Techniques de
BIOLOGIE MOLECULAIRE
1ère ANNEE MASTER
2020/2021
Semestre 1
Pr. Rajae Ramdan
Plan du cours
Les techniques de biologie moléculaire
• Préparation des acides nucléiques
(Extraction et Purification)
• Evaluation quantitative et qualitative des AN
• Amplification in vitro et in vivo des AN
• Séquençage des AN
EXTRACTION ET PURIFICATION
DES ACIDES NUCLÉIQUES
Les types d’échantillons
Les leucocytes Les biopsies Autres liquides
(GB) tissulaires biologiques: salive…
Les méthodes d’extraction/purification des acides
nucléiques sont généralement des combinaisons de
deux ou plusieurs techniques et avec plusieurs étapes :
Lyse des cellules
Elimination des protéines
Elimination des autres acides nucléiques (ARN, etc.)
Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool
Extraction/précipitation
Chromatographie
Centrifugation
Séparation par affinité
1
Extraction d’ADN à partir des cellules eucaryote
Exemple 1: Extraction et purification d’ADN génomique à
partir d’un prélèvement de sang;
Exemple 2: Extraction et purification d’ADN génomique à
partir d’un échantillon végétale.
2
Extraction d’ADN à partir des cellules procaryote
Exemple : Plasmide (purification par lyse alcaline)
I. Extraction d’ADN
L’extraction d’ADN consiste à isoler les molécules d’ADN
à partir d’un organisme, un tissu ou des cellules pour
permettre sont analyse.
Les principales étapes de l’extraction d’ADN sont la
destruction des tissus et la lyse cellulaire, l’inactivation
d’endonucléases, l’élimination des protéines et
peptides, et enfin la purification de l’ADN.
Destruction des tissus et lyse cellulaire
Les méthodes les plus utilisées sont:
Des méthodes mécaniques: La destruction mécanique
des tissus consiste à broyer le matériel biologique frais
ou congelé à l’aide d’un mortier;
Les méthodes enzymatiques font appel à des enzymes
permettant la lyse des tissus comme la protéinase K;
Les méthodes chimiques utilisent des produits
entraînant la désorganisation des membranes cellulaires
comme les détergents (SDS, TritonX100, CTAB).
1
Extraction d’ADN à partir des cellules
eucaryote
Exemple 1
Extraction et la purification d’ADN à partir d’un
prélèvement de sang
Prélèvement de sang veineux au pli du coude.
Le sang est recueilli sur EDTA,
Rôle de l’EDTA:
Se lie aux cations divalents de la paroi cellulaire, affaiblissant
ainsi l'enveloppe cellulaire.
Après la lyse cellulaire, l'EDTA limite la dégradation de l'ADN en
liant les ions Mg2+, cofacteurs nécessaires des nucléases.
(EDTA : acide éthylène diamine tétra-acétique)
Pour faciliter l’extraction de l’ADN on isole du sang total un
culot de cellules nucléés:
les lymphocytes
(=Des leucocytes dont le rôle est la défense immunitaire
de l'organisme face aux agressions infectieuses)
1. Le sang est déposé en 2. Les lymphocytes
gradient de densité dans sont recueillies à la
un tube à centrifuger, limite supérieure de
au-dessus d’une couche la couche de Ficoll,
de polyfluorocarbone les autres cellules
plus denses ont
sédimenté
3. Lavage des
4. Formation d’un
lymphocytes
culot blanc au fond
du tube
Extraction de l’ADN
1.L’extraction de
l’ADN se fait par
broyage dans une
presse à tissus
Débris membranaires
2. Homogénéisation
dans un tube de Potter
3. Dissoudre
l’homogénat avec
une solution de lyse
4. Purification des
solutions d’AN et de
protéines par addition
de phénol saturé de
tampon Tris-EDTA
5. Recueille de la phase
aqueuse et Lavage par
le chloroforme et
l’alcool isoamylique
Purification de l’ADN
Se fait le plus souvent par précipitations répétées dans l’alcool
qui suffisent à débarrasser l’AN des protéines contaminantes
et enzymes
Une solution d’ADN
est additionnée d’un
large excès d’éthanol
absolu
Le culot est égoutté,
Lavage de l’ADN puis séché sous vide
On peut conserver l’ADN purifié,
à sec ou le redissoudre par H2O ou
Tris-EDTA
Exemple 2
Extraction et purification d’ADN à partir
d’un échantillon végétale
Extraction et purification de l’ADN des plantes
1. Attaque mécanique: 2. Lyse chimique: 3. Séparation par
broyage, cassures des Tampon d’extraction: affinité aux phases
structures, usage de l’azore -Tris-HCl 100mM (pH=8)
liquide - CTAB (0,3%)
- EDTA 20mM
- NaCl 1,4M
- 2-mércaptoéthanol 1%
Apparition
Lavage de l’ADN (+ARN) 4. Précipitation de l’ADN
parforme
sous l’éthanol à 70%
de pelotte
Les perturbations des parois cellulaires et des membranes sont généralement
réalisées avec une combinaison appropriée d'enzymes pour digérer la paroi
cellulaire et de détergents pour rompre les membranes.
