l’abri des rayons solaires, les parties aériénnes (feuilles-
tiges) ont été pulvérisées, broyées et pesées (m=950g).

I.2. Extraction de la plante :

La matière végétale a subit une macération dans un mélange hydro alcoolique
(EtOH/H2O: 7/3, v/v), pendant 24 heures. Le premier extrait récupéré est filtré puis
concentré sous pression réduite. La macération est répétée (3x24 heures) avec
renouvellement du solvant.
 Après concentration à une température n’excédant pas 40°C, nous avons obtenu un
résidu sirupeux. Ce dernier est dilué avec de l’eau distillée.
 La solution obtenue est laissée au repos à froid pendant une nuit pour décantation.
Cette décantation permet le dépôt de la chlorophylle, des cires, etc...
 Après filtration, la phase aqueuse obtenue est épuisée successivement par des
extractions liquide-liquide dans une ampoule à décanter en utilisant des solvants non
miscibles à l’eau et de polarité croissante en commençant par le chloroforme, puis l’acétate
d’éthyle et en dernier le n-butanol.
 Les trois phases organiques récupérées sont évaporées sous pression réduite et pesées
les rendements sont donnés dans le (tableau 1).
Tableau 1 : Les masses des extraits.
Matériel végétal Extrait Masse (g)
Chloroforme 2
950g Acétate d’éthyle 4.78
n-butanol 10

27
 950 g de matière végétale pulvérisée.

 Macération dans (EtOH: H2O) (7:3)

 Filtration
 Concentration à sec

Extrait brut

 Traitement avec H2O

 Filtration

Phase aqueuse

 Extraction par CHCl3

 Décantation

Phase aqueuse Extrait CHCl3

m=2g

 Concentration à
 Extraction par AcOEt
m= sec
 Décantation

Phase aqueuse Extrait AcOEt

m = 4.78g
 Extraction par n-BuOH
 Décantation
 Concentration à
sec

Phase aqueuse Extrait n-Butanol

m =10g

Figure 1 : Protocole d’extraction de la plante.  Concentration à

sec

28
 I.3 Séparations et purification :
I.3.1. Test chromatographique :
Le profil HPLC de la phase acétate d’éthyle montre que l’extrait est riche en
flavonoïdes. (Voire annexe).

Figure 2 : Le profil HPLC de la phase acétate

 Conditions :
 Colonne : RESTEK ultra C18, 5µm, 250x46 mm
 Eluant : ACN/H2O (50:50).
 Débit : 1ml/min.
 Température : 30°C.
I.3.2. Séparation sur colonne :
4.78g de l’extrait Acétate d’éthyle sont dissous dans le minimum de méthanol et
mélangés à une petite quantité de gel de polyamide, puis pulvérisé jusqu’à l’obtention d’une
poudre homogène. Cette dernière est déposée en haut de la colonne de polyamide préparée
dans le toluène. L’élution est réalisée par un gradient de polarité du système toluène-
méthanol, commençant par le toluène pur, en augmentant la polarité par l’addition
progressive de méthanol.
Des fractions de 150 ml sont recueillies. La progression de cette colonne est
rassemblée dans le (tableau 2)

29
 Tableau 2: Résultats du fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle.

Lot de fraction Toluene % MeOH %

1-5 100 0
6-16 98 2
17-30 96 4
31-51 92 8
52-80 88 12
81-112 85 15
113-144 80 20
145-180 75 25
181-200 70 30
201-220 50 50
221-230 0 100

Les fractions sont analysées par chromatographie analytique sur couche mince de gel de
silice avec différents systèmes d’élutions.
Les plaques CCM sont visualisées sous lumière UV (254 et 365nm) puis révélées avec
l’acide sulfurique.
Selon les résultats donnés par les plaques chromatographiques sur gel de silice, éluées par
différents systèmes, nous avons pu regrouper les fractions qui ont les mêmes compositions et le
tableau 3 résume le regroupement des fractions de la colonne.
Tableau 3 : Regroupement final des fractions de la colonne.

Lot N° de la fraction Observation

1-10 F1 Graisse et cires
11-41 F2
42-50 F3 Mélange de produits
120-125 F4 Mélange séparable
60-79 F5 Mélange séparable
80-90 F6 Faible quantité
91-114 F7 Mélange séparable
115-139 F8 Mélange séparable
140-162 F9 Faible quantité
163-175 F10 Produit majoritaire
176-190 F11 Mélange complexe
191-217 F12
218-230 F13

30
 Parmi les fractions obtenues, on a étudié celles qui sont simples et séparables et celles
qui ont une quantité importante
Après l’examen des plaques CCM de gel de silice sous lumière UV à 254 nm et 365
nm, on a choisi l’étude de deux fractions : F7, F10.
II.1.1. Etude de la fraction F7
La fraction F7 (164 mg) a subi une deuxième séparation sur colonne isocratique
de gel de silice en utilisant le système : AcOEt/MeOH /H2O (20 :0,25 :0.25) v/v. comme
éluant.
Le suivi de la séparation et le rassemblement final des fractions, sont présentés dans le
(tableau 4).
Tableau 4 : Résultats de la séparation par chromatographie sur colonne de la fraction F7
1-16 F7-1 Produits non flavoniques
17-27 F7-2 Mélange de produit
28-36 F7-3 Mélange de produit
37-42 F7-4 Mélange du produit et
AcOEt :MeOH :H2O début d’apparition du
(20 :0,25 :0.25) v/v produit P1
43-48 F7-5 Produit P1de petite
quantité
49-53 F7-6 Produit P1, mono-tâche
54-60 F7-7 Quantité insuffisante
61-67 F7-8
68-73 F7-9 Mélange complexe

74-80 F7-10

a. Traitement de la sous fraction f 7-6 :

La sous fractions f 7-6, montre une mono-tâche sur la plaque CCM de coloration
violette, sous la lumière UV 356 nm.
 Traitement de la fraction F10:
Dans la fraction F10, nous avons observé la formation de cristaux fins de couleur
jaune que nous avons lavé et séché pour obtenir 42 mg de produit à l’état pur.

