LÀ SPE<iTRQSGQPIE

I. , Introduction , • •
La spectroscopie est l'ensemble dés techniques qui permettent d*afialyser : - la lumière émise
par une source lumineuse - la lumière transmise bU réfléchie par un corps absorbant. -
L'interaction de la lumière avec là niatièrÉ est â i'origine de la majeure partie des phénomènes
électriques, magnétiques, optiques ét chimiques observés dans notre environnement proche.. .

II. Domaines d'application

La spectrophotôtnétHe est utilisée dàris divers domaines : chimie, pharmacie, environnement,
agroalimèritaice, bioliagié etc,.., aussi bien au laboratoire que sur site industriel. Exemple :
Dans l'industrie pharmaceutique, de nombreux dosages de médicaments sont réalisés par
spectrophotomëtrie d'absorption U V - V I S .

III. Spectroscopie XJV-Visible

3.1. Principe
Lorsque les radiations électromagnétiques rencontï'ent la matière, oïl observe une interaction,
entre matière et oridë é l e c t r q m a ^ é t i q u e . "~ . ' :, , ... " • *
On parle de spgÇteQscopielJJ/^visible, lorsque c e s j n t e m c t i o n ^ ^ îedomaiiv
UV-Visible (UVjlOOJAOQnm et Visible 400 à 8 0 ^ 1 1 ) 7 " ^ " "

Le spectrophotomètre fait passerune radiation (lumière) monochromatique (une seuje

lfw£T^ffln-jjW travgrs ^]TI(;> inngnf^yfX (longùeiif dé la cuve) de solution &tmesuis
l'absorbancc A (grandeur liée à la quantité de lumière absorbée par la solution).

U n spectrophotomètre permet de visualiser ces bandes d'absorptions.

I 1 i*^ i \' ' I

-'•:::--^D,024 Ai
' i

•''*:iniî[Link]:it;i;-.ir

-'^J'^^l On trace ainsi des Spectres de transmission, OU bien d'absorption.

A ' ^ P ' ^ ^ s spectre de transmission renseigne sur tout ce qui n'a pas été absorbé. Le spectre
-^'vd'absorption se déduit directement du spectre de transmission. Il renseigne sur toutes les
-lP radiations absorbées.

3.2. La loi de Beer-Lambert

L'absorbancc dépend de la couleur de la radiation, de sa longueur d'oride • G.
Soit 10 l'intensité de la lumière incidente et 1 l'intensité de la lumière transmise.
Le spectrophotomèti-e_com£are I etIO à travers soit la transmittance T CL = 1 /10) ou
l|absûriaâncë
4^,^J=iegX-(les 2 mesures sont possibles)
Si l'énergie associée à la radiation de longueur d ' o n d e n ' e s t pas du tout absorbée par la
solution étudiée alors A(>.1) = 0 . L'énergie est transmise à 100 / 100 = 1 = 1Q 0 = T.
Si l'énergie associée à la radiation de longueur d'onde À2 est absorbée à 99 % par la solution
étudiée alors A(?w2) = 2. L'énergie est transmise à 1 /100 = 0,01 = 10 - 2 - T
Il faut régler le zéro en plaçant le solvant dans la cuve et l'absorbance doit être nulle.
L'absorbancc A est proportionnelle à la concentration de la solution selon la L o i de Beer-
Lambert.

A.==8xLxC
Avec : •
A : absorbance de la solution (sans unité)
L : longueur de la solution traversée par la lumière (en cm)
C : concentration de la solution (en mol.L"')
s: coefficient d'extinction molaire (en [Link]"'.cm"')

8 dépend de la nature de la solution et de la longueur d'onde

3.3. Coukur perçue et longueur djonde maximale

Unejesgèce_chimigue est caractérisée en spectroscopie UV-visible par la longueur d^onde
(max) du maximum d'absorption et p t F î a vïïiéur""d^û c^^^ molaire e(Xmax )
correspondante.. ~~ —— ~ ~

1-
A

0,8 -
\ On trace tout d'abord le spectre
d'absorption A = f( À, ) afin de
i %

\ déterminer le maximum
0,6- f
d'absoiption \.
\
0,4 -
\
\
/ \
./
/ \
>.(fnQx) \
400 500 600 700
Longueur d'ondo dans l'air Inm)

Cette longueur d'onde ^^max est directement liée à la substance étudiée et à sa couleur
éventuelle.
En effet, la radiation préférentiellement absorbée correspond à la couleur complémentaire de
celle de la substance:
 . Couleurs observées

