ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE NANTES

ANNEE 2007

ETUDE DE LA PREVALENCE DE BABESIA

DIVERGENS CHEZ LA TIQUE IXODES RICINUS

THESE
pour le
diplôme d’Etat
de
DOCTEUR VETERINAIRE

présentée et soutenue publiquement

le 12 janvier 2007
devant
la Faculté de médecine de Nantes
par

Hortense CARRER

Née le 3 février 1980 à Suresnes (92)

JURY

Président : Monsieur Michel MARJOLET

Professeur à la Faculté de Médecine de Nantes
Rapporteur : Monsieur Alain CHAUVIN
Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes
Assesseur : Madame Sébastien ASSIE
Maître de conférence à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes
Membre invité : Madame Sarah BONNET
Chargé de recherches à l’Umr Ihpm, Envn

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 TABLE DES MATIERES
Table des matières.................................................................................................................... 1
Liste des abréviations............................................................................................................... 6
Liste des tableaux ..................................................................................................................... 7
Liste des figures ........................................................................................................................ 8
Liste des annexes ...................................................................................................................... 9
Introduction ............................................................................................................................ 10
Etude bibliographique .......................................................................................................... 12
I. La babésiose bovine à Babesia divergens ................................................................ 14
I.1. Epidémiologie de la maladie en France ........................................................... 14
I.2. Symptômes ....................................................................................................... 15
I.3. Diagnostic, traitement et prophylaxie .............................................................. 16
I.3.1 Diagnostic ........................................................................................................ 16
I.3.2 Traitement ........................................................................................................ 17
I.3.3 Prophylaxie ...................................................................................................... 17
II. Ixodes ricinus Linné 1758, vecteur de Babesia divergens ....................................... 20
II.1. Classification et morphologie........................................................................... 20
II.1.1 Classification .................................................................................................. 20
II.1.2 Morphologie externe....................................................................................... 20
II.1.3 Morphologie interne ....................................................................................... 23
II.2. Cycle de développement et biologie d’I. ricinus.............................................. 25
II.2.1 Cycle d’I. ricinus ............................................................................................ 25
II.2.2 Facteurs d’hôtes.............................................................................................. 27
a) Nombre d’hôtes et de phases parasitaires .................................................... 27
b) Nature des hôtes ........................................................................................... 27
c) Localisation sur les hôtes ............................................................................. 28
II.2.3 Facteurs extrinsèques du cycle évolutif.......................................................... 28
a) Température ................................................................................................. 28
b) Hygrométrie ................................................................................................. 29
II.2.4 Activités saisonnière et journalière................................................................. 30
a) Activité saisonnière ...................................................................................... 30
b) Activité journalière....................................................................................... 30
II.2.5 Distribution des tiques et biotopes.................................................................. 31
II.3. Maladies transmises par Ixodes ricinus............................................................ 33
III. Babesia divergens, agent responsable de la babésiose bovine............................. 36
III.1. Historique et classification ........................................................................... 36
III.2. Diversité génétique....................................................................................... 36
III.3. Hôtes............................................................................................................. 37
III.3.1 Hôtes invertébrés........................................................................................... 37
III.3.2 Hôtes vertébrés.............................................................................................. 37
III.4. Cycle asexué chez le bovin .......................................................................... 37
III.5. Cycle sexué chez I. ricinus........................................................................... 42
III.5.1 Reproduction sexuée dans l’intestin de la tique ............................................ 42
III.5.2 Développement dans différents organes internes de la tique ........................ 43
III.5.3 Développement dans les glandes salivaires de la tique................................. 45
III.5.4 Durées des différentes étapes du cycle de développement de Babesia chez le
vecteur ...................................................................................................................... 45
III.6. Modalités d’infection et de transmission de B. divergens chez I. ricinus .... 47
III.6.1 Acquisition de l’infection.............................................................................. 47

2
 III.6.2 Transmission transovarienne......................................................................... 47
III.6.3 Transmission transtadiale.............................................................................. 47
III.6.4 Transmission de l’infection à l’hôte vertébré................................................ 47
III.6.5 Conservation de l’infection chez les tiques................................................... 49
III.7. Facteurs de variation de l’infection et de la transmission ............................ 50
IV. Transmission de Babesia par son vecteur : etat des connaissances sur la
prévalence de portage de Babesia chez I. ricinus............................................................. 52
IV.1. Techniques de collecte des tiques ................................................................ 52
IV.1.1 Recherche de tiques sur les animaux ............................................................ 52
IV.1.2 Capture des tiques dans l’environnement ..................................................... 52
a) La méthode du drapeau ................................................................................ 52
b) Les pièges à dioxyde de carbone.................................................................. 53
IV.2. Conservation des tiques................................................................................ 53
IV.3. Techniques de mise en évidence des parasites............................................. 53
IV.3.1 Colorations .................................................................................................... 53
IV.3.2 Amplification de l’ADN par PCR................................................................. 54
Etude personnelle ................................................................................................................. 58
Cadre général et objectifs ...................................................................................................... 60
Matériels et méthodes ............................................................................................................ 62
I. Capture des tiques dans l’environnement................................................................. 62
I.1. Choix des élevages ........................................................................................... 62
I.2. Estimation de l’échantillon requis.................................................................... 63
I.3. Sélection des lieux de récolte ........................................................................... 63
I.4. Période de capture ............................................................................................ 64
I.5. Conditions climatiques..................................................................................... 64
I.6. Technique de récolte des tiques ....................................................................... 64
II. Conservation des tiques............................................................................................ 65
III. Dissection des tiques et isolement des glandes salivaires .................................... 66
IV. Mise en évidence de l’ADN de B. divergens chez I. ricinus ............................... 67
IV.1. Extraction de l’ADN des glandes salivaires................................................. 67
IV.2. Amplification de l’ADN par réactions de polymérisation en chaîne (PCR) 68
IV.2.1 Réalisation des PCR double amplification.................................................... 69
IV.2.2 Réalisation des PCR simple amorce Bab...................................................... 69
IV.2.3 Réalisation des PCR simple amorce Ir.......................................................... 70
IV.3. Analyse des résultats .................................................................................... 70
V. Les prélèvements sanguins et leur utilisation........................................................... 70
V.1. Choix des animaux ........................................................................................... 70
V.2. Réalisation des prélèvements sanguins ............................................................ 70
V.3. Sérologies par Immuno-Fluorescence Indirecte............................................... 71
V.3.1 Obtention des antigènes et préparation des lames d’antigènes ...................... 71
V.3.2 Réalisation de l’IFI......................................................................................... 71
V.4. Culture de Babesia ........................................................................................... 72
V.4.1 Préparation des hématies de bovin pour la culture de B. divergens ............... 72
V.4.2 Culture in vitro de B. divergens sur hématies de bovin.................................. 72
V.5. Traitement des cultures positives ..................................................................... 73
V.5.1 Confirmation de la présence de B. divergens par PCR .................................. 73
a) Extraction de l’ADN .................................................................................... 73
b) Mise en évidence de B. divergens par PCR ................................................. 73
V.5.2 Typage de souches par RFLP......................................................................... 74
V.6. Analyse des résultats ........................................................................................ 74

3
Résultats .................................................................................................................................. 76
I. Collectes et dissections des tiques, extractions de l’ADN des glandes salivaires.... 76
II. Résultats des PCR sur glandes salivaires d’I. ricinus .............................................. 77
III. Cultures de B. divergens, PCR Bd37 et typage par RFLP ................................... 79
IV. Sérologies par immunofluorescence indirecte ..................................................... 82
V. Détermination du taux d’infection des troupeaux de bovins par Babesia divergens84
Discussion................................................................................................................................ 86
I. Matériels et méthodes............................................................................................... 86
I.1. Choix des amorces dans l’évaluation de la prévalence .................................... 86
I.2. Risques de contamination par l’ADN du parasite pendant les différentes étapes
d’évaluation de la prévalence....................................................................................... 87
I.3. Cultures ............................................................................................................ 88
I.4. Typage des souches par RFLP ......................................................................... 89
I.5. Sérologies ......................................................................................................... 89
II. Résultats ................................................................................................................... 90
II.1. Prévalences d’infection de B. divergens chez les bovins en zone d’endémie.. 90
II.1.1 Statut sérologique vis-à-vis de B. divergens des élevages sélectionnés ......... 90
II.1.2 Mise en évidence de B. divergens dans le sang des bovins par culture in vitro
et typage des souches présentes dans les élevages................................................... 91
II.1.3 Présence comparée de B. divergens détectée par IFI et par culture ............... 92
II.2. Prévalences de Babesia et Theileria dans les glandes salivaires des tiques
femelles I. ricinus......................................................................................................... 93
II.3. Découverte d’un foyer de B. major en Loire-Atlantique ................................. 95
Conclusion et perspectives..................................................................................................... 98
Références bibliographiques ............................................................................................... 100
Annexes ................................................................................................................................. 110

4
5
 LISTE DES ABREVIATIONS

ADN : Acide Désoxyribonucléique.

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism : polymorphisme de longueur des fragments

amplifiés.

ARN : Acide Ribonucléique.

BET : Bromure d’Ethidium.

CPD : Citrate Phosphate Dextrose.

Dnase : Désoxyribonucléase.

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay.

ENVN : Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes.

EPPI : Eau Pour Préparation Injectable.

IFI : Immunofluorescence Indirecte.

IgG : Immunoglobulines G.

Kda : Kilo dalton.

MGG : May-Grünwald-Giemsa.

pb : paire de bases.

PBS : Phosphate Buffer Saline.

PCR : Polymerase Chain Reaction : réaction de polymérisation en chaîne de l’ADN.

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA : amplification aléatoire d’ADN polymorphe.

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism : polymorphisme de longueur des fragments de

restriction.

RT : Room Temperature : température ambiante.

SVF : Sérum de Veau Fœtal.

UV : Ultra Violet.

6
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Durées en jours des différentes étapes du cycle d’I. ricinus en fonction de la
température, d’après Aeschlimann (1972)………………………….……....…..28

Tableau 2 : Principaux agents pathogènes transmis par Ixodes ricinus………………….…..32

Tableau 3 : Durées des différentes étapes du développement des Babesia chez leurs vecteurs
maintenus à 28 °C, d’après Mehlhorn et Schein (1984)………………….….....45

Tableau 4 : Prévalences et méthodes de détection de différentes Babesia chez I. ricinus :

revue de la littérature………………………………………………………..…..54

Tableau 5 : Bilan des collectes d’Ixodes ricinus, des dissections et des extractions d’ADN
réalisées au cours de l’étude……………………………………..………..…….75

Tableau 6 : Bilan des amplifications de l’ADN de Babesia et Theileria dans les glandes
salivaires de tiques femelles par PCR avec les amorces Bab et des vérifications
d’extraction d’ADN avec les amorces Ir…..………………………………..…..77

Tableau 7 : Résultats des cultures de Babesia, des amplifications par PCR d’un fragment du
gène codant pour la protéine Bd37 et des typages de B. divergens par
RFLP……………………………………………………………….……...……79

Tableau 8 : Bilan des résultats sérologiques de détection des anticorps anti-B. divergens et
anti-B. major par immunofluorescence indirecte pour les 4 élevages
sélectionnés……………………………………………………………………..82

Tableau 9 : Présence comparée de B. divergens dans le sang des bovins ne présentant pas de
symptômes de babésiose dans les 4 élevages, déterminée par les deux techniques
diagnostiques utilisées : Immunofluorescence Indirecte et culture in
vitro………………………………………………………………………….….84

7
 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Distribution de la babésiose bovine en France, d’après L’Hostis et al. (1995)…...14

Figure 2 : Systématique des tiques, d’après Camicas et Morel (1977)…………………...….19

Figure 3 : Femelle adulte d’I. ricinus……………………………………………….………..20

Figure 4 : Morphologie externe générale d’une tique Ixodidae, d’après Sonenshine (1991)..21

Figure 5 : Structure générale des glandes salivaires d’une tique femelle, d’après Sonenshine
(1991)………………………………………………………………………..….22

Figure 6 : Anatomie interne d’une tique femelle adulte, d’après Sonenshine (1991)……..…23

Figure 7 : Femelle I. ricinus à l’affût…………………………………….………….……….26

Figure 8 : B. divergens en culture in vitro sur hématies de Mouton………………….……...38

Figure 9 : Structure générale d’un Apicomplexe au stade mérozoïte, d’après Preiser et al.
(2000)………………………………………………………………………..….40

Figure 10 : Cycle de Babesia divergens chez ses deux hôtes, d’après Mehlhorn et Walldorf
(1988)…………………………………………………………………………...43

Figure 11 : Transmission et maintien de Babesia divergens dans les populations d’hôtes et de

vecteurs…………………………………………………………...………….....47

Figure 12 : Principe de la méthode du drapeau………….…………………………………...64

Figure 13 : Saturateur contenant les boites de cultures où sont conservées les tiques I. ricinus
au laboratoire……………….…………………………………………………...65

Figure 14 : Amplification de l’ADN de Babesia et Theileria dans les glandes salivaires d’I.
ricinus femelles à l’aide des amorces Bab…………….………………………..77

Figure 15 : Typage des souches de B. divergens par digestion enzymatique (Bgl II) des
produits de PCR obtenus avec les amorces Bd37…………………..….……….80

Figure 16 : Typage des souches de B. divergens par digestion enzymatique (Rsa I et Bgl II)
des produits de PCR obtenus avec les amorces Bd37…………………...….…..80

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 LISTE DES ANNEXES

Annexe I : Clés d’identification d’Ixodes ricinus d’après Hillyard (1996) et Morel

(2000)………………………………………………………………………..109

Annexe II : Résultats détaillés par élevage des amplifications par PCR avec les amorces Bab
et Ir sur glandes salivaires de tiques……………………..…………………….110

Annexe III : Résultats détaillés par élevage des sérologies réalisées par la technique
d’immunofluorescence indirecte…………………...…..……………………115

Annexe IV : Estimation de la présence de Babesia divergens dans le sang des bovins par IFI
et par culture in vitro détaillée par élevage……………...…………………….118

9
 INTRODUCTION

Les maladies transmises par les tiques, actuellement en pleine émergence, sont très diverses, atteignent
à la fois les animaux et l’Homme et provoquent une morbidité et une mortalité importante à travers le
monde.
Présente dans toute l’Europe, la tique Ixodes ricinus, qui possède une très large gamme d’hôtes, est
porteuse et vectrice de nombreux agents pathogènes. Parmi ces différents agents, les parasites du genre
Babesia posent un important problème vétérinaire au niveau mondial et sont l’objet d’un récent regain
d’intérêt en tant que zoonose émergente. Les Babesia sont des protozoaires intra-érythrocytaires qui
provoquent chez de nombreuses espèces animales, une maladie appelée babésiose ou piroplasmose,
caractérisée par un syndrome hémolytique.

En France, Babesia divergens est responsable de la plupart des cas de babésiose bovine et donc à
l’origine de pertes économiques importantes en élevage. Elle représente un risque zoonotique même si
les cas humains restent rares et ne sont rencontrés que chez des individus splénectomisés. Malgré son
importance économique, médicale et sanitaire, c’est pourtant l’une des Babesia la moins étudiée. Sa
biologie est intimement liée à celle de son vecteur I. ricinus mais de nombreux points demeurent
incertains voire inconnus notamment en ce qui concerne le déroulement de son cycle de
développement chez la tique, les interactions avec son vecteur ou encore l’épidémiologie de sa
transmission.

L’évaluation de la prévalence d’un parasite chez son vecteur s’intègre dans les recherches sur
l’épidémiologie et la transmission d’une maladie vectorielle. Chez I. ricinus, les prévalences des
différentes espèces de Babesia demeurent peu étudiées. Quelques études récentes utilisant les
techniques de biologie moléculaire ont permis de déterminer des prévalences pour B. microti, parasite
des rongeurs transmissible à l’homme, chez I. ricinus. En revanche, peu de données récentes sont
disponibles sur la prévalence de B. divergens chez son vecteur.

Le but du travail présenté ici est de déterminer dans un premier temps la proportion de tiques
infectantes dans une population de tiques située dans des élevages endémiques de babésiose bovine.
Pour ce faire, la prévalence de B. divergens a été estimée à l’aide de techniques de biologie
moléculaire dans les glandes salivaires de tiques femelles I. ricinus récoltées dans de tels élevages.
Une des difficultés de réalisation de cette partie réside dans le fait qu’aucune référence n’est
disponible, tant sur les techniques utilisables que sur les valeurs de prévalence attendues.

Le deuxième objectif de notre projet est d’évaluer en parallèle la prévalence parasitaire chez les bovins
dans les élevages sélectionnés, et comprend la détermination du statut sérologique du troupeau et la
recherche de bovins porteurs de B. divergens par mise en culture de prélèvements sanguins.

La première partie de ce document développe une étude bibliographique sur les agents impliqués dans
la babésiose bovine, tout d’abord le vecteur I. ricinus, puis le parasite B. divergens, puis répertorie les
différentes études de prévalences de Babesia effectuées chez I. ricinus.
La seconde partie de ce document concerne la description des modalités et des résultats de notre
travail, qui sont ensuite discutés.

10
11
 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

12
13
 I. LA BABESIOSE BOVINE A BABESIA
DIVERGENS

Babesia divergens est le principal parasite responsable, en France, de la babésiose ou piroplasmose

bovine. Cette maladie est dite vectorielle car elle est transmise aux bovins par la tique Ixodes ricinus.
Babesia major transmise par Haemaphysalis punctata, également responsable de la babésiose bovine,
est moins pathogène, moins fréquente et présente une répartition géographique plus restreinte
(L’Hostis et al., 1995 ; Zintl et al., 2003). Nous allons dans le reste de cette étude nous intéresser à la
babésiose bovine due à B. divergens.

L’importance économique de cette maladie n’est pas négligeable : mortalité, diminution de la

production chez les animaux atteints, même après la guérison, convalescence longue, possibilité de
rechutes (Bourdoiseau et L’Hostis, 1995).

I.1. Epidémiologie de la maladie en France

En raison de l’intervention obligatoire des tiques comme vecteurs de la maladie, les caractères
épidémiologiques de la babésiose sont directement liés à la biologie de la tique I. ricinus, qui sera
décrite dans la suite de ce mémoire. Il s’agit d’une maladie contractée au pâturage, endémique,
existant sous la forme de foyers très localisés. Les formes cliniques apparaissent pendant les saisons à
tiques, au printemps et à l’automne. A ces périodes, les bovins sont au pâturage et les tiques sont
actives, la fréquence des morsures de tiques est donc plus importante (Bussiéras et Chermette, 1992 ;
Zintl et al., 2003 ; L’Hostis et Chauvin, 1999).

L’incidence de la maladie est de 0,4 % par an. Sa distribution en France correspond à celle de la tique
vectrice. La plupart des cas sont retrouvés dans le Nord-Ouest et l’Ouest de la France, le Sud-Ouest et
le Centre (figure 1) (L’Hostis et al., 1995).

La babésiose sévit chez les animaux de plus de un an et demi à deux ans. Les veaux infectés ne
développent pas de babésiose clinique sévère. Ils présentent des parasitémies faibles et persistantes
sans apparition de signes cliniques. Cette résistance liée à l’âge est bénéfique pour l’hôte mais
également pour la transmission ultérieure de parasite. Elle est liée en partie et dans un premier temps à
la protection colostrale de la mère lorsque celle-ci provient d’une région endémique de babésiose et à
la présence du thymus. On a longtemps pensé qu’un facteur sérique non identifié et indépendant des
anticorps intervenait aussi dans protection du jeune bovin. Etant donné l’utilisation fréquente de sérum
de veau pour les cultures de Babesia sp., cette hypothèse est actuellement rejetée. La différence de
réponse à l’infection entre les jeunes bovins et les adultes pourrait être partiellement expliquée par la
localisation et le moment d’apparition de la réponse inflammatoire : chez les veaux, la production
d’oxyde nitrique, qui intervient dans la réponse immunitaire contre B. bovis, apparaît plus
précocement que chez l’adulte et semble être concentrée au niveau de la rate (Zintl et al., 2005).

14
 Figure 1 : Distribution de la babésiose bovine en France
d’après L’Hostis et al. (1995)
Dans les régions où la fréquence du parasite est élevée, les animaux se contaminent en général avant
l’âge d’un an sans développer de signes cliniques. Ils acquièrent ainsi une immunité. Pour que cette
dernière soit stable et durable, des contacts réguliers avec le parasite sont nécessaires. Même si la
résistance à la maladie diminue chez les animaux âgés, ceux-ci sont dans la majorité des cas,
immunisés contre le parasite. Il y a donc peu de cas cliniques dans les régions endémiques (Zintl et al.,
2003). On parle alors de situation endémique stable (Morel, 2000).

I.2. Symptômes

Les bovins sont sensibles à B. divergens mais l’infection est souvent de faible importance, avec une
parasitémie basse et peu de signes cliniques. Les cas cliniques de babésiose sont souvent liés à
l’existence de maladies intercurrentes ou à une baisse de l’état physiologique général (stress, troubles
nutritionnels, lactation, gestation).
B. divergens est responsable, chez les bovins en phase clinique, d’un syndrome hémolytique avec
hyperthermie. Ces symptômes, qui correspondent à la forme aiguë de la maladie, apparaissent après
une incubation d’une semaine environ. L’hyperthermie est d’installation soudaine et persiste plusieurs
jours, puis est suivie d’une hypothermie. Le syndrome hémolytique est caractérisé par une anémie, une
hémoglobinurie, une bilirubinurie (urines de couleur brune, moussantes) et un ictère inconstant
d’apparition tardive. Les signes digestifs généralement associés sont pathognomoniques de la
babésiose : matières fécales très liquides émises avec force au travers d’un anus fortement contracté
(« défécation à travers un trou de serrure »). D’autres troubles généraux sont fréquemment présents :
abattement, polypnée, tachycardie, chute de la production laitière, parfois avortement. En fin
d’évolution, des troubles nerveux peuvent apparaître : torpeur, affolement et troubles locomoteurs
(Bourdoiseau et L’Hostis, 1995). Les symptômes peuvent s’aggraver jusqu’à la mort de l’animal en

15
l’absence de traitement précoce (mortalité de 10-15 %). La forme initiale peut être suivie de rechutes
identiques à la forme aiguë.
En l’absence de traitement, la piroplasmose évolue le plus souvent vers une guérison caractérisée par
une convalescence lente (anémie persistante, productions diminuées) pouvant évoluer sur plusieurs
années.
Les infections subcliniques sont de loin les plus fréquentes et sont caractérisées par un portage
asymptomatique ou peu symptomatique (adynamie, appétit parfois capricieux, baisse des productions,
anémie modérée, hyperthermie discrète et irrégulière). Elles peuvent faire suite aux infections aiguës
ou apparaître d’emblée.
Il existe également des formes suraiguës, chez les femelles laitières hautes productrices, avec
syndrome méningo-encéphalitique et ictère, aboutissant à la mort en 24-36 heures (Euzéby, 1990).

I.3. Diagnostic, traitement et prophylaxie

I.3.1 Diagnostic

Le diagnostic clinique est fondé sur la symptomatologie et sur des considérations épidémiologiques
(saison, région, âge et origine des animaux). Le diagnostic différentiel permet de distinguer la forme
aiguë de la maladie des autres causes de syndrome fébrile et d’hématurie (intoxication à la mercuriale
et à la fougère aigle), d’ictères (leptospirose) et d’anémies (anaplasmose) (Bourdoiseau et L’Hostis,
1995).

Même si en pratique, le diagnostic thérapeutique est fréquent pour des raisons évidentes d’économie,
le diagnostic de laboratoire s’avère pourtant très utile. Les colorations simples peuvent cependant être
réalisées au cabinet.
Au laboratoire, différentes méthodes de diagnostic direct et indirect du parasite ont été développées :

− le diagnostic direct (mise en évidence du parasite) permet de confirmer une suspicion clinique
et se fait par hématologie : prélèvements d’une goutte de sang capillaire – généralement à
l’oreille – étalement sur lame, coloration au May-Grünwald-Giemsa, observation au
microscope et recherche des éléments intra-érythrocytaires caractéristiques de B. divergens,
plus rarement par xénodiagnostic (inoculation de sang à un hôte sensible comme la gerbille de
Mongolie) ou par amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) de l’ADN parasitaire.

− le diagnostic indirect par sérologie est plus souvent mis en place pour les enquêtes
épidémiologiques. Deux techniques sont couramment utilisées : l’immunofluorescence
indirecte (IFI) pour déterminer le statut immunologique d’un troupeau et l’ELISA (enzyme-
linked immunosorbent assay) qui permet de différencier les infections récentes des plus
anciennes ainsi que les infections multiples pendant une saison de pâture (Chauvin et al.,
1995). Les recherches menées actuellement sur l’amélioration de la technique ELISA ont pour
objectif de permettre son utilisation pour des enquêtes à grande échelle.

16
 I.3.2 Traitement

Le traitement spécifique des babésioses bovines consiste en une injection d’imidocarbe (Carbésia®) à
la posologie de 1 à 3 mg/kg de poids vif (généralement 1 mL/100 kg), par voie intra-musculaire ou
sous-cutanée (temps d’attente avant abattage ou livraison du lait : 28 jours pour la viande ; quatre
traites pour le lait). Des traitements complémentaires sont parfois nécessaires : perfusions de soluté
isotonique voire transfusion sanguine, administration de fer et de vitamines, anti-anémiques,
protecteurs hépato-rénaux (Bussiéras et Chermette, 1992 ; Bourdoiseau et L’Hostis, 1995 ; Zintl et al.,
2003).

I.3.3 Prophylaxie

La prophylaxie est basée sur la lutte contre les tiques (acaricides sur les bovins, entretien des
pâturages), souvent difficile à appliquer sur le terrain, et sur la mise en place d’une chimioprévention
par l’imidocarbe (à la dose minimale de 2,5 mg/kg) qui confère une protection contre les babésies
pendant 4 à 6 semaines et permet l’instauration, pendant cette période, d’une immunité en zone
d’endémie (Bourdoiseau et L’Hostis, 1995).
La lutte contre les tiques est un choix délicat, car il ne faut pas rompre l’équilibre « hôte-parasite», si
celui-ci est installé dans un troupeau (L’Hostis, 1997). En zone d’endémie, il faut maintenir et
contrôler la présence de l’agent pathogène dans l’environnement, sans chercher à le faire disparaître,
afin d’assurer l’établissement chez les jeunes bovins des prémunitions naturelles précoces et
l’entretien de ces prémunitions (Morel, 2000).
Aucun vaccin n’est actuellement disponible pour lutter efficacement contre B. divergens (Zintl et al.,
2003).

17
La babésiose bovine est une maladie infectieuse non contagieuse due à des hémoprotozoaires du
genre Babesia obligatoirement transmis après évolution cyclique chez des tiques dures. La babésiose
à B. divergens est considérée comme la maladie vectorielle transmise par les tiques la plus importante
en France en pathologie bovine, de part sa fréquence, la gravité des signes cliniques associés et les
pertes économiques qu’elle engendre. La lutte contre cette maladie est étroitement liée à la biologie
de son vecteur I. ricinus, que nous allons détailler dans la suite de ce travail.