31
 4,7g d’extrait acétate d’éthyle

CC polyamide
Toluène/MeOH (gradient croissant)

F7 F10
F1 F13
CC (gel de silice) (Isocratique)
AcOEt/MeOH /H2O
(20 :0,25:0.25) v/v

 Précipitation
 Lavage

F7-1 F 7-10

F7-6

P2

P1

Figure 3: Organigramme de Séparations chromatographiques effectuées sur l’extrait

Acétate de la plante.

32
III. Résultats et discussion :
Les composés isolés ont été identifiés par les analyses spectrales, particulièrement la
RMN-H1et UV-Visible, sans négliger les autres caractéristiques physicochimiques
(hydrolyse acide, Rf et la fluorescence sous lumière de Wood).
III.1. Identification de produit P1 :
a. Comportement chromatographique :

Système SI
Rf 0.34
Fluorescence sous lumière de Violette
Wood
SI : (AcOEt : MeOH : H2O) (20 :0.25 :0.25) v/v

b. Données spectrométrie :
b.1. Données spectrométrie UV-Visible:
Le produit P1 a été analysé en spectrophotométrie UV-Visible en présence d’une série
de réactifs permettent de tirer les observations suivants (Tableau 5) :
Tableau 5: Données de la série spectrale UV-Visible du produit P1.
Bande I Autres Bande II
Réactifs λmax (nm) bandes λmax (nm) Interprétation
λmax (nm)
MeOH 355 - 254 Flavonol(3-OR)
NaOH 413 330 271 4'-OH
NaOAc 396 - 274 7-OH
NaOAc+H3BO3 365 - 269 Pas de ortho di-OH sur le cycle B
AlCl3 403 - 268 Pas de ortho di-OH sur le cycle B
AlCl3+HCl 400 - 269 5-OH

Interprétation :
 Le comportement chromatographique dans les différents systèmes indique que le
composé p1est un flavonoïde monoglycosyle.
 Les données du spectre UV du produit effectué dans le méthanol (Figure 5, Tableau
5), et de la fluorescence violette de ce composé sous la lumière de Wood et la valeur de la
bande I (λmax= 355) nm indiquent qu’il s’agit d’un flavonoïde de type flavonol substitué en
3 (3-OR).
 l’apparition d’un épaulement au niveau de la bande II indique que le cycle B est
bisubstitué.

33
  L’addition de NaOH induit un effet bathochrome de la bande I (Δλ=+58 nm) avec
augmentation de l’intensité lumineuse indiquant la présence d’un OH libre en position 4', la
présence d’une nouvelle bande à 330 nm montre la présence d’un OH en 7.
 La présence d’un effet bathochrome de la bande II (Δλ=+17 nm) après l’addition de
NaOAc par rapport au spectre MeOH confirme la présence d’un OH en 7.
 Le déplacement bathochrome (Δλ=+45 nm) de la bande I observe dans le spectre UV
enregistré dans le chlorure d’aluminium acidifié (AlCl3+HCl), comparativement à celui
enregistré dans le méthanol, indique la présence d’un groupement hydroxyle en position 5.
 L’absence d’un effet hypsochrome de la bande I après l’addition de HCl au système
(MeOH+AlCl3) indique l’absence d’un système ortho di-hydroxylé sur le cycle B. Ceci est
confirmé par le faible déplacement de la bande I (Δλ= +3nm), en comparant le spectre
(MeOH+NaOAc+H3BO3) avec le spectre enregistré dans le MeOH.

0,7

0,6 MeOH 0,8 MeOH+

0,7
NaOH
0,5

0,6
0,4
Absorbance

0,5
Absorbance

0,3
0,4

0,2 0,3

0,2
0,1
0,1
0,0
0,0

-0,1 -0,1
250 300 350 400 450 500 250 300 350 400 450 500
Longueur d'onde (nm) Longueur d'onde (nm)

0,8
MeOH+ 1,0
0,7
NaOAc+
0,6 H3BO3 MeOH+
0,8
AlCl3+
0,5 HCl
Absorbance

0,6
0,4
Absorbance

0,3
0,4
0,2

0,1 0,2

0,0
0,0
-0,1
250 300 350 400 450 500
250 300 350 400 450 500
Longueur d'onde (nm) Longueur d'onde (nm)

Figure 4: Série spectrale UV –Visible de produit P1.

34
 Ces données permettent la proposition de la structure partielle suivante pour le produit P1 :

b.2. Données spectroscopiques RMN-H1:

Tableau 6:Données spectroscopiques RMN-H1 (500MHz, CD3OD) de P1.
Déplacement Intégration Multiplicité Constante de Attribution
chimique (ppm) couplage J (Hz)
7.95 1H d 2.0 H2’
7.61 2H dd 8.5 et 2.0 H6’
6.93 1H d 8.5 H5’
6.43 1H d 2.1 H8
6.23 1H d 2.1 H6
5.44 1H d 7.4 H1’’(Glu)
3.76 3H s - OCH3

