Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Université Abderahman Mira

Béjaia

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences Alimentaires

POLYCOPIE DE COURS

Méthodes Séparatives

Dr . HADDADI GUEMGHAR H.

Polycopié destiné pour

les étudiants en Licences
du département des
Sciences Alimentaires
 Sommaire

Partie I : Chromatographie et notions fondamentales 1

1. Historique 1

2. Principe de la chromatographie 2

3. Classification des méthodes chromatographiques 3

3.1. Classification selon la nature des phases 3

3.2. Classification selon la nature des phénomènes mis en jeu 3

3.3. Classification selon la technique mise en jeu 4

4. Grandeurs fondamentales et définitions 4

4.1. Notion de temps 4

4.2. Notion de volume 5

4.3. Notion de concentration 6

4.4. Notion d'efficacité 8

5. Qualité de la séparation 13

5.1. Sélectivité 13

5.2. Résolution 14

6. Notion de pression 14

Références bibliographiques 15

Partie II : Chromatographie liquide à haute performance 17

1. Appareillage 17

2. Etude détaillée des éléments d’un appareil HPLC 19

2.1. Réservoir de solvant (éluant) 19

2.2. Pompe 19

2.3. Vanne d'injection 20

2.4. Colonne 20
2.5. Phase stationnaire 21

2.5.1. Phase normale 21

2.5.2. Phase inverse 21

2.6. Phase mobile 22

2.7. Détecteurs 23

3. Analyse quantitative 24

3.1. Méthode de l'étalonnage externe 24

3.2. Méthode des ajouts 25

3.3. Méthode de l'étalon interne 25

Références bibliographiques 26

Partie III : Chromatographie par échange d’ions 27

1. Schéma de principe d’une installation de chromatographie ionique. 27

2. Les résines échangeuses d’ions 28

2.1. Groupements fonctionnels 29

2.2. Support 30

3. Principe 31

4. Equilibre d’échange ionique 32

5. Séparation des acides aminés 33

Références bibliographiques 35

Partie IV : Chromatographie d’exclusion stérique 36

1. Principe 36

2. Théorie de la CES 38

3. Phase stationnaire 39

4. Applications de la CES 41

Références bibliographiques 42

Partie V : Chromatographie planaire 43

1. Généralités 43

2. Principe 43
3. Mode Opératoire 44

4. Paramètres de la chromatographie planaire 45

5. Application de la chromatographie planaire 46

Références bibliographiques 47

Partie VI : Chromatographie en phase gazeuse 48

1. Introduction 48

2. Principe 48

3. Grandeurs de rétentions 49

4. Instrumentation 52

5. Optimisation d’une analyse CPG 59

Références bibliographiques 59

Partie VII : Electrophorèse capillaire 61

1. Introduction 61

2. Instrumentation 61

3. Principe 62

3.1. Théorie de l’électrophorèse 62

3.2. Ordre de migration 66

4. Efficacité et résolution 67

Références bibliographiques 67
 Partie I :
Chromatographie et
notions
fondamentales
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

Partie I : Chromatographie et
notions fondamentales

1. Historique
La chromatographie est une science très ancienne. Ainsi on trouve la première
référence d'un processus chromatographique dans l'Ancien testament qui fait mention de
propriétés adsorptives de certaine variété de bois pour adoucir de l'eau amère. Ce sont les
tanins hydrophobes qui constituaient une phase stationnaire apolaire (chromatographie
d’adsorption). Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau
de mer. Les phénomènes mis en jeu relèvent ici de l’échange d’ions. Au XVIème siècle, le
strasbourgeois BRUNSWIG purifiait de l'éthanol en faisant passer la vapeur à travers une
éponge imprégnée d'huile d'olive et réalisait une expérience de chromatographie gaz-liquide
400 ans avant la "découverte" de cette technique.

Le mot chromatographie vient du grec chroma (croma), couleur. Cette origine

s’explique historiquement : dans les années 1900, Tswett, botaniste russe, sépara des pigments
végétaux grâce à une nouvelle technique, qu’on appela par la suite chromatographie, par
référence aux composés colorés qui avaient été alors séparés. De nos jours, ce terme
recouvre plus généralement toutes les techniques de séparation de substances en solution
par passage au travers d’un matériau sélectif.

