République Algérienne Démocratique et Populaire
Université des Sciences et de la Technologie d’Oran Mohamed BOUDIAF
Département de Génétique Moléculaire et Appliquée
COURS 3:
LES OUTILS ENZYMATIQUES EN GÉNIE
GÉNÉTIQUE
Dr ABDI Meriem
Génie génétique, Licence 3 Biochimie
LES ENZYMES DE RESTRICTION
• Les enzymes de restriction sont des endonucléase qui peuvent couper un fragment
d’ADN au niveau d’une séquence spécifique (4 à 6 paires de bases) appelée site de
restriction.
OH
OH
Enzymes
de restrictions
LES ENZYMES DE RESTRICTION
• Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement connues, on en retrouve
naturellement dans un grand nombre d'espèces de bactéries.
• Elles sont produites par les bactéries pour se protéger de l’ADN étranger provenant
d’autres organismes.
• Elle constitue un mécanisme de défense contre les infections par les bactériophages, des
virus spécifiques des bactéries.
LES ENZYMES DE RESTRICTION
• Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des endonucléases, c'est-à-dire des
enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l'intérieur
de la chaîne d'un acide nucléique.
• Les endonucléases diffèrent des exonucléases, puisqu'elles peuvent cliver les brins d'acide
nucléique de manière interne, alors que les exonucléases n’attaquent la molécule d'acide
nucléique qu'au niveau de ses extrémités.
SÉQUENCES RECONNUES PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION
• Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont
habituellement des séquences dites palindromiques. Ces séquences palindromiques sont
le plus souvent constituées de 4, 5 ou 6 paires de bases.
5’-G G A T C C-3’
3’-C C T A G G-5’
SÉQUENCES RECONNUES PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION
Les enzymes de restriction clivent au niveau des les liaisons phosphodiester.
5’-G G A T C C-3’
3’-C C T A G G-5’
Lorsqu’une endonucléase de restriction coupe un ADN, plusieurs
extrémités peuvent être générées
EXTREMITES FRANCHES OU BOUTS FRANCS
• La coupure a lieu au milieu du site de restriction.
• Pas de liaison spontanée entre les fragments qui ont résulté de cette coupure.
• La T4 ligase peut rétablir la ligation des deux brins d’ADN.
5’
3’
3’ 5’
SmaI
EXTREMITES COHESIVES OU BOUTS COHESIFS
• Les coupures sont décalées l’une par rapport à l’autre sur les deux brins.
• Les parties simples brins peuvent s’apparier.
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
EcoRI PstI
5’rentrant 5’sortant
NOMENCLATURE DES ENZYMES DE RESTRICTION
Le nom comporte 3 ou 4 lettres correspondant à la bactérie à partir de laquelle l’enzyme est
extraite:
• La première lettre correspond à la première lettre du genre de la bactérie
• La seconde et troisième lettre en minuscule correspondent aux deux premières lettres de
l’espèce bactérienne
• La quatrième lettre correspond à la souche bactérienne, elle n’est pas présente dans
toutes les enzymes de restriction
• Un chiffre romain pour le numéro d’ordre de caractérisation de l’enzyme
NOMENCLATURE DES ENZYMES DE RESTRICTION
Exemple : Enzyme de restriction EcoRI
Genre: Escherichia
Espèce: coli
Souche:RY317
Ordre de découverte: (I)
TYPES D’ENZYMES DE RESTRICTION
Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de coupure, on distingue trois
types d’enzymes de restriction:
Enzymes de type I : L’enzyme reconnaît un site particulier qui n’a aucune symétrie et coupe
l’ADN à environ 1000 jusqu’à 5000 nucléotides plus loin.
Enzymes de type III : L’enzyme reconnaît une séquence mais coupe à une vingtaine de
paires de bases plus loin
TYPES D’ENZYMES DE RESTRICTION
Enzymes de type II : les plus utilisées en génie génétique. Leurs sites de restrictions sont
des séquences palindromiques. Elles coupent au niveau de leurs sites de restriction.
PROBABILITE DE COUPURE
AUTRES OUTILS ENZYMATIQUES
I. EXONUCLÉASES
Des enzymes qui éliminent des nucléotides un a un à partir d’une extrémité de l’ADN.
Exemple :
• Bal31: obtenue de cultures d’Alieromonas espejana, elle élimine des nucléotides à partir
des deux extrémités des deux brins.
• L’exonucléase 3: obtenue a partir d’E coli, elle catalyse l’hydrolyse séquentielle des
nucléotides d’un ADN à partir de l’extrémité 3’ libre.
AUTRES OUTILS ENZYMATIQUES
II. ENDONUCLÉASES NON SPECIFIQUES
Des enzymes capables de rompre des liaisons phosphodiesters internes.
Exemple :
• La DNAse 1: extraite du pancréas, coupe préférentiellement après une base pyrimidique.
• La nucléase S1: extraite de culture d'Aspergillus oryzae dégrade seulement les acides
nucléiques monocaténaires.
AUTRES OUTILS ENZYMATIQUES
III. LES POLYMÉRASES
Sont des enzymes qui synthétisent un nouveau brin d’ADN complémentaire a une matrice
d’ADN ou ARN.
Deux types de polymérases sont couramment utilisées en génie génétique :
• L’ADN polymérase I: Extraite d’E-coli, elle se fixe à une région monobrin et synthétise
totalement le brin complémentaire. L’activité polymérasique s’effectue dans le sens 5’-3’ à
partir d’une amorce 3’OH.
AUTRES OUTILS ENZYMATIQUES
III. LES POLYMÉRASES
• La transcriptase réverse: Codée par les gènes Pol des rétrovirus, elle transcrit l’ARN en
ADN complémentaire.
L’activité polymérasique s’effectue dans le sens 5' vers 3'.
AUTRES OUTILS ENZYMATIQUES
IV. LES LIGASES
Des enzymes qui permettent de relier deux fragments d’ADN double brins.
• ADN ligase: elle assure la formation des liaisons phosphodiesters entre une extrémité
3’OH et une extrémité 5’phosphate de fragments d’ADN à bout cohésifs.
• T4 ligase: Elle est capable d’effectuer des ligations entre deux fragments d’ADN a bouts
francs.
UTILITÉS DES ENZYMES DE RESTRICTION
Les enzymes de restriction peuvent être utilisées en génie génétique pour:
1. Etablir une carte génétique appelée « carte de restriction » d’une molécule d’ADN. Cette
carte donne l’ordre des sites de restriction le long de cette molécule, et la taille des fragments
produits.
2. Faire produire à des cellules hôte une protéine exogène. Les enzymes de restriction jouent
un rôle crucial dans ce processus car elles permettent l’intégration d’un brin d’ADN exogène
dans un plasmide dans le but de l’exprimer dans la cellule hôtes.