Interprétation :
Le spectre RMN-H1 (Figure 5-6, Tableau 6) confirme les informations apportées par la
spectroscopie UV-visible, en montrant les signaux caractéristiques d’un flavonol (3-OR) bi
substitué sur le cycle B, apparaissant comme suit :
 Un doublet résonant à δ=7.95 ppm d’intégration 1H (J = 2 Hz) (couplage méta),
attribuable à H2'.
 Un doublet dédoublé résonant à δ = 7.61 ppm d’intégration 1H (J = 8.5 et 2.0 Hz)
(couplage méta avec 2’ et ortho avec 5’), attribué à H6′.
 Un double à δ = 6.93 ppm d’intégration 1H (J = 8.5 Hz) (couplage ortho),
attribuable à H5'.L’ensemble de ces trois signaux oriente vers une bisubstitution du noyau B.
 deux doublets apparaissent à δ=6.43 ppm et à δ=6.23 ppm d’intégration 1H (J = 2.1
Hz), attribués respectivement à H8 et H6, (couplage metha).
 L’apparition d’un doublet à δ=5.44 ppm (J =7.4 Hz) caractéristique d’un proton
anomérique du sucre H1’’.
 Un singulet d’intégration 3H à δ = 3.76 ppm indiquant la présence d’un groupement
méthoxyle (OCH3) dans la molécule.
 Dans l’intervalle [3.20-3.90] ppm, se trouvent les autres protons des sucres.
35
 O-CH3

Figure 5: Spectre RMN-H1 (500MHz, CD3OD) du produit P1.

H2 H6 H8 ’
H5 H6 ’ H1’’
’ ’
’

Figure 6 : Spectre RMN-H1 (500MHz, CD3OD) du produit P1.

Ces données ne nous permettent pas de suggérer la structure finale du produit P1

Pour déterminer la position de méthoxyle et celle de sucres ainsi que la nature exacte du
sucre nous avons procédé à l’hydrolyse acide du composé P1 (Tableau 7).

Tableau 7 : Résultats de la série spectrale UV Visible du produit P1, après hydrolyse.

36
Partie aglycone P1
Réactif Bande I λmax (nm) Bande II λmax (nm)
MeOH 376 256

 L’aglycone obtenue, après l’hydrolyse acide, donne une fluorescence jaune sous
lampe
 UV indiquant la présence d’un flavonol, ce résultat nous permette d’attribuer le
groupe méthoxyle à la position 3′et le sucre à la position 3.
 L’hydrolyse acide de ce composé montre la présence d’un glucose identifies par
chromatographie avec des témoins de référence.

Figure 7. La Co-chromatographie des sucres libérés des composés P1, P2.

 Ces résultats (UV-Visible, RMN-H1, l’hydrolyse acide) nous permettent d’identifier
la structure finale du produit P1 :

Ce composé est connu sous le nom : Isorhamnétine-3-O-β-D-glucoside.

37
III.2.Identification de produit P2 :
a. Comportement chromatographique :

Système SI
Rf 0.23
Fluorescence sous lumière de Wood Jaune
SI : (AcOEt : MeOH : H2O) (20 :0.25 :0.25) v/v
b. Données spectrométrie :
b.1. Données spectrométrie UV-Visible:
Le produit P2 a été analysé en spectrophotométrie UV-Visible en présence d’une série
de réactifs permettent de tirer les observations suivants (Tableau 8) :
Tableau 8: Données de la série spectrale UV-Visible du produit P2.

Bande I Autres Bande II

Réactifs λmax(nm) bandes λmax (nm) Interprétation
λmax (nm)
MeOH 372 - 256 Flavonol 3-OH
NaOH 425 - 271 4'-OH
NaOAc 406 - 259 7-OR
NaOAc+H3BO3 390 - 261 ortho di-OH sur le cycle B
AlCl3 461 - 271
ortho di-OH sur le cycle B
AlCl3+HCl 429 - 267 5-OH
Interprétation :
 Le comportement chromatographique indique que le composé est un flavonoïde
monoglycosyle.
 La fluorescence jaune sous la lampe de Wood et l’absorption maximale de la bande
I à (λ max = 372nm) du spectre UV du produit enregistré dans le méthanol indique
qu’il s’agit d’un flavonoïde de type flavonol 3-OH.
 L’addition de NaOH induit un effet bathochrome de la bande I (Δλ=+53 nm) avec
augmentation de l’intensité lumineuse indiquant la présence d’un OH libre en position 4'et
l’absence d’une nouvelle bande dans l’intervalle [320-335] nm montre la présence d’un OR
en 7.
 L’addition de NaOAc ne provoque pas de déplacement bathochrome de la bande II
par rapport au spectre MeOH ; ce qui confirme la présence d’un OR en 7.
 Le déplacement bathochrome (Δλ=+57 nm) de la bande I observe dans le spectre UV
enregistré dans le chlorure d’aluminium acidifié (AlCl3+HCl), comparativement à celui
enregistré dans le méthanol, indique la présence d’un groupement hydroxyle en position 5.
38
  La présence d’un effet hypsochrome de la bande I (Δλ=-32 nm) après l’addition de
HCl au système (MeOH+AlCl3) indique la présence d’un système ortho di-hydroxylé sur le
cycle B. Ceci est confirmé par l’effet bathochrome de la bande I (Δλ= +18nm), en
comparant le spectre (MeOH+NaOAc+H3BO3) comparativement au spectre enregistré dans
le MeOH.

1,6
MeOH
1,0 MeOH+
1,4
NaOH
1,2
0,8
1,0
Absorbance

0,6

Absorbance
0,8

0,6
0,4
0,4

0,2 0,2

0,0
0,0
-0,2
250 300 350 400 450 250 300 350 400 450
Longueur d'onde (nm) Longueur d'onde (nm)

MeOH+
0,7 1,0 AlCl3+
MeOH+
0,6
NaOAc+ HCl
H3BO3 0,8
0,5

0,6
Absorbance

0,4
Absorbance

0,3
0,4
0,2

0,2
0,1

0,0
0,0

-0,1
250 300 350 400 450 500 250 300 350 400 450 500

Longueur d'onde (nm) Longueur d'onde (nm)

Figure 8: Série spectrale UV –Visible de produit P2

Ces données permettent la proposition de la structure partielle suivante pour le produit p2 :

39
b.2. Données spectroscopiques RMN –H1 :
Tableau 9:Données spectroscopiques RMN –H1 (500MHz, CD3OD) de P2.