C’est effectivement au début du siècle qu’eut lieu la première expérience de

chromatographie sur papier. Le botaniste russe Tswett sépara des pigments végétaux grâce à
cette technique, qui fut dès lors utilisée dans de nombreux cas en chimie organique. En 1950
apparut la hromatographie en phase gazeuse, puis dans les années 60 la chromatographie
d’exclusion. C’est en 1969, après le 5e Symposium International « Advances in
Chromatography », que la chromatographie en phase liquide s’est véritablement développée.

En fait, dès 1958 Spackman, Stein et Moore analysèrent des acides aminés pour la
première fois de manière automatique. Ceci marqua le début de la chromatographie en phase
liquide moderne. Giddings oeuvra pour le développement de cette technique (cf. Son ouvrage
Dynamics of chromatography), jusqu’à ce que Scott (Oak Ridge National Laboratory)

1
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

obtienne de très bonnes résolutions en séparant plusieurs centaines de composés différents par
échange d’ions sous haute pression. C’est grâce à ce nouveau procédé, et grâce surtout aux
nouvelles technologies (notamment le traitement par ordinateur) que la chromatographie en
phase liquide sur colonne a atteint l’efficacité de la chromatographie en phase gazeuse. Cette
chromatographie en phase liquide sous haute pression, ou haute performance (HPLC) est
désormais la seule utilisée en analyse. Aujourd’hui la chromatographie liquide est la
technique analytique la plus utilisé à l’heure actuelle.

2. Principe de la chromatographie
Le principe de la chromatographie repose sur l'équilibre de concentrations des
composés (soluté S) présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire et la phase
mobile (gaz ou liquide) qui se déplace. La séparation est basée sur l'entraînement différentiel
des constituants du mélange. Ces derniers parcourent la phase stationnaire avec des temps
proportionnels à leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la
phase stationnaire (polarité, ...).
K
[S]phase mobile [S]phase stationnaire

L'élution d'un soluté S en chromatographie est donc caractérisé par la constante d'équilibre K,
appelée aussi constante de partition, de distribution ou constante de Nernst.

C’est le paramètre physico-chimique de base en chromatographie qui quantifie le

rapport de concentration de chaque composé entre les deux phases en présence.

[S]phase stationnaire
𝐾 =
[S]phase mobile

Les facteurs qui contrôlent la séparation sont surtout d'ordre thermodynamique: la rétention de
l'échantillon sur la colonne est donc contrôlée thermodynamiquement.

(eq. 1)

K varie avec la température T suivant l'équation classique (eq.1), où ΔrG° est la différence
d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases. K est >>1 donc ΔrG° est
négative.

2
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

3. Classification des méthodes chromatographiques

On peut classer les méthodes chromatographiques de trois manières:

o selon la nature des phases

o selon la nature des phénomènes mis en jeu dans la séparation
o selon la technologie mise en œuvre.

3.1. Classification selon la nature des phases

Selon la nature de la phase mobile on distingue:

- la chromatographie en phase liquide CPL

- la chromatographie en phase gazeuse CPG

- la chromatographie en phase supercritique CPS

Selon la nature de la phase stationnaire on distingue:

- la chromatographie gaz / solide CGS

- la chromatographie gaz / liquide CGL

- la chromatographie liquide / solide CLS

- la chromatographie liquide / liquide CLL

3.2. Classification selon la nature des phénomènes mis en jeu

Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les
molécules à séparer. On distingue ainsi:

 La chromatographie d'adsorption :

La séparation entre les molécules est fondée sur le processus répété d'adsorption et
désorption par la phase stationnaire. Dans les premières études les phases stationnaires «
modèles d’études » étaient la silice et la cellulose. En conséquence, les phénomènes étudiés
correspondaient essentiellement à des interactions de type liaison hydrogène. D’autres phases
ont été utilisées depuis avec des mécanismes d’échange impliquant des liaisons Van der
Waals, hydrogène et des interactions hydrophobes. Il s'agit d’une chromatographie liquide-
solide.

3
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

 La chromatographie de partage :

La séparation est fondée sur les différences de solubilité des molécules à séparer entre
phase mobile et phase stationnaire liquide (phase qui imprègne ou qui est greffée sur un
solide). Il s'agit alors de chromatographie liquide-liquide (CLL).