18
19
 II. IXODES RICINUS LINNE 1758, VECTEUR DE
BABESIA DIVERGENS

II.1. Classification et morphologie

II.1.1 Classification

Les tiques sont des Arthropodes hématophages appartenant à la classe des Arachnides et à la sous-
classe des Acariens. I. ricinus est une tique dure (sous-ordre des Ixodina) qui appartient à la famille
des Ixodidés (Ixodidae) (Camicas et Morel, 1977 ; Morel, 1981) (figure 2).

Figure 2 : Systématique des tiques

d’après Camicas et Morel (1977).

II.1.2 Morphologie externe

I. ricinus appartenant à la sous-classe des Acariens, elle en possède les caractéristiques principales :

• un corps globuleux, non segmenté, formé de deux parties : le capitulum (ou gnathosome) à
l’avant et l’idiosome en arrière ;

• six paires d’appendices : - quatre paires de pattes formées de six segments chez les
adultes et les nymphes, les larves étant hexapodes,
- une paire de chélicères,
- une paire de pédipalpes.

20
De plus, I. ricinus présente les particularités morphologiques des tiques dures de la famille des
Ixodidés (figure 4) :

• une grande taille,

• l’existence d’une cuticule souple et extensible permettant la réplétion,

• la présence de plaques chitineuses constituant le scutum dorsal,

• la présence d’un rostre, comprenant un hypostome, responsable de l’ancrage sur l’hôte. Le

rostre étant plus long que large, on parle de tique longirostre.

I. ricinus passe, au cours de son développement, par trois stades successifs morphologiquement
distincts et séparés par deux métamorphoses : la larve, la nymphe et l’adulte.

Les adultes présentent un dimorphisme sexuel marqué :

− la femelle (figure 3) mesure entre 5 (à jeun) et 15 mm (gorgée) de long. L’idiosome est

constitué d’un scutum brun foncé en forme de losange qui se termine au milieu du corps ; le
reste du tégument dorsal est brun-roux. On observe deux aires poreuses bien individualisées
sur le gnathosome en vue dorsale. La première paire de hanche ou coxa I porte une longue
épine externe,

− le mâle se différencie de la femelle par sa taille plus petite ( entre 5 et 8 mm), par un scutum
épais et rigide occupant presque toute la surface du corps, par un gonopore operculé et
l’absence d’aires poreuses.

Figure 3 : Femelle adulte d’I. ricinus

La nymphe est morphologiquement semblable à la femelle adulte mais de taille plus réduite et de
couleur unie. Elle mesure entre 1 et 2,5 mm de longueur. Elle ne possède ni gonopore (pore génital
situé entre les hanches IV) ni aires poreuses.

21
La larve est comparable à la nymphe mais elle est plus petite et possède seulement trois paires de
pattes. Elle mesure entre 0,5 et 1 mm de longueur. Les stigmates sont absents (orifices des trachées
internes s’ouvrant latéralement dans l’alignement des hanches chez les adultes) (Morel, 2000 ;
Hillyard, 1996).

Les clés d’identification d’I. ricinus sont présentées en annexe I.

A : Vue dorsale ; B : Vue ventrale ; C : Hypostome, vue ventrale ; D : Capitulum, vue dorsale.
E : Capitulum, vue ventrale ; F : Pore génital ; G : Spiracle ; H : Segments terminaux des pattes.
A : anus ; Als : Alloscutum ; Bc : Base du capitulum ; C-1 : coxa I ; CAP : capitulum ; Cg : sillon cervical ; Ga :
pore génital ; Gg : sillon génital ; Hyp : Hypostome ; Id : Idiosome ; Lg : Sillon latéral ; Mg : Sillon marginal ;
OP : Opisthosome ; Pa : aire poreuse ; Palp : Pédipalpe ; Pod : Podosome ; Prg : sillon pré-anal ; Sp : spiracle.

Figure 4 : Morphologie externe générale d’une tique Ixodidae

d’après Sonenshine (1991)

22
 II.1.3 Morphologie interne

Nous nous intéresserons uniquement à l’anatomie interne de la femelle car seule cette dernière sera
étudiée dans le travail présenté.

L’anatomie interne de la femelle d’I. ricinus est présentée dans la figure 6 (Sonenshine, 1991).

L’appareil digestif : la bouche s’ouvre au-dessus de l’hypostome et est limitée par les chélicères. Un
pharynx aspirant pourvu de muscles puissants lui fait suite, puis un œsophage et un estomac en
position centrale. Ce dernier est constitué de nombreux caeca antérieurs, postérieurs, dorsaux et
ventraux. Ces diverticules se gonflent lors du repas sanguin et occupent alors tous les espaces libres de
la cavité hémocoelienne. Les caeca aboutissent à un sac rectal, suivi d’un anus.

A ce tube digestif sont associées deux glandes salivaires en forme de grappes de raisin (figure 5), qui
s’étendent du niveau des orifices stigmatiques aux bords latéraux de l’écusson dorsal (Morel, 2000).

SD : Conduit salivaire principal ; SGA : Acini salivaires non granuleux (type I) ; SGG : Acini salivaires
granuleux (type II et III).
Figure 5 : Structure générale des glandes salivaires d’une tique femelle
d’après Sonenshine (1991)

Un conduit salivaire central s’étend postérieurement dans la longueur de chaque glande et se continue
antérieurement vers le capitulum où les deux conduits se réunissent en un salivarium commun. Quatre
types d’acini sont retrouvés chez le mâle. Chez la femelle, seuls trois types d’acini sont présents :

Acini de type I : situés le long du conduit principal, en régions antérieure et moyenne

de la glande, ils sont responsables des secrétions hygroscopiques permettant à la tique de maintenir
son équilibre hydrique en captant l’humidité atmosphérique.

Acini granuleux de type II et III : dispersés le long de la glande surtout en régions

moyenne et postérieure, ils sécrètent le cément qui permet la fixation des pièces buccales de la tique à
la peau de l’hôte (Sonenshine, 1991).

23
 La partie gauche du schéma montre les organes, une fois les caeca retirés ; la partie droite représente les caeca
coupés médialement, les diverticules reposant sur le reste des organes.
LG : colonne longitudinale des ovaires ; MD : caecum ; MS : estomac ; Mal. T : tubes de Malpighi ; O : ovaire ;
OV : oviducte ; PnT : troncs nerveux ; Rec. S : sac rectal ; SGA : glande salivaire, zone à acini non granuleux ;
SGG : glande salivaire, zone à acini granuleux ; SD : conduit salivaire ; Syn : ganglion céphalique ; TAG :
glande tubulaire accessoire ; TrT : troncs trachéaux ; Tr : trachée.
Figure 6 : Anatomie interne d’une tique femelle adulte
d’après Sonenshine (1991)

24
La salive contient différents enzymes et plusieurs types de modulateurs pharmaco-dynamiques qui
s’opposent aux composants hémostatiques et inflammatoires produits par l’hôte suite à la blessure.
Des anti-coagulants sont également sécrétés.

Les glandes salivaires constituent un organe de prédilection pour la transmission d’agents pathogènes
lors de la piqûre car la tique injecte de la salive au moment où elle se gorge et est donc à même de
transmettre les agents pathogènes qui ont colonisé les glandes salivaires. C’est le cas notamment pour
Babesia divergens responsable de la babésiose bovine et transmise par I. ricinus.

L’appareil génital : il est constitué d’un ovaire tubulaire situé en arrière du ganglion cérébral. Les
oviductes qui en émanent décrivent de nombreuses boucles et sont en contact étroit, sur certaines
portions, avec les caeca gastriques. Ils s’unissent en un utérus, prolongé par un vagin qui débouche au
niveau du pore génital.

L’excrétion est assurée par deux tubes de Malpighi, réunis en une ampoule excrétrice qui s’ouvre sur
l’anus. Les excrécats sont constitués par de la guanine et de la mélanine. De l’eau et des ions minéraux
sont excrétés au cours du repas par des glandes cuticulaires et par la salive.

La respiration est permise par des trachées qui rejoignent les stigmates situés en arrière des hanches
IV.

La circulation est assurée par un cœur dorsal pulsatile en forme de canal.

Le système nerveux est constitué par un ganglion céphalique (Morel, 2000).

II.2. Cycle de développement et biologie d’I. ricinus

II.2.1 Cycle d’I. ricinus

Le cycle d’I. ricinus est composé de trois stades : larve, nymphe et adultes mâle et femelle, séparés
chacun par une métamorphose. Il y a changement d’hôte entre chaque stade : il s’agit d’un cycle
triphasique. Les trois phases parasitaires sont séparées par deux phases à terre, ou vie libre, au cours
desquelles s’effectuent les mues.
La majorité de la durée de vie d’I. ricinus se passe dans l’environnement, la phase parasitaire étant
réduite uniquement au temps nécessaire au gorgement, éventuellement à la copulation pour les adultes.
Il s’agit d’une espèce exophile à tous ses stades, c’est à dire qu’elle n’a pas d’habitat spécialisé
(Aeschlimann, 1972).

La femelle gorgée se détache de l’hôte et cherche à gagner un abri pour pondre ses œufs : dans les
profondeurs de la couche végétale, sous une pierre, dans les crevasses du sol ou entre les racines des
plantes. Les mouvements de la femelle gorgée sont très réduits, probablement à cause de son volume,
et se limitent essentiellement à une progression verticale en direction du sol (Milne, 1948). La ponte a
lieu dans les deux mois qui suivent, temps nécessaire à la digestion du sang et à la maturation des

25
ovules. Elle est unique, puisque la femelle meurt après la ponte, et abondante (500 à 2000 œufs) (Pérez
et Rodhain, 1977).

La mortalité des femelles gorgées pendant la phase de pré-oviposition n’est pas négligeable. Elle est à
la fois la conséquence des prédateurs (essentiellement les oiseaux et les musaraignes) et de la
dessiccation en cas de détachement dans un milieu non protégé par une couverture végétale suffisante
(Milne, 1948).

Les œufs vont éclore en 6 à 8 semaines, libérant des larves. La larve ne se met en quête d’un hôte que
plusieurs jours après son éclosion (environ deux semaines), temps nécessaire pour durcir son
tégument, perdre une certaine quantité d’eau et éliminer les déchets de l’incubation.
De la même façon que pour les stades nymphaux et adultes, la larve monte sur la végétation et attend
le passage d’un hôte, généralement un micromammifère, dans la position caractéristique d’affût. Les
larves sont souvent regroupées au même endroit en « nid », à faible distance du lieu de ponte
(Macleod, 1932).
Après un repas de 3 à 7 jours, la larve gorgée se laisse tomber, le détachement se faisant
préférentiellement dans le terrier de l’hôte (tendance à la pholéophilie). Elle quitte alors ce terrier
grâce à un phototropisme positif afin d’effectuer sa mue à l’extérieur (Graf et al., 1978).

La mue, d’une durée de 4 à 8 semaines, aboutit à la formation d’une nymphe de taille identique à celle
de la larve gorgée. Le comportement de la tique à ce stade est comparable à celui du stade larvaire en
ce qui concerne les déplacements, la recherche de l’hôte (stade ubiquiste) et la durée du repas sanguin.
La phase au sol qui suit le repas sanguin est, chez la nymphe, nettement plus longue que chez la larve :
2 à 5 mois (Pérez et Rodhain, 1977).

Le stade adulte succède au stade nymphal. Le durcissement de la cuticule s’effectue en une semaine
environ après la mue (Macleod, 1932). La tique se met en quête d’un hôte plusieurs semaines après la
mue, après un temps de repos et de maturation. La stratégie d’attente de l’hôte est identique à celle des
larves et des nymphes ; la durée de cette attente peut cependant être plus longue chez la femelle adulte
que chez les immatures car cette dernière est plus résistante dans l’environnement. Deux positions
peuvent être observées pour l’affût : la tique peut engainer l’extrémité d’une tige, d’une feuille ou
d’une inflorescence de graminée, elle se tient alors la tête en bas. Cette position est observée le plus
souvent sur les graminées des chemins en sous-bois. Plus fréquemment, I. ricinus se tient sous les
feuilles (plus rarement sur les feuilles) des végétaux, à l’abri du soleil et du vent, le capitulum vers
l’apex des feuilles les plus terminales qui sont inclinées vers les chemins, c’est à dire à l’endroit le
plus propice pour entrer en contact avec un hôte. Les tiques ont également tendance à se grouper sur
une même feuille (Gilot et al., 1975). La première paire de pattes est habituellement portée vers
l’avant et remuée dans l’air, comme le seraient des antennes (figure 7). Ce sont elles qui portent les
organes de Haller, à rôle sensoriel (Macleod, 1932).
La tique est attirée par le mouvement et le CO2 produit par l’hôte lors de son passage à proximité de
l’affût. La femelle s’accroche alors à l’hôte pour effectuer son gorgement.
Le mâle se poste également à l’affût, non pour se nourrir car il n’effectue pas de repas sanguin, mais
pour rechercher des femelles sur les hôtes.

26
 Figure 7 : Femelle I. ricinus à l’affût.

La copulation peut s’effectuer sur le sol, un grand nombre de femelles adultes à jeun est fécondé dans
la nature (Graf, 1974) ou sur l’hôte pendant le repas de la femelle. Cette dernière synthétise des
phéromones sexuelles attractives pour le mâle, ce qui pourrait faciliter les rencontres dans
l’environnement (Graf, 1975). Le repas sanguin ne peut être achevé sans fécondation, que la rencontre
entre les deux sexes ait lieu avant ou après le début du repas.

La durée du gorgement est de 8 à 10 jours, avec une première phase lente d’environ une semaine au
cours de laquelle le poids de la tique est multiplié par 10, puis une phase de gorgement rapide, d’une
durée de 12 à 24 heures, avec une multiplication de poids supérieur à 10 (Hillyard, 1996). Une fois
gorgée la femelle se détache, ce détachement se faisant préférentiellement le jour (Graf et al., 1978).

II.2.2 Facteurs d’hôtes

a) Nombre d’hôtes et de phases parasitaires

Comme nous l’avons vu précédemment, le cycle d’I. ricinus passe par trois phases parasitaires,
chacune sur un hôte différent, séparées par deux phases à terre au cours desquelles se déroulent les
pupaisons : il s’agit d’un cycle triphasique ou trixène (Morel, 1979).
b) Nature des hôtes
La nature des hôtes d’I. ricinus est extrêmement variée : grands et petits mammifères, oiseaux et
reptiles. Le cycle biologique est alors qualifié de télotrope (Morel, 1979). Il y a ubiquité parasitaire,
mais il n’y a jamais égalité de choix entre les diverses catégories d’hôtes et cette préférence peut
s’exprimer en pourcentage : 80 à 90 % des immatures se retrouvent sur les rongeurs (essentiellement
campagnols, mulots), insectivores (musaraignes et hérissons) et oiseaux, 10 à 20 % sur les léporidés,
carnivores et ongulés (Pérez et Rodhain, 1977). Parmi les immatures, les larves sont préférentiellement
retrouvées sur les micromammifères, les nymphes sur les rongeurs mais également sur les animaux de
plus grande taille : lièvres, écureuils, hérissons, renards, oiseaux et parfois lézards (Bourdeau, 1993).
Les adultes se retrouvent presque exclusivement sur les grands mammifères sauvages et domestiques :
cervidés, sangliers, renards, chiens, moutons, bovins et sur l’homme. Au cours d’une étude réalisée en

27
Suisse en 1973, Mermod et collaborateurs n’ont jamais retrouvé de tiques adultes sur des
micromammifères (Mermod et al., 1973).
On ne peut parler de tiques du bétail à proprement parler, même si à l’heure actuelle, dans un
environnement transformé par les techniques modernes de l’agriculture et de l’élevage, le bétail peut
constituer les seuls hôtes pratiquement disponibles pour I. ricinus. Dans ces zones, le bétail a
simplement remplacé les ongulés locaux, partiellement ou complètement (Morel, 2000).
c) Localisation sur les hôtes
Les sites d’attachement préférentiels des femelles adultes sur les bovins sont l’aisselle, la mamelle ou
la région inguinale, la nuque, le pli du grasset et le flanc (L’Hostis et al., 1994). Dans le cas d’une
infestation importante, le site de fixation majoritaire peut se déplacer à la surface de l’hôte au cours de
la saison d’activité de la tique. Si le site est saturé, la tique colonise d’autres régions du corps. Chez les
carnivores et les rongeurs, les tiques sont trouvées le plus souvent sur le cou et la tête et chez les
reptiles, au niveau des aisselles et de l’aine (Morel, 2000).

II.2.3 Facteurs extrinsèques du cycle évolutif

Au cours d’un cycle, les tiques, bien que parasites obligatoires, ne passent qu’environ trois semaines
au total fixées sur l’hôte. Pendant ces phases parasitaires, elles sont relativement indépendantes du
microclimat environnant ; le seul facteur qui semble jouer alors un rôle est la température de la peau
de l’hôte : le gorgement est plus lent sur un reptile que sur un homéotherme, plus lent sur un animal en
hibernation que sur un actif.
Pendant les phases de vie libre qui occupent la majorité de la vie de la tique, les facteurs climatiques
ont une très grande importance car il existe alors des relations très étroites entre la tique et le milieu
naturel (Milne, 1949 et 1950 ; Pérez et Rodhain, 1977). Cette dernière est capable de résister au jeûne
(plus d’une année), au froid et dans une moindre mesure à la sécheresse et aux chaleurs estivales
(Euzéby et Rancien, 1966).
a) Température
La température est un facteur dynamique régulant l’activité d’I. ricinus ainsi que son organogenèse.
Elle influe donc sur la durée de son cycle (Morel, 2000). Les durées des différentes étapes, obtenues
par plusieurs auteurs et relatées dans le tableau ci-dessous, montrent l’existence d’un « cycle court » à
température tempérée (environ 15-20°C), et d’un « cycle long » à température plus basse
(Aeschlimann, 1972).

L’étude des cycles montre que cette espèce peut supporter de très forts ralentissements dans son
évolution alors qu’elle est soumise à de basses températures, certains auteurs n‘hésitant pas à parler de
diapause. La photopériode intervient aussi dans le contrôle de cette diapause (Belozerov et al., 2002).
I. ricinus est capable de supporter des amplitudes de températures considérables, lui permettant de
passer sans dommage les mois d’hiver, au cours desquels il peut devenir endophile, vivant caché dans
les galeries des micromammifères ou dans la litière végétale (Aeschlimann, 1972). Macleod (1935) a
montré que tous les stades de la tique sont capables de survivre quatre jours à –8°C dans des
conditions expérimentales. La résistance au froid est donc importante.

28
Tableau 1 : Durée en jours des différentes étapes du cycle d’Ixodes ricinus en fonction de
la température
d’après Aeschlimann (1972)
Durées en jours
Pomerantzev Aeschlimann Brossard
(in Aeschlimann, 1972) (1972) (in Aeschlimann, 1972)
Cycle court Cycle long
Cycle court (17-21°C) Cycle court
(15-20°C) (≤ 15°C)
Préoviposition 4 27 3-22 8-17
Embryogenèse 25 400 Environ 30 31-47
22°C
Prénutrition
10 570 16 21
larvaire
Repas larvaire 3 6 5 2-3
Postnutrition
28 426 30-55 21-25
larvaire
(Mue) 26°C
Prénutrition
10 540 24-72 21
nymphale
Repas nymphal 3 6 4-7 2-6
Postnutrition
56 360 Jusqu’à 100 24-37
nymphale
(Mue) 26°C
Prénutrition de la
10 810 30 21
femelle
Repas de la femelle 6 14 6-14 6-11

b) Hygrométrie
Plus encore que la température, l’hygrométrie est un facteur limitant pour la survie d’I. ricinus. Une
humidité relative importante est toujours nécessaire pour garantir le développement et la survie des
œufs et des pupes ainsi que celle des tiques écloses, à jeun ou non. La valeur de l’humidité relative du
biotope requise pour la survie de la tique diffère selon les stases notamment en fonction de leur
masse : les préimagos sont les plus exigeantes ; les adultes, de plus grande taille et bien sclérifiés, se
défendent mieux contre l’évaporation. Les tiques non gorgées sont moins sensibles à la dessiccation
que les tiques gorgées (Milne, 1948 ; Morel, 2000).
Entre 22°C et 32°C, les pupaisons larvaires aboutissent dans 100 % des cas dans des conditions de
saturation ; pour les mêmes températures, à 95 % d’humidité, la mortalité atteint 10-20 % ; à 90 %
d’humidité, la mortalité est de 15 à 30 %. Les trois stades évolutifs ne survivent que peu de jours si
l’hygrométrie baisse en dessous de 70 % (Aeschlimann, 1972). Ces exigences hygrométriques élevées
existent non seulement pendant les périodes d’organogenèse, mais aussi pendant les périodes
d’activité qui précèdent le repas. La tique ne peut survivre que dans les zones où la couverture
végétale assure une hygrométrie élevée (Pérez et Rhodhain, 1977).
La distribution verticale des tiques est en relation avec leur résistance à la dessiccation : les adultes
non gorgés à l’affût sont retrouvés sur les végétaux à des hauteurs plus importantes que les nymphes et

29
les larves, en moyenne à 40 et 70 cm du sol. Les individus des trois stades se placent
préférentiellement à l’abri du soleil et du vent.
Pour résister à la déshydratation, I. ricinus va maintenir fermés ses spiracles respiratoires la plupart du
temps, et possède un système d’élimination des déchets azotés très économique en eau. De plus, la
tique dispose de mécanismes d’absorption ou de production d’eau : absorption de l’eau atmosphérique
à travers la cuticule ou grâce aux glandes salivaires, production d’eau au cours du métabolisme de la
tique gorgée (Sonenshine, 1991).
En définitive, le développement de cette espèce est lent, même en présence de conditions climatiques
favorables : la durée du cycle est de deux ou trois ans en France, depuis l’œuf pondu par une femelle,
jusqu’à celui pondu par une femelle de la génération suivante (Euzéby et Rancien, 1966), et elle peut
s’étendre à 6 ans dans le Nord de l’Europe (Bourdeau, 1993).

II.2.4 Activités saisonnière et journalière

a) Activité saisonnière
Dans les pays d’Europe tempérée, la population active d’I. ricinus évolue de manière bimodale au
cours de l’année (Macleod, 1939 ; Evans, 1950 ; Aeschlimann, 1972 ; Mermod et al., 1973 ; Gilot et
al., 1975 ; Pérez-Eid, 1975 ; L’Hostis et al., 1996 ; Morel, 2000 ; Randolph et al., 2002). On observe
un important pic de printemps de mars à juillet selon les régions et un second pic d’activité moins
important à l’automne, pendant les mois de septembre à novembre.
Les adultes et les nymphes suivent la même courbe d’activité au printemps : elles commencent leur
activité en février avec un pic généralement au mois de mai, les nymphes pouvant occasionnellement
présenter leur maximum d’activité 2-3 semaines après les adultes. Les larves apparaissent plusieurs
semaines après et leur activité est maximale en juin (Milne, 1947).
Lors de conditions climatiques moins favorables (températures, altitude, pluviométrie), l’activité des
tiques peut être unimodale. C’est le cas des pays méditerranéens où l’on n’observe qu’un seul pic
d’activité en automne, voire uniquement en hiver de décembre à février (Principato et al., 1989).
b) Activité journalière
Au cours de leur période d’activité, les tiques sont actives le jour et la nuit, avec cependant une activité
beaucoup moins intense la nuit. Ce comportement est à mettre en relation avec les variations
nycthémérales de températures (Milne, 1947), la présence d’hôtes disponibles ainsi qu’avec les
variations de l’intensité lumineuse.
Les tiques actives sont positionnées à l’affût à la recherche d’un hôte. Toutefois cette position ne peut
être conservée indéfiniment : l’activité des tiques est caractérisée par des mouvements verticaux
importants, alternativement vers le haut et vers le bas de la végétation. La descente vers le sol d’une
tique à l’affût amorce la fin d’une période d’activité et le début d’une période de quiescence sous le
couvert végétal au cours de laquelle la tique va reconstituer ses réserves hydriques (Milne, 1949).
Pendant la vie parasitaire, l’activité est majoritairement diurne pour les nymphes et les adultes. Quant
aux larves, elles infestent les micromammifères principalement entre 20h et 24h, suivant l’activité
nocturne de ces hôtes. Le détachement des trois stades successifs est diurne, le sommet du pic de

30
détachement des larves coïncidant avec les périodes de repos de leurs hôtes, il s’effectue donc dans
leurs terriers (Graf et al., 1978).

II.2.5 Distribution des tiques et biotopes

C’est la végétation qui assure la régulation thermique et hygrométrique (microhabitat) dans toute la
couche supérieure du sol et à sa surface, soit par elle-même avec ses tiges et ses racines, soit par ses
produits de décomposition avec la litière végétale et l’humus. Les exigences très strictes d’I. ricinus
vis à vis de l’hygrométrie sont telles que les possibilités d’existence de cette espèce sont liées à des
formations végétales capables d’offrir une humidité relative très élevée. Ceci explique qu’elle présente
une répartition globale très vaste mais qu’à l’intérieur de cette aire de distribution, cette tique adopte
une répartition en mosaïque (par exemple, elle est absente des formations végétales méditerranéennes
en France) (Pérez et Rodhain, 1977). Au sein de la couche végétale, si celle-ci est suffisamment dense,
les fluctuations thermiques sont moins importantes, les températures étant plus fraîches en été et plus
chaudes en hiver par rapport à celles du macroclimat. Il en est de même pour l’humidité relative qui
est plus constante dans les strates les plus basses de la végétation (Milne, 1948). Plus la couverture
végétale est épaisse, plus la densité de tique est élevée (Hillyard, 1996).

L’habitat typique d’I. ricinus en France est dominé par la présence :

− de forêts de hêtres, chênes, châtaigniers, charmes, aulnes et noisetiers avec un sous-bois riche
et dense,
− de nombreuses haies vives et de bosquets, de promontoires et de brise-vent naturels,
− de bocage, buissons, roncières, terrains en friche ou marécageux à flore dense et variée, avec
une humidité relativement élevée et un climat dans l’ensemble pluvieux,
− d’une altitude inférieure à 1200 mètres,
− d’une végétation composée d’herbes, souvent de pâtures permanentes, de renoncules, de
mousse, de tapis herbacé des prairies.
(Milne, 1945 et 1950 ; Aeschlimann, 1972 ; Morel, 1981 ; Gilot et al., 1975 ; Pérez et Rodhain, 1977 ;
Gilot et al., 1989 ; Hillyard, 1996).