Déplacement Intégration Multiplicité Constante de Attribution

chimique (ppm) couplage J (Hz)
7.79 1H d 2.1 H2’
7.69 2H dd 8.4 et 2.1 H6’
6.91 1H d 8.4 H5’
6.78 1H d 2.1 H8
6.49 1H d 2.1 H6
5.08 1H d 7.4 H1’’(Glu)

Interprétation :
Le spectre RMN-H1 (Figure 9-10, Tableau9) confirme les informations apportées par
la spectroscopie UV-visible, en montrant les signaux caractéristiques d’un flavonol (3-OH)
substitué sur le cycle A, apparaissant comme suit :
 Un doublet résonant à δ=7.79 ppm d’intégration 1H (J = 2.1 Hz) (couplage méta),
attribuable à H2'.
 Un doublet dédoublé résonant à δ = 7.69 ppm d’intégration 1H (J = 8.4 et 2.1 Hz)
(couplage méta avec 2’ et ortho avec 5’), attribué à H6′.
 Un doublet à δ = 6.91 ppm d’intégration 1H (J = 8.4 Hz) (couplage ortho),
attribuable à H5'.
 deux doublets apparaissent à δ=6.78ppm et à δ=6.49 ppm d’intégration 1H (J = 2.1
Hz), attribués respectivement à H8 et H6.
 L’apparition d’un doublet à δ=5.08ppm (J =7.4 Hz) caractéristique d’un proton
anomérique du sucre H1’’.
 Dans l’intervalle [3.40-3.75] ppm, se trouvent les autres protons des sucres.

40
 H1’’

Figure 9: Spectre RMN –H1 (500 MHz, CD3OD) du produit P2.

H2 ’
H6
H6 ’ H5 ’ H8

Figure 10 : Spectre RMN –H1 (500 MHz, CD3OD) du produit P2.

Ces données ne nous permettent pas de suggérer la structure finale du produit P2.
Pour déterminer la position et la nature exacte du sucre nous avons procédé à l’hydrolyse
acide du composé P2 (Tableau 10).
Tableau 10. Résultats de la série spectrale UV Visible du produit P2, après hydrolyse.
Partie aglycone P2
Réactif Bande Iλmax (nm) Bande IIλmax (nm)
MeOH 371 255
NaOAc 392 274

41
  Après l’addition de NaOAc par rapport au spectre enregistré dans MeOH, on
observe un déplacement bathochrome de la bande II (∆λ=+15nm) indiquant la présence
d’un OH libre en position 7 ce résultat confirme la présence d’un sucre à cette position.
 L’hydrolyse acide de ce composé montre la présence d’un glucose identifies par
chromatographie avec des témoins de référence (Figure 7).
 Ces résultats (UV-Visible, RMN –H1, l’hydrolyse acide) nous permettent d’identifier
la structure finale du produit P2 :

Ce composé et connu sous le nom : Quercétine-7-O-β-D–glucoside.

42
Partie biologique

43
 Chapitre I :

Matière et méthodes

44
 Chapitre I matière et méthodes

Introduction :
Les extraits naturels de plantes contiennent une variété de composés phénoliques
auxquels sont attribuées diverses activités biologiques [1].
Pour cette raison la présente étude est consacrée à lévaluation les propriétés
antioxydante et antibactérienne de l’extrait acétate d’éthyle à partir d’une plante de genre
Evax. Le potentiel antioxydant des échantillons était évalué en utilisant la technique
d’inhibition du radical libre DPPH et l’activité bactérienne par la méthode de diffusion en
milieu gélosé [2].

I. Dosage des polyphénols :

I.1. principe du dosage :
Les teneurs en polyphénols totaux de l’extrait, fraction et sous-fraction sont déterminées
selon la méthode de Folin-Ciocalteu [3].
Ce dernier est constitué par un mélange d’acide phospho tungstique et d’acide phospho
molybdique qui est réduit, lors de l’oxydation des phénols en mélange d’oxydes bleus de
tungstène et de molybdène. La coloration bleue produite possède une absorption 765 nm.
Pour cela, la détermination se fait spectrophoto métriquement à cette longueur d’onde.
I.2. Protocole expérimental :
 Une prise de 125µL de l’extrait dilué (selon le solvant et l’organe) est mélangée avec 500µl
d’eau distillée et 125µL de réactif de Folin-Ciocalteu.
 Après une agitation vigoureuse du mélange suivie d’un repos de 3min, une prise de 1250µl de
Na2CO3 2% est additionnée.
 Enfin le mélange obtenu est ajusté par de l’eau distillée à 3mL.
 Après un repos de 90 min à l’obscurité, la lecture est effectuée à une longueur d’onde de
765nm.
 La gamme étalon est préparée avec de l’acide gallique à des concentrations variables de
50,100, 200, 300, 400, 500 mg.mL-1. Les teneurs en polyphénols sont exprimées en mg
d’équivalent acide gallique par gramme de matière sèche (mg EAG. MS).
 La concentration expérimentale de produit est =1mg /mL.