 La chromatographie d'échange d'ions :

La phase stationnaire est un solide à la surface duquel se trouvent des groupements

ionisés. La rétention des solutés ce fait grâce à des interactions de type ioniques.

 La chromatographie d'exclusion :

La phase stationnaire est un solide poreux les molécules sont séparé selon leur forme
et leur masse moléculaire.

 La chromatographie d'affinité :

Elle consiste à fixer par exemple une enzyme sur la phase stationnaire

3.3. Classification selon la technique mise en jeu

Selon le support de la chromatographie on distingue:
 la chromatographie sur colonne
 la chromatographie planaire (chromatographie sur papier ou chromatographie sur
couche mince).

4. Grandeurs fondamentales et définitions

4.1. Notion de temps

4.1.1. Temps de rétention tr

Un constituant est caractérisé par son temps de rétention tr qui représente le temps
écoulé entre l’instant de l’injection et celui qui correspond sur le chromatogramme au
maximum du pic qui lui est lié. Le temps de rétention est indépendant de la quantité injectée.

4.1.2. Temps mort tm

Le temps mort tm est le temps mis par un soluté non retenu par la phase stationnaire
pour traverser la colonne (temps passé dans la phase mobile).

4
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

4.1.3. Temps de rétention réduit tr’

La différence entre le temps de rétention et le temps mort est désignée par
le temps de rétention réduit du soluté tr’ . En d’autres termes c’est le temps passé par
un soluté dans la phase stationnaire, soit :

𝒕𝒓′ = 𝒕𝒓 − 𝒕𝒎 (eq. 2)

Figure 1. Caractéristique d’un pic d’élution en chromatographie

Ici t0 est le temps du début de l’injection, cependant dans certains ouvrages il
symbolise le temps mort.

4.2. Notion de volume

4.2.1. Volume d’élution ou volume de rétention Vr

Le volume d’élution (de rétention) Vr de chaque soluté représente le volume de phase
mobile nécessaire pour le faire migrer d’une extrémité à l’autre de la colonne. Il correspond
sur le chromatogramme au volume de la phase mobile qui s’est écoulé entre l’instant de
l’injection et celui correspondant au maximum du pic. Si le débit D est stationnaire,

Vr = tr.D (eq. 3).

4.2.2. Volume d’un pic, Vpic.

Il correspond au volume de phase mobile dans lequel le composé est dilué en sortie de

colonne. Il vaut par définition : Vpic = ɷ·D (eq. 4).

ɷ : correspond à la largeur du pic à la base.

5
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

4.2.3. Volume de la phase mobile dans la colonne (volume mort Vm)

Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé volume mort) Vm
correspond au volume interstitiel accessible. Il peut être calculé d’après le chromatogramme,
à condition d’introduire un soluté non retenu par la phase stationnaire. On peut l’exprimer en

fonction de tm et du débit D : Vm= tm·D (eq. 5)

4.2.4. Volume de la phase stationnaire

Ce volume désigné par Vs n’apparaît pas sur le chromatogramme. Dans les cas
simples on le calcule en retranchant du volume total interne de la colonne vide le volume de la
phase mobile.

4.3. Notion de concentration

En chromatographie chaque soluté injecté dans la colonne est soumis à deux effets
antagonistes : un effet d’entraînement par la phase mobile dans laquelle il est soluble et un
effet de rétention avec la phase stationnaire avec laquelle il interagit. On caractérise la
distribution de chaque soluté entre les deux phases par le coefficient de partage ou coefficient
de distribution.

4.3.1. Coefficient de partage

A un instant donné, le soluté est à la concentration Cm dans la phase mobile et Cs dans
la phase stationnaire. Leur rapport à l'équilibre est appelé coefficient de partage K
𝐂𝐬
𝑲 = (eq. 6)
𝐂𝐦

Lorsque le soluté n’a aucune affinité avec la phase stationnaire, Cs est nulle, donc
K=0. Le soluté n’est pas retenu dans la colonne si la phase mobile est très différente du
solvant d’injection, il y’a un risque de faire précipiter le soluté en tête de colonne, donc de la
boucher. Dans ce cas le soluté peut ne jamais sortir du système chromatographique. Ce qui
veut dire que la Cm ne peut pas être nulle.