Dans les landes, les bruyères et les fougères produisent une litière abondante, permettant le maintien
de conditions microclimatiques favorables.
Dans les forêts et les bois, I. ricinus se localise dans les secteurs suffisamment éclairés pour permettre
la croissance d’une strate herbacée : taillis peu denses, en lisière, sur les bordures des chemins à ciel
ouvert, dans les clairières (Morel, 1981).

Les biotopes colonisés par I. ricinus sont également liés à la présence d’hôtes vertébrés. Ainsi
retrouve-t-on ces tiques au sein d’écosystèmes riches en mammifères.
Au sein de l’écosystème prairial, les pâtures les plus favorables au développement d’I. ricinus sont
celles adjacentes à des bois, dont les clôtures sont faites de haies ou les prairies broussailleuses des
bocages (Euzéby et Rancien, 1966 ; L’Hostis, 1995). On peut classer les pâtures en trois catégories en
fonction du risque de contamination par I. ricinus :

31
 − les parcelles à fort risque d’infestation, situées à proximité d’un bois de feuillus ou de
conifères,
− les parcelles à risque d’infestation intermédiaire qui sont constituées par les prairies naturelles
et les prairies en bord de haies,
− les parcelles à faible risque d’infestation qui sont les prairies artificielles éloignées de tout bois
(Mémeteau et al., 1998).

Dans une pâture, la répartition des tiques n’est pas homogène : on les trouvera de préférence en
périphérie, au niveau des bandes limitrophes où se développe une végétation dense : à proximité des
haies, dans les zones ombragées par de grands arbres (Gilot et al., 1975). La capture de tiques en plein
pâturage est beaucoup plus rare (L’Hostis et al., 1995).
A l’intérieur d’une pâture, certaines espèces végétales semblent augmenter le taux d’infestation par les
tiques et notamment les fougères, les joncs, les carex, les molinies, les bruyères et les mousses
(Macleod, 1939 ; Milne, 1944).

32
 II.3. Maladies transmises par Ixodes ricinus

La tique I. ricinus est le vecteur de nombreux agents pathogènes tant pour l’animal que pour l’homme.
Elle intervient dans la transmission d’hémoparasites comme les Babesia, d’arbovirus et de bactéries.
Ces maladies sont répertoriées dans le tableau 2. Leur distribution géographique est liée à celle du
vecteur, comme toutes les maladies vectorielles.

Tableau 2 : Principaux agents pathogènes transmis par Ixodes ricinus.

Maladie / Agent Localisation

Espèce(s) atteinte(s) Sources bibliographiques
pathogène géographique
Bovin, homme Commun en Europe Euzéby et Rancien, 1966 ;
Hémoparasites

Babésiose à B. divergens
splénectomisé (France) Hillyard, 1996
Micromammifères, Bourdeau, 1993 ;
Babésiose à B. microti USA, Europe, Asie
homme Guiguen et Degeilh, 2001

Babésiose à B. capreoli Ongulés sauvages Europe Guiguen et Degeilh, 2001

Anaplasmose à
Bovin Vaste répartition (France) Pérez-Eid et Gilot, 1998
Anaplasma marginale
Rickettsies

Ehrlichiose à Anaplasma Mouton, bovin, Hillyard, 1996 ;

Europe occidentale
phagocytophilum chevreuil Pérez-Eid et Gilot, 1998
Nombreuses espèces
Fièvre Q Hillyard, 1996 ;
Bactéries

animales dont ruminants Cosmopolite

Coxiella burnetii Pérez-Eid et Gilot, 1998
et homme
Maladie de Lyme Homme, chien, bovin,
Cosmopolite Pérez-Eid et Gilot, 1998
Borrelia burgdorferi cheval
Nombreux animaux
Tularémie dont ruminants, Guiguen et Degeilh, 2001 ;
Cosmopolite
Francisella tularensis rongeurs et lièvre, Hillyard, 1996
homme
Encéphalites à tique Hillyard, 1996 ;
Mouton, chèvre, homme Eurasie tempérée et froide
Flaviviridae Pérez-Eid, 2001
Arbovirus

Virus de Tettnang &

Hillyard, 1996 ;
Eyach Homme Allemagne et France
Pérez et Gilot, 1998
Reoviridae
Louping ill Iles britanniques et Hillyard, 1996 ;
Mouton, homme
Flaviviridae Norvège Pérez et Gilot, 1998

33
I. ricinus est la tique la plus commune d’Europe du Nord-Ouest et son aire de répartition mondiale est
très vaste. Elle colonise de nombreux biotopes. Des populations importantes sont rencontrées quand
coexistent un écosystème végétal adapté et un cheptel domestique ovin ou bovin, ou une faune sauvage
adéquate en abondance. C’est une tique longirostre à cycle triphasique et télotrope, d’une durée
d’environ 3 ans en France et qui est fortement lié aux conditions climatiques. Les rôles pathogènes
indirects de cette espèce sont nombreux. Dans les élevages bovins français, elle est surtout connue
pour son rôle vecteur de la babésiose bovine à Babesia divergens.

34
35
 III. BABESIA DIVERGENS, AGENT RESPONSABLE
DE LA BABESIOSE BOVINE

III.1. Historique et classification

Babesia divergens, protozoaire hémoparasite transmis par les tiques, est l’agent principal de la
babésiose bovine en France. Il est d’autre part responsable des rares cas européens de babésiose
humaine intervenant chez des individus splénectomisés.

Ce parasite a été observé pour la première fois par Babes en 1888, et reconnu comme agent de la
babésiose bovine par M’Fadyean et Stockman (1911), qui l’ont alors nommé Piroplasma divergens.
On peut également trouver dans la littérature les termes de Babesiella ou Microbabesia (Euzéby,
1990).

Il s’agit d’un protozoaire appartenant à l’embranchement des Apicomplexa, à la classe des

Aconoidasida (ou Piroplasmea), à l’ordre des Piroplasmidora et à la famille des Babesidae (Telford et
al., 1993).

La place des Babesia dans la classification fut longtemps confuse et controversée, les premières
classifications étant basées sur les caractéristiques morphologiques des formes intra-érythrocytaires
visibles au microscope après étalement sur lame et coloration au May-Grünwald-Giemsa, et sur les
spécificités d’hôte vertébré. Récemment, l’utilisation de techniques moléculaires (séquençage de
l’ADN ribosomal) a permis de préciser cette classification à partir de critères plus objectifs (Homer et
al., 2000).

III.2. Diversité génétique

Le polymorphisme génétique de B. divergens a également été étudié grâce aux techniques de biologie
moléculaire. De nombreuses méthodes permettent de déterminer ce polymorphisme de manière plus
ou moins fine : les réactions de polymérisation en chaîne (PCR) et le polymorphisme de longueur des
fragments de restriction (RFLP), l’amplification aléatoire de l’ADN polymorphe (RAPD), le
polymorphisme de longueur des fragments amplifiés (AFLP) et le séquençage. Le polymorphisme a
été étudié à partir d’une protéine de surface appelée Bd37, dont le gène codant a été séquencé. Six
profils génétiques distincts ont été déterminés (Vallet, 2000). Une septième forme allélique pour cette
protéine a été mise en évidence par la suite. Parmi ces 7 types génétiques, deux sont nettement
prédominants, le type 1 et le type 2. La co-infection d’un même bovin par plusieurs souches peut être
observée (Baune, 2002).

36
 III.3. Hôtes

B. divergens est un parasite hétéroxène à deux hôtes : un hôte invertébré représenté par la tique I.
ricinus et un hôte vertébré, principalement le Bovin.
Chez ces deux hôtes, le cycle évolutif de B. divergens se déroule en plusieurs phases :
− une phase endo-érythrocytaire chez le bovin qui correspond à une multiplication asexuée
ou mérogonie ;
− une phase exo-érythrocytaire chez la tique I. ricinus, qui comprend :

− une reproduction sexuée ou gamogonie,

− une sporogonie ou multiplication asexuée.

III.3.1 Hôtes invertébrés

Toutes les Babesia sont transmises par des tiques dures ou Ixodidés et B. divergens est transmise par I.
ricinus. En tant que maladie vectorielle, l’épidémiologie et la lutte contre la babésiose bovine sont
donc intimement liées à la biologie de cette tique, qui a été développée dans la deuxième partie de ce
travail.

III.3.2 Hôtes vertébrés

L’hôte vertébré de prédilection de B. divergens est le Bovin. Le renne y est également sensible (Zintl
et al., 2003). Dans des conditions expérimentales, le parasite peut infester un certain nombre
d’animaux splénectomisés : des chimpanzés et des macaques rhésus (Garnham et Bray, 1959), des
mouflons et des daims (Zintl et al., 2003), des rats (Philipps, 1984), des moutons (Chauvin et al.,
2002). Le seul animal de laboratoire à y être sensible, qu’il soit splénectomisé ou non, est la Gerbille
de Mongolie (Lewis et William, 1979). Cet animal est donc très utilisé dans les recherches sur ce
parasite. L’homme peut également être infecté après une morsure de tique. Il s’agit d’une maladie rare
en Europe mais très grave et souvent mortelle (40 % de mortalité). Elle touche essentiellement les
sujets immunodéprimés : 80 % des formes cliniques en Europe surviennent chez des individus
splénectomisés (Maslin et al., 2004).

B. divergens semble avoir une gamme d’hôte plus large in vitro. Ainsi le parasite peut être maintenu
en culture sur hématies de bovin, d’homme, de rat (Zintl et al., 2003) et de mouton (Chauvin et al.,
2002).
Les érythrocytes ne se multiplient pas, on ne peut donc entretenir Babesia en cultures cellulaires qu’en
renouvelant fréquemment les érythrocytes (Morel, 2000).

III.4. Cycle asexué chez le bovin

Le bovin est un hôte intermédiaire car il est le siège d’une multiplication uniquement asexuée. La
forme infectante de B. divergens pour les érythrocytes du bovin est le sporozoïte, injecté par
l’intermédiaire de la salive de la tique lors du repas sanguin. L’efficacité de l’infection par les Babesia
dépend directement de la durée d’attachement de la tique au bovin. Si le repas d’une tique
contaminante n’est pas interrompu et conduit jusqu’à son terme, le taux d’infection est proche de 100

37
%. L’émission des sporozoïtes infectants se fait à la fin du repas et la transmission du parasite est
facilitée par les propriétés anti-inflammatoires et immuno-suppressives de la salive (Maslin et al.,
2004).

Les étapes de l’invasion de l’hématie et la structure générale des Apicomplexes ont surtout été décrites
pour le genre Plasmodium sur les érythrocytes humains. Les résultats de ces recherches peuvent être
extrapolés aux Babesia, avec quelques variations spécifiques à ce genre.
Les Apicomplexes possèdent des structures cellulaires spécialisées permettant la pénétration dans les
érythrocytes : un complexe apical localisé au pôle antérieur qui comprend un anneau polaire, un
conoïde, des rhoptries, des micronèmes et des granules denses (Cheng, 1986). Chez Babesia,
contrairement à Plasmodium, les granules denses sont remplacés par les corps sphériques de plus
grande taille. Un à quatre corps sphériques sont généralement observés chez Babesia bovis (Dowling
et al., 1996). B. divergens, comme Babesia bigemina, ne possède pas de conoïde (Mehlhorn et Schein,
1984 ; Mehlhorn, 1988).
Le sporozoïte adhère à la membrane érythrocytaire de manière aléatoire, puis s’oriente afin de
présenter son complexe apical antérieur perpendiculairement à la surface de l’hématie. Une jonction se
crée entre la membrane de la cellule-hôte et celle du parasite, permettant leur fusion et une adhésion
irréversible. Il y a libération du contenu des micronèmes et des rhoptries au contact du globule rouge,
ce qui a pour effet la pénétration active dans l’hématie et la formation d’une vacuole parasitophore par
invagination de la membrane érythrocytaire, à la manière du processus d’endocytose (Rudzinska,
1981). Enfin, les corps sphériques libèrent leur contenu après la fermeture de la vacuole parasitophore
(Preiser et al., 2000).

Après l’internalisation, les organites spécialisés de la forme infectante disparaissent, l’espace entre la
vacuole et le parasite diminue. Finalement chez Babesia, la membrane parasitophore disparaît à son
tour pour laisser le sporozoïte directement en contact avec le cytoplasme érythrocytaire. Pendant toute
la phase endo-érythrocytaire, Babesia n’est donc entourée que d’une seule membrane plasmique,
contrairement à Plasmodium qui est entouré par deux membranes, la vacuole parasitophore persistant
chez ce parasite (Rudzinska, 1981 ; Yokoyama et al., 2006).

Le sporozoïte grossit et prend une forme arrondie, dite en anneau, appelée trophozoïte. Au cours d’une
période de maturation, ce dernier acquiert de nouveaux organites spécialisés qui persisteront au stade
suivant (Rudzinska, 1981). Du trophozoïte mature bourgeonnent deux parasites-fils par scission
binaire (division longitudinale) : les mérozoïtes. Il s’agit de la mérogonie, ou multiplication asexuée,
au cours de laquelle le matériel parasitaire de la cellule-mère est dupliqué puis transmis à chaque
parasite-fils : chaque mérozoïte possède son propre complexe apical (Mehlhorn, 1988 ; Mackenstedt et
al., 1990).
C’est au moment de cette division que l’on peut observer dans les hématies les formes géminées
piriformes caractéristiques de B. divergens (figure 8), les deux mérozoïtes divergeant l’un par rapport
à l’autre, ce qui a donné son nom au parasite.

L’observation des mérozoïtes dans les hématies fait partie des méthodes de diagnostic de la babésiose.
Le parasite est observé au microscope (grossissement x 1000) après étalement de sang et coloration au

38
May-Grünwald-Giemsa. La coloration de Giemsa met parfois en évidence des tâches de Maurer dans
les hématies parasitées. Le parasite est polymorphe en raison de la présence de différents stades
évolutifs. Chez les bovins, les formes annulaires prédominent sur les formes en poire (65 et 31 %
respectivement). Les formes géminées occupent dans l’hématie une position périphérique, et parfois
même marginale ; dans ce cas, l’angle obtus formé par les éléments géminés couvre le globule à la
façon d’un accent circonflexe (Euzéby, 1990). Leur longueur est inférieure au rayon de l’hématie (1 x
1,5 µm) et ils apparaissent bleutés avec la coloration (L’Hostis, 1997).

Chez les hôtes expérimentaux, le parasite prend des aspects différents de ceux décrits chez le bovin :
chez la gerbille, B. divergens occupe une position centrale, les éléments géminés piriformes sont
moins abondants et plus larges, et les formes bourgeonnantes plus nombreuses, parfois en tétrade
(Euzéby, 1990). De même, chez les primates infestés, les parasites en situation marginale dans les
hématies sont rares (Garnham et Bray, 1959).

Les interactions spécifiques hôte-parasite expliquant ces modifications morphologiques ne sont pas
connues mais font probablement intervenir le système immunitaire, la taille des hématies et la
disponibilité en nutriments (Zintl et al., 2003).

1-Trophozoïte ; 2-Mérozoïte en cours de division ; 3-Forme géminée (deux mérozoïtes haploïdes).

Figure 8 : B. divergens en culture in vitro sur hématies de Mouton
(Photo : A. Chauvin)

Le mécanisme de sortie de l’hématie n’est pas bien connu. Le complexe apical semble parfois jouer un
rôle (enzymes sécrétées par les rhoptries) dans la lyse de la membrane érythrocytaire. Cependant, les
lésions les plus importantes causées à la membrane plasmique de l’hématie paraissent être l’œuvre du

39
pôle postérieur de Babesia, au niveau duquel on trouve une structure cellulaire « enroulée » (coiled
organelle) (Rudzinska, 1981).

Après éclatement de l’hématie, les mérozoïtes vont poursuivre leur développement : chaque élément
géminé pénètre dans un nouvel érythrocyte. Deux mérozoïtes peuvent infecter en même temps une
même hématie (Mackenstedt et al., 1990). Le processus d’invasion est identique à celui des
sporozoïtes. En effet, les mérozoïtes comme les sporozoïtes possèdent les organites cellulaires
nécessaires à l’invasion des érythrocytes que nous avons précédemment décrits. D’autres organites
sont présents au sein du cytoplasme : de nombreux ribosomes, un réticulum endoplasmique granuleux
bien développé, une à deux mitochondries, ainsi qu’un noyau entouré d’une double membrane percée
de pores (Mehlhorn, 1988). Le cytoplasme contient également un plasmide, morceau d’ADN
circulaire, vestige d’une endosymbiose secondaire avec une algue verte (Kohler et al., 1997). Il est
entouré d’une membrane plasmique trilaminaire (Mehlhorn, 1988).

L’organisation cellulaire générale d’un mérozoïte est schématisée dans la figure 9.

Les mérozoïtes ayant pénétré les hématies vont à nouveau se diviser chacun en deux mérozoïtes-fils et
le cycle d’infestation des érythrocytes recommence.

Cette multiplication rapide, aboutissant à la lyse de nombreuses hématies, est responsable des signes
cliniques de la babésiose bovine : hémolyse extravasculaire, splénique, et hémolyse intravasculaire
responsable d’une hémoglobinémie puis de l’hémoglobinurie et de la bilirubinurie observées. On a
donc un syndrome fébrile puis un syndrome hémolytique, associés ou non à des signes digestifs de
type diarrhée, une atteinte cardio-respiratoire, une anorexie et une apathie (Bourdoiseau et L’Hostis,
1995).

Une partie des trophozoïtes ne se duplique pas mais grossit à l’intérieur de l’hématie sans entraîner
d’hémolyse : il s’agit des stades sexués ou gamétocytes. Au cours du repas sanguin pris par la tique,
seules ces formes sexuées évolueront et poursuivront leur développement dans le vecteur.

40
Figure 9 : Structure générale d’un Apicomplexe au stade mérozoïte
d’après Preiser et al. (2000)

41
 III.5. Cycle sexué chez I. ricinus

Le déroulement du cycle chez la tique a surtout été étudié chez Babesia microti. Ce parasite,
initialement classé parmi les Babesia, a finalement été reconnu comme appartenant au genre Theileria.
L’extrapolation à B. divergens des résultats obtenus sur B. microti doit donc être interprétée avec une
certaine réserve, mais reste possible étant donné la similitude entre les deux genres. Le cycle de B.
divergens est schématisé dans la figure 10.

III.5.1 Reproduction sexuée dans l’intestin de la tique

L’existence d’une reproduction sexuée chez B. divergens a longtemps été controversée. Outre des
clichés en microscopie électronique, une des premières preuves d’un cycle sexué chez ce parasite a été
apportée en 1990 par le biais de mesures et comparaison des quantités d’ADN de différents stades de
B. divergens dans l’intestin, l’hémolymphe et les glandes salivaires d’I. ricinus (Mackenstedt et al.,
1990).
Lors de son repas sanguin sur un bovin parasité, la tique femelle adulte ingère des hématies contenant
des gamétocytes. Toutes les autres formes asexuées absorbées (mérozoïtes, trophozoïtes) sont détruites
au cours de la digestion et notamment par l’action lytique de la salive. Ainsi, seuls les gamétocytes
contenus dans des érythrocytes intacts sont infectants pour la tique (Rudzinska et al., 1984 ; Young et
Morzaria, 1986 ; Morel, 2000).

Dans la lumière intestinale de la tique, les gamétocytes vont subir des modifications cytoplasmiques à
l’intérieur des hématies : leur taille augmente et de nouveaux organites cellulaires se développent,
notamment des microtubules et un cytostome. La maturation des gamétocytes et leur transformation en
gamètes se poursuivent avec la mise en place d’une structure en forme de pointe de flèche (arrowhead)
et le développement de protrusions cytoplasmiques (rays). Ce stade est également appelé corps étoilé
(ray body) et avait été observé par Koch en 1906 qui lui avait alors donné le nom de Strahlenkörper
(Mehlhorn et Schein, 1984 ; Young et Morzaria, 1986).
Pendant cette transformation, il y a lyse des hématies et les gamètes se retrouvent libres dans la
lumière intestinale.

Les gamètes s’accolent deux par deux, puis on observe la fusion de leurs membranes plasmiques, la
migration et la fusion des deux noyaux pour donner un zygote. Lors de l’adhésion, le cytoplasme d’un
des deux corps étoilés apparaît souvent plus dense que celui de l’autre, laissant ainsi supposer
l’existence d’un gamète mâle et d’un gamète femelle.

Le zygote ovoïde se différencie ensuite en ookinète mobile, de forme allongée. Les modalités de
passage du zygote, de la lumière intestinale vers les cellules épithéliales, et de la sortie de l’ookinète
hors de l’épithélium intestinal sont mal connues. Chez certains parasites (B. bigemina, Theileria
annulata et B. microti) le processus de différenciation en ookinète se déroulerait dans les cellules
intestinales de la tique. Il fait intervenir une vacuole interne et la création de nouvelles membranes
plasmiques (Mehlhorn et Schein, 1984 ; Gough et al., 1998). Chez B. microti, seuls les parasites au
stade zygote équipés d’une structure en pointe de flèche peuvent traverser la membrane péritrophique
d’I. dammini (matrice chitinisée semi-perméable recouvrant l’épithélium intestinal) et pénétrer dans

42
les cellules épithéliales par vacuolisation de la membrane plasmique de la cellule-hôte, où ils se
transforment en ookinètes (Rudzinska et al., 1983 et 1984). Cette structure en pointe de flèche chez le
zygote de B. microti n’est décrite chez aucune autre Babesia à ce stade. D’après d’autres auteurs, chez
B. bigemina et B. bovis, la transformation en ookinète se déroulerait dans la lumière intestinale puis ce
dernier migrerait dans les cellules épithéliales (Young et Morzaria, 1986).
A l’intérieur des cellules épithéliales de l’intestin, une première phase de multiplication asexuée du
parasite aboutit ensuite à la formation de sporokinètes (Young et Morzaria, 1986).

III.5.2 Développement dans différents organes internes de la

tique

Les sporokinètes quittent l’épithélium intestinal et gagnent de nombreux tissus via l’hémolymphe,
principalement les fibres musculaires, l’épiderme, les hémocytes, les cellules des tubes de Malpighi,
les glandes salivaires et les ovaires. Ces différents tissus et cellules sont le siège d’une multiplication
asexuée ou sporogonie qui aboutit à la formation de nombreux nouveaux sporokinètes (Young et
Morzaria, 1986 ; Zintl et al., 2003).

Le processus de sporogonie peut être subdivisé en trois étapes principales :

− les sporokinètes pénètrent dans les cellules sans former de vacuole parasitophore. A l’intérieur
du cytoplasme, ils perdent les caractéristiques cytoplasmiques du stade mobile (sporokinète),
leur noyau grossit et devient lobulé ;

− chaque kinète subit ensuite des remaniements cellulaires (protrusions cytoplasmiques, division
du cytoplasme et du noyau, invagination de la membrane plasmique) en de nombreux
cytomères également appelés « fission body » ;

− les cytomères se différencient en nouveaux sporokinètes (Mehlhorn et Schein, 1984).

Deux ou trois cycles de sporogonie se produisent, aboutissant à la formation de très nombreux

sporokinètes (Zintl et al., 2003). Ces derniers vont poursuivre leur développement en sporozoïtes
uniquement dans les glandes salivaires. Les sporokinètes produits dans les autres tissus ne vont pas se
transformer en sporozoïtes et ne sont pas transmis aux hôtes vertébrés (Young et Morzaria, 1986).

La multiplication des sporokinètes dans les ovaires de la femelle gorgée et l’invasion des œufs en
développement aboutit à l’éclosion de larves infectées. Cette contamination ovarienne après un repas
sanguin sur un hôte infecté explique la transmission transovarienne de la femelle gorgée aux larves
(Joyner et al., 1963 ; Friedhoff et Smith, 1981 ; Zintl et al., 2003).

43
 Figure 10 : Cycle de Babesia divergens chez ses deux hôtes
d’après Mehlhorn et Walldorf (1988)

44
 III.5.3 Développement dans les glandes salivaires de la tique

Les sporokinètes, situés dans les cellules des glandes salivaires, vont se différencier en sporontes, puis
acquérir les organites cellulaires caractéristiques des formes infectantes, les sporozoïtes. La formation
des sporozoïtes peut être divisée en trois étapes.

La différentiation en sporontes (également appelés sporoblastes par certains auteurs) se caractérise par
une augmentation de la taille du noyau et des cellules-hôtes. Le sporonte est une grande cellule
polymorphe, à noyau lobulé et contenant de nombreuses mitochondries.

L’étape suivante ne débute qu’une fois la tique fixée sur un hôte vertébré. Les organites spécialisés des
futurs sporozoïtes (micronèmes et rhoptries) sont synthétisés dans les sporontes et s’organisent. De
multiples protrusions, contenant chacune un complexe apical, un anneau polaire, des mitochondries et
un fragment de nucléoplasme, se développent à partir des sporontes.

Finalement, les sporozoïtes, en forme caractéristique de poire, sont émis par bourgeonnement. Jusqu’à
10 000 sporozoïtes peuvent être produits au sein d’une seule alvéole salivaire (Rudzinska, 1981 ;
Karakashian et al., 1983 ; Mehlhorn et Schein, 1984 ; Homer et al., 2000).

Ces sporozoïtes vont être transmis au vertébré lors du repas de la tique par l’intermédiaire de la salive.
Plusieurs milliers de sporozoïtes sont déposés dans le derme lors de la morsure et ce uniquement
pendant les dernières heures du gorgement. En effet, il faut 5 jours à partir du début du gorgement de
la femelle adulte pour que les premiers sporozoïtes soient émis chez B. microti (Young et Morzaria,
1986), 4 jours pour Babesia gibsoni chez des larves de Rhipicephalus sanguineus (Higuchi et al.,
1995) et pour Babesia ovata chez des nymphes d’Haemaphysalis longicornis (Higuchi et al., 1994).

III.5.4 Durées des différentes étapes du cycle de

développement de Babesia chez le vecteur

Les durées de développement de plusieurs espèces de Babesia chez leurs vecteurs respectifs maintenus
à 28 °C sont présentées dans le tableau 3.

L’étude du développement de B. microti dans les caeca de larves d’I. dammini permet de préciser les
durées de certaines phases du cycle parasitaire : les premiers parasites intacts à l’intérieur
d’érythrocytes également intacts sont retrouvés dans l’intestin du vecteur 10 heures après la fixation
des larves sur hamsters.

Le premier organite visible en microscopie électronique est le cytostome, puis apparaissent les
microtubules et les protrusions cytoplasmiques (rays ou strahlen) 46 heures post-fixation, la structure
en pointe de flèche (arrowhead) après 58 heures.

Dix minutes après la réplétion, les gamétocytes commencent à former des gamètes, qui fusionnent
14h30 à 18 heures post- réplétion.

Plusieurs jours après la réplétion, les caeca contiennent encore de nombreux parasites qui sont pour la
plupart en voie de dégénérescence, suite à l’action des enzymes digestives. A partir de 12-14 jours
après réplétion, plus aucun parasite n’est visible dans les caeca (Rudzinska et al., 1984).