45
Chapitre I matière et méthodes

II. Activité anti radicalaire :

II.1. définition :
L’activité anti radicalaire d’un composé correspond à sa capacité à résister à
l’oxydation.
Un antioxydant est une substance qui, en faible concentration par rapport à celle du
substrat oxydable, retarde ou prévient de manière significative l’oxydation de ce substrat [3].
Plusieurs substances pouvant agir en tant qu'antioxydants in vivo ont été proposées ;
elles incluent le beta-carotène, l'albumine, l'acide urique, les estrogènes, les polyamines, les
flavonoïdes, l'acide ascorbique, les composes phénoliques, la vitamine E.
Elles peuvent stabiliser les membranes en diminuant leur perméabilité et elles ont
également une capacité de lier les acides gras libres [4].
Pour évaluer l’activité anti-radicalaire de l’extrait acétate d’éthyle, nous avons effectué
deux tests sur ce dernier :
 Inhibition du radical stable DPPH.
 Dosage de polyphénols totaux en utilisant la méthode de Folin-Ciocalteu.
II.2. Les radicaux libres :
Un radical libre se définit comme tout atome, groupe d’atomes ou molécule possédant
un ou plusieurs électrons non appariés dits célibataires sur l’orbitale externe.
L'ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs est souvent appelé espèces
réactives de l’oxygène [5].
II.3. Inhibition du radical stable DPPH. :
Le composé chimique DPPH ou le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle fut l’un des premiers
radicaux libres utilisé pour étudier la relation structure-activité antioxydante des composés
phénoliques. Le principe est de mesurer la capacité des différents extraits à inhiber le radical
stable DPPH.
Par cette méthode, on considère que l'activité antioxydante n'est autre que la capacité
des antioxydants d'agir comme piégeurs des radicaux libres. Ils agissent en transférant un
atome d'hydrogène ce qui conduit à la réduction du DPPH (figure 1) au cours de la réaction et
à un changement de coloration dans la solution initiale qui devient jaune pâle.
L'avancement de la réaction est suivi par spectrophotométrie à 517 nm [6,7].

46
Chapitre I matière et méthodes

Figure 1 : Réduction du DPPH par le phénol

II.4. Méthode :
a. Préparation de la solution DPPH.:
4 mg de DPPH. (C18 H12 N5O6 ; Mr : 394.33), est solubilisé dans 100 ml de MeOH
absolu pour avoir la concentration de 100 µmol/L.
b. Préparation des solutions mères de concentration 5mg/ml :
On mélange 0.05g de la phase Acétate d’éthyle, avec 10 mL de MeOH absolu dans un
tube à essai.
c. Préparation des dilutions de l’extrait :
L’expérience effectuée sur 5 concentrations différentes d’échantillon de l’ordre
décroissant, dilués dans le méthanol (Tableau 1) :
A partir de chaque solution mère on prépare les dilutions suivantes selon la relation
suivante :

C1 × V1 = C2 × V2

 C1 : Concentration de la solution mère (5mg/mL).

 V1 : volume de la solution mère (mL).
 V2 : volume de MeOH ajouté (mL).
 C2 : Concentration finale (mg/mL).
Tableau 1 : Les différentes concentrations des extraits.
Concentration finale (mg/ml) V de SM (mL) V de MeOH (mL)
3 3 2
2 2 3
1 1 4
0.5 0.5 4.5
0.25 0.25 4.75
0.125 0.025 4.975
0.0625 0.0125 4.9875

47
 Chapitre I matière et méthodes

 On mélange 3mL de la solution méthanolique du DPPH. préparé avec 30µL de l’extrait.

 On laisse à l’abri de la lumière et à température ambiante pendant 15 minutes.
 On mesure l’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre à 517nm.
 Finalement on mesure l’absorbance de chaque concentration par rapport à un blanc constitué
uniquement par le méthanol pur (30μL) et le DPPH (3mL).
 On trace la courbe de la cinétique de disparition du DPPH. en présence de l’échantillon à
tester en fonction du temps pour déterminer le temps de stabilisation de la réaction et pour
effectuer la lecture de l’absorbance du produit.
 On convertit les mesures d’absorbance en % DPPH restant par la relation suivante :

Le pourcentage d’inhibition est calculé selon la formule suivante :

I % = Blanc –Extrait ∗
100
Blanc
 I % : Pourcentage d’inhibition.
 Extrait : La densité optique du DPPH en présence de l’extrait à tester.
 Blanc : La densité optique de DPPH dans la solution méthanolique.
 On trace la courbe % DPPH restant en fonction de la quantité de l’échantillon antioxydant (en
mg/mL).
 On termine par la lecture graphique la quantité d’antioxydant nécessaire pour dégrader 50%
de DPPH [8].

III. Activité antibactérienne :

III.1. Méthodes de détermination de l’activité antibactérienne :
L’examen des données bibliographiques fait apparaitre la diversité des méthodologies
utilisées pour mettre en évidence l’activité antibactérienne des extraits. Citons quelques
méthodes :
 Antibiogramme.
 Méthode de dilution.
 Méthode de micro-atmosphère.

48
Chapitre I matière et méthodes

a. Principe de la méthode de l’Antibiogramme :

C’est une vieille méthode pour mesurer le pouvoir antibactérien elle est appelée aussi
méthode des disques ou méthode par diffusion en milieu gélosé, inspire de la méthode de
Shroeder et Messing (1949) [10].
Cette méthode consiste à utiliser des disques de papier filtre imprégnés dans les
solutions et placés à la surface des géloses ensemencées. Après incubation, les diamètres
d’inhibition sont mesurés en mm ; ils correspondent aux zones ou les germes avaient été
inhibés ou détruits par la diffusion de composés.
La sensibilité d’un germe est nulle quand le diamètre est inférieur ou égal à 8 mm.
Elle est limitée pour un diamètre compris entre 8 et 14 mm et moyenne pour un
diamètre entre 14 et 20 mm. Pour un diamètre supérieur ou égal à 20 mm, le germe est très
sensible [10].

