Introduction à la biophotonique

Chapitre 5 : Techniques d’optique non linéaire

 Techniques ONL : SFG - Historique

• Maiman (1960) : premier LASER

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 2

 Techniques ONL : SFG - Historique

• Franken (1961) : premier effet optique non linéaire : SHG

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 3

 Techniques ONL : SFG - Historique

• Bloembergen (1981) : prix Nobel pour sa contribution au

développement des spectroscopies LASER

• Shen (1987) : première expérience de spectroscopie par génération de

fréquence-somme (SFG) simplement résonnante

• 2001-2002 : premières expériences de génération de fréquence-

somme doublement résonnante (DR-SFG)

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 4

 Quelques manifestations du phénomène

 Génération de faisceaux lasers de longueur d’onde variable par cristaux « non-

linéaires)

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 5

 Techniques ONL : introduction

 L’origine des techniques optiques non linéaire (ONL) réside dans le champ
électrique intense généré par certains lasers.
Microscopique Macroscopique

p   0 E P  N  0 E   0  (1) E
 0   E  E P
 0  (2)  E  E
 0  E  E  E  0  (3)  E  E  E
...
E ...

 : polarisabilité (1) : susceptibilité d’ordre 1

 : hyperpolarisabilité d’ordre 2 (2) : susceptibilité d’ordre 2
 : hyperpolarisabilité d’ordre 3 (3) : susceptibilité d’ordre 3
EE <<
~ EEcoulombien
coulombien  LASERS
Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 6
 Techniques ONL : processus du second ordre

E1 (t )  E1z cos(1t ) 2 ondes électromagnétiques de fréquences

différentes se propageant selon ox et
E2 (t )  E2 z cos(2t ) polarisées selon oz

Réponse du matériau:
Px  PLx  PNLx
  0  xz(1) ( E1  E2 )   0  xzz
(2)
( E1  E2 ) 2
  0  xz(1) E1   0  xz(1) E2   0  xzz E1   0  xzz
(2) 2
E2  2 0  xzz
(2) 2 (2)
E1 E2
2cos a cos b  cos(a  b)  cos(a  b)
En se limitant au second ordre
et en utilisant les formules trigonométriques: 1  cos 2 x  2cos 2 x

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 7

 Techniques ONL : processus du second ordre

Nous avons alors :

E12z 2
(2) E2 z
PNLx  0 (2)
xzz   0  xzz  Rectification optique
2 2
2
(2) E1 z
 0  xzz cos(21t )
2
2
 Génération du second
(2) E2 z
 0  xzz cos(22t ) harmonique (SHG)
2
 0  xzz
(2)
E1z E2 z cos  (1  2 )t   Génération de fréquence-
somme (SFG)
 0  xzz
(2)
E1z E2 z cos  (1  2 )t   Génération de fréquence-
différence (DFG)

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 8

 SFG : Principe

 La spectroscopie SFG est celle qui présente le potentiel le plus intéressant

pour l’étude de phénomènes biologiques.
Observation du
 Principe : deux techniques SFG. rendement SFG
par rapport à
IR / VIS

Spectre
Vibrationnel / électronique

SFG = processus d’ordre pair

=> SFG interdite
dans les matériaux
centrosymétriques

Sensibilité à
l’interface
Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 9
 SFG : Principe

SFG classique SFG doublement

résonante
Etat électronique excité

Non Non
Résonant Résonant Résonant Résonant
(Vis) (SFG)

Résonant Etat électronique fondamental Résonant

(IR)

 Renseigne sur modes de vibration de  Renseigne sur états électroniques

la molécule de la molécule
i p iq
 2
2 P N Ap e Aq e
I(DR)SFG  
2
SFG
F χ (2)  (2) 
c p 1 q 1 (SFG   p  i p ) (IR  q  iq )
F : facteurs de Fresnel

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 10

Techniques ONL : SFG - dispositif

 Chaîne de détection

 Laser pulsé visible

 Laser pulsé
infrarouge

 Amplificateur
 Laser de pompe

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 11

 Techniques ONL : SFG - spectromètre

 Signal SFG très faible (10−6 vis) => filtrage spatial (diaphragmes) &
spectral (filtres dichroïques et spectromètre)

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 12

 SFG : Dispositif

Monochromateur Interface
utilisateur

Lasers

Echantillon
 Techniques ONL : SFG - spectre

 lvisible : fixe; lIR : variable

CH3
Intensité SFG

(2) 2
I SFG ≈ 
2
≈  (2 )
Substrat  ( 2)
Adsorbat
DT/Au(111) ppp 458 nm
2800 2850 2900 2950 3000 Non résonant Résonant
-1
Nombre d'ondes (cm )

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 14

 Techniques ONL : SFG - spectre

 Interprétation

 Pour être actif en SFG un groupement chimique doit

o ne pas être disposé de manière centro-symétrique
o être actif en Raman (un peu cela suffit)
o être actif en IR (principale contrainte)

 => pour identifier un groupement moléculaire, on se base sur les tables

d’absorption IR des modes de vibration.

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 15

 Techniques ONL : SFG - application

CH 3  ( CH 2 )10  SH
CH3
CH2
8

6 CH 2 dominent
Infrared signal (a. u.)

0 Intensité SFG Gold(111)

I SFG ≈  (2) 2
I (IR ) I (Vis )
SFG signal (a .u.)