45
 Il n’est pas facile d’identifier les différentes séquences du développement des Babesia dans les
intestins de leurs vecteurs, et les relations que ces formes peuvent avoir entre elles, car les parasites
sont ingérés par la tique sur une longue période et ne se développent donc pas de façon synchrone ; on
observe toujours plusieurs stades différents au même moment. Une étude sur le développement in
vitro des stades intestinaux de B. bigemina chez Boophilus microplus a permis de synchroniser le
développement du parasite. Dans cette espèce, les corps étoilés se forment dans les hématies qu’ils
quittent après 4 heures d’incubation. Ils commencent à adhérer entre eux après 5,5 heures
d’incubation. La fusion des membranes est observée après 6,5-7 heures d’incubation (Gough et al.,
1998).

Chez T. equi, l’invasion des glandes salivaires de trois espèces de tiques vectrices (Hyalomma
anatolicum anatolicum, H. a. excavatum et Rhipicephalus turanicus) est identique. Huit jours après
réplétion des nymphes, les kinètes ont envahi les alvéoles des glandes salivaires et se sont transformés
en sporontes. Chez les adultes issus de ces nymphes, la formation des sporozoïtes est achevée 5 jours
après attachement (Moltmann et al., 1983).

Tableau 3 : Durées des différentes étapes du développement des Babesia chez leurs
vecteurs maintenus à 28 °C, d’après Mehlhorn et Schein (1984)
NB : B. equi est désormais classé parmi les Theileria.

Espèce de Babesia B. bigemina B. bovis B. canis B. caballi B. ovis B. equi

Dermacentor
reticulatus
Boophilus Haemaphysalis Dermacentor Rhipicephalus Hyalomma
Vecteur Boophilus spp.
spp. leachi nitens bursa spp.
Rhipicephalus
sanguineus
Stades des tiques Adultes, Nymphes,
Adultes, larves Adultes Adultes Adultes
étudiés nymphes adultes
Durée d’apparition
des gamètes après 7-19 heures ? 2-3 jours ? ? 1 jour
la réplétion
Durée d’apparition
des premiers
kinètes dans 3 jours 4 jours 6 jours 6 jours 5 jours 2 jours
l’hémolymphe
après la réplétion
Durée de détection
Pas de
des premiers
4 jours 5 jours 2 jours ? 6 jours pénétration
kinètes dans les
dans les œufs
œufs
Durée moyenne de
9 jours
l’attachement à
(nymphes) 2-3 jours 3-5 jours 3-5 jours
l’apparition des 2-3 jours (adultes) ?
16 jours (larves) (adultes) (adultes)
sporozoïtes dans les
(adultes)
glandes salivaires

46
 III.6. Modalités d’infection et de transmission de B.
divergens chez I. ricinus
III.6.1 Acquisition de l’infection

Il a longtemps été admis que, dans le genre Babesia, seule la femelle adulte peut acquérir l’infection
au cours d’un gorgement sur un hôte contaminé (Joyner et al., 1963 ; Donnelly et Peirce, 1975 ; Lewis
et Young, 1980). Les Babesia spécifiques aux rongeurs font exception (B. merionis et B. microti) car
elles sont acquises par gorgement des larves puis transmises par les nymphes (Friedhoff et Smith,
1981 ; Gray et al., 2002).

Plus récemment, une étude in vitro a cependant montré que les larves et les nymphes d’I. ricinus
peuvent également acquérir B. divergens après gorgement sur membrane (Bonnet et al., 2006).

III.6.2 Transmission transovarienne

B. divergens se transmet par voie transovarienne : le parasite acquis par une femelle adulte persiste
dans les œufs puis les larves qui en sont issues (Joyner et al., 1963 ; Donnelly et Peirce, 1975 ; Bonnet
et al., 2006). Ce phénomène est dû à la multiplication des kinètes dans les ovaires de la femelle après
son infection et à la contamination ultérieure des glandes salivaires de la larve. Koch (1905) avait mis
en évidence la présence de B. bigemina dans des œufs de tiques infectées. Cependant, tous les œufs
d’une femelle infectée ne s’infectent pas (Donnelly et Peirce, 1975). En effet, la ponte peut débuter
avant le passage des kinètes dans l’hémolymphe, les premiers œufs ne sont donc pas infectés. Chez B.
microplus, la transmission transovarienne de B. bigemina ne commence pas avant 80 à 96 heures post-
réplétion lorsque 13 à 53 % des œufs ont déjà été déposés (Friedhoff et Smith, 1981).

III.6.3 Transmission transtadiale

B. divergens se transmet par voie transtadiale : le parasite se transmet de la larve à la nymphe (Joyner
et al., 1963), de la nymphe à l’adulte F1 puis de l’adulte F1 à la larve F2 même sans nouvel apport de
parasite (Donnelly et Peirce, 1975 ; Bonnet et al., 2006). La réalisation de PCR sur glandes salivaires
et sur carcasses de tiques sans glandes salivaires (adultes et nymphes) montre que la transmission
transtadiale est due à la persistance du parasite dans les glandes salivaires mais également dans le
corps de la tique après la mue.

III.6.4 Transmission de l’infection à l’hôte vertébré

Tous les stades peuvent transmettre l’infection (Joyner et al., 1963 ; Donnelly et Peirce, 1975). La
multiplication de B. divergens et la présence des formes infectantes ont été détectées par la coloration
de Feulgen dans les glandes salivaires des trois stades (Petrov, 1941) et dans les glandes salivaires de
nymphes et d’adultes par PCR (Bonnet et al., 2006). Une seule tique adulte ou une seule nymphe suffit
à transmettre l’infection au bovin. Par contre, toutes les tiques qui se gorgent sur un bovin infecté ne
s’infectent pas (Donnelly et Peirce, 1975).

Les modalités de la transmission sont représentées dans la figure 11.

47
Figure 11 : Transmission et maintien de Babesia divergens dans les populations d’hôtes
et de vecteurs.

48
Les études réalisées in vitro ou en conditions expérimentales doivent cependant être interprétées en
tenant compte des connaissances de la biologie d’I. ricinus in vivo. En effet, l’infection des tiques
nécessite qu’elles se nourrissent sur un hôte réservoir du parasite. C’est le cas des nymphes et des
adultes qui effectuent leur gorgement sur de grands animaux comme les bovins. Par contre les larves
se nourrissent essentiellement sur des micromammifères qui sont résistants à l’infection. Les bovins
sont plus souvent parasités par les tiques adultes, c’est donc ce stade qui est important dans la
transmission du parasite. De plus, les larves, bien qu’elles soient plus nombreuses que les autres
stades, ont tendance à avoir une distribution très localisée comme nous l’avons vu dans notre
deuxième partie. Elles infectent alors un nombre d’hôtes plus restreint et ont donc un rôle plus limité
dans l’épidémiologie de la babésiose bovine (Bonnet et al., 2006).

III.6.5 Conservation de l’infection chez les tiques

Les transmissions transtadiale et transovarienne permettent une persistance longue de B. divergens

dans la population du vecteur et expliquent qu’à court terme, la présence d’hôtes vertébrés n’est pas
indispensable au maintien du parasite dans la population de tiques (Zintl et al., 2003). Donnelly et
Peirce (1975) ont montré que l’infection pouvait persister jusqu’aux larves de deuxième génération
sans nouvel apport de parasites (tiques entretenues sur hôtes non réceptifs). En conditions naturelles,
l’accomplissement du cycle de développement d’I. ricinus requiert 3 ans en moyenne. L’infection par
B. divergens doit donc persister au sein de la population de tiques pendant au moins 4 ans, même en
l’absence de bovins (Bussiéras et Chermette, 1992 ; Zintl et al., 2003).

49
 III.7. Facteurs de variation de l’infection et de la
transmission

L’infection de la tique se fait lors du gorgement sur un bovin porteur chronique ou en phase de
parasitémie. Des parasitémies élevées (supérieures à 1 %) chez les bovins peuvent entraîner des
lésions sévères de l’épithélium digestif et la mort de la tique infectée ou des lésions de l’ovaire
réduisant de façon importante la ponte. C’est donc en présence de parasitémies moyennes que se
réalisent principalement les infections (Friedhoff et Smith, 1981 ; Büscher et al., 1988).

L’âge des tiques intervient dans l’évolution de l’infection chez les tiques. En effet, le taux d’infection
de l’hémolymphe par B. ovis chez des tiques infectées non gorgées diminue avec l’âge (Friedhoff et
Smith, 1981). Des observations identiques ont été réalisées par Büscher et al. (1988) qui précisent que
les tiques restent malgré tout infectées toute leur vie. Chez les nymphes infectantes d’I. dammini, la
proportion d’acini infectés par B. microti dans les glandes salivaires diminue également avec le temps
(Piesman et al., 1987). D’autres auteurs observent une perte du pouvoir infectant après 7,5 mois
(Friedhoff et Smith, 1981). Ce phénomène a également été décrit pour Theileria parva chez
Rhipicephalus appendiculatus, qui devient non-infectant 34 à 40 semaines après la mue : les parasites
meurent donc avant leur vecteur (Martin et al., 1964).

La température peut également jouer un rôle dans la transmission de l’infection. Ainsi, des
températures basses peuvent inhiber la transmission transovarienne chez certaines femelles gorgées (B.
bigemina chez B. microplus à 20 °C). Des températures trop élevées inhibent voire éliminent parfois
l’infection (B. merionis chez Hyalomma excavatum à 35 °C).

La température stimule le développement des sporozoïtes de B. bovis dans les glandes salivaires de B.
microplus : à 37 °C, ils sont produits en 1 à 3 jours ; à 30 °C en 3 à 5 jours (Friedhoff et smith, 1981).

L’humidité ne semble pas avoir d’influence sur le développement de Babesia, tant que celui de la
tique n’est pas modifié (Friedhoff et Smith, 1981).

50
Comparée aux espèces tropicales et subtropicales de Babesia sp. et à B. microti, principale
responsable des cas de babésiose humaine dans le monde, B. divergens est un hémoparasite membre
des Apicomplexes peu étudié. De nombreuses questions relatives à sa biologie ou à la réponse de
l’hôte à son infection restent sans réponse. Ainsi, le processus d’invasion ou de sortie des cellules
hôtes, le cycle biologique dans le vecteur, les besoins métaboliques du parasite, les mécanismes
immunitaires de l’hôte vertébré sont peu connus. L’acquisition de connaissances dans ces domaines
permettrait de mieux connaître le parasite et donc d’améliorer les possibilités de traitement ou d’aider
les études en cours sur la vaccination. En épidémiologie, peu de données sont disponibles sur la
transmission de B. divergens, sur les relations vecteur-parasite et notamment sur l’incidence des
infections par Babesia sp. dans des populations de tiques.

51
 IV. TRANSMISSION DE BABESIA PAR SON
VECTEUR : ETAT DES CONNAISSANCES SUR LA
PREVALENCE DE PORTAGE DE BABESIA CHEZ I.
RICINUS

L’étude des relations entre le parasite et son vecteur est indispensable aux recherches sur les maladies
vectorielles. La connaissance de la prévalence du parasite chez les tiques permet d’apporter des
informations sur les modalités de sa transmission au sein d’une population de tiques. Elle informe
également sur le risque de contamination en cas de morsure de tique.
Cette prévalence a été étudiée par différentes méthodes expérimentales pour différentes espèces de
Babesia transmises par I. ricinus.

IV.1. Techniques de collecte des tiques

Les études de prévalence d’un parasite chez son vecteur nécessitent la collecte de ce dernier. Les
périodes de collecte tiennent compte de l’activité saisonnière des tiques et se font généralement au
printemps et à l’automne (Skotarczak et al., 2002).

IV.1.1 Recherche de tiques sur les animaux

Les tiques peuvent être récupérées gorgées, entièrement ou partiellement, sur leurs hôtes vertébrés :
micromammifères, bovins, hôtes expérimentaux après gorgement en laboratoire (Petrov, 1941). Cette
technique est longue, minutieuse, surtout pour la collecte des larves, requiert la capture des hôtes
(piégeage des micromammifères) et une contention appropriée des animaux (bovins maintenus en salle
de traite, anesthésie des micromammifères par exemple) (Hillyard, 1996). Dans ce cas, l’optimisation
de la récolte est permise par la connaissance des zones d’attachement privilégiées de chaque espèce de
tique sur son hôte, zones qui ont été décrites pour I. ricinus dans la deuxième partie de cette étude.

IV.1.2 Capture des tiques dans l’environnement

a) La méthode du drapeau
Les tiques non-gorgées sont collectées dans l’environnement par la méthode dite du drapeau
(Macleod, 1932 ; Aeschlimann, 1972). Les tiques à l’affût dans l’environnement sont attirées à la fois
par le mouvement et par le dioxyde de carbone émis par les hôtes potentiels. Cette méthode simule le
passage d’un animal, active ainsi les tiques et permet la collecte des trois stades d’I. ricinus. Elle est
réservée à la collecte des tiques exophiles.
Cette technique consiste à traîner lentement un drapeau en tissu sur la végétation et à récupérer à
intervalles réguliers les tiques qui y sont fixées. Le tissu utilisé doit être clair, les tiques fixées étant
ainsi plus facilement visibles et récoltées, et de texture molletonnée, afin de faciliter la fixation des
tiques. Les dimensions des drapeaux sont variables. Les plus grands (2m x 1m par exemple) sont lestés
avec des baguettes de bois puis traînés sur le sol derrière l’expérimentateur. Les plus petits sont
montés sur baguettes de bois et permettent des captures le long des haies, sur le bord des pâtures ou

52
sur terrain accidenté (Ginsberg et Ewing, 1989 ; Hillyard, 1996). Cette technique est fortement
dépendante des conditions climatiques : les drapeaux sont bien moins efficaces quand ils sont mouillés
et le vent peut considérablement gêner la capture (temps de contact du drapeau avec le sol diminué,
chute des tiques déjà accrochées) (Spickett et al., 1991).
L’objectif étant de ramasser une quantité maximale de tiques, les captures se font dans des régions ou
des biotopes favorables à leur développement : forêts, pâtures en jachère (Skotarczak et Cichocka,
2001 ; Sinski et al., 2006).
b) Les pièges à dioxyde de carbone
Une autre méthode de capture des tiques non gorgées dans l’environnement consiste en l’utilisation de
pièges à dioxyde de carbone. Cette technique permet d’attirer les tiques en simulant la présence d’un
hôte en dégageant du CO2 à partir d’une source de dégagement (carboglace ou bouteille de gaz
carbonique). On associe un piège à cet attractif pour retenir les tiques : eau ou papier collant, et parfois
des phéromones d’attraction (Hillyard, 1996). Ces pièges ont un périmètre d’action limité : la plupart
des tiques situées à plus de 0,5 m du piège ne sont pas attirées (Gray, 1985). Ils sont utilisés pour la
capture des tiques endophiles et des adultes exophiles. Cette technique est également limitée par les
conditions climatiques.

IV.2. Conservation des tiques

Les tiques peuvent ensuite être conservées en attendant des analyses ultérieures :
− vivantes dans des récipients permettant le maintien d’une humidité adéquate : flacon avec du
coton humide ou quelques brins d’herbe (Gern et Brossard, 1986) ;
− mortes dans l’éthanol à 70 % et à température ambiante (Skotarczak et al., 2002 ; Stanczak et
al., 2004), congelées à – 20 °C (Hartelt et al., 2004) ou à – 60°C (Rudolf et al., 2005).

IV.3. Techniques de mise en évidence des parasites

IV.3.1 Colorations

Les colorations correspondent aux techniques les plus anciennes. La coloration de May-Grünwald-
Giemsa est appliquée sur frottis d’organes de tiques femelles adultes gorgées et associée à l’utilisation
du test d’hémolymphe selon Burgdorfer, mis au point pour la détection des Rickettsies chez les tiques
en 1970. Les frottis sont ensuite observés au microscope à objectif à immersion et les différents stades
du parasite sont mis en évidence chez les tiques (Gern et Brossard, 1986).

La coloration de Feulgen (mise en évidence de l’ADN) sur coupes histologiques de tiques, suivie
d’une observation au microscope, permet de détecter le parasite dans différents organes de tiques
gorgées ou non, notamment les sporozoïtes dans les glandes salivaires (Petrov, 1941 et 1948).

Ces techniques ne permettent cependant pas de différencier les unes des autres les espèces de Babesia.
De plus, elles sont longues, fastidieuses et peu adaptées aux études de prévalence à grande échelle.

Les résultats des prévalences obtenus dans le cadre d’études réalisées grâce à ces techniques de
diagnostic sont présentés dans le tableau 4.

53
 IV.3.2 Amplification de l’ADN par PCR

L’utilisation récente du génie moléculaire a permis de diminuer nettement le temps et la difficulté des
manipulations mais également d’augmenter la spécificité grâce à l’utilisation d’amorces spécifiques
d’espèces. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) amplifie spécifiquement un fragment
d’ADN choisi et permet ainsi la détection des parasites. Toutes les études réalisées à ce jour sur
l’estimation de la prévalence des Babesia chez les tiques sont effectuées sur tiques entières non
gorgées et concernent suivant les cas un ou plusieurs des stades d’I. ricinus.

La préparation des échantillons pour les PCR passe tout d’abord par une étape d’extraction de l’ADN
des tiques entières. Cette extraction est parfois problématique : les tiques possèdent un exosquelette
chitinisé très solide qu’il faut détruire avant extraction. L’ADN extrait des tiques semble être très
sensible à la dégradation. De plus, la présence d’inhibiteurs de Taq-polymérase est soupçonnée chez
les tiques gorgées ou non. Ces difficultés peuvent avoir un impact sur les prévalences déterminées
dans plusieurs études (Halos et al., 2004).

Deux techniques principales d’extraction sont utilisées, sur échantillons individuels (tiques analysées
une à une) ou sur pools d’individus (les nymphes et les larves sont parfois analysées en pools) :

− lyse des tiques à l’aide d’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) (Guy et Stanek, 1991 ;
Skotarczak et Cichocka, 2001 ; Skotarczak et al., 2002 ; Stanczak et al., 2004) ;

− broyage mécanique (au mortier, pilon ou broyeur à billes), avec parfois digestion par la
protéinase K (Halos et al., 2004), puis extraction de l’ADN à l’aide de kits d’extraction
commercialisés (laboratoires Qiagen ou Biorad) (Duh et al., 2001 ; Hartel et al., 2004 ; Halos
et al., 2005 ; Rudolf et al., 2005).

Un certain nombre d’amorces ont été utilisées pour détecter les parasites par PCR chez I. ricinus. La
plupart permettent l’amplification d’un fragment du gène codant pour l’ARN 18S (petite sous-unité
ribosomale) de B. sp. ou de B. microti d’après la technique mise au point par Persing et al. (1992)
(Duh et al., 2001 ; Skotarczak et Cichoka, 2001 ; Kuzna-Grygiel et al., 2002 ; Skotarczak et al., 2002 ;
Hartelt et al., 2004 ; Stanczak et al., 2004 ; Halos et al., 2005 ; Rudolf et al., 2005 ; Pieniazek et al.,
2006 ; Sinski et al., 2006).

Dans certaines études, la validation de l’extraction d’ADN est réalisée par une amplification de l’ADN
d’I. ricinus. Les amorces utilisées amplifient un fragment du gène codant pour l’ARN 16S
mitochondrial (Black et Piesman, 1994 ; Halos et al., 2005).

Les résultats de ces différentes études sont reportés dans le tableau ci dessous (tableau 4). Les
prévalences obtenues chez les femelles adultes non gorgées sont présentées en gras car elles pourront
être comparées avec les résultats de notre étude.

54
Tableau 4 : Prévalences et méthodes de détection de différentes Babesia chez I. ricinus :
revue de la littérature
Pâture + : pâture sur laquelle les bovins présentent de fréquents cas cliniques annuels de babésiose (10-40 %) ;
Pâture +/- : pâture avec peu de cas cliniques de babésiose (2 cas par an en moyenne) ; Pâture - : pâture sans cas
clinique de babésiose.

Nombre de tiques
Espèces de Stades Techniques détectées positives / Prévalence
Vecteur Sources
Babesia étudiés utilisées nombre de tiques (%)
éprouvées
Adultes
(mâles et Total : 276 / 461 59,9 %
Réaction de Feulgen Kuzna-
femelles)
sur glandes Nymphes : 241 / 412 58,5 % Grygiel et
et
salivaires al., 2002
nymphes Adultes : 35 / 49 71,4 %
non gorgés
31 / 3113 1%
Nymphes PCR sur tiques
Hartelt et
et adultes entières puis
28 / 31 B. divergens 0,89 % al., 2004
non gorgés séquençage
3 / 31 B. microti 0,1 %
Babesia sp. I. ricinus
Nymphes Total : 19 / 92 20,6 %
et adultes Nymphes : 9 / 74 12 %
PCR sur tiques Halos et
(mâles et
entières Mâles : 4 / 9 44 % al., 2005
femelles)
non gorgés Femelles : 6 / 9 67 %
28 / 1328 2,1 %
Tiques PCR sur tiques
Pieniazek
non entières et
26 / 28 B. divergens 1,96 % et al., 2006
gorgées séquençage
2 / 28 B. microti 0,15 %
91 / 355 sur pâture + 25,6 %

Femelles Dissections de tiques Petrov,

1 / 355 sur pâture +/- 1,3 %
gorgées femelles gorgées et 1941
mise en évidence de
Babesiella
I. ricinus sporozoïtes dans les
bovis 0 / 180 sur pâture - 0%
glandes salivaires
Femelles par la coloration de 25 % sur
adultes Feulgen Absence de valeurs pâture + Petrov,
non numériques 0 % sur 1948
gorgées pâture -
Adultes et
PCR sur tiques Duh et al.,
B. microti I. ricinus nymphes 10 / 135 7,4 %
entières 2001
non gorgés
Total : 71 / 533 13,3 %
Adultes
(mâles et Larves : 4 / 19 2,1 % Skotarczak
femelles) PCR sur tiques et
Nymphes : 26 / 234 11,1 %
nymphes entières Cichoka,
et larves Mâles : 19 / 132 14,4 % 2001
non gorgés
Femelles : 22 / 148 14,9 %

55
 Adultes
(mâles et Total : 8 / 461 1,7 %
Kuzna-
femelles) PCR sur tiques
Nymphes : 8 / 412 1,9 % Grygiel et
et entières
al., 2002
nymphes Adultes : 0 / 49 0%
non gorgés
Total : 130 / 2095 6,2 %
Adultes
(mâles et Larves : 12 / 385 3,1 %
femelles) PCR sur tiques Skotarczak
Nymphes : 49 / 1160 4,2 %
nymphes entières et al., 2002
et larves Mâles : 25 / 263 9,5 %
non gorgés
Femelles : 44 / 287 15,3 %
Total : 73 / 716 10,2 %
Adultes
(mâles et Larves : 4 / 128 3,1 % Skotarczak
femelles) PCR sur tiques et
Nymphes : 34 / 439 7,7 %
nymphes entières Sawczuk,
et larves Mâles : 13 / 71 18,3 % 2003
non gorgés
Femelles : 22 / 78 28,8 %

Nymphes Total : 16 / 701 2,3 %

et adultes Nymphes 5 / 398 1,3 %
PCR sur tiques Stanczak
(mâles et
entières Mâles : 6 / 139 4,3 % et al., 2004
femelles)
non gorgés Femelles 5 / 164 3%
Nymphes PCR sur tiques
5 pools positives sur Rudolf et
non entières (pools de 3 1,5 %
70 al., 2005
gorgées et 10 nymphes)
Males et Total : 9 / 1513 0,6 %
femelles
Larves : 0 / 1300 0%
non
PCR sur tiques Sinski et
gorgés, Nymphes : 4 / 50 8%
entières al., 2006
larves et
Mâles : 1 / 71 1%
nymphes
gorgées Femelles : 4 / 92 4%
Test d’hémolymphe
Femelles
selon Burgdorfer et
et Total : 2 / 184 1,1 %
frottis d’organes Gern et
Babesia nymphes
colorés au Giemsa Brossard,
divergens gorgées
pH 7,2. Observation 1986
sur bovin, Femelles : 2 / 146 1,37 %
au microscope
mâles
objectif 50X
Adultes et
B. divergens- PCR sur tiques Duh et al.,
I. ricinus nymphes 3 / 135 2,2 %
like entières 2001
non gorgés
Total : 16 / 533 3%
Adultes
(mâles et Larves : 0 / 19 0% Skotarczak
femelles) PCR sur tiques et
B. divergens Nymphes : 0 sur 19 0%
nymphes entières Cichoka,
et larves Mâles : 6 / 132 4,5 % 2001
non gorgés
Femelles : 10 / 148 6,7 %

56
Parmi toutes les Babesia chez lesquelles des études de prévalence ont été réalisées, B. microti chez I.
ricinus a été la plus étudiée, probablement de part son implication dans les cas de babésiose humaine.
Parmi l’ensemble des Babesia sp. étudiées, seuls des résultats de prévalences chez des tiques entières
généralement non-gorgées sont disponibles. De tels résultats reflètent des prévalences de tiques
infectées mais non de tiques infectantes. La prévalence des tiques infectantes au sein d’une population
de tiques n’a été que très peu étudiée. L’estimation de cette dernière requiert un travail fastidieux de
mise en évidence des parasites dans les glandes salivaires uniquement, ce qui a été l’un des objectifs
de ce mémoire, appliqué à B. divergens chez I. ricinus.

57
 ETUDE PERSONNELLE

58
59
 CADRE GENERAL ET OBJECTIFS

L’étude présentée dans ce mémoire s’inscrit dans le cadre de recherches beaucoup plus vastes menées
sur la babésiose à B. divergens au sein de l’Unité Mixte de Recherches ENVN / INRA « Interaction-
Hôte-Parasite-Milieu » (IHPM) et plus précisément sur l’analyse des relations vecteur-parasite et le
rôle d’I. ricinus dans la transmission de la maladie.

Les prélèvements nécessaires à cette étude ont été effectués dans des élevages de la région Pays de La
Loire, dans laquelle des cas cliniques réguliers de babésiose bovine sont détectés.

L’objectif principal de cette étude a été de déterminer la prévalence de B. divergens dans une
population de tiques femelles adultes I. ricinus non gorgées et collectées dans des élevages présents
dans des zones endémiques de babésiose ; cette prévalence a été déterminée par la recherche de
parasites dans les glandes salivaires des tiques : il s’agit donc de révéler la proportion d’I. ricinus
femelles infectantes dans une population de tiques donnée ;

En préliminaire à cette étude, nous avons déterminé la prévalence de B. divergens chez les bovins des
élevages où les tiques ont été récoltées et analysées afin de vérifier qu’il s’agit bien d’élevages
endémiques de babésiose. Pour cela, le statut sérologique du troupeau vis-à-vis de B. divergens a été
déterminé, le parasite a été recherché dans des prélèvements sanguins par mise en culture afin de
détecter la proportion de bovins présentant une parasitémie à B. divergens, puis les parasites cultivés
ont été typés afin de préciser la ou les souches de B. divergens en présence. Les souches présentes
chez les bovins devaient être comparées à celles présentes chez les tiques récoltées dans le même
élevage.