Figure 2: Schéma simplifié de la méthode de l’antibiogramme.

III.2. Détermination de l’effet bactériostatique ou bactéricide :

Lorsque l’on parle d’activité antibactérienne, on distingue deux sortes d’effets : une
activité létale ou bactéricide et une inhibition de la croissance ou activité bactériostatique
[11].
La détermination de l’effet bactéricide ou bactériostatique d’un extrait est réalisée en
procédant à un repiquage des zones d’inhibition formées et ne présentant aucune croissance
bactérienne visible à l’œil nu sur milieu de culture.
 S’il y a une croissance bactérienne, l’extrait a un effet bactériostatique sur la souche
testée.

49
Chapitre I matière et méthodes

 Si, au contraire, il y a une absence de croissance bactérienne, l’extrait présente un

effet bactéricide vis-à-vis de cette souche.

III.3 Evaluation de l'activité antibactérienne de l’extrait acétate d’éthyle :

L’étude de l'activité antibactérienne de l’extrait acétate d’éthyle de la plante a été
réalisée au niveau du Laboratoire de Bactériologie du Centre Hospitalier Universitaire de
Constantine (CHU _ BEN BADES de Constantine).
Le test utilisé dans notre travail est la méthode des disques.
Les bactéries utilisées sont:
 Des souches de référence: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 43300, fournies par l'Institut Pasteur
d'Alger. (ATCC = American Type Culture Collection)
 Des souches hospitalières (SH) de prélèvements des malades du CHU (Escherichia
coli,Pseudomanas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella heilberg, Enterobarter aerogenes, Morganella morganii)
 Repiquage des espèces bactériennes :
Les différentes espèces bactériennes ont été repiquées par la méthode des stries, puis
incubées à 37 °C afin d’obtenir des colonies isolées qui vont servir à la préparation de
l’inoculum.
 Préparation de l’inoculum :
Des colonies bien séparées des espèces bactériennes concernées ont été prélevées à
l’aide d’une anse de platine stérile et homogénéisées dans 10 mL de bouillon nutritif puis
portées à l’incubation pendant (18-24) heures à 37 °C.
 Préparation des disques :
Des disques de papier Whatman n° 3 de 6 mm de diamètre stériles ( stérilisation à120
°C pendant 15 min par autoclavage), sont chargés de l’extrait naturel à tester, des disques
imprégnés de Acétate sont également utilisés qui vont servir de témoin négatif.
 Préparation des milieux de culture :
La gélose de Muller Hinton stérile prête à l’usage a été coulée dans des boites de pétri
stériles de 90 mm de diamètre. L’épaisseur de la gélose est 2 mm réparti uniformément dans
les boites.
Ces dernières doivent être séchées 30 min à une température ambiante du laboratoire
avant leur emploi.

50
Chapitre I matière et méthodes

 Ensemencement :
Des boites de pétri stériles préalablement coulées, sont ensemencées par étalage à l’aide
d’un râteau stérile, l’ensemencent s’effectué de telle sorte à assurer une distribution homogène
des bactéries.
A l’aide d’une pince stérile, les disques de papier filtre contenant les extraits à tester
sont déposés à la surface de la gélose inoculée au préalable.
 Lecture et analyse :
L’activité antibactérienne se manifeste par l’apparition d’un halo d’inhibition de la
croissance microbienne autour du papier Whatman contenant l’extrait à tester.
La lecture s’effectue après 24 h d’incubation à 37 °C par:
 La mesure du diamètre d’inhibition observé
 Classification des bactéries dans l’une des catégories : sensible, intermédiaire ou
résistante.

51
 Références bibliographiques
[1] Bouzid, W., Yahia1, M., Abdeddaim .M., Aberkane ,M.C., Ayachi, A. (2011).
Lebanese Science Journal, 12(1), p.59.
[2] Baghiani, A., Belkhiri, F., Boumerfeg, S., Khennouf, S., Arrar, L., Harzallah, D.
(2013). Journal de La Recherche sur La Protection des Plantes, 53(2), p.128.
[3] Kujala, T. S., Loponen, J. M., Klika, K. D., Pihlaja, K. (2000). Bioressources
Technology 98 (2007), 1120-1123.
[4] Halliwell, B. (1999). How to characterize a biological antioxydant free radical.
Research Communications, 9, 1-32.
[5] Svoboda, K.P., Hampson, J.B. (1999). Plant Biology Department, SAC
Auchincruive, Ayr, Scotland.
[6] Favier, A. (2003). Journal of Ethnopharmacology,Vol. 115(2), 108-115.
[7] Blois, M.S. (1958). Antioxidant determinations by the use of stable free radical.
Nature, 181: 1199-1200.
[8] Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E., Berset, C. (1995). Use of a free radical method
to evaluate antioxidant activity. Lebensmitel–Wissenschauft& Technology, 28: 25-30.
[9] Svoboda K.P., J.B. Hampson, (1999). Bioactivity of essential oils of selected
temperate aromatic plants: antibacterial, antioxidant, antiinflammatory and other related
pharmacological activities. Plant Biology Department, SAC Auchincruive, Ayr, Scotland,
UK., KA6 5HW.

[10] Duraffourd, C., Dhervicourt, L., Laparaz, J.C. (1990). Examen de laboratoire
galénique,
Eléments thérapeutiques synergiques T.1.2éme éd. Masson.paris, p.10.
[11] Abdesselam, Z. (2006). Les huiles essentielles, un pouvoir antimicrobien avéré.
Nutra News.Ed. Fondation pour le libre choix. 6, p.16.