CH 3 dominent s

1
 s(2)   Sub
(2 )
  Ad
(2)
s
i q
Dodecanethiol / Or N Aq e
 Sub
(2)
≈ IR independant  Ads
(2)

0
(   q  i q )
( ) ( )
2800 2900 3000
(2) q 1 IR
Wavenumber (cm-1) (2)
N Re s Re s

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 16

 Techniques ONL : SFG – intérêt biophotonique

 Pas de signal si groupements disposés de manière centrosymmétrique =>

sensibilité à quelques groupements => intéressant pour étude des liaisons
entre grosses molécules et les applications de type biocapteur.

 Sensibilité intrinsèque à l’interface (à la monocouche moléculaire) =>

biocapteurs

 Sensibilité à l’ordre => orientation des groupements réactifs (intéressant

pour biocapteurs)

 Sensibilité aux niveaux d’absorption et de fluorescence.

 Inconvénients : coût, difficultés d’utilisation

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 17

 Techniques ONL : SFG – applications bio

 Capteur biologique biocytine / avidine

Molécule sonde : Biocytine (Vitamine B8) Molécule cible : Avidine (Protéine)

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 18

Techniques ONL : SFG – applications bio
Reconnaissance ?

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 19

 Techniques ONL : SFG – applications bio
Origine des bandes

3050 cm-1
3150 cm-1

• Disparition des vibrations Spectre infrarouge

CH2 de chaîne : BSA
Réorganisation de la couche

• 3050 cm-1 : C-H cycle ?

• 3150 cm-1 : N-H ?

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 20

Techniques ONL : SFG – applications bio
Sélectivité ?

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 21

 Techniques ONL : SFG - application

 Etude de la Green Fluorescent Protein (GFP) déposée sur Pt

 Structure de la protéine et niveaux d’énergie

 Niveaux d’absorption à 470 nm et de fluorescence à 510 nm

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 22

 Techniques ONL : SFG - application

 LO IR varie
2,5

Résonances
480 nm
2,0
Dépôt GFP.
532 nm
1,5
SFG Signal (a. u.)

550 nm
1,0 Amplitude dépend de la
longueur d’onde visible
600 nm
0,5
Couplage
650 nm
0,0
2800 2850 2900 2950 3000
Infrared Wavenumber (cm-1)

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 23

 Techniques ONL : SFG – applications bio

 LO visible varie Si scan LO visibles sur

- non-résonant : pas de variation du signal SFG.
- résonance : variation du signal SFG

Couplage entre propriétés vibrationnelles et

électroniques
(SFG doublement résonnante DRSFG)

 SFG
2
2
I(DR)SFG 
2
F χ (2)

i p iq
P N Ap e Aq e
 (2)  
p 1 q 1 (SFG   p  i p ) (IR  q  iq )
Résonances Résonances
dans Vis dans IR
Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 24
 Techniques ONL : SFG – applications bio
GFP B-form

 Comparaison SFG – fluorescence / adsorption

GFP I-form

SFG
SFG Fit
Deconv. Fit Résonances à

- 535 nm (SFG à 470 nm): niveau

électronique d’absorption du
1
chromophore
Intensity

0 - 600 nm (SFG à 510 nm): niveau de

fluorescence
Luminescence

Absorbance

DRSFG donne accès aux propriétés

électroniques d’une couche de protéines
1

0
350 400 450 500 550 600
Wavelength (nm) Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 25
 Techniques ONL : processus multiphotons

 Absorption multiphotons : au moins deux photons (pas nécessairement de

même fréquence) sont absorbés simultanément pour atteindre un niveau
d’énergie réel.

 Effet important dans les molécules p conjuguées

 Champ E intense + milieu centrosymmétrique

n( I )  n0  n2 I  n3 I 2  ...
o I : intensité de la lumière (# E2)
o n0 : indice de réfraction linéaire
o n2 :indice de réfraction non linéaire (dépend de (3) )

o n2 << n0 => E >> pour observer les effets

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 26

 Techniques ONL : processus multiphotons

n( I )  n0  n2 I  n3 I 2  ...

 On se limite au second terme

 Partie réelle du second terme :

o dépend de I
o va modifier les propriétés de réflexion et de diffusion de la lumière par
le matériau

 Partie imaginaire du second terme :

o dépend de I
o va modifier les propriétés d’absorption
o Responsable du processus d’absorption à 2 photons (2PA).

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 27

 Techniques ONL : processus multiphotons

 Représentation du processus

niveau
réel

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 28

 Techniques ONL : processus multiphotons

 Intérêt : Emission d’un photon plus énergétique . 2 photons se combinent

pour envoyer électron de l’état fondamental S0 dans un état excité Si =>
relaxation S1 => électron retombe dans son état fondamental en émettant
un photon plus énergétique (que les photons incidents).
 Si photons incidents dans IR (=> bonne pénétration), la fluorescence a lieu
dans le visible (intéressant pour imagerie : 2TP fluorescence microscopy)

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 29

 Techniques ONL : processus multiphotons

 Différences avec génération de seconde harmonique (SHG)

 SHG :
o Niveau d’arrivée virtuel => pas d’absorption
o Le photon généré a une énergie double du photon incident
o La lumière émise est cohérente (très directionnelle) : si faisceau laser
en entrée on a ~ faisceau laser en sortie (cfr cristaux doubleurs)

 2PA :
o Niveau d’arrivée réel => absorption
o Le photon généré a une énergie moindre que le double de l’énergie du
photon incident
o La lumière émise est incohérente, l’émission est non directionnelle

Introduction à la biophotonique / Techniques ONL / L. Dreesen 30