Notre travail sur le terrain et en laboratoire a consisté en la réalisation expérimentale de la première

partie de cette étude : sélection des élevages, contacts avec les éleveurs, collecte de tiques et
prélèvements sanguins sur les bovins, réalisation des dissections de tiques, des extractions d’ADN et
des amplifications par PCR sur glandes salivaires. Les analyses servant à la seconde partie de cette
étude (sérologies, cultures, mise en évidence de B. divergens dans les cultures positives par PCR et
typage par RFLP) ont été effectuées par le personnel du laboratoire IHPM de l’Ecole Nationale
Vétérinaire de Nantes.

60
61
 MATERIELS ET METHODES

Le but de cette étude est de déterminer la prévalence de B. divergens dans les glandes salivaires de
tiques femelles adultes d’I. ricinus (tiques infectantes). La première étape de notre partie
expérimentale a donc consisté en une collecte de tiques dans des élevages sélectionnés. De plus, dans
chaque élevage, des prélèvements sanguins sur un échantillon d’animaux ont été effectués afin
d’étudier le statut sérologique du troupeau et de déterminer la proportion de bovins infectés par B.
divergens par une mise en culture.

I. CAPTURE DES TIQUES DANS L’ENVIRONNEMENT

I.1. Choix des élevages

Les critères d’inclusion étaient :

− la proximité géographique avec la ville de Nantes, permettant des collectes sur une journée,
avec un temps de transport le moins long possible pour augmenter la période de recherche ;
− la présence de cas cliniques réguliers de babésiose au sein du cheptel ;
− l’existence de bois ou autres biotopes favorables au développement d’I. ricinus proches des
pâtures ou la connaissance de ces élevages comme étant des « élevages à tiques ».

Quatre élevages ont ainsi été retenus pour notre étude : deux élevages ont été recrutés en Ille-et-
Vilaine à partir des données recueillies par H. Haurou-Patou pour sa thèse de doctorat vétérinaire
(Haurou-Patou, 2002). Un troisième élevage, situé dans la Sarthe, a été sélectionnée en fonction des
données recueillies par M. L’Hostis lors de son travail de thèse universitaire (L’Hostis, 1994). Le
dernier élevage, situé à Machecoul en Loire-Atlantique, a été sélectionné grâce aux renseignements du
Dr Cesbron, praticien à la clinique vétérinaire de Machecoul.
Les éleveurs ont tout d’abord été contactés par téléphone, les objectifs de l’étude leur ont été
présentés, les besoins éventuels précisés (contention des animaux, accord pour les prélèvements de
sang, disponibilité des pâtures pour la collecte de tiques).
Après leur accord, un contact téléphonique 2 à 3 jours avant la date de la collecte a permis de fixer
définitivement un rendez-vous. Les éleveurs ne pouvaient être prévenus plus tôt car les jours de
collecte étaient choisis en fonction des conditions météorologiques, qui influencent de façon
importante l’efficacité de la méthode du drapeau, comme nous l’avons vu dans notre étude
bibliographique. La présence des éleveurs n’était requise que le premier jour pour la localisation des
pâtures et le jour des prélèvements sanguins pour assurer la contention des bovins.
Les quatre élevages retenus sont des élevages laitiers de vaches Prim’Holstein et Normande qui
présentent des antécédents de cas cliniques de babésiose et/ou une densité importante de tiques
retrouvées sur les animaux.

Ces élevages seront par la suite identifiés par les lettres A, B, C et D.

Elevage A : Marigne Laillé, Sarthe (72).

62
Elevage B : Mezières sur Couesnon, Ille et Vilaine (35).
Elevage C : Paimpont, Ille et Vilaine (35).
Elevage D : Machecoul, Loire-Atlantique (44).

I.2. Estimation de l’échantillon requis

Pour estimer la population de tiques nécessaire à cette étude, nous considérons qu’une population de
tiques dans un milieu favorable à sa survie est infinie et que la collecte ne modifie ni la taille de la
population ni la prévalence théorique de Babesia. Nous utilisons deux prévalences de référence : une
prévalence de B. divergens obtenue chez des femelles I. ricinus non-gorgées déterminée par PCR sur
tiques entières de 6,7 % (Skotarczak et Cichoka, 2001) ; et une prévalence de B. microti chez des
femelles non-gorgées après PCR sur tiques entières de 3 % (Stanczak et al., 2004). Les études de
prévalence de B. microti chez I. ricinus étant relativement nombreuses, nous avons choisi comme
référence celle présentant la prévalence la plus faible. En se basant sur ces valeurs, la probabilité de
collecter une tique « saine » est respectivement pour B. divergens et B. microti de 0,93 et de 0,97. Si
l’on prend un intervalle de confiance de 95 %, on peut considérer que la probabilité de collecter une
tique saine à chaque prélèvement est obtenue en utilisant la formule : (probabilité de collecter une
tique saine)n ≤ 0,05 ; n représentant la taille de notre échantillon de tiques. Nous obtenons n ≥ 44
tiques avec la prévalence théorique de B. divergens et n ≥ 98 tiques pour la prévalence théorique de B.
microti. Les protocoles de ces études étant différents de celui envisagé pour notre travail (étude sur
glandes salivaires de tiques et non sur tiques entières) et aucune référence bibliographique n’existant
sur les prévalences des tiques infectantes, nous avons choisi de récolter un échantillon de tiques plus
important.
Ainsi, il a été décidé au début de l’étude de collecter environ 250 tiques par élevage dans les 4
élevages sélectionnés. La détection du parasite par PCR sur glandes salivaires a été réalisée au fur et à
mesure des ramassages et le nombre de tiques analysées a par la suite évolué au cours de l’étude en
fonction des résultats obtenus : la prévalence observée étant supérieure à la prévalence théorique, la
taille de l’échantillon a donc été réduite.

I.3. Sélection des lieux de récolte

Les pâtures choisies comme sites de capture ont été déterminées grâce aux indications des éleveurs
(pâtures sur lesquelles les animaux ont beaucoup de tiques, bordées par des bois ou des haies). En
fonction des élevages et de la densité de tiques présentes, la récolte a été effectuée sur deux pâtures
minimum et jusqu’à six pâtures pour certains.
La présence d’I. ricinus dépend du couvert végétal et des hôtes à disposition. Nous avons vu dans la
première partie de ce mémoire que la densité au sein d’un pâturage n’est pas homogène : les tiques
sont essentiellement présentes en périphérie, le long des haies, des bois ou à l’intérieur d’une pâture si
cette dernière contient des îlots de végétation avec des arbres. Les récoltes ont donc été réalisées
principalement en périphérie de pâture.

63
 I.4. Période de capture

I. ricinus n’est pas active tout au long de l’année mais présente une activité généralement bimodale en
France avec un pic d’activité au printemps de mars à juillet et un pic moins prononcé à l’automne. Les
collectes ont donc été effectuées à partir du mois d’avril et jusqu’au début du mois de juillet.

I.5. Conditions climatiques

Les conditions climatiques sont importantes à prendre en compte pour l’efficacité de la collecte.
Comme précédemment évoqué dans la partie bibliographique, la collecte ne se fait pas par temps de
pluie, car le drapeau mouillé empêche une bonne fixation des tiques. Lors de capture le matin, il faut
régulièrement changer de drapeau car la rosée l’humidifie de façon importante.
Le vent peut également avoir un rôle défavorable sur le résultat de la capture, pour les raisons
précédemment citées dans la première partie de l’étude. Cependant, il s’agit d’un facteur non
prédictible pour le choix des dates de récolte.
Il faut aussi tenir compte de la température : au début du printemps, les températures peuvent être
basses, notamment le matin, et la densité de tiques ramassée est alors plus faible.
Des températures trop chaudes, surtout sur une longue période, diminuent la densité de tiques au sein
d’une pâture. Ainsi lors de la seule sortie effectuée au mois de juillet, aucune tique n’a été collectée.
La décision de partir pour une journée de collecte se faisait donc 2-3 jours avant, en fonction des
prévisions météorologiques.

I.6. Technique de récolte des tiques

Nous avons vu dans la première partie de ce mémoire que les tiques du genre I. ricinus présentent au
cours de leur cycle de développement une phase de vie libre au cours de laquelle elles sont présentes
dans l’environnement, et une phase de vie parasitaire correspondant à la fixation sur l’hôte. C’est cette
phase de vie libre qui va nous permettre de les capturer.
Nous avons utilisé la méthode du drapeau décrite par Macleod (1932), qui permet de capturer des
tiques à l’affût par simulation du passage d’un hôte (figure 12).
Deux types de drapeau ont été utilisés :
− un drap de grande taille (130 x 225 cm environ) lesté par des baguettes de bois et traîné
derrière l’expérimentateur. Tous les 10 mètres environ, il est retourné et sa surface est
entièrement examinée pour récupérer les femelles adultes à l’aide d’une pince à épiler. Ce
matériel a été peu utilisé dans notre étude car il est peu pratique en bordure de pâture, sur
terrain accidenté ou le long des haies, le tissu restant très souvent accroché dans la végétation.
L’objectif étant de ramasser le plus grand nombre de tiques nous avons préféré utiliser les
drapeaux plus petits ;
− des draps de dimensions plus réduites (50 x 40 cm ou 50 x 55 cm environ) montés à
l’extrémité d’une baguette de bois de 100 cm de longueur. Ils sont également traînés sur la
végétation et retournés tous les 10 mètres environ pour en retirer les tiques femelles. Les
mâles, les nymphes et les larves n’ont pas été récupérés.

64
Les tiques sont ensuite déposées dans de petites boites en plastique percées de trous et à l’intérieur
desquelles sont disposés quelques brins d’herbe pour assurer une humidité convenable jusqu’au retour
au laboratoire.

A la fin de chaque journée de collecte, les femelles adultes sont ramenées dans l’unité IHPM de
l’ENVN et déposées dans des saturateurs qui permettent de les maintenir en vie jusqu’à l’étape de
dissection.

Figure 12 : Principe de la méthode du drapeau

II. CONSERVATION DES TIQUES

La dissection des tiques est une étape longue et peut se faire, en fonction du nombre de tiques, sur
plusieurs jours. Pendant ce laps de temps, il est nécessaire qu’elles soient maintenues en vie pour en
extraire les glandes salivaires car ces dernières subissent une lyse rapide en cas de mort de la tique.
Après récolte, toutes les tiques sont donc conservées dans l’élevage de l’unité IHPM de l’ENVN, dans
des conditions favorables à leur survie. Les femelles adultes sont comptées puis placées par 20 dans
des boites de culture en plastique avec bouchon perforé à filtre. Ces boites de culture sont disposées
dans des saturateurs (figure 13) contenant du chlorure de magnésium à saturation afin de maintenir
une humidité relative d’environ 80 %, correspondant aux exigences d’I. ricinus. La température de la
pièce est d’environ 23°C en moyenne, mais est soumise aux variations de températures extérieures et
l’installation d’un climatiseur est nécessaire pendant les mois d’été.

65
 Figure 13 : Saturateur contenant les boites de culture où sont conservées les tiques I.
ricinus au laboratoire

III. DISSECTION DES TIQUES ET ISOLEMENT DES

GLANDES SALIVAIRES

Les études de prévalence d’infection des Babesia chez leur vecteur sont de deux types :

− les recherches de parasites sur tiques entières permettent de déterminer le nombre de tiques
infectées au sein d’une population, c’est à dire la prévalence de portage de l’infection chez les
tiques. Il s’agit de la majorité des études de prévalence réalisées.

− les recherches de parasites uniquement dans les glandes salivaires des tiques permettent
d’évaluer le nombre de tiques infectantes dans une population, c’est à dire les tiques
susceptibles de transmettre l’infection aux bovins. Comme nous l’avons vu dans la première
partie de ce mémoire, chez I. ricinus, B. divergens persiste par voie transtadiale dans les
carcasses des tiques et notamment dans les caeca. Seule la détection des pathogènes dans les
glandes salivaires , à partir desquelles ils seront injectés à un nouvel hôte lors d’une piqûre,
permet de différencier les tiques vectrices infectantes des autres.

L’objectif principal de notre étude étant de déterminer le nombre de tiques infectantes dans une
population de tiques, une étape de dissection des tiques et d’isolement des glandes salivaires a donc
été nécessaire.

Ces dissections ont été réalisées selon un protocole mis au point par Sarah Bonnet, chargée de
recherche au sein de l’UMR IHPM de l’Ecole Vétérinaire de Nantes. Elles se font sur tiques vivantes,
sous loupe binoculaire.

Une bande de scotch double-face est collée sur le couvercle d’une boite de Pétri. La tique à disséquer
est déposée sur le scotch, sur le ventre, le capitulum dans la direction opposée à l’opérateur. Pour plus
de stabilité, des lambeaux de colle sont rabattus sur les pattes à l’aide d’une pince fine. Sous la loupe

66
binoculaire, une première coupe transversale est réalisée entre les deux premières paires de pattes à
l’aide d’une lame de scalpel, puis une deuxième coupe longitudinale est faite de la tête à l’extrémité de
l’idiosome.

On dépose alors une goutte de tampon PBS 1X (Phosphate Buffer Saline) stérile sur la tique. A l’aide
de pinces entomologiques à dissection de type Dumond, la cuticule est écartée ce qui permet de
repérer les glandes salivaires. Ces dernières sont extraites en totalité, en évitant de ramener dans les
pinces des fragments de caeca.

Si les prélèvements sont souillés par des fragments de caeca, les glandes sont nettoyées sous loupe
binoculaire dans une cupule contenant du PBS. Elles sont ensuite déposées au fond d’un tube
eppendorf stérile avec le minimum de PBS possible (une goutte), et placées au congélateur à – 80 °C.

Tout le matériel à dissection est nettoyé entre chaque tique avec du DNA off® (Eurobio) qui permet
de détruire toute trace d’ADN, puis rincé avec de l’eau distillée et séché.

IV. MISE EN EVIDENCE DE L’ADN DE B.

DIVERGENS CHEZ I. RICINUS

IV.1. Extraction de l’ADN des glandes salivaires

L’extraction de l’ADN présent dans les glandes salivaires est réalisée à l’aide du kit Proméga,
Wizard® Genomic DNA Purification Kit. Les extractions sont faites individuellement par série de 12
paires de glandes salivaires, issues de tiques provenant d’élevages différents.

La décongélation des échantillons est très rapide et s’effectue pendant la mise en place du matériel.

− Une première étape consiste à lyser les cellules : 150 µL de tampon PBS 1 X et 900 µL de
« Cell Lysis » solution sont ajoutés dans chaque eppendorf contenant une paire de glandes
salivaires. Après mélange au vortex, les tubes sont incubés 10 minutes à température ambiante
(RT), puis centrifugés à 16000 g pendant 1 minute, afin de récupérer les noyaux et d’éliminer
le contenu cytoplasmique. Le surnageant est donc éliminé et cette première étape est
renouvelée une seconde fois. Il est parfois nécessaire de mélanger les tubes à nouveau avant la
centrifugation car les glandes salivaires restent souvent collées aux parois de l’eppendorf.

− L’étape suivante permet de lyser les noyaux pour libérer l’ADN et de détruire les ARN
présents : 300 µL de « Nuclei Lysis » solution et 1,5 µL de Rnase A sont ajoutés, puis
l’ensemble est mélangé légèrement au vortex et mis à incuber à 37°C pendant 15 minutes.

− L’élimination des protéines est réalisée avec 100 µL de « Protein Precipitation » solution, puis
chaque tube est mélangé 15 secondes et centrifugé à 16000 g pendant 3 minutes. Le
surnageant est prélevé et déposé dans un nouvel eppendorf stérile.

− L’ajout d’isopropanol (300 µL) au surnageant permet la précipitation de l’ADN : les tubes
sont retournés doucement pour homogénéiser le mélange, incubés 10 minutes à RT et

67
 centrifugés à 16000 g pendant 15 minutes. Le surnageant est éliminé en renversant le contenu
de chaque tube (sans pipeter).

− L’ADN est ensuite rincé et débarrassé des sels grâce à 300 µL d’éthanol 70 % qui sont ajoutés
sur les culots. Les tubes sont renversés pour optimiser le rinçage, puis centrifugés 2 minutes à
16000 g. Le surnageant est éliminé en renversant doucement le tube et les culots sont séchés
dans l’étuve à 37 °C pendant 30 minutes, les tubes étant placés ouverts et à l’envers dans un
portoir.

− La dernière étape de l’extraction consiste à réhydrater les culots d’ADN avec 50 µL de

« Rehydratation » solution. Ils sont ensuite laissés une nuit à + 4 °C, avant leur utilisation, puis
conservés à + 4 °C.

IV.2. Amplification de l’ADN par réactions de

polymérisation en chaîne (PCR)
Afin de détecter spécifiquement l’ADN de B. divergens éventuellement présent dans l’ADN extrait
des glandes salivaires, des PCR sont réalisées individuellement sur chaque paire de glandes salivaires.
Pour mettre en évidence l’ADN du parasite, des recherches préalables d’amorces adéquates ont été
menées à l’UMR IHPM. L’amorce spécifique de B. divergens étudiée, appelée Bd37, amplifie un
fragment du gène codant pour une protéine de surface des mérozoïtes, la protéine Bd37. Cette amorce
fonctionne bien sur tiques entières. En revanche, et pour une raison inconnue, les essais réalisés au
laboratoire ont montré que l’amorce Bd37 ne s’hybridait pas lors de PCR sur glandes salivaires. Il a
donc été décidé pour cette étude d’utiliser des amorces moins spécifiques mais efficaces sur glandes
salivaires et reconnaissant tous les parasites du genre Babesia et Theileria. Ces amorces, Bab GF2
(GYY TTG TAA TTG GAA TGA TGG) et Bab GR2 (CCA AAG ACT TTG ATT TCT CTC)
permettent d’amplifier un fragment du gène codant pour l’ARN 18S des Babesia et des Theileria. La
taille du produit de PCR attendu est d’environ 550 paires de base (pb). Les résultats obtenus avec ces
amorces doivent donc être interprétés avec précaution car l’ADN détecté peut être celui de B.
divergens mais également de toutes autres Babesia ou Theileria transmises par I. ricinus.

Afin de valider l’extraction d’ADN dans les échantillons, l’ADN d’I. ricinus est mis en évidence par
PCR en utilisant des amorces spécifiques amplifiant une partie du gène codant pour l’ARN 18S d’I.
ricinus. Nous avons utilisé les amorces Ir up 1 (TTG CTG TGG TAT TTT GAC TAT AC) et Ir down
2 (AAT TAT TAC GCT GTT ATC CCT GA) qui amplifient un fragment d’environ 250 pb.

Dans un premier temps, nous avons amplifié conjointement l’ARN 18S de Babesia et l’ARN 18S d’I.
ricinus. Cette amplification a été réalisée sur 45 échantillons de l’élevage A et 19 échantillons de
l’élevage B. La double amplification n’étant pas constante (fréquents résultats positifs pour Babesia
mais négatifs pour I. ricinus), il a été décidé pour la suite des échantillons de réaliser une simple
amplification avec l’amorce Bab.

Avec des quantités d’amorces Ir et Bab équimolaires comme décrit par la suite, le signal obtenu pour
le fragment de 250 pb correspondant à l’ADN d’I. ricinus était faible voir nul. Il a donc été décidé

68
d’utiliser deux fois plus d’amorces Ir que d’amorces Bab pour les échantillons suivants, les quantités
des autres composants n’étant pas modifiées, excepté le volume d’eau pour préparation injectable
(EPPI). Les PCR équimolaires n’ont donc concerné que les 23 premiers échantillons de l’élevage A.

Seuls les échantillons présentant des résultats négatifs vérifiés ont été testés par PCR avec l’amorce Ir
afin de contrôler l’efficacité de l’extraction et d’éliminer ainsi les faux négatifs.

IV.2.1 Réalisation des PCR double amplification

Chaque amplification est réalisée avec 15 µL d’ADN préalablement extrait lors d’une réaction d’un
volume réactionnel final de 30 µL, comprenant 1X de tampon PCR, 4mM de MgCl2, 0,33 mM de
dNTps, 0,5 µM de chaque amorce Bab GF2 et GR2, 0,5 µM de chaque amorce Ir up 1 et down 2, 1,5
U de Taq polymérase et complété avec de l’EPPI.

Pour le témoin négatif, le volume d’échantillon est remplacé par un volume équivalent d’EPPI, pour le
témoin positif B. divergens, par un volume équivalent d’ADN de parasites issus de cultures cellulaires
et pour le témoin positif I. ricinus, par un volume équivalent d’ADN de tique. Les réactions sont alors
réalisées dans les mêmes conditions que précédemment.

Les réactions d’amplification sont ensuite effectuées dans un thermocycleur programmable

(thermocycleur PTC 100, Perkin Elmer) respectant le programme suivant : une étape de dénaturation
de l’ADN de 5 minutes à 94 °C puis 35 cycles d’1 minute à 94 °C (dénaturation de l’ADN) suivi
d’une étape de 30 secondes de 63 °C à 58 °C (hybridation des amorces Bab et Ir) et une minute à 72
°C (élongation des brins). Une étape d’élongation finale de 10 minutes à 72 °C termine le programme.

Les produits de PCR sont ensuite visualisés sur table UV après une migration de 45 minutes à 80 volts
sur gel d’agarose à 1,2 % coloré au bromure d’éthidium ou BET (Eurobio).

IV.2.2 Réalisation des PCR simple amorce Bab

Chaque amplification est réalisée avec 15 µL d’ADN préalablement extrait, dans un volume
réactionnel final de 30 µL. Le mélange pour chaque réaction est constitué de tampon 1X, 4 mM de
MgCl2, 0,33 mM de dNTps, 1,5 U de Taq polymérase, 0,5 µM de chaque amorce Bab GF2 et Bab
GR2, complété par de l’EPPI.

Pour le témoin négatif, le volume de l’échantillon est remplacé par un volume équivalent d’EPPI. Pour
le témoin positif, le volume de l’échantillon est remplacé par un volume équivalent d’ADN de B.
divergens obtenu des cultures cellulaires. La réaction est réalisée dans les mêmes conditions pour les
deux témoins.

L’amplification est réalisée dans un thermocycleur programmable avec le programme suivant : une
étape de dénaturation de l’ADN de 5 minutes à 94 °C puis 35 cycles d’1 minute à 94 °C (dénaturation
de l’ADN double brin), 1 minute à 60 °C (hybridation des amorces), 1 minute 30 à 72 °C (élongation
des brins complémentaires) et une étape d’élongation finale de 10 minutes à 72 °C.

69
 IV.2.3 Réalisation des PCR simple amorce Ir

Le protocole de constitution du mélange est identique à celui des PCR simple amorce Bab décrit ci-
dessus, excepté la concentration des amorces Ir qui est de 1 µM final chacune pour chaque réaction, le
témoin positif qui est composé de 15 µL d’extrait d’ADN d’I. ricinus et la température d’hybridation
des amorces qui est de 58 °C.

IV.3. Analyse des résultats

L’analyse statistique des prévalences est réalisée en utilisant le test du Khi² et le test exact de Fisher.

V. LES PRELEVEMENTS SANGUINS ET LEUR

UTILISATION

Dans les quatre élevages sélectionnés, des prélèvements sanguins sont effectués sur un échantillon
représentatif des bovins de l’élevage et constituent la deuxième étape de ce travail. Ces prélèvements
sont destinés à la réalisation de sérologies anti-B. divergens, afin d’obtenir un profil sérologique des
troupeaux. Ils vont également servir à une mise en évidence directe de B. divergens par mise en
culture des parasites éventuellement présents dans les échantillons de sang. Les cultures positives sont
ensuite contrôlées grâce à une PCR utilisant une amorce spécifique de B. divergens puis typées par
RFLP afin de déterminer la ou les souches de B. divergens présentes dans l’élevage.

V.1. Choix des animaux

Les prises de sang sont réalisées sur un échantillon d’animaux présents à la traite soit un mélange de
primipares et multipares. Le nombre de prélèvements dépend du nombre de vaches présentes à la traite
avec une moyenne d’environ 25 prises de sang.

Elevage A : 26 vaches prélevées ;

Elevage B : 20 vaches prélevées ;

Elevage C : 24 vaches prélevées ;

Elevage D : 26 vaches prélevées.

V.2. Réalisation des prélèvements sanguins

Les vaches étant maintenues au cornadis, les prises de sang sont faites préférentiellement à la veine
jugulaire (aiguilles de 40 mm) ou sous la queue (aiguilles de 25 mm) en fonction des possibilités de
contention et de la disponibilité des éleveurs. Il faut bien veiller à retirer le tube plein avant de retirer
l’aiguille, afin de limiter au maximum la pénétration de germes dans le tube. 10 mL de sang destinés
aux sérologies et aux cultures, sont prélevés par animal, dans des tubes contenant 1,4 mL de CPD
(Citrate Phosphate Dextrose – Sigma C-7165) à rôle anti-coagulant. Chaque tube est identifié avec le

70
numéro de travail de l’animal (numéro à quatre chiffres) et maintenu au frais dans une glacière le jour
du prélèvement puis ramené au laboratoire où il est conservé à + 4 °C jusqu’à son utilisation.

Les tubes sont désinfectés et centrifugés 10 min à 1200 g. Après récupération, les plasmas sont utilisés
pour la réalisation des sérologies, le buffy-coat (couche contenant les leucocytes après centrifugation)
est retiré et les culots d’hématies sont récupérés pour la mise en culture qui mettra éventuellement en
évidence B. divergens.

V.3. Sérologies par Immuno-Fluorescence Indirecte

V.3.1 Obtention des antigènes et préparation des lames
d’antigènes

Les lames d’antigènes sont fabriquées au laboratoire, soit directement à partir de cultures de B.
divergens, soit après inoculation du parasite en culture à la Gerbille de Mongolie et prélèvement de
sang du rongeur lorsque sa parasitémie atteint 20-30 % (vérification du taux de parasitémie par
étalement sanguin et coloration au MGG).

Après prélèvement, le sang de Gerbille est dilué dans du tampon PBS 1 X (1 mL de sang pour 15 mL
de PBS) puis centrifugé, le surnageant est éliminé. Cette opération est renouvelée une seconde fois. Le
culot d’hématies finalement obtenu est dilué de moitié avec du PBS 1 X puis des tests de dilution sont
réalisés afin de déterminer à quelle dilution l’IFI est optimale.

Une fois la dilution adéquate obtenue, l’antigène est déposé sur une lame à antigènes constituée de 18
puits (50 µL par puits). Les lames sont conservées au congélateur à – 80 °C.

V.3.2 Réalisation de l’IFI

Les lames d’antigènes sont décongelées et fixées dans l’acétone 1 à 2 minutes à température ambiante.