52
 Chapitre II :

Résultats et discussion

53
I. Dosage des poly phénols :
La courbe d’étalonnage de l’acide gallique est représentée dans la (figure 1) :

2
y = 0,0035x - 0,0092
quantité de ployphenols en µg

1.5 R² = 0,9973

0.5

0
0 100 200 300 400 500 600
consentration en µg de l'acide gallique

Figure 1 : La courbe d’étalonnage de l’acide gallique.

La valeur de la DO mesurée de l’échantillon est mentionnée dans le (tableau 1) :
Tableau 1: la densité optique de l’extrait
Ф acétate
ere
DO (nm) 1 expérience 1.244
2eme expérience 1.268

Le pourcentage des composés poly phénoliques indiqué dans le (tableau 2) est calculé
selon la relation suivante :
Y= 0,0035x - 0,0092

Tableau 2:Les pourcentages des poly phénols calculés de la phase acétate.

DO ext Quantité de poly phénols

en (mg/g d’extrait)
ФAcétate 1.244 358.05
1.268 364.91
Thé vert _ 400

Ces résultats indiquent que la richesse de la plante étudiée en polyphénols est

importante. L’extrait acétate d’éthyle contient 364.91mg/g de polyphénols, cette quantité est
proche aux polyphénols trouvés dans l’extrait de thé vert 400mg/g1.

1
Sun, J., Chen, P., Lin, L.Z., Harnly, J.M. (2011). A non-targeted approach to chemical discrimination between
green tea dietary supplements and green tea leaves by HPLC/MS, Journal of the Association of Official
Agricultural Chemists, 94: 103-10

54
II. Activité anti radicalaire :
Selon les mesures effectuées sur l’extrait acétate de la plante, nous avons calculé le
pourcentage d’inhibition du DPPH. Selon la formule indiquée dans le chapitre précédent.
Les résultats obtenus sont représentés comparativement à la quercétine dans le
(tableau3).
Tableau 3 : Pourcentages d’inhibition du DPPH par l’extrait AcOEt.
Concentration d’extrait AcOEt % de réductions de DPPH
(mg/mL)
Concentration Concentration Extrait Quercétine
Initiale finale Acétate D’éthyle

5 0.0495 94.02 /
3 0.0297 92.58 /
2 0.0198 63.39 96.06
1 0.0099 31.02 95.91
0.5 0.00495 19.07 95.81
0.25 0.00247 3.75 94.72
0.125 0.00123 4.81 /
0.0625 0.00061 2.12 /

II.1.Etude de l’extrait Acétate d’éthyle :

Le tableau 3 montre que l’extrait AcOEt possède un excellent pouvoir inhibiteur du
radical DPPH. :
La meilleure inhibition (94.02%) est atteinte a une concentration de 500 µg /ml
La meilleure inhibition avec la quercitine (96%) et obtenue a une concentration de 200 µg /ml
a. Détermination de la valeur CI50 :
La détermination de la CI50 se fait à partir du graphe figure 2
180
y = 3088x + 1,432
160
R² = 0,998
% d'inibition du DPPH

140
120
100
80
60
40
20
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Concentration de l'extrait AcOET(µg/ml)

Figure2 : Courbe de pourcentage d’inhibition de DPPH par l’extrait Acétate d’éthyle.

55
 120

100 94.02 96.06 95.91 95.81 94.72

92.58

80 Acétate d'éthyle
63.39 Quercétine
60

40 31.02

19.07
20
3.75 4.81 2.12
0
1 2 3 4 5 6 7 8

Figure 3 : Histogramme représentatif du pourcentage d’inhibition du DPPH par l’extrait

Acétate d’éthyle en présence de standard (quercétine).
La concentration correspondante à 50% d’inhibition est calculée selon l’équation du
graphe suivante :
Y= 3088x + 1.432

Pour y= 50%, laCI50sera calculée comme suit :

X= (50-1.432)/3088 = 0.01572 mg/mL

CI50 = 15.72µg /mL

 Les résultats du test DPPH ont révélé que l’extrait acétate d’éthyle de la plante
présente une activité anti radicalaire très importante.
 La valeur de la CI50 porte de celle de la quercétine (CI50 = 12µg /mL) montre que
l’extrait AcOEt possède un potentiel anti radicalaire très important.
 Ceci est dû à la grande richesse de l’extrait en polyphénols.
 Ce résultat corrobore la relation polyphénols-activité anti radicalaire DPPH..

56
III. Activité antibactérienne :
Tableau 4: Les différentes dilutions avec les concentrations finales.
Concentration Volume de solution de Volume d’eau Concentration final
initiale (µg/mL) l’extrait (mL) distillée (mL) (µg/mL)
2000 6.4 3.6 (D1)
1280 2 2 (D2)
1 3 (D3)
0.5 3.5 (D4)
0.5 7.5 (D5)
80 2 2 (D6)
1 3 (D7)

III.1. Interprétation des résultats :

 Les zones d’inhibition des différentes dilutions sont résumées dans le (tableau 5)
Tableau 5 : Les zones d’inhibitions des différentes délitions de l’extrait acétate
Zone d’inhibition (mm)
Souches bactériennes Sm D1 D2 D3 D4 D5
Escherichia coli ATCC 25922 11 10 9 8.5 8 7.5
Escherichia coli SH 12 11.5 11 10 9 8
Staphylococcus aureus ATCC 43300 15 14 13 12 11 10
Staphylococcu saureusSH / / / / / /
Pseudomanas aeruginosa ATCC 27853 / / / / / /
Pseudomanas aeruginosa SH 14 12 11 10 9 7
Klebsiella pneumoniae SH 11 10 9 8 / /
Salmonella heilberg 12 11 10 9 8 7
Enterobarter aerogenes / / / / / /
Morganella morganii 13 12.5 12 11.5 11 10

 Les zones d’inhibition de l’extrait Acétate d’éthyle de la plante, indiquent que

l’efficacité diminue en fonction des concentrations, plus la concentration est faible moins
l’extrait est efficace les zone varie de 7.5 mm à 15 mm (tableau5).
L’évaluation de l’activité antibactérienne de l’extrait Acétate d’éthyle montre une
meilleure activité vis-à-vis des souches de Staphylococcus aureus ATCC, Pseudomanas
aeruginosa SH et Morganella morganii avec des zones d’inhibition respectives de 15, 14 et
13 mm.
On n’observe aucune zone d’inhibition autour des disques pour Staphylococcus aureus
SH, Pseudomanasae ruginosa ATCC et Enterobarter aerogenes.
Les résultats montrent que l’extrait ne possède pas une bonne activité antibactérienne
malgré sa grande richesse en polyphénols.