. Jaune Bleu-veri exp : À,max 650 nm, là Solution

absorbe la [Link], elle est alors
bleue (couleur complémentaire) (voir
Jaune Cyan
flèche)
Remarque: une substance incolore

Jaune-
absorbe dans l ' U V : Àmax= 250 nm . .
orange BI6U

Orartge BleU'
violet

Violet
Magenti

Lorsqu'une espèce absorbe dans plusieurs domaines de longueurs d'onde, sa couleur résulte
de la synthèse additive des couleurs complémentaires des radiations absorbées.
Exp : Le vert de bromôcrësol absorbe à ^max = 440 nm ét à Xmax = 615 nm, les coiileurs
complémentaires soîîl: jaune-orange et bleu-vert, lé mélange donne du vert.

3.4. Dosage par étalonitage : ' ;- ;, A A

On peut ensuite effectuer une d é t e r t r t i n ^ ^ .
concentration de la substance en effectuant un dosage
par étakjnnage. On réalisé alors jîlusîeûrs^iolutiohs de
concgntration connues pour lesquelles on détermine •
l'absijrbance^ à la valeur de 1 max.. O n l t o c ê ï a ^ o u r b e
d'étalonnage, A e n f o n c t i o n de C.
En mesurant l'absorbance AS d'une solution inconnue
et en la repjDoctapOïïDâlcoûr
concentration .CS de la solution iricopoue

IV. Spectroscopie infra-rouge

4.1. Principe
Quelque soit leur état physique, les atomes d'une molécule ne sont pas immobiles : ils
subissent des vibrations d'élongation ou de déformation à une fréquence bien déterminée qui
dépend des atomes mais aussi de l'envirormement de la liaison.
Pour une fréquence d q p n ^ ^ lumière IR absorbée, ces liaisons rentrent
en résonance : l'énergie apportée est alors consommée : les molécules absorbent et la
transmittance T (proportion d'énergie transmise par un échantillon) diminue. Si on représente
sur un graphe l'évolution de la transmittance T en fonction du nombre d'onde o (la fréquence
divisée par la vitesse de la lumière dans le milieu), on observe des variations.
 G = 1 / A, (en cm ' )
Un spectre IR renseigne donc sur la
nature des liaisons dans une molécule,
sur ses groupes caractéristiques.
Une transmittance de 100% signifie que 'à. II. li i '
l'échantillon n'absorbe rien, d'où des
bandes vers le bas en cas d'absorption

4.2. Exploitation de spectres

On distingue généralement deux zones dans un sp^fre I R
Nombre d'onde g compris entre 1500 et 4000 cm" .
On étudie cette zone car elle permet de visualiser les
bandes d'absorption des groupes caractéristiques.
On s'intéresse aussi à la position de la bande (indiquée jjar
son nombre d'onde), à sa largeur (bande large ou fm^^'et à
son intensité (valeur minimales de T)

Nombre d'onde o compris entre 400 et 1500 cm"

Cette zone s'appelle l'empreinte digitale de la molécule ;
elle comporte beaucoup de bandes, et n'est exploitable que
par comparaison avec un spectre de référence.

Exp : t [Link]*-*'**

- O
Su-
O h

0'-

liquide.

C=N
M-H O-H c=c
4000 3200 2800 2300 2100 1800 1500 900
:X-H
(liaison H-heteroatome) C M Triples • _pout3les Simples
1_

I I I _L
4000 3000 2380 cm 2000 1460-1380 cm' 1000
co. nujol

Quelques domaines d'absorption correspondant à divers types de liaisons chimiques. Les

nombres d'onde sont exprimés en cm""'.
4.3. Apiparëillage

Dans un spëdtroniètré infrarouge un rayon de lumière infrarouge est produit et séparé en deux
faisceaux. L'un passé au. travers de l'échantillott, l'autre au ttavers d'une référence qui est
parfois le coftipôsé dans lequel l'éciiaiitillon a été dissous.. Lés faisceaux sont ensuite réfléchis.
jusqu'à un détecteur, après être pasisés'par iin séparateur qui alterne rapidement les faisceaux. •
entrant dans le détecteur. Les deux signaux sont comparés et le sjpectrè ainsi obtenu tracé.

Schéma de fonctionnement d'^un spectromètre infrarouge .,

V. Spectrométrîede masse .
Mass Spectrometry ou MS est une technique physique d'analyse permettant dé détecter et ; ,
d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur ihasse et de caractériser leur structure
chimique.