Le détergent ionique le plus couramment utilisé à cette étape est le SDS.
L'ARN est généralement dégradé par l'addition de RNase.
Les protéines sont soumises à une dénaturation chimique et / ou à une
dégradation enzymatique par addition de protéinase-K.
La technique d'élimination des protéines la plus courante implique la
dénaturation et l'extraction dans la phase organique, à savoir le phénol et
chloroforme.
2
Extraction d’ADN à partir des cellules
procaryote
Exemple : Plasmide (purification par lyse alcaline)
Le plasmide est un morceau circulaire d’ADN présent dans les
bactéries. Dans de nombreux cas, il porte des gènes non
essentiels, qui sont responsables de la survie d'une bactérie dans
des conditions défavorables.
Protocole d'extraction d'ADN plasmidique par lyse alcaline
L'extraction de plasmide par lyse alcaline nécessite un ensemble de reactifs
et tampons d'extraction et de purification des A N:
Un milieu de culture pour la préparation de susupension bacterienne;
Tampons et reactifs (EDTA, Hydroxyde de sodium NaOH…)
Protocole d'extraction d'ADN plasmidique par lyse alcaline
Cette méthode permet de préparer
sélectivement l'ADN du plasmide,
tout en éliminant l'ADN du
chromosome bactérien
pH:13
-L'ADN chromosomique, très long
(~10⁶ paires de base),
-L'ADN plasmidique, court (~10³
paires de base),
Conservez le tube à -20 ° C jusqu'à
utilisation ultérieure.
Observations sur l'extraction d'ADN plasmidique par
lyse alcaline
Passez l’ADN plasmidique isolé sur un gel d’agarose à 0,8% et observez
le schéma de formation de bandes qui sera visible en fonction de leur
vitesse de migration;
Mesurer la DO à 260 et 280 pour vérifier la quantité et la qualité du
plasmide isolé.
II. Extraction de l’ARN
L’extraction de l’ARN est la première étape du diagnostic
moléculaire .
Dans les laboratoires de diagnostic, l’extraction d’ARN est
généralement effectuée à l’aide de kits commerciaux.
Les kits commerciaux d’extraction d’ARN sont tout basés sur les
mêmes principes et doivent être utilisés selon les instructions du
fabriquant.
Isolation de l’ARN
Le [Link] est utilisé pour :
- lyser les particules virales pour
extraire ARN et ADN;
- empêcher l'activité des RNases
et DNases qui pourraient
endommager l'extrait.
Centrifugation en gradient de Chlorure de Césium
Si l'on charge un mélange d'ADN et d'ARN sur un gradient de
CsCl2 6M et que l'on centrifuge à l'équilibre, chaque
macromolécules se répartit selon sa densité.
(a) Supposons que l'on traite ce mélange d'ADN et d'ARN par
une RNase on n'observe plus qu'une bande qui migre à la
densité de l'ADN. (b)
protéine = 1,3g/ml ARN = 1,75-1,89g/ml ADN = 1,6-1,79g/ml.
Purification de l’ARN
(Chromatographie d’affinité)
Une purification meilleur doit remplir deux conditions:
- ADN suffisamment pur
- ADN non altéré