Le témoin positif est constitué de sérums de bovins positifs en mélange obtenus lors d’analyses
ultérieures, le témoin négatif avec du sérum bovin négatif.

Les sérums à tester sont dilués avec du tampon PBS 1 X (3 dilutions : 1/80ème, 1/160ème et 1/320ème),
déposés sur les lames (1 goutte par puits) puis incubés 20 minutes à 37 °C en atmosphère humide.
Deux rinçages de 5 minutes en PBS sont suivis d’un séchage à l’air comprimé.

Les complexes antigènes–anticorps sont mis en évidence par l’utilisation de bleu d’Evans
(BioMerieux ® Réf 75491) et d’un conjugué, dilués au 1/100ème dans du PBS. Le conjugué est
constitué d’immunoglobulines anti IgG de bovin associées à l’isotiocianate de fluorescéine (Sigma
anti IgG BV, F-7887).

Les lames sont placées à l’étuve 30 minutes à 37 °C, puis rincées deux fois en PBS pendant 5 minutes.

L’observation se fait au microscope UV entre lame et lamelle après montage en présence de Fluoprep
(glycérine tamponnée et PVA, BioMerieux ® Réf 75521).

71
 V.4. Culture de Babesia
V.4.1 Préparation des hématies de bovin pour la culture de
B. divergens

Après l’étape de centrifugation, le culot obtenu pour chaque prélèvement et contenant les hématies est
lavé avec un milieu de culture iso-osmotique, le RPMI 1640 (BioWhittaker) dans des tubes de
culture : à 3 mL de culot sont ajoutés 10 mL de RPMI, l’ensemble est mélangé puis centrifugé 10
minutes à 1200 g.

Le surnageant et le reste du buffy-coat sont éliminés. Le culot d’hématies restant est dilué au tiers avec
du RPMI 1640 additionné de gentamicine (VWR) à la concentration finale de 50 µg/mL. Cette
solution constitue la solution de base d’hématies utilisée pour les cultures. Elle est répartie en tubes de
15 mL et peut être conservée à + 4 °C pendant un mois maximum.

V.4.2 Culture in vitro de B. divergens sur hématies de bovin

La culture du parasite est réalisée dans des plaques de culture de 24 puits, chaque puits ayant un
volume de 2 mL.

Les parasites sont cultivés dans du milieu RPMI comprenant 50 µg/mL de gentamicine et 0,25 µg/mL
final d’amphotéricine B afin de prévenir respectivement les infections bactériennes et fongiques.

Par puits, sont ajoutés 1,3 mL de ce milieu, 400 µL de sérum de veau fœtal ou SVF (milieu final à 20
% de SVF) et 450 µL de globules rouges au 1/3 en RPMI (solution de base décrite ci-dessus) pour un
milieu final à 7,5 % de globules rouges.

Le milieu est changé tous les 2 jours : les hématies sédimentent au fond des puits donc le surnageant
est enlevé et un nouveau milieu de culture est ajouté (RPMI/Genta/Ampho et SVF à 20 %). Tant que
la parasitémie est inférieure à 5-10 %, il n’est pas nécessaire d’effectuer un repiquage de la culture
avec de nouvelles hématies.

Lorsqu’une culture est positive, le surnageant s’assombrit car la lyse des hématies lors de la
multiplication des mérozoïtes libère de l’hémoglobine. Pour confirmer ce résultat et mettre en
évidence des parasites, ainsi que pour déterminer la parasitémie, 5 µL de culot d’hématies sont
prélevés et étalés sur lame, suivi d’une coloration au May-Grünwald-Giemsa (MGG) et d’une
observation au microscope (objectif à immersion x 100). Cet examen permet une appréciation
quantitative et qualitative de la culture (évaluation de la parasitémie grâce à un tube à dessin).

Si après trois semaines de culture, aucun parasite n’est détecté, on peut considérer que les hématies de
l’animal testé sont indemnes de B. divergens.

Lorsqu’un puits est positif et que la parasitémie excède 5-10 %, il faut effectuer un repiquage : 100 à
200 µL de la culture sont alors dilués dans du milieu neuf additionné de globules rouges de bovin ou
de mouton sains.

72
 V.5. Traitement des cultures positives

Des analyses sont réalisées sur les cultures positives afin :

− de vérifier qu’il s’agit bien de B. divergens par amplification de l’ADN parasitaire avec des
amorces spécifiques de B. divergens, les amorces Bd37 ;

− de typer la souche de B. divergens en effectuant une RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism), c’est à dire une digestion de l’ADN par des enzymes de restriction qui
permettent après migration sur gel de différencier les souches en fonction des profils obtenus.

V.5.1 Confirmation de la présence de B. divergens par PCR

a) Extraction de l’ADN
La mise en évidence de B. divergens par PCR nécessite une étape préparatoire d’extraction d’ADN.
Pour cette extraction, les cultures positives doivent atteindre un niveau de parasitémie de 8 à 10 %.
Une fois ce niveau atteint (contrôle par étalement et coloration au MGG), les parasites sont récupérés
par centrifugation (10 minutes à 1200 g) et le culot d’hématies est remis en suspension dans du PBS
stérile. L’extraction est réalisée avec le kit Promega (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) en
suivant le même protocole que pour l’extraction d’ADN des glandes salivaires. Les extraits sont
ensuite conservés à + 4 °C.
b) Mise en évidence de B. divergens par PCR
Bd37 est une protéine immunodominante de 37 kDa présente à la surface des mérozoïtes de B.
divergens. Un polymorphisme a été mis en évidence avec l’existence de 6 formes alléliques connues et
une 7ème non séquencée (Delbecq et al., 2002 ; Precigout et al., 2004). Les amorces utilisées, Bd37 up
(ATG AAA ACC AGT AAG ATT CTC AAC AC) et Bd37 down (GCC GTA TAG CAA ATC CAT
CAT), permettent d’amplifier un fragment du gène codant pour cette protéine et donc de mettre en
évidence spécifiquement B. divergens. Le produit de PCR obtenu est un fragment d’environ 900 pb.

Les PCR sont réalisées dans un volume réactionnel final de 50 µL avec 10 µL d’extrait d’ADN à
tester. Pour chaque échantillon, le mélange est constitué de tampon PCR 1X, de 4 mM de MgCl2, de
0,33 mM de dNTps (Eurobio), de 0,5 U de Taq polymerase (Eurobio), 0,5 µM de chaque amorce Bd37
up et Bd37 down, et complété avec de l’EPPI. Le témoin négatif est constitué d’EPPI à volume
équivalent à celui des échantillons et le témoin positif d’ADN de B. divergens issue de cultures.

Les tubes sont placés dans un thermocycleur programmable (PTC 100 Perkin Elmer) où sont réalisés
40 cycles d’amplification précédés d’une étape de dénaturation de l’ADN de 10 minutes à 94 °C.
Chaque cycle comporte 1 minute de dénaturation à 94 °C, 1 minute d’hybridation des amorces à 58 °C
et 1 minute d’élongation à 72 °C. Une étape d’élongation finale de 10 minutes à 72 °C termine
l’amplification.

Les produits de PCR obtenus sont visualisés sur table UV après migration par électrophorèse sur gel
d’agarose à 0,8 % contenant du BET.

73
 V.5.2 Typage de souches par RFLP

Afin de mettre en évidence le polymorphisme de B. divergens, les produits issus de la PCR Bd37 sont
digérés par des enzymes de restriction (Rsa I et Bgl II). Ces enzymes vont couper les brins d’ADN au
niveau de sites précis et connus. Les fragments obtenus seront de tailles différentes en fonction des
souches et permettront de les différencier lors d’une migration sur gel d’agarose. Chaque produit issu
de l’amplification par les amorces Bd37 est soumis à l’action de Rsa I puis de Bgl II.

Le volume réactionnel final est de 19,2 µL et contient 10 µL de produit amplifié par PCR Bd37, 15,8
µL d’EPPI, 2,5 µL de tampon Rsa I 10X ou de tampon Bgl II 10X et 0,9 µL d’enzymes Rsa I (1000 U)
ou Bgl II (500 U). Les échantillons sont incubés à 37 °C pendant 3 à 4 heures puis placés à 4 °C pour
arrêter la réaction.

Les différents fragments de restriction sont alors séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %
contenant du BET pendant environ 1 heure à 110 V. Les gels sont ensuite examinés sur une table UV
et les profils comparés.

V.6. Analyse des résultats

Deux techniques d’analyse ont été utilisées dans cette étude afin de mettre en évidence directement ou
indirectement B. divergens dans le sang des bovins, l’IFI et la culture in vitro. Nous avons décidé de
comparer les résultats de ces deux méthodes afin de déterminer leur degré d’accord en utilisant le test
du Kappa.

74
75
 RESULTATS

I. COLLECTES ET DISSECTIONS DES TIQUES,

EXTRACTIONS DE L’ADN DES GLANDES
SALIVAIRES

Les résultats des collectes de tiques femelles, des dissections et des extractions de l’ADN des glandes
salivaires sont présentés dans le tableau ci-dessous (tableau 5).
Tableau 5 : Bilan des collectes d’Ixodes ricinus, des dissections et des extractions d’ADN
réalisées au cours de l’étude.

Nombre de
Nombre Nombre
tiques Nombre de Nombre de
Nombres de de d’extractions
Elevage femelles tiques tiques
visites réalisées parcelles d’ADN
adultes disséquées mortes
de collecte réalisées
collectées
A 277 4 6 256 21 79
B 266 3 2 259 7 67
C 22 2 5 22 0 22
D 45 3 6 37 8 37
Total 610 12 19 574 36 205

Au total, 610 femelles adultes I. ricinus ont été récoltées dans les 4 élevages sélectionnés. Douze
visites ont été nécessaires pour obtenir cet échantillon. La mortalité a été de 6,3 % sur l’ensemble des
tiques depuis la récolte jusqu’à la dissection. 574 tiques ont été disséquées soit 574 paires de glandes
salivaires isolées. 205 extractions d’ADN ont été effectuées à partir des glandes salivaires.

Les élevages A et B sont ceux dans lesquels le plus grand nombre de tiques a été ramassé. Dans ces
deux élevages, la collecte de tiques a été conforme à la taille de l’échantillon attendu. En revanche,
dans les élevages C et D, pourtant décrits comme présentant des cas cliniques réguliers de babésiose et
possédant des pâtures à tiques, les objectifs de départ en matière de taille d’échantillon n’ont pas été
atteints. Il a été décidé de ne pas effectuer de visites supplémentaires dans ces élevages étant donné le
rendement faible en capture de tiques (respectivement 11 et 15 tiques en moyenne par visite) et la
durée de l’étude qui était incompatible avec des sorties nombreuses. Ils ont quand même été pris en
compte dans l’étude.

Le nombre de parcelles visitées a été variable : il dépendait tout d’abord du nombre de parcelles
disponibles, de la répartition géographique de ces parcelles (regroupées ou non) et du rendement de
chacune.

Les tiques vivantes ont toutes été individuellement disséquées pour en extraire les glandes salivaires.
En revanche, toutes les extractions d’ADN n’ont pas été effectuées pour les élevages A et B car les

76
recherches d’ADN parasitaire par PCR ayant été réalisées conjointement à ces extractions, les résultats
obtenus ont fait évoluer la taille de l’échantillon théorique dans le sens d’une diminution du nombre de
PCR nécessaires. Pour les élevages C et D, l’ADN de tous les échantillons a été extrait, étant donné le
nombre réduit de paires de glandes salivaires obtenu.

La mortalité des tiques est un facteur non contrôlable et qui dépend à la fois des conditions de
température et d’humidité lors de la récolte et du transport ou dans le local d’élevage mais également
du temps de dissection donc du nombre de tiques collectées. Ainsi l’élevage A a permis la collecte la
plus importante, mais le temps nécessaire aux dissections a fait qu’il a également été l’élevage avec la
plus importante mortalité. L’élevage C est celui correspondant à la plus faible collecte et toutes les
tiques ont pu être disséquées. Les tiques provenant de l’élevage D ont présenté une mortalité
importante malgré la faible taille de l’échantillon initial.

II. RESULTATS DES PCR SUR GLANDES

SALIVAIRES D’I. RICINUS

Les résultats des PCR sont présentés dans le tableau ci-dessous (tableau 6). Les PCR simple amorce
Bab ainsi que les PCR double amorces Bab/Ir réalisées au début de l’étude sont incluses dans le
tableau. Au total, 199 échantillons ont été testés en PCR utilisant l’amorce Bab. Parmi ces
échantillons, 172 ont été positifs, 25 négatifs et 2 douteux.

La figure 14 représente un exemple du résultat obtenu sur gel d’agarose pour une amplification PCR
utilisant les amorces Bab de l’ADN contenu dans les glandes salivaires d’I. ricinus.

L’interprétation des résultats c’est à dire l’identification des produits amplifiés visualisés sur gels sous
UV a été réalisée par le même examinateur. Un résultat est considéré comme douteux lorsque le signal
émis est très faible ou qu’une contamination d’un puits à un autre est envisagée.

Les échantillons dont la première PCR Bab a fourni un résultat douteux ou négatif ont été contrôlés à
l’aide d’une seconde PCR Bab.

D’autre part, les 25 échantillons négatifs en PCR Bab ont été soumis à une PCR permettant
l’amplification d’un fragment d’ADN d’I. ricinus afin de valider l’extraction d’ADN. 3 échantillons
parmi les 25 se sont révélés négatifs. Ils ne contenaient pas d’ADN de tique et ont donc été exclus des
calculs de prévalence, de même que les échantillons douteux.

Les résultats des PCR détaillés par élevage sont présentés en annexe II.

La prévalence globale caractérisant le nombre d’I. ricinus femelles adultes infectantes dans des zones
endémiques de babésiose bovine sélectionnées au cours de notre étude est donc de 88,6 %. Il s’agit
d’une prévalence de Babesia sp et Theileria sp.

Pour chaque élevage, une prévalence individuelle a été déterminée et ces pourcentages ont été
comparés en utilisant plusieurs tests statistiques.

77
 Tableau 6 : Bilan des amplifications PCR de l’ADN de Babesia et Theileria dans les
glandes salivaires de tiques femelles avec les amorces Bab et des vérifications
d’extraction d’ADN avec les amorces Ir

Elevage A B C D Total
Nombre
d’échantillons 73 67 22 37 199
testés

PCR Bab positives 62 51 22 37 172

PCR Bab négatives 9 16 0 0 25
dont PCR Ir
8 14 0 0 22
positives
PCR Bab
2 0 0 0 2
douteuses
Echantillons
positifs en Babesia 88,6 78,5 100 100 88,6
et en Theileria (%)

M (pb) 1 2 3 4 5 6 M 7

1000

500

100

1 : témoin négatif ; 2 : témoin positif ; 3-7 : glandes salivaires ; M : marqueur de taille ; pb : paires de bases.

Figure 14 : Amplification de l’ADN de Babesia et Theileria dans les glandes salivaires

d’I. ricinus femelles à l’aide des amorces Bab

78
Etant donné les faibles effectifs des élevages C et D (effectifs < 5), les pourcentages sont analysés
statistiquement en réalisant un test du Khi² corrigé. La différence entre les prévalences des quatre
élevages est significative (0,025 > p > 0,010).

Nous avons également réalisé un test du Khi² non corrigé entre les élevages A, B et (C+D). Les trois
prévalences sont également significativement différentes avec cette méthode (p = 0,0008).

Nous avons analysé la différence entre les pourcentages A et B en utilisant un test exact de Fisher. Il
n’y a pas de différence significative entre les pourcentages A et B (p bilatérale = 0,1611). De même,
les pourcentages entre C et D étant identiques, nous avons décidé de réaliser un test exact de Fisher en
groupant les élevages similaires par 2, soit (A+B) et (C+D). La différence est alors significative entre
ces deux groupes (p bilatérale = 0,0003).

III. CULTURES DE B. DIVERGENS, PCR BD37 ET

TYPAGE PAR RFLP

Les résultats de mise en culture de B. divergens à partir du sang des bovins, des PCR réalisées sur les
cultures positives et basées sur l’amplification d’un fragment du gène codant pour la protéine Bd37 et
des RFLP sont présentés dans le tableau 7.

Dans l’élevage A, 6 échantillons de sang de bovins sur 26 ont présenté des cultures de Babesia
positives soit un pourcentage de bovins porteurs du parasite de 23,1 %. Parmi ces 6 cultures positives,
tous les parasites se sont révélés être B. divergens après amplification d’un fragment du gène codant
pour la protéine Bd37. Les types 1, 2 et 3 de B. divergens ont été retrouvés dans cet élevage par RFLP
(figure 16 puits 2, 3, 4).

Par les mêmes méthodes, dans l’élevage B, deux bovins sur 20 ont été découverts porteurs de B.
divergens de type 6, soit 10 % des bovins avec parasitémie ; dans l’élevage C, trois bovins sur 24
porteurs de B. divergens de type 3, soit 12,5 % de bovins porteurs.

Dans l‘élevage D, 17 échantillons de sang sur 26 ont été positifs après mise en culture. L’observation
au microscope des lames après coloration au MGG, réalisée pour chaque culture positive, a mis en
évidence des anomalies morphologiques dans deux prélèvements sanguins (échantillons MAC 1 et
MAC 2). En effet, sur l’étalement obtenu à partir de la culture MAC 1, deux formes de Babesia ont été
observées : une petite forme morphologiquement semblable à B. divergens, et une grande forme qui ne
correspondait pas à la morphologie de B. divergens mais à celle de B. major. Sur l’étalement obtenu à
partir de la culture MAC 2, seule une Babesia « grande forme » également semblable à B. major a été
observée. L’amplification d’un fragment du gène codant pour la protéine Bd37 par PCR sur la culture
positive MAC 2 s’est effectivement révélée négative. En revanche la PCR Bd37 sur la culture positive
MAC 1 a été positive, confirmant ainsi la présence simultanée de B. divergens et B. major dans la
culture initiale.

A partir de ces deux cultures, des clonages ont été réalisés afin d’isoler les souches atypiques
examinées. 4 clones ont ainsi été isolés : MAC 1A et 1B et MAC 2A et 2B. L’amplification par PCR

79
Bd37 sur ces 4 clones a été négative. Le typage des clones par RFLP n’a montré aucun profil
caractéristique des types connus de B. divergens (figure 15 puits 9 et 10 pour MAC 2A et 1B). Deux
bovins sur 26 étaient donc porteurs de B. major, soit un pourcentage de 7,7 %.

Sur toutes les autres cultures positives de cet élevage, les PCR Bd37 ont mis en évidence B. divergens
(16 PCR Bd37 positives sur 17), soit un pourcentage de bovins porteurs de 61,5 %, et la RFLP a
permis la détection d’une majorité de B. divergens de type 3 (14 sur 16 cultures positives à B.
divergens) ainsi qu’un bovin porteur du type 2 (figure 16 puits n°8) et un autre porteur de l’association
type 2 et 4 (figure 16 puits n°7).

Tableau 7 : Résultats des cultures de Babesia, des amplifications par PCR d’un
fragment du gène codant pour la protéine Bd37 et des typages de B. divergens par RFLP
Nombre Nombre de
Identification des
Elevage d’échantillons cultures PCR Bd37 RFLP
cultures
mis en culture positives
LEL 1 + Type 2
LEL 2 + Type 2
LEL 3 + Type 3
Elevage A 26 6
LEL 4 + Type 1
LEL 5 + Type 3
LEL 6 + Type 3
MEZ 1 + Type 6
Elevage B 20 2
MEZ 2 + Type 6
BRO 1 + Type 3
Elevage C 24 3 BRO 2 + Type 3
BRO 3 + Type 3
MAC 1 + Type 3
MAC 1A -
MAC 1B -
MAC 2 -
MAC 2A -
MAC 2B -
MAC 3 + Type 2 et 4
MAC 4 + Type 2
17 MAC 5 + Type 3
(dont une culture MAC 6 + Type 3
Elevage D 26 uniquement MAC 7 + Type 3
positive à B. MAC 8 + Type 3
major) MAC 9 + Type 3
MAC 10 + Type 3
MAC 11 + Type 3
MAC 12 + Type 3
MAC 13 + Type 3
MAC 14 + Type 3
MAC 15 + Type 3
MAC 16 + Type 3
MAC 17 + Type 3

80
 Pb 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10

1000

500

100

1,2 et 6 : type 6 ; 3-5 : type 3 ; 7 : association des types 1 et 3 ; 8 : absence d’amplification ; 9 et 10 : type non
répertorié chez B. divergens (morphologie de B. major en culture) ; M : marqueur de poids moléculaire.
NB : pour déterminer les souches de B. divergens, une double digestion par les enzymes de restriction Rsa I et
Bgl II est nécessaire. Sur cette figure, seuls les profils après digestion par Bgl II sont représentés.
Figure 15 : Typage des souches de B. divergens par digestion enzymatique (Bgl II) des
produits de PCR obtenus avec les amorces Bd37

1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 15
Pb
1000

500

100

1 : type 3 avec Rsa I ; 2 : type 2 ; 4 : type 1 ; 3, 5 et 6, 9-15 : type 3 ; 7 : association des types 2 et 4 ; 8 : type 2.
M : marqueur de poids moléculaire.
NB : pour déterminer les souches de B. divergens, une double digestion par les enzymes de restriction Rsa I et
Bgl II est nécessaire. Sur cette figure, l’échantillon 1 est digéré par Rsa I, les autres par Bgl II.
Figure 16 : Typage des souches de B. divergens par digestion enzymatique (Rsa I et Bgl
II) des produits de PCR obtenus avec les amorces Bd37

81
 IV. SEROLOGIES PAR IMMUNOFLUORESCENCE
INDIRECTE

Dans les 4 élevages retenus, une recherche d’anticorps sériques anti-B. divergens a été effectuée sur
les prélèvements sanguins par la technique d’immunofluorescence indirecte.
Pour l’élevage A, les sérologies B. divergens ont toutes été négatives, soit un pourcentage de
séropositivité de 0 %.
Pour l’élevage B, 19 prélèvements sur 20 ont été négatifs et un douteux, soit un pourcentage de
séropositivité de 0 %.
Pour l’élevage C, 23 prélèvements sur 24 ont été négatifs et un positif, soit un pourcentage de
séropositivité de 4,2 %.
Pour l’élevage D, 13 sérums sur 24 ont été négatifs, 9 positifs et 2 douteux, soit un pourcentage de
séropositivité de 37,5 %.

Il paraissait anormal pour l’élevage A que toutes les sérologies anti-B. divergens soient négatives. En
effet le statut sérologique de cet élevage a déjà été étudié au cours de plusieurs travaux de thèse et les
résultats ne concordaient pas. Il a donc été décidé de fabriquer de nouvelles lames d’antigènes en
utilisant les parasites obtenus en culture à partir du sang du bovin n° 335 issu de cet élevage. Ces
nouvelles sérologies ont permis la détection de 8 bovins présentant des anticorps anti-B. divergens, 11
bovins négatifs et 5 bovins douteux, ce qui donne un pourcentage de séropositivité de 33,3 %.

D’après les résultats des cultures de l’élevage D, une suspicion de circulation de B. major dans le
troupeau a conduit à réaliser des sérologies anti-B. major. 24 animaux sur 24 testés en IFI présentaient
des anticorps sériques anti-B. major, soit 100 % des animaux testés. Cependant, la spécificité de la
méthode appliquée à B. major n’est pas définie.

Les résultats des sérologies détaillés par élevage sont présentés en annexe III, le bilan des résultats
sérologiques pour les élevages est décrit dans le tableau 8.

82
 Tableau 8 : Bilan des résultats sérologiques de détection des anticorps anti-B. divergens
et anti-B. major par immunofluorescence indirecte pour les 4 élevages analysés
Pour les sérums positifs, le seuil de dilution est fixé au 1/80ème , les résultats douteux sont caractérisés par +/- au
1/80ème. Sérologies non réalisées : -.
Sérologies B. divergens Sérologies Ag 335 (élevage A) Sérologies B. major
Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre
Nombre
de de de de de de de de
de bovins
Elevage bovins bovins bovins bovins bovins bovins bovins bovins
positifs
positifs négatifs douteux négatifs douteux positifs négatifs douteux
(%)
(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
0 24 0 5
8 11 - - -
A
(0) (100) (0) (33,3) (45,8) (20,8)
0 19 1
B - - - - - -
(0) (95) (5)
1 23 0
C - - - - - -
(4,2) (95,8) (0)
9 13 2 24 0 0
D - - -
(37,5) (54,2) (8,3) (100) (0) (0)
10 79 3
Total 8 11 5 24 0 0
(10,9) (85,9) (3,2)

83
 V. DETERMINATION DU TAUX D’INFECTION
DES TROUPEAUX DE BOVINS PAR BABESIA
DIVERGENS

Nous avons décidé de comparer par élevage et pour chaque bovin prélevé les deux méthodes utilisées
dans cette étude pour la détection de B. divergens : le résultat de la sérologie par IFI qui permet une
mise en évidence indirecte du parasite par la recherche des anticorps sériques anti-B. divergens et le
résultat de la culture in vitro, qui consiste en une mise en évidence directe du parasite dans les
échantillons de sang. Seuls ont été pris en compte pour cette mise en parallèle les résultats clairement
négatifs ou positifs que ce soit en IFI ou en culture : les résultats douteux ont été écartés, ainsi que les
échantillons n’ayant été testés qu’avec une seule des deux techniques. Les comparaisons des résultats
globaux obtenus par immunofluorescence indirecte et par culture in vitro sont représentées dans le
tableau 9. Les tableaux représentant ces résultats par élevage et par bovin identifié par son numéro de
travail sont contenus dans l’annexe IV.
Pour l’élevage A, sur 22 échantillons testés avec les deux méthodes, 40,9 % des bovins sont négatifs
en sérologie et en culture (-/-) ;
31,8 % sont négatifs en culture et positifs en sérologie (-/+) ;
18,2 % sont positifs avec les deux techniques (+/+) ;
9,1 % sont positifs en culture et négatifs en sérologie (+/-).
Pour l’élevage B, 94,7 % des 19 échantillons testés sont négatifs pour les deux techniques (-/-) ;
5,3 % sont positifs en culture et négatifs en sérologie par IFI (+/-).
Pour l’élevage C, 83,3 % des 24 animaux testés sont négatifs par les deux techniques (-/-) ;
12,5 % des bovins sont positifs en culture et négatifs en sérologie (+/-) ;
4,2 % sont négatifs en culture in vitro mais positifs en sérologie (-/+).
En raison de la mise en évidence du parasite B. major dans l’élevage D, deux types d’antigènes ont été
utilisés pour les sérologies réalisées dans cet élevage : un antigène B. divergens et un antigène B.
major.

− Sérologies anti-B. divergens : 36,4 % des 22 échantillons testés sont positifs en culture et
négatifs en sérologie (+/-) ; 31,8 % des échantillons sont positifs en culture et en sérologie
(+/+) ; 22,7 % des bovins sont négatifs avec les deux techniques (-/-) et 9,1 % sont négatifs en
culture et positifs en sérologie (-/+).