5.1. Principe ' .

Un composé organique introduit dans le spectromètre de masse est ionisé par bombardement
électronique à 70eV. L'ion ainsi obtenu, appelé ion moléeulaire, permet la détermination de
la masse molaire du composé. I l peut y avoir des ruptures des liaisons chimiques au sein
de l'ion moléculaire, formant ainsi des ions fragments caractéristiques puisque cette
dissociation éventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mécanismes bien déterminés.
Ces ions fragments sont ensuite séparés en fonction de leur rapport masse/charge par
l'application d'un champ magnétique et/ou électronique, puis collectés par un détecteur.
L'ensemble de ces ions fragments constitue le spectre de masse dont la lecture permet
l'identification de la structure moléculaire.

5.2. Appareillage

La composition de base d'un spectromètre de masse:

• Un système d'introduction de l'échantillon

• Une source d'ions ou chambre d'ionisation
• U n analyseur qui sépare les ions en fonction de leur masse et de leur charge
 Un détecteur qui détecte ies ions sortant de l'analyseur

Source d ions Analyseur en masse m/z Oeieclion Trailerrwnt du signa/

Toluène C T H ,
MASS SPECTRUM (Électron ionization)
100
Suivant le type d'ionisation utilisé,

à
&-
afi un spectre de masse peut être
Ht caractéristique d'une molécule.
u
1C 60- Ainsi en le comparant avec des
banques de spectres, i l est
Tolueno cficmiûaf siRjc&jre
< 40" possible d'identifier la molécule.

ai 20 Une spectrométrie de masse

utilisant l'ESI (ionisation
0.0 H- electrospray) présente souvent ses
15 30 45 60 75 90 105 résultats sous forme de m/z (ou
m/z
masse / charge) pour présenter la
proportion des différentes formes
chargées d'un m ê m e composé.

HPLC couplé à un spectromètre de masse

I fi
. \
 / -

/ V I . Résonance magnétique nucléaire

-6.1.Définition ,/'' • ••'^v

— " :^: ^T-.^ 'V\yv ''/'r^:' -Ç'
;,; l a résonance magnétique nucléaire (RMN) est une propriété de certains noyaux atomiques
; ^^y'. . V; possédant un spin nucléaire (par exemple'h, '^C, " Ô ' •''F, " f , " ^ e / . . ) , : placés darts un champ
magnétique. Lorsqu'ils sont soumis à uh rayonnement électromagnétique (radiofréquence), le plus '
souvent appliqué souà fonne d'impulsïoris, les noyaux atomiques peu
:. rayonnement puis- la relâcher lors de la relaxation.L'éuergie mise en jeu Iprs de ce phénomène de
V résonancecorresporidàunefréquenceti-èsprécise, dé
. . [Link]éculâires. Ce phénomène permetdonc IPbservatiôn des propriétés quam -,
magnétiques des npyai^x dans les phases gaz, liquide ou. solide. Seuls les atomes dont les. noyaux •
possèdent un momerit-màgrtétïquedoriheritlieu:auphén^^ ".-

6.1. Principe : i '

La R M N tiré sdri explication du fait que lés noyaux des atomes (les protons et les neutrons)
possèdent une softe dé « petit aitharit » interne que les physiciens appellent « spin ». Oh peut
donc dire qu'un atome possède aussi un spin en ajoutant tous les spins de chaque particule qui
le compose. A noter que si 2 petits aimants sont iiiverses l'un de l'autre, alors ils s'annulent et
le spin résultant est ainsi nul.

Si on applique un chattip magnétique à ces « petits aimants », ils vont alors se mettre à
tourher sur eux m ê m e en décrivatit un cône, un peu à la manière d'une toupie, c'est le
phénomène de la précession de Larnior.
Ainsi, tous les atomes ayant un nombre de protons et de neutrons pair come ToXygène (4
protons + 4 neutrons) et le carbone (i8 protons + S neutrons) ont un spin nul et ne sont donc
pas soumis au phénomène de R M N . En revanche; tous les. atomes ayant un nombre de protons
et dé neutrons im|)air sont soumis à ce phénomène de résonance magnétique tel l ' h y d r o g è n e
(1 seul proton). L'hydrogène est intéressant en R M N car i l très bien connu des scientifiques et
i l est présent en grande quantité dans les molécules.