57
 Cela montre qu’il n’ya pas de relation entre l’activité antibactérienne et la richesse en
polyphénols bien que certain flavonoïdes possèdent une activité antibactérienne mais cela
dépend de leur structure et sur leur mode d’action sur les souches Gram+ou Gram- a loin de la
relation souche -activité anti radicalaire

Figure 4 : Effet de L’extraits acétate d’éthyle sur la culture de Streptococus

anterococcus SH et Pseudomanas aeruginosa SH

58
Conclusion

59
 Le but principal de notre travail est d’isoler et d’identifier les métabolites secondaires de
type flavonoïde à partir d’une plante de la famille Asteraceae et de genre Evax, récoltée de la
région de Constantine, dans le cadre de la recherche sur les plantes d’origine Algérienne, afin de
découvrir l’intérêt biologique de ces dernières et valoriser l’importance de la flore de notre pays.
Nous nous sommes intéressées aux flavonoïdes à cause de profil HPLC de la phase
acétate de notre plante qui a montré la richesse de cette dernière aux flavonoïdes.
L’étude phytochimique de cette plante nous a permis de séparer deux flavonoïdes, en
utilisant une technique d’extraction et de purification, basée sur la combinaison de méthodes
chromatographiques (CC, CCM).
Les deux ont été identifiés, grâce à l’utilisation des méthodes physico-chimiques et
spectrales (Rf, fluorescence, UV-Visible, RMN- H1, hydrolyse acide), il s’agit de :
Isorhamnétine-3-O-β-D-glucoside.
Quercétine-7-O-β-D–glucoside.
Des tests de l’activité antibactérienne de l’extrait acétate vis-à-vis de plusieurs souches
ont montré que ces dernières ont une sensibilité différente en présence d’activité
antibactérienne éventuellement sélective des extraits.
L’extrait acétate a révélé une bonne activité anti radicalaire (CI50 = 15.72µg/mL.)
dont le dosage des polyphénols totaux a confirmé une grande richesse ce qui a eu accord
avec le résultat de l’activité anti radicalaire.

53
 Summary

Our works concern the determination of the flavonoids of a plant from the genus Evax
belonging to the Asteraceae family. For this aim, we have used several methods of extraction
and chromatographic separations such as TLC, CCM and HPLC. By the use of physico-
chemical and spectral methods (UV-Vis, 1H NMR and acid hydrolysis), we have isolated and
identified two flavonols:

 Isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside.
 Quercetin-7-O-β-D –glucoside.

The ethyl acetate extract showed the best DPPH radical scavenging. This was confirmed
by the total poly phenols titration which revealed the great richness of the ethyl acetate
extract, (using Folin-Ciocalteu method).

The ethyl acetate extract exhibited the best antibacterial activity against, Staphylococcus
aureus ATCC Pseudomanas aeruginosa SH and Morganella morganii.

Keywords: Asteraceae, Evax,flavonoids, anti radical activity, antibacterial activity,

polyphenols titration.

53
 ‫الملخص‬
‫الهدف الرئيسي من هذا البحث هو فصل و تحديد منتو جات االيض الثانوي الفالفونويدية من الجنس ‪ Evax‬الذي ينتمي‬
‫إلى العائلة ‪ Asteraceae‬و لتحقيق ذلك قمنا باستخدام مختلف طرق االستخالص وتقنيات الفصل الكروماتوغرافي‬
‫(كروماتوغرافيا العمود والطبقة الرقيقة) ‪ .‬عن طريق المعلومات المتحصل عليها بطرق التحليل الفيزيو كيميائيو الطيفي‬
‫(مطيا فية األشعة فوق البنفسجية ومطيا فية الرنين النووي المغناطيسي للبروتون أحادي البعد) تمكنا من التعرف على بنى‬
‫مركبين من النوع الفالفونول‪:‬‬

‫‪‬‬ ‫‪Isorhamnétine-3-O-β-D-glucoside.‬‬
‫‪‬‬ ‫‪Quercétine-7-O-β-D-glucoside.‬‬

‫أظهر مستخلص خالت اإلثيل فعالية مضادة للجذور الحرة جيدة وذلك باستعمال طريقة الـ ‪ ، DPPH‬و هذا ما يعكس‬
‫غناه بالمركبات الفينولية التي تمت معايرتها بطريقة ‪.Ciocolteu-Folin‬‬

‫كما بين مستخلص خالت اإلثيل فقد أظهر فعالية عالية ضد البكتيريا مع كل من السالالت‪:‬‬

‫‪ Morganella morganii‬و ‪ Pseudomanas aeruginosa SH‬و‪.Staphylococcus aureus ATCC‬‬

‫الكلمات المفتاحية‪, Evax،Asteraceae:‬فالفونويد‪ ،‬فعالية مضادة للجذور الحرة ‪,‬فعالية مضادة للبكتيريا‪،‬معايرة متعددات‬
‫الفينول‪.‬‬

‫‪53‬‬