− Sérologies anti-B. major : 95,8 % des échantillons sont négatifs en culture et positifs en
sérologie (-/+) et 4,2 % sont positifs avec les deux techniques (+/+).

Nous allons essayer de déterminer si les deux techniques sont en accord ou non. Pour cela, la
concordance entre les deux techniques est déterminée à l’aide du test du Kappa (Fermanian, 1984).
Nous obtenons pour l’ensemble des valeurs appliquées à B. divergens un coefficient Kappa égal à
0,28 : l’accord entre l’IFI et la culture in vitro est ainsi considéré comme médiocre mais l’accord entre
les deux méthodes ne résulte pas de l’effet du hasard (p = 0,003).

84
 Tableau 9 : Présence comparée de B. divergens dans les échantillons de sang des bovins
ne présentant pas de symptôme de babésiose dans les 4 élevages, déterminée par les deux
techniques diagnostiques utilisées : Immunofluorescence Indirecte et culture in vitro

Culture - : culture négative ; Culture + : culture positive ; Sérologie - : sérologie négative ; Sérologie + :
sérologie positive ; Sérologie D : sérologie douteuse.

Total pour Elevage D

Elevage A Elevage B Elevage C
B. divergens B. divergens B. major
Nombre total
de bovins 96 26 20 24 26 26
prélevés
Nombre total
d’échantillons 87 22 19 24 22 24
interprétables
Résultats des tests

Pourcentage Pourcentage Pourcentage Pourcentage

d’échantillons d’échantillons d’échantillons d’échantillons élevage D

Culture Total pour (valeurs numériques)
IFI élevage A élevage B élevage C
in vitro B. divergens
(valeurs (valeurs (valeurs
B. divergens B. major
numériques) numériques) numériques)

40,9 94,7 83,3 22,7 0

- - 52
(9) (18) (20) (5) (0)
18,2 0 0 31,8 4,2
+ + 11
(4) (0) (0) (7) (1)
9,1 5,3 12,5 36,4 0
+ - 14
(2) (1) (3) (8) (0)
31,8 0 4,2 9,1 95,8
- + 10
(7) (0) (1) (2) (23)

85
 DISCUSSION

I. MATERIELS ET METHODES

I.1. Choix des amorces dans l’évaluation de la

prévalence

L’objectif initial de ce travail était d’évaluer la prévalence de B. divergens chez les femelles I. ricinus
en travaillant sur l’ADN parasitaire présent dans les glandes salivaires. Il était donc prévu d’utiliser
des amorces spécifiques de ce parasite (amorces Bd37) qui avaient déjà été utilisées avec succès pour
détecter l’ADN de B. divergens à partir de tiques entières. Cependant, il s’est avéré au cours d’essais
préliminaires que ces amorces ne fonctionnaient pas sur glandes salivaires. Pour la poursuite de ce
travail il a donc été nécessaire d’utiliser d’autres amorces. Les seules disponibles au laboratoire IHPM
(amorces Bab) ne sont pas spécifiques de B. divergens mais amplifient l’ADN de toutes les Babesia et
les Theileria. Les prévalences individuelles obtenues par élevage et la prévalence globale qui en
découle doivent donc être interprétées avec précautions. En effet, I. ricinus est le vecteur de plusieurs
hémoparasites, principalement B. divergens en France mais cette tique peut également être porteuse de
nombreux autres agents pathogènes dont l’ADN peut être amplifié par les amorces utilisées ici.

Ainsi, dans nos régions, elle peut transmettre B. capreoli, parasite du chevreuil et B. microti, parasite
des rongeurs, bien que sa présence en France ne soit pas certaine. D’autre part, la responsabilité de
cette tique dans la transmission éventuelle de certaines espèces de Theileria du groupe buffeli ou de
Trypanosoma theileri est soupçonnée (Aeschlimann et al., 1979). Ainsi, un trypanosome semblable à
T. theileri a été retrouvé dans l’hémolymphe d’I. ricinus (Aeschlimann et al., 1979 ; Monod et al.,
1986). T. theileri est fréquemment retrouvé dans le sang des bovins lors de culture in vitro (ce parasite
est classiquement transmis par les Tabanidés) et sa détection par PCR avec les amorces Bab réalisée
par le laboratoire IHPM s’est révélée inconstante mais parfois positive (M. Jouglin, communications
personnelles). Il n’est donc pas certain que les amorces Bab n’amplifient pas T. theileri. Il n’est
cependant pas prouvé qu’I. ricinus puisse transmettre ce parasite, donc que T. theileri soit présent dans
ses glandes salivaires. Une recherche d’ADN de parasites à partir des glandes salivaires de tiques telle
que nous la réalisons dans notre travail, évite d’amplifier l’ADN des parasites non transmis : T. theileri
ne devrait donc pas être amplifiée dans notre étude.

I. ricinus peut être porteur d’un agent pathogène seul ou de plusieurs simultanément. Plusieurs études
ont ainsi démontrées l’existence de co-infections chez les tiques de cette espèce, généralement un
parasite du genre Babesia associé à une bartonelle ou à une rickettsie comme Anaplasma
phagocytophilum responsable de l’ehrlichiose bovine ou Borrelia burgderfori qui est à l’origine de la
maladie de Lyme (Hartelt et al., 2004 ; Stanczak et al., 2004 ; Halos et al., 2005). L’amorce Bab est
cependant suffisamment spécifique pour éviter les réactions croisées avec de tels agents pathogènes.
La co-infection d’I. ricinus par B microti et B. divergens n’a pas été établie, mais très peu d’études
sont disponibles à ce sujet (Skotarczak et Cichocka, 2001).

86
 I.2. Risques de contamination par l’ADN du parasite
pendant les différentes étapes d’évaluation de la
prévalence

L’utilisation des techniques de biologie moléculaire implique le respect de règles strictes afin d’éviter
les contaminations des échantillons à traiter par de l’ADN « parasite ». L’obtention d’une prévalence
très élevée de Babesia chez les femelles I. ricinus, sans comparaison avec les taux d’infection
retrouvés dans la littérature, nous oblige à nous interroger sur une éventuelle contamination au cours
du déroulement de notre protocole. Les différentes étapes que nous avons suivies doivent donc être
analysées afin d’y déterminer des points critiques, au cours desquels des contaminations auraient pu
avoir lieu.

Les étapes constituant ce protocole se sont déroulées dans des pièces différentes et suivant le principe
de « marche en avant » de manière à limiter les contaminations.

L’étape initiale qui correspond à la dissection des tiques et l’isolement individuel des glandes
salivaires nous paraît présenter le risque de contamination le plus élevé. En effet, au cours de la
dissection, les caeca sont généralement lésés et libèrent leur contenu dans le tampon PBS. Les glandes
salivaires lors de la récupération sont alors souvent accompagnées de fragments de contenu digestif.
L’objectif de ce travail étant de déterminer la prévalence des tiques infectantes, on ne doit amplifier
que l’ADN parasitaire réellement présent dans les glandes salivaires. L’ADN des agents pathogènes
éventuellement présents dans les caecas mais non transmis par I. ricinus et qui pourrait être amplifié
par PCR (comme T. theileri par exemple) ne doit pas contaminer les échantillons. Pour éviter cette
contamination et éliminer les fragments de caeca, les glandes salivaires sont rincées dans du tampon
PBS. La limite de ce rinçage est la taille des particules : des fragments trop petits ne seront pas vus
même à l’aide de la loupe binoculaire et donc ne seront pas éliminés.

D’autre part, entre chaque tique, les pinces entomologiques sont plongées quelques minutes dans un
produit destiné à la destruction de l’ADN, le DNA-off® (Eurobio), puis rincées avec de l’eau distillée
et séchées. Il s’agit d’un nettoyant à base de surfactant et d’agent détruisant l’ADN permettant
d’éliminer l’ADN contaminant des surfaces de travail et du matériel. Le temps de trempage
recommandé par le fabricant est d’une à deux heures pour le petit matériel de laboratoire et de
plusieurs minutes pour les surfaces. Cependant, la nécessité de rendement est à prendre en
considération dans cette étude : nous avons déjà insisté sur le fait que l’étape de dissection des tiques
était particulièrement longue et devait se faire rapidement après la collecte afin de limiter au maximum
leur mortalité. L’alternance entre plusieurs jeux de pinces (généralement 2 et jusqu’à 4 pinces en
fonction de la disponibilité du matériel) permettait de les laisser tremper dans le DNA-off® le temps
de disséquer entre une à trois tiques. Le temps de dissection d’une tique étant d’environ 10 minutes, la
durée du trempage que nous avons observée était donc généralement insuffisante pour garantir une
efficacité de décontamination de 100 %.

Afin d’objectiver une éventuelle contamination entre deux tiques qui se suivent pendant cette étape de
dissection, et de valider ainsi la méthode de décontamination avec le DNA-off®, une solution
consisterait à intercaler pendant la dissection des tiques à tester d’autres tiques connues comme étant

87
indemnes de Babesia, donc devant donner un résultat de PCR négatif. De telles tiques indemnes sont
présentes à Belle-Île. Une collecte de femelles I. ricinus maintenues par la suite dans l’élevage IHPM
aurait permis d’obtenir un lot tiques femelles « témoin négatif », indemnes de B. divergens. Ce
protocole de contrôle utilisant des tiques « témoin négatif » n’est applicable que si les amorces
utilisées pour les amplifications par PCR sont spécifiques de B. divergens, éventuellement de
l’ensemble des Babesia. Les tiques de l’espèce Haemaphysalis collectées à Belle-Île ne sont pas
indemnes de Theileria. On ne sait pas si les tiques I. ricinus de Belle-Île en sont porteuses également.
Etant donné qu’il n’est pas certain qu’I. ricinus ne transmette pas Theileria et que nos amorces Bab
reconnaissent toutes les Babesia et les Theileria, les résultats des amplifications utilisant les amorces
Bab sur des I. ricinus « témoins » ne permettraient donc pas de conclure et un résultat positif pourrait
tout aussi bien signaler la présence de Theileria dans la « tique témoin » qu’une contamination
éventuelle par de l’ADN de Babesia provenant d’une tique testée.

Les extractions d’ADN étaient réalisées dans une salle réservée uniquement à cet usage (zone de pré-
amplification). Les cônes utilisés ne possédaient pas de filtres mais étaient stérilisés, ainsi que les
tubes eppendorf utilisés. La contamination d’une ou plusieurs micropipettes par de l’ADN de Babesia
(gouttelettes remontant au-delà du cône) aurait pu néanmoins par la suite souiller tous les échantillons
suivants. D’après cette hypothèse, la contamination aurait dû se produire dès le départ et concerner
tous les échantillons suivants. Cette hypothèse paraît peu probable étant donné l’existence
d’échantillons négatifs en PCR Bab détectés parmi des échantillons positifs.

La préparation des mélanges avant amplification (zone propre) s’est déroulée dans une troisième pièce
également réservée à cet usage, sous hotte stérile, à l’aide de tubes et de cônes à filtre stériles. Le
matériel était stérilisé entre chaque manipulation grâce à un système de rayonnement UV. Tous les
témoins négatifs pour chaque amplification ont été validés comme réellement négatifs. La salle
contenant le thermocycleur était uniquement destinée aux amplifications, à la migration sur gel et à la
lecture des résultats de PCR (zone de post-amplification). Les produits d’amplification étaient
également conservés dans cette pièce. Les risques de contamination durant ces étapes paraissent
faibles.

I.3. Cultures

Comme la tique I. ricinus, les bovins peuvent également être poly-parasités : B. major est une autre
Babesia transmise par Haemaphysalis punctata et responsable en France de cas de babésiose bovine,
mais les formes cliniques dues à ce parasite sont moins sévères et peuvent passer inaperçues (L’Hostis
et Seegers, 2002). Theileria buffeli, également susceptible de parasiter les bovins et transmise par H.
punctata est présente en France (Corse, Belle-Île, suspicion dans les Alpes du Sud) mais demeure très
peu étudiée. La répartition de ces parasites est probablement sous estimée et de nombreux bovins sont
vraisemblablement porteurs asymptomatiques (L’Hostis et Seegers, 2002). Il en est de même pour les
trypanosomoses bovines au sujet desquelles peu d’études sont disponibles en France. Des
trypanosomes sont cependant régulièrement retrouvés en culture in vitro au laboratoire IHPM et ces
parasites sont considérés comme contaminants des cultures. En effet, ils empêchent la croissance de B.
divergens dont le développement est recherché. La seule solution en cas de contamination est

88
d’augmenter la concentration d’amphotéricine B dans les milieux de culture. Les bovins sont le plus
souvent porteurs asymptomatiques de trypanosomes, bien que Trypanosoma theileri soit suspecté dans
un cas de méningo-encéphalite en Suisse (Braun et al., 2002).

Cependant, dans le cas des cultures in vitro, nous avons utilisé des amorces permettant l’amplification
du gène codant pour la protéine Bd37 pour vérifier que les cultures positives correspondaient au
développement de B. divergens. Ces amorces sont beaucoup plus spécifiques que les amorces Bab
utilisées dans l’évaluation de la prévalence chez les tiques. Elles n’amplifient que B. divergens et donc
le poly-parasitisme des bovins ne pose pas de problème en terme de spécificité de détection par PCR.

I.4. Typage des souches par RFLP

Les profils connus de B. divergens, obtenus après digestion par les enzymes de restriction Rsa I et Bgl
II sont au nombre de 7. Cette digestion enzymatique s’effectue sur les produits de l’amplification par
PCR d’un fragment du gène codant pour la protéine Bd37. Ce polymorphisme génétique de B.
divergens ne s’appuie donc que sur la variabilité génétique de la seule protéine Bd37. D’autres types
de B. divergens existent peut-être, basés sur la variabilité génétique d’autres protéines du parasite.

I.5. Sérologies

La sérologie par immunofluorescence indirecte (IFI) permet de détecter les immunoglobulines G (IgG)
anti-B. divergens après le pic de parasitémie sanguin : elles apparaissent vers le 13ème ou 14ème jour
après l’infection. Ainsi la sérologie est négative pendant la première partie de l’épisode clinique. Le
titre en anticorps atteint son maximum vers la troisième semaine post-infection et peut persister de
plusieurs mois à deux ans (Trees, 1978). L’indication de choix de cette technique est la détermination
de la prévalence de B. divergens dans un troupeau infecté situé dans une région endémique. L’IFI
permet donc de détecter les animaux qui ont été en contact avec B. divergens mais n’atteste pas de la
présence du parasite au moment du prélèvement. Elle dépiste les infections plus ou moins anciennes
ou la présence d’anticorps d’origine maternelle chez les veaux après ingestion de colostrum de vache
immunisée.

Le défaut majeur de cette méthode est la subjectivité de l’opérateur qui effectue la lecture. Elle
nécessite donc quelqu’un d’expérimenté, ce qui a été le cas pour notre étude.

Cette technique appliquée à la détection des anticorps anti-B. divergens possède certaines limites : les
souches de B. divergens de type 5 ne sont pas reconnues, des réactions croisées peuvent exister, seules
les souches génétiquement proches de celle utilisée pour l’antigène réagissent. Ceci est illustré par les
résultats que nous avons obtenus dans l’élevage A : les sérologies ont été reconduites avec un antigène
fabriqué à partir des parasites obtenus par culture d’un bovin de l’élevage. Le pourcentage de
séroprévalence est passé de 0 % avec l’antigène initial à 33,3 % avec les B. divergens du bovin n°335.
Cependant, cette adaptation à la souche de parasite présent dans chaque élevage n’a pas été réalisée
pour les autres élevages négatifs en sérologie (élevages B et C). L’interprétation des séroprévalence
très faibles voire nulles dans ces élevages n’est donc pas évidente.

89
 II. RESULTATS

II.1. Prévalences d’infection de B. divergens chez les

bovins en zone d’endémie
II.1.1 Statut sérologique vis-à-vis de B. divergens des
élevages sélectionnés

Les sérologies par IFI effectuées dans chaque élevage permettent d’illustrer leur statut sérologique vis-
à-vis de B. divergens à un instant donné, et donc de vérifier qu’il s’agit bien d’élevages endémiques
avec une circulation de parasites au sein du troupeau.

Les études épidémiologiques réalisées sur la babésiose bovine dans des élevages endémiques révèlent
des pourcentages de séropositivité détectés en IFI élevés et des incidences cliniques faibles (Donnelly
et al., 1972 ; L’Hostis et al., 1997). Ainsi, en Suisse en 1988, 33,9 % des bovins en zone d’endémie
possédaient des anticorps anti-B. divergens au printemps avant la période de pâture. Ce pourcentage a
augmenté en été (59,1 %) (Gern et al., 1988) ; sur l’île d’Arran en Ecosse, 28 % des bovins
présentaient des anticorps anti-B. divergens (Latif et Wells, 1973) ; une étude localisée en Irlande du
Nord a mis en évidence une séroprévalence globale chez les bovins de 31,8 % (Taylor et al., 1982).

Au vu des résultats présentés dans le tableau 8, les quatre élevages ont des profils sérologiques
différents. Les bovins de l’élevage A ont présenté une séropositivité nulle avec l’antigène
habituellement utilisé pour les IFI. La réalisation de nouvelles plaques d’antigènes à partir d’une
culture positive à B. divergens de cet élevage a permis d’obtenir un taux de séropositivité de 33,3 %.
Comme mentionné précédemment, les résultats initialement négatifs de l’élevage A suggèrent qu’il
existe bien un problème de sensibilité de la technique d’IFI lié à la variabilité antigénique des
différentes souches de B. divergens.

Le pourcentage de l’élevage A est comparable à celui obtenu pour l’élevage D qui est de 37,5 %. Ces
deux valeurs correspondent à celles trouvées dans la littérature et déterminées au cours d’enquêtes de
séroprévalence dans différents pays d’Europe. Dans les deux élevages A et C, les résultats
sérologiques nous permettent donc de conclure qu’il existe bien une circulation de B. divergens au sein
du troupeau.

Les élevages B et C ont des prévalences respectives de 0 % et 4,2 %. Ces résultats sérologiques très
faibles voire nuls sont en contradiction avec les commémoratifs des éleveurs, les études précédemment
réalisées et les résultats obtenus en culture qui montrent qu’il existe des bovins porteurs de parasites.
Ce sont cependant les élevages avec le moins de cultures positives, ce qui semble cohérent avec les
résultats sérologiques. Cette faible prévalence sérologique peut être le résultat d’un problème de
spécificité des antigènes utilisés en routine comme cela a été illustré dans l’élevage A. Il aurait été
nécessaire de recommencer les sérologies dans ces deux élevages B et C à partir des parasites obtenus
avec les cultures positives. Il peut également s’agir d’un problème de sensibilité de la technique
appliquée sur un échantillon d’animaux à faibles titres d’anticorps, et qui ne sont alors pas détectés.

90
Pour l’élevage D, des sérologies anti-B. major ont été effectuées : 100 % des animaux de l’échantillon
sont porteurs d’anticorps anti-B. major. Ce pourcentage de séroprévalence est très élevé et signale
donc une très importante circulation de parasite dans le troupeau, tous les animaux ayant été en contact
avec le parasite. Aucune étude épidémiologique sur la babésiose bovine à B. major n’ayant été réalisée
en France et notamment aucune étude de séroprévalence, nous ne pouvons comparer ce pourcentage à
une valeur de référence. Cependant, l’importance de la séropositivité vis à vis de B. major dans ce
troupeau confirme l’idée retrouvée chez certains auteurs qu’il s’agit probablement d’un parasite dont
la présence est sous estimée (L’Hostis et Seegers, 2002).

Certains animaux de l’élevage D possèdent des anticorps dirigés contre les deux parasites recherchés :
9 bovins sur 22 testés soit 40,1 % sont porteurs des deux types d’anticorps. La question de la
spécificité de l’IFI entre deux espèces de Babesia peut se poser, étant donné le manque de spécificité
entre souches au sein d’une même espèce. Plusieurs études sur l’utilisation de l’IFI pour différencier
les infections entre B. major et B. divergens ont été menées. Elles s’accordent pour dire que les titres
en anticorps dans des systèmes homologues (antigènes et anticorps d’une même espèce de Babesia)
sont beaucoup plus élevés que ceux obtenus dans des systèmes hétérologues, la différence de titres en
anticorps étant significative (Joyner et al., 1972 ; Leeflang et Perié, 1972 ; Goldman et Rosenberg,
1974). Les réactions croisées engendrent donc des titres faibles non détectés. L’IFI permet bien de
détecter séparément les anticorps issus des deux types d’infections.

II.1.2 Mise en évidence de B. divergens dans le sang des

bovins par culture in vitro et typage des souches présentes
dans les élevages

La mise en culture in vitro des hématies de bovins permet de détecter les animaux présentant une
parasitémie, c’est à dire les bovins porteurs qui constituent une source de parasites. Cette technique
permet notamment de mettre en évidence les très faibles parasitémies, observées sur des animaux
cliniquement asymptomatiques, parasitémies qui ne sont pas détectables au microscope après
coloration au MGG. Elle permet également d’étudier la diversité génétique de B. divergens en isolant
les différentes souches éventuellement présentes dans un même troupeau. La sensibilité de cette
technique a été déterminée sur hématies de mouton : la parasitémie la plus faible détectée est 10-7 % ce
qui correspond à 10 parasites/mL de sang (Malandrin et al., 2004). Dans notre étude, les cultures se
font sur hématies de bovins. Tous les animaux prélevés étaient asymptomatiques le jour des prises de
sang. La mise en culture a révélé des bovins porteurs chroniques de B. divergens dans tous les
élevages avec des pourcentages variables. Les élevages B et C présentent des valeurs similaires autour
de 11 %, l’élevage A montre un portage de 23,1 % et l’élevage D est celui présentant le plus grand
pourcentage de porteurs chroniques avec 61,5 %. Peu de références sont disponibles sur la prévalence
de portage des bovins. Une étude réalisée dans l’Ouest de la France sur 77 prélèvements de sang de
bovins sans signe clinique de babésiose a montré un pourcentage de bovins porteurs en culture sur
hématies de moutons de 40,2 % (Malandrin et al., 2004). Une autre étude de prévalence réalisée dans
l’Est de la France utilise l’amplification par PCR d’un fragment du gène codant pour l’ARN 18S de B.
divergens pour détecter les faibles parasitémies chez les bovins. La sensibilité de cette technique

91
permet de détecter des parasitémies de 10-6 % dans 1 mL de sang. La prévalence de B. divergens chez
les bovins obtenue par cette technique et dans cette région est de 20 % (Devos et Geysen, 2004). La
différence de résultats entre ces deux études peut s’expliquer par la différence de technique et
notamment la sensibilité plus grande de la culture in vitro et également par le moment de
l’échantillonnage. En effet, les prélèvements de sang de la première ont été effectués au printemps et
en été alors que les animaux de la deuxième étude ont été prélevés l’hiver. La parasitémie doit évoluer
en fonction de la saison, de la même façon que les taux d’anticorps, et elle doit être donc plus
importante lors de la période d’activité des tiques.
De la même façon que l’étude sérologique a mis en évidence des bovins présentants simultanément
des anticorps anti-B. major et anti-B. divergens dans l’élevage D, un des bovins de cet élevage est
porteur à la fois de B. divergens et de B. major (culture MAC 1). Ce parasite n’étant pas transmis par
la même tique, il s’agit d’un animal piqué au moins une fois par une tique de l’espèce I. ricinus et par
une tique de l’espèce H. punctata.
Le typage des souches de B. divergens réalisé après digestion enzymatique des produits de PCR avec
les amorces Bd37 révèle différents profils : des élevages avec un seul type de B. divergens et des
élevages avec plusieurs types, voire des bovins porteurs de deux types simultanément. Ainsi, les
élevages B et C présentent respectivement uniquement du type 6 et uniquement du type 3. Il s’agit
cependant des élevages avec le nombre de cultures positives le plus faible, on ne peut donc pas être
certain avec cette unique étude qu’une souche et une seule y circule. L’élevage A associe des types 1,
2 et 3. L’élevage D montre une dominance du type 3, associé à la présence de type 2, et un bovin
porteur à la fois de type 2 et 4. L’origine des deux types simultanés chez ce bovin peut avoir deux
origines : il a pu être piqué par deux tiques porteuses chacune d’un type de B divergens, ou il a pu être
piqué par une seule tique vectrice des deux types à la fois.
Ces résultats nous indiquent également qu’il n’y a de type 5 dans aucun élevage sélectionné. Cette
information est utile pour l’interprétation des résultats sérologiques car ce type ne réagit pas avec les
antigènes habituellement utilisés pour l’IFI.
Les types 1 et 2 sont décrits comme classiquement prédominants (Baune, 2002), ce qui n’est pas le cas
dans notre étude, qui voit le type 3 fortement majoritaire.

II.1.3 Présence comparée de B. divergens détectée par IFI et

par culture

Après avoir analysé par élevage les résultats des sérologies et des cultures, nous voulons déterminer
s’il existe un lien entre les résultats obtenus par ces deux techniques. Nos résultats totaux indiquent
que 72,4 % des bovins des quatre élevages présentent les mêmes résultats avec les deux techniques
(+/+ et -/-). Afin de déterminer l’existence ou non de ce lien, nous avons utilisé le test du Kappa, qui
permet d’analyser statistiquement l’accord entre deux techniques. Les effectifs totaux des quatre
élevages sont les seuls suffisamment conséquents pour l’analyse statistique. Le coefficient total
mesuré (x = 0,28) témoigne d’un accord médiocre entre les deux méthodes. Toutefois, nous avons
démontré que cet accord ne résulte pas de l’effet du hasard (p = 0,003). Ce degré d’accord médiocre
s’explique par le fait que bien qu’elles soient liées, ces techniques ne reposent pas sur les mêmes bases
biologiques. L’une recherche les anticorps anti-B. divergens dans le sang des bovins, c’est à dire

92
reflète un contact avec le parasite. Le parasite peut être présent ou absent chez l’animal séropositif.
L’autre technique cherche à mettre en évidence directement le parasite donc détecte les animaux
porteurs de parasites, avec ou sans signes cliniques (sans dans le cas de notre étude). Une autre étude
similaire réalisée sur 77 échantillons de sang de bovins sans signe clinique prélevés dans l’Ouest de la
France montre une bonne corrélation entre la sérologie par IFI et la culture in vitro avec 89,6 % des
échantillons donnant le même résultat avec les deux techniques (Malandrin et al., 2004). Le
coefficient kappa mesuré pour l’étude de Malandrin et al.( x = 0,79) témoigne d’un accord bon, cet
accord entre l’IFI et la culture ne résultant pas de l’effet du hasard (p < 0,0001).
Dans les élevages analysés au cours de notre étude, deux profils ne comportant qu’un résultat positif
pour une seule des techniques sont présents :
− certains bovins sont positifs en culture et négatifs en sérologie (+/-) : 16,1 % des animaux
testés. Ce statut peut être expliqué par un manque de sensibilité de l’IFI ou par l’absence de
réactions croisées entre différentes souches de B. divergens (souches de l’élevage différentes
de celle utilisée pour les lames d’antigènes).
− d’autres bovins sont négatifs en culture mais positifs en sérologie (-/+) : 11,5 % des animaux
testés. Cette situation peut s’expliquer par un problème de sensibilité de la culture
(concentration sanguine en parasites trop faible), la nature sporadique de la parasitémie lors
d’infections chroniques, l’absence de circulation de parasites, la persistance des anticorps
circulant même après l’élimination des parasites par l’hôte ou l’incapacité de certains parasites
à se développer dans les milieux de culture (Malandrin et al., 2004).
Il paraît donc logique que les deux méthodes donnent des résultats qui se recoupent, mais seulement
partiellement.