Le spectre R M N correspond à l'àbsorptioh par certains atomes de l'échantillon, de certaines

des fréquences présentes dans la source électromagnétique. L'interprétation de ces signaux
(position, aspect, intensité) conduit à un ensemble d'informations d'où l'on déduit des détails
de structure concernant l'échantillon. Ces essais peuvent être effectués en phase liquide ou
solide

6.3. Appareillage
D'un point de vue technique, la prise d'un spectre nécessite un matériel relativement complexe
du fait de la faible intensité du phénomène mis en jeu. L'échantillon est préparé dans un tube
en verre borosilicaté dans un solvant dépourvus, si possible, d'atomes correspondant à
l'isotope étudié. Par exemple, le solvant de choix pour l'étude des spectres protons est le
chloroforme deutérié CDCI3. Son choix est issu de plusieurs avantages : le proton du
chloroforme est facilement échangé par un deutérium, i l est donc peu cher et de plus, le
deutérium résonnant à une fréquence différente du proton, i l est utilisé pour stabiliser le
champ magnétique extérieur, aussi bien dans le temps (stabilité) que dans l'espace
(homogénéité). Ces deux aspects du champ sont importants puisque compte tenu de la nature
extrêmement ténue du signal, une variation spatiale et/ou une dérive temporelle provoqueront
un élargissement important des signaux risquant de faire disparaître les figures de couplage.
 La sensibilité d'une expérience de R M N
s'améliore avec l'accroissement du champ
magnétique ce qui nécessite l'utilisation
d'aimants supraconducteurs. Ils permettent
•foun-'lle; du iKUisfen
de faire circuler un courant très intense (de
plusieurs dizaines d'ampère) dans un circuit
de résistance nulle. Ainsi aucune perte
d'énergie par dissipation thermique n'est à
déplorer, alors qu'une bobine en cuivre dans
d'Azote
les m ê m e s conditions dégagerait une énergie
qui la ferait fondre ! Le prix à payer est qu'à
l'heure actuelle, la plupart des matériaux
supraconducteurs ne le sont qu'en dessous
d'une certaine température (dite critique) qui
est très faible (de l'ordre de -270 °C), ce qui
Dispûsitii'
nécessite l'emploi d'hélium liquide (qui bout
(HK'[Link] à -269 °C). A f i n d'assurer un minimum de
ix'imetiaiu perte thermique, celui-ci calorifiigé à l'aide
l'introduction du
d'azote liquide (bouillant à -196 °C).
tube (échanlilion)
daii!; la mnde

Un spectre R M N comporte des pics ou

séries de pics appelés « signaux »
correspondants à la résonance des
différents protons présents dans la
molécule. Ces signaux sont placés sur un
axe horizontal indiquant une grandeur
6.4. Spectre R M N appelée « déplacement chimique » notée ô
et exprimée en partie par million (ppm).

[Link];; et! Le déplacement chimique reflète le

décalage entre la fréquence de résonance
des protons de la molécule étudiée et une
fi-équence de résonance prise pour
référence. En général la fréquence prise
pour référence est la fréquence de
résonance des protons de la molécule de
^>> î'] K ;
tétramethylsylane (TMS).

Une molécule contient des protons identiques qui seront représentés par un seul pic dont l'air
est proportionnel au nombre de protons présents. Le spectre R M N du proton aura donc
plusieurs signaux avec différents déplacements chimiques, représentant les différents
environnements et non le nombre de protons présents.

L'intégration des signaux afin d'obtenir l'air sous les pics permet de connaître le nombre total
de protons présents.
 r

• Spéctrdscbpie R M N en^^^^^

"• À côté de la fadipcfistallograiphié, l a

macromoïéculés biologiques é n biologie struCturàlérElle rie riécessite pas robténtion de
nionocristaux et pèmiet d'étudier dés: prp^^ des acides nucléiques à des concentrations
. • niillirnolaireS-Lestechniqùes de RMN^^n^ conduisent à corréler les
.-. •• fréquences de plusieurs Spiris et d é résoudre les. ambiguïtés liées aux superpositions spectrales.
Des protéines de;,imàsse moléculàiré^^d^^
, •; ' oligôhUcléotideB de plusieurs dizaine

• Là kMN Citi iniiàgerie médte^

L'imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM) est une technique d'imagerie médicale
permettant d'avoir Une vue 2D ou 3 b d'une partie du corps. Cette technique est très utile pour
, l'observation du cerveau. Grâce aux différentes séquences (séquence I R M ) , [Link] observer
différents tissus avec dés contrastés très élevés, car la résolution en contraste est nettement
. meilleure que Celle du sCahne. :^ . .