II.2. Prévalences de Babesia et Theileria dans les glandes

salivaires des tiques femelles I. ricinus

Sur 194 tiques femelles adultes testées par PCR dans les 4 élevages, 172 présentent des Babésidées
dans leurs glandes salivaires, ce qui nous donne une prévalence globale de 88,6 % de tiques femelles
adultes potentiellement infectantes dans une population de tiques en zone d’endémie. Cette valeur est
beaucoup plus importante que celles obtenues dans la littérature, qui sont répertoriées dans la première
partie de ce travail. La situation par élevage est équivalente avec des prévalences élevées pour les
élevages A, B, C, et D respectivement de 88,6 %, 78,5 %, 100 % et 100 %. L’analyse statistique de ces
quatre prévalences à l’aide d’un Khi² corrigé (effectifs trop faibles pour les élevages C et D pour
réaliser un Khi² classique) montre qu’elles sont significativement différentes. Nous avons décidé
d’étudier 2 à 2 ces prévalences : les prévalences des élevages C et D sont identiques et les prévalences
des élevages A et B ne sont pas significativement différentes (test exact de Fisher, p bilatérale =
0,1611). Au vu de ces analyses statistiques, nous obtenons une homogénéité dans les résultats des
élevages A et B : les prévalences sont statistiquement équivalentes pour ces deux élevages. Il s’agit
des élevages avec le plus grand nombre de tiques analysées. Les deux élevages à plus petits effectifs
obtiennent également des résultats semblables. On peut se demander si les différences observées entre
(A+B) et (C+D) ne sont pas dues à l’échantillonnage réduit des deux derniers élevages.

93
Les prévalences de Babesia chez I. ricinus déterminées dans d’autres études sont inférieures à nos
résultats. La seule valeur disponible obtenue par PCR pour B. divergens chez des femelles I. ricinus
est de 6,7 % (Skotarzcak et Cichoka, 2001). La technique mise en œuvre pour obtenir cette prévalence
diffère de celle que nous avons employée : les PCR ont été réalisées sur tiques entières avec des
amorces différentes des nôtres. De plus, un doute subsiste sur la spécificité des amorces utilisées pour
calculer la prévalence de B. divergens dans l’étude de Skotarzcak et Cichoka. Les valeurs des
prévalence obtenues pour B. microti chez les femelles I. ricinus sont variables, de 3 % à 28,8 % en
fonction des études mais demeurent bien inférieures à celle que nous obtenons. Cependant, même si B.
microti a été bien plus étudiée que B. divergens chez I. ricinus, il s’agit d’une Theileria et non d’une
Babesia et ses modalités de transmission ne sont pas identiques à celles de B. divergens : B. microti ne
dispose pas d’une transmission transovarienne, il paraît donc cohérent que plus de tiques soient
porteuses de B. divergens qui se transmet de la femelle gorgée aux larves qui en sont issues. Les
résultats de prévalence de B. microti doivent donc être extrapolés à B. divergens avec précaution, d’où
la difficulté d’interprétation des résultats avec si peu de valeurs de référence.
Une autre étude a déterminé une prévalence de Babesia sp. chez des nymphes et des adultes I. ricinus
par PCR sur tiques entières. La valeur obtenue chez les femelles est de 67 %. Dans cette étude, les
tiques ont, comme dans notre protocole, été collectées sur des pâtures. Cette prévalence est la seule
répertoriée présentant une valeur proche de la notre, bien que dans ce travail, seules neuf I. ricinus
femelles aient été analysées (Halos et al., 2005).

Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer l’écart existant entre notre valeur et les
prévalences obtenues par d’autres auteurs. La première hypothèse consiste à penser que la prévalence
que nous avons trouvée n’est pas correcte. Dans ce cas, les prévalences très élevées que nous avons
déterminées s’expliqueraient par une erreur de protocole avec une contamination des échantillons au
cours de l’étape de dissection des tiques comme nous l’avons précédemment expliqué. Cette
hypothèse ne peut malheureusement pas être vérifiée en utilisant des tiques témoins indemnes de
Babesia avec les amorces Bab dont nous disposons car elles ne sont pas assez spécifiques (présence de
Theileria à Belle-île).

La deuxième hypothèse est qu’il n’y a pas eu de problème de contamination mais que les valeurs
élevées de prévalences observées sont dues à plusieurs facteurs spécifiques à notre protocole et qui
peuvent intervenir individuellement ou de manière combinée :
− dans cette étude, nous avons été contraints d’utiliser une amorce peu spécifique pour détecter
les parasites contenus dans les glandes salivaires. Cette amorce est susceptible de reconnaître
toutes les Babesia et les Theileria transmises par I. ricinus. En supposant que les tiques sont
fréquemment poly-parasitées, la prévalence obtenue avec cette amorce est logiquement plus
importante que celle des autres études utilisant des amorces spécifiques d’un seul parasite ou
de Babesia sp.. Ainsi, la prévalence de 67 % déterminée par Halos et al. (2005), qui concerne
les Babesia sp., est proche de notre valeur si l’on considère qu’I. ricinus est vecteur de
Babesia et de Theileria.
− notre protocole de collecte de tiques, qui constituent le matériel de base de l’étude, diffère de
celui de la plupart des autres études de prévalence. En effet, les collectes de tiques non

94
 gorgées dans ces dernières se font toujours avec la méthode du drapeau dans des zones de
forêts et de bois. Nos collectes ont été spécifiquement effectuées dans des pâtures situées dans
des élevages endémiques de babésiose bovine, dans lesquels par définition, B. divergens est
présente tant chez les bovins que chez les tiques. De fréquents contacts se produisent
probablement entre les bovins et les tiques dans de tels élevages. Le choix que nous avons fait
dans les lieux de récolte pourrait donc expliquer cette prévalence élevée ;
− les amplifications de l’ADN des parasites recherchés dans les études précédentes sont
réalisées sur tiques entières et non uniquement sur glandes salivaires comme notre protocole
l’exige. Dans notre partie bibliographique, nous avons vu que les extractions d’ADN de tiques
sont souvent problématiques pour plusieurs raisons : la présence d’un exosquelette chitinisé
rend la tâche plus ardue, l’ADN extrait est pour une raison inconnue très sensible à la
dégradation et des inhibiteurs de Taq-polymérase sont soupçonnés d’être présents chez les
tiques gorgées ou non. Ces facteurs peuvent jouer un rôle en diminuant l’efficacité des
amplifications par PCR et donc peuvent avoir un impact sur les taux d’infection des tiques
reportés dans les études précédentes. Les taux d’infection obtenus sur tiques entières
pourraient être sous-estimés (Halos et al., 2004).

II.3. Découverte d’un foyer de B. major en Loire-

Atlantique

La culture des hématies de bovins de l’élevage D a mis en évidence des Babesia dont la forme
observée après coloration au MGG ne correspondait pas à la morphologie caractéristique de B.
divergens. Ce parasite correspondait aux descriptions macroscopiques de B. major : dans cette espèce,
les formes annulaires d’1,8 µm de diamètre prédominent sur les formes allongées qui sont sub-
piriformes et mesurent 2,6 µm de longueur ; les éléments géminés dessinent un angle aigu ; toutes les
formes sont situées en position centrale dans l’hématie (Sergent et al., 1926 ; Euzéby, 1990). Cette
hypothèse de la présence de B. major dans l’élevage D a été confirmée par la réalisation de sérologies
anti-B. major sur les prélèvements sanguins. Tous les animaux prélevés étaient positifs : il s’agissait
donc bien d’une circulation de B. major dans cet élevage. De plus, les amplifications par PCR d’un
fragment du gène codant pour la protéine Bd37 spécifique de B. divergens réalisées sur les cultures
présentant ces formes parasitaires atypiques ont toutes été négatives : on peut conclure qu’il ne s’agit
pas de B. divergens. La preuve formelle de l’existence de B. major a été apportée par le séquençage de
produits de PCR amplifiant l’ADN des parasites issus des cultures. La séquence obtenue a été
comparée avec une séquence disponible pour B. major, déterminée par des chercheurs chinois. Une
seule base diffère entre les deux séquences.
Cette espèce de Babesia demeure peu étudiée, comme le sont les autres protozoaires transmis aux
bovins par les tiques hormis B. divergens, probablement de part leur faible pouvoir pathogène. En effet
les infections dues à B. major seraient pratiquement asymptomatiques (Malbert et al., 1988). Ce
parasite a été isolé et décrit en Algérie par Sergent et al. qui avaient importé des animaux de France à
des fins expérimentales (1926). Il est connu en France dans les départements du Lot, de la Charente et
dans la région de l’Aubrac (Euzéby, 1990 ; L’Hostis et al., 1995 ; L’Hostis et Seegers, 2002). La

95
fréquence des infections à B. major est sûrement sous estimée, tout comme l’aire de répartition du
parasite. Cette dernière est liée à la répartition de la tique vectrice H. punctata, qui est retrouvée dans
toute l’Europe, de l’Espagne au Sud de la Scandinavie. En France, cette tique triphasique est présente
dans différents microhabitats, notamment le long de l’Atlantique et dans le Sud-Ouest (L’Hostis et
Seegers, 2002). En Loire-Atlantique, aucun foyer de babésiose à B. major n’avait encore été détecté.
Cette découverte a entraîné la mise en place par le laboratoire IHPM d’un projet spécifique sur B.
major dans cet élevage : au cours de l’année 2005-2006, des prélèvements sanguins réguliers sur les
vaches laitières, des collectes de tiques par la méthode du drapeau et des piégeages de
micromammifères ont été effectués. Au cours de ces collectes, seule une tique de l’espèce H. punctata
a été capturée, contre un grand nombre d’I. ricinus. Ce résultat pose la question de la spécificité
vectorielle de B. major. L’hypothèse de la transmission de ce parasite par I. ricinus a déjà été évoquée
aux Pays-Bas suite à une étude expérimentale. La tique femelle adulte ayant contracté l’infection, les
sporozoïtes seraient inoculés par les larves de la génération suivante, sans transmission aux stades
évolutifs ultérieurs (Wart et al., 1971).

96
97
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Malgré son importance médicale, sanitaire et économique, la babésiose bovine et plus particulièrement
son épidémiologie restent mal connues. Outre l’étude chez les hôtes vertébrés, les bovins, la
compréhension de l’épidémiologie de cette maladie à transmission vectorielle et des phénomènes qui
la régissent passent nécessairement par une analyse de la prévalence du parasite impliqué, B.
divergens, chez son vecteur, I. ricinus.
L’objectif principal de cette étude consistait à déterminer la prévalence de B. divergens chez I. ricinus
à l’aide d’un protocole original : détecter la présence éventuelle du parasite par PCR dans les glandes
salivaires de la tique, c’est à dire estimer la proportion de tiques infectantes. Cette recherche a été
menée sur des femelles I. ricinus collectées dans des élevages endémiques de babésiose bovine. Nous
avons dans un premier temps vérifié et évalué la circulation de B. divergens parmi les bovins des
quatre élevages sélectionnés en réalisant deux types d’analyses sur des échantillons de sang des bovins
de chaque élevage : une mise en culture des parasites éventuellement présents a permis la détection
des bovins porteurs de B. divergens et une recherche des anticorps sériques anti-B. divergens par
immunofluorescence indirecte a précisé le statut sérologique des troupeaux. L’existence d’un défaut
de sensibilité de la technique sérologique vis-à-vis de souches de B. divergens différentes de la souche
de référence utilisée pour les antigènes a été démontrée dans cette étude (cas de l’élevage A). Cela
limite donc l’interprétation des séroprévalences les plus faibles obtenues.
La détermination de la prévalence chez la tique n’a pu être effectuée selon l’objectif initial, en raison
d’un problème d’amorces. L’utilisation d’amorces non spécifiques de B. divergens a conduit à
déterminer une prévalence des Babésidées chez I. ricinus. La valeur que nous avons déterminée est de
88,6 %. Cette prévalence est supérieure à celles obtenues par d’autres auteurs, notamment pour
Babesia sp. chez I. ricinus. Certains facteurs inhérents à notre protocole peuvent expliquer cette
différence. Ainsi, les lieux de collecte des tiques, le matériel biologique utilisé pour les amplifications
par PCR (tiques entières vs glandes salivaires), mais surtout la détection d’autres parasites
éventuellement présents chez la tique et détectés avec ces amorces sont autant d’explications
possibles. Enfin, l’hypothèse d’une éventuelle contamination au moment de la dissection des tiques
pouvant expliquer l’importance de notre valeur n’est pas exclue. Les études futures visant à déterminer
la prévalence de tiques infectantes et donc à même de transmettre B. divergens aux bovins vont
nécessiter la mise au point d’amorces spécifiques et efficaces sur glandes salivaires.
Cette étude a d’autre part permis la découverte d’un foyer de B. major en Loire Atlantique, ce qui a
conduit à la mise en place d’un projet spécifique sur ce parasite qui, comme nous l’avons vu, demeure
très peu étudié. Des piégeages de micro-mammifères, des collectes de tiques sur les pâtures et des
prélèvements sanguins ont été effectués tout au long de l’année 2005-2006, et vont permettre
d’apporter de nouvelles informations sur ce parasite. Enfin, notre travail a permis de collecter un grand
nombre de tiques femelles adultes et donc de disposer d’un nombre conséquent de glandes salivaires
disséquées. Ce matériel biologique va pouvoir être utilisé pour des analyses ultérieures, notamment
pour la mise au point d’amorces spécifiques de B. divergens, l’étude de la présence d’autres agents
pathogènes ou des co-infections chez I. ricinus ainsi que les études de génétique des populations de
tiques.

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108
109
 ANNEXES

Annexe I : Clés d’identification d’I. ricinus d’après Hillyard (1996) et

Morel (2000).

Détermination de la famille et de la stase

1) 3 paires de pattes ; capitulum antérieur ; plaques stigmatiques absentes : Larves.
Scutum présent ; pédipalpes à articles inégaux, coalescents, non mobiles entre eux, le
ème
4 réduit.
1-2 paires de soies sous-hypostomales ; organe de Haller ouvert en fosse ou fermé en
capsule (su une seule paire de soies sous-hypostomales, organe de Haller ouvert) ; ocelles et
festons toujours absents : 3-5 paires de soies scutales (si 3 paires, organe de Haller ouvert) :
Ixodidés.
2) 4 paires de pattes ; plaques stigmatiques présentes ; scutum présent ; capitulum antérieur
terminal ; palpes à articles inégaux, coalescents non mobiles entre eux, le 4ème réduit ; plaques
stigmatiques postérieures aux coxae IV ; tégument souple strié ; dimorphisme sexuel accusé :
Nymphes et adultes Ixodoïdes.
3) Sillon périanal en courbe antérieure à l’anus, à branches postérieures parallèles ou
convergentes ; hypostome à files de dents inégales ; 1 ou 2 paires de soies sou-hypostomales :
organe de Haller ouvert en fosse ou fermé en capsule (si une seule paire de soies sou-
hypostomales, organe de Haller ouvert) ; ocelles et festons toujours absents ; tarse I dépourvu
de sillon périapical transverse : Nymphes et adultes Ixodidés.
Scutum seulement sur la partie antérieure de la face dorsale ;
Gonopore et aire poreuses absents : Nymphes.
Aires poreuses présentes ; gonopore au niveau des coxae III ou IV : Femelles.
Scutum recouvrant toute la face dorsale (conscutum) ; gonopore au niveau des coxae II ou
III ; tégument ventral sclérifié entre les sillons ventraux et périanal ; hypostome à
denticulation très inégale, peu développée, parfois réduite (mâles non fixés sur l’hôte) :
Mâles.

Détermination de l’espèce d’Ixodes

Pattes de longueur et d’épaisseur modérées ; présence de deux aires poreuses ; pédipalpes
sans épine latérale sur l’article I ; espèce longirostre avec des pédipalpes longs, articles II et
III de même longueur ou plus long que la largeur de la base du capitulum ; 2 épines sur le
coxa I, l’interne mesurant 3 fois la longueur de l’externe : Ixodes ricinus.

110
Annexe II : Résultats détaillés par élevage des amplifications par PCR
avec les amorces Bab et Ir sur glandes salivaires de tiques.

Résultats des PCR réalisées sur les tiques de l’élevage A

+ : PCR positive ; - PCR négative ; D : résultat douteux ; vérif : vérification après un résultat douteux ou négatif.

Double amorce
n° tube Amorce Bab Amorce IR
Bab/IR
1 +/+
2 +/+
3 +/+
4 +/+
5 +/+
6 +/- Vérif -
7 - / - vérif - / - Vérif -, 2ème vérif -
8 +/+ Vérif +
9 +/- D
10 +/+ Vérif -
11 +/-
12 +/-
13 +/-
14 +/-
15 +/-
16 +/-
17 +/-
18 +/-
19 +/-
20 +/-
21 +/-
22 +/-
23 +/+
24 +/+
25 +/+
26 +/+
27 -/- Vérif + Vérif +
28 -/- Vérif + Vérif +
29 -/- Vérif + Vérif +
30 +/-
31 -/- Vérif + Vérif +
32 -/+ Vérif +
33 +/-
34 +/-
35 -/- Vérif + +
36 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
37 +/-
38 +/-
39 +/-

111
 40 +/+
41 +/+
42 +/-
43 +/+
44 +/-
45 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
46 +
47 D vérif - - vérif +
48 +
49 +
50 +
51 +
52 D vérif - - vérif +
53 - vérif - - vérif +
54 +
55 - vérif +
56 - vérif - - vérif +
57 - vérif - - vérif +
58 - vérif +
59 +
60 +
61 +
62 +
63 +
64 - vérif + - vérif +
65 +
66 +
67 - vérif – plus d’adn? - vérif +
68 - vérif – plus d’adn? - vérif +
69 +
70 - vérif + - vérif +
71 - vérif + +
72 +
73 - vérif - - vérif +

112
 Résultats des PCR réalisées sur les tiques de l’élevage B
Double amorce
n° tube Amorce Bab Amorce IR
Bab/IR
1 -/+ Vérif +
2 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
3 -/- Vérif + Vérif +
4 -/- Vérif -, 2ème vérif + Vérif +
5 -/- Vérif -, 2ème vérif + Vérif +
6 -/- Vérif + Vérif +
7 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
8 -/- Vérif -, 2ème vérif - Vérif D, 2ème vérif +
9 -/- Vérif -, 2ème vérif - Vérif D, 2ème vérif +
10 -/- Vérif -, 2ème vérif - Vérif D, 2ème vérif +
11 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
12 -/- Vérif + Vérif +
13 -/- Vérif -, 2ème vérif + Vérif +
14 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
15 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
16 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
17 -/- Vérif - Vérif -, 2ème vérif +
18 -/+ +
19 -/- Vérif -/D, 2ème vérif +
20 - - vérif -
21 +
22 +
23 +
24 +
25 +
26 +
27 D vérif +
28 - vérif + +
29 D vérif +
30 +
31 - vérif - +
32 +
33 +/D vérif D
34 +
35 +
36 +
37 D vérif -, 2ème vérif - +
38 - vérif - +
39 +
40 +
41 +
42 D vérif +
43 D vérif +
44 +
45 +
46 - vérif +
47 +
48 - vérif +

113
 49 +
50 D vérif +
51 - vérif +
52 D vérif +
53 +
54 +
55 +
56 +
57 +
58 +
59 +
60 - - vérif -
61 +
62 +
63 +
64 +
65 +
66 +
67 +

Résultats des PCR réalisées sur les tiques de l’élevage C

n° tube Amorce Bab Amorce IR
1 D vérif (+)
2 (+) vérif (+)
3 +
4 +
5 +
6 +
7 +
8 +
9 +
10 +
11 (+) vérif (+)
12 +
13 D vérif (+)
14 +
15 +
16 D vérif (+)
17 +
18 +
19 (-) vérif (+)
20 +
21 +
22 +

114
Résultats des PCR réalisées sur les tiques de l’élevage D
n° tube Amorce Bab Amorce IR
1 +
2 +
3 +
4 +
5 +
6 +
7 +
8 +
9 +
10 +
11 +
12 +
13 +
14 +
15 +
16 +
17 +
18 +
19 +
20 +
21 +
22 +
23 +
24 (-) vérif (+) +
25 +
26 +
27 +
28 +
29 (-) vérif (+) +
30 +
31 +
32 +
33 +
34 +
35 +
36 +
37 +

115
Annexe III : Résultats détaillés par élevage des sérologies réalisées par
la technique d’immunofluorescence indirecte

Résultats sérologiques de l’élevage A

Ag Bd : antigène Babesia divergens ; F.p. : fluorescence partielle.
Numéro de Ag élevage A (bovin n° 335)
Ag B.
travail des
divergens 1/80 1/160 1/320
bovins
14 - - - -
15 - F.p.
111 - - - -
204 - - - -
327 - + +/- -
329 - ? +/- +/-
330 - - - -
335 - + - -
351 - - - -
547 - - - -
942 - - - -
1340 - F.p.
2060 - + +/- -
2061 - - - -
2350 - + +/- -
4399 - + + -
4456 - +/- ? - -
4515 - - - -
7238 -
7288 - - -
8298 - - - -
8666 - + + -
9004 - +/- ? - -
9010 - + - -
9322 + + -
9382 -

116
Résultats sérologiques de l’élevage B
Numéro de
Ag B. divergens
travail des bovins
3837 -
3852 -
3854 -
3856 -
3889 -
3892 -
3899 +/- au 1/80ème
3948 -
3950 -
3951 -
3961 -
3968 -
3970 -
3974 -
3985 -
3991 -
3994 -
4002 -
4003 -
4014 -

Résultats sérologiques de l’élevage C.

Numéro de
Ag B. Divergens
travail des bovins
4843 -
4931 -
4983 -
5020 + au 1/160ème
5036 -
5060 -
5070 -
5081 -
5120 -
5121 -
5142 -
5144 -
5167 -
5176 -
5177 -
5179 -
5183 -
5208 -
5223 -
5252 -
5263 -
5268 -
5835 -
7414 -

117
 Résultats sérologiques de l’élevage D
Numéro de Ag B. divergens Ag B. major MAC 1,
travail des dilutions 1/80 ; 1/160;
1/80 1/160 1/320
bovins 1/320.
6416 + + +/- + aux trois dilutions.
6426 D D D + aux trois dilutions.
6430 - - - + aux trois dilutions.
6439 + + +/- + aux trois dilutions.
6457 + + +/- + aux trois dilutions.
6469 D D D + aux trois dilutions.
6474 - - - + aux trois dilutions.
6482 - - - + aux trois dilutions.
6483 + + +/- + aux trois dilutions.
6484 + + - + aux trois dilutions.
6485 - - - + aux trois dilutions.
6487 - - - + aux trois dilutions.
6499 - - - + aux trois dilutions.
6502 + + +/- + aux trois dilutions.
6503 + + + + aux trois dilutions.
6509 + + +/- + aux trois dilutions.
6510 - - - + aux trois dilutions.
6517 - - - + aux trois dilutions.
6518 - - - + aux trois dilutions.
6519 - - - + aux trois dilutions.
6520 - - - + aux trois dilutions.
6522 - - - + aux trois dilutions.
6523 - - - + aux trois dilutions.
6530 + + - + aux trois dilutions.

118
 Annexe IV : Estimation de la présence de Babesia divergens dans le
sang des bovins par IFI et par culture in vitro détaillée par élevage

Elevage A

Cultures + : cultures positives ; Cultures - : cultures négatives. Sérologies + : sérologies positives ; sérologies - :
sérologies négatives ; sérologies D : sérologies douteuses.

Numéro de Sérologie anti-

travail des Cultures B. divergens Ag
bovins 335
0014 - -
0015 - D
0111 - -
0204 - -
0327 + +
0329 + +
0330 + -
0335 + +
0351 - -
0547 - -
0942 - -
1340 - D
2060 - +
2061 - -
2350 - +
4399 - +
4456 - +
4515 - -
7238 - Non réalisée
7288 - -
8298 + -
8666 - +
9004 - +
9010 - +
9322 + +
9382 - Non réalisée

119
 Elevage B

Cultures + : cultures positives ; Cultures - : cultures négatives. Sérologies + : sérologies positives ; sérologies - :
sérologies négatives ; sérologies D : sérologies douteuses.

Numéro de
Sérologie anti-
travail des Cultures
B. divergens
bovins
3837 - -
3852 - -
3854 - -
3856 - -
3889 - -
3892 - -
3899 + D
3948 - -
3950 - -
3951 - -
3961 - -
3968 - -
3970 - -
3974 + -
3985 - -
3991 - -
3994 - -
4002 - -
4003 - -
4014 - -

120
 Elevage C

Cultures + : cultures positives ; Cultures - : cultures négatives. Sérologies + : sérologies positives ; sérologies - :
sérologies négatives ; sérologies D : sérologies douteuses.

Numéro de
Sérologies anti-
travail des Cultures
B. divergens
vaches
4843 - -
4931 - -
4983 - -
5020 - +
5036 - -
5060 - -
5070 - -
5081 - -
5120 - -
5121 - -
5142 - -
5144 - -
5167 + -
5176 - -
5177 - -
5179 - -
5183 - -
5208 - -
5223 + -
5252 + -
5263 - -
5268 - -
5835 - -
7414 - -

121
 Elevage D

Cultures + : cultures positives ; Cultures - : cultures négatives. Sérologies + : sérologies positives ; sérologies - :
sérologies négatives ; sérologies D : sérologies douteuses.

Numéro de travail Cultures Cultures Sérologies anti- Sérologies anti-B.

des vaches B. divergens B. major B. divergens major
5648 + + Non réalisée Non réalisée
6416 - - + +
6426 - - D +
6430 - - - +
6439 + - + +
6457 + - + +
6469 - - D +
6470 + - Non réalisée Non réalisée
6474 + - - +
6482 + - - +
6483 + - + +
6484 - - + +
6485 + - - +
6487 - - - +
6499 - - - +
6502 + - + +
6503 + - + +
6509 + - + +
6510 - - - +
6517 + - - +
6518 - - - +
6519 + - - +
6520 + + - +
6522 + - - +
6523 + - - +
6530 + - + +

122