Le coefficient de partage est fonction de trois types d’affinités :

 celle entre le soluté et la phase mobile

 celle entre le soluté et la phase stationnaire
 mais aussi celle entre les phases stationnaire et mobile.

6
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

Soluté

Phase stationnaire Phase mobile

4.3.2. Facteur de capacité K’

Le facteur de capacité K' est le rapport de la quantité d'un même soluté dans la phase
stationnaire et dans la phase mobile.
𝐂𝐬 𝐕𝐬 𝐕𝐬
𝑲′ = × =𝐊 (eq. 7)
𝐂𝐦 𝐕𝐦 𝐕𝐦
Vs : volume de la phase stationnaire

Vm : volume de la phase mobile ou volume mort

K’ est un paramètre très important en chromatographie. Il est défini en régime isocratique. Ce

n’est pas une constante, bien qu’il ne varie pas avec le débit ou la longueur de la colonne, car
il dépend des conditions opératoires. Ce paramètre rend compte de la faculté plus ou moins
grande de la colonne à retenir chaque composé (capacité). Dans la mise au point des
séparations on fait en sorte que K’ ne dépasse pas 10, afin de ne pas trop allonger le temps de
passage des composés.

K' est aussi le rapport du temps passé par un soluté dans la phase stationnaire sur le
temps passé par ce même soluté dans la phase mobile. K' peut être déterminé
expérimentalement par l’équation suivante :
𝒕𝒓−𝒕𝒎
𝑲′ = (eq. 8)
𝒕𝒎
Le temps de rétention est ainsi lié au facteur de capacité par la relation :

𝒕𝒓 = 𝒕𝒎(𝟏 + 𝑲′ ) (eq. 9)

Remarque
La mesure de tm peut se faire en injectant un composé dont on est sur qu’il n’est pas retenu
sur la colonne dans les conditions choisies.

7
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

Compte tenu des equations 3 et 5 le volume de rétention Vr d’un soluté pourra

s’écrire :

Vr = Vm (1 + k) (eq. 10)

Ou :

Vr = Vm + KVs (eq. 11)

4.4. Notion d'efficacité

4.4.1. Efficacité théorique (nombre de plateaux théoriques)

La largeur d'un pic est caractéristique de l'efficacité de la séparation : plus le pic est fin
plus la chromatographie est efficace. L'efficacité est mesurée par le nombre de plateaux
théorique Nth.

4.4.2. Model des plateaux théoriques

Une colonne de N plateaux théoriques est une colonne divisée en N petits disques
cylindriques successifs. On admet que la phase mobile progresse non pas de façon continue,
mais par sauts successifs d'un plateau théorique à l'autre. Dans chaque plateau théorique,
on observe une rétention du soluté S, du fait de l'équilibre de ce produit entre la phase mobile
[S]pm et la phase stationnaire [S]ps.

Une colonne réelle aura donc "N plateaux théoriques" si elle se comporte comme une
"colonne à distiller théorique" de N plateaux.

Figure 2. Model des plateaux théoriques

8
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

Dans cette théorie, les pics de chromatographie ont une forme gaussienne et la variance s2 est
reliée au nombre de plateaux théoriques N et au temps de rétention tr par la relation:
Ns2=(tr)2 (eq. 12)
N augmente donc avec le temps de rétention et diminue si la largeur des pics (s)
augmente. D'après la relation 12, une « bonne » colonne de chromatographie qui conduit à des
pics fins (s petit) pour des temps de rétention (tr) élevés, est donc caractérisée par un nombre
de plateaux théoriques N élevé.
Sur le chromatogramme (figure 3) , s représente la demi-largeur du pic à 60,6 % de sa
hauteur et tr le temps de rétention du composé. tr et s doivent être mesurés dans la même
unité (temps, distances ou volumes écoulés, si le débit est constant). Si on exprime s en unités
de volume (en faisant intervenir le débit), 4s correspond au « volume du pic » soit 95 % du
composé injecté. Par suite des propriétés de la courbe de Gauss (ɷ = 4s), il en résulte
𝑡𝑟 2
l’equation 13. 𝑁 = 16 ɷ2 (eq. 13)

Les pics étant assez souvent déformés à la base, cette dernière est rarement employée :
on utilise de préférence la formule équivalente 14.
𝑡𝑟 2
𝑁 = 5,54 (eq. 14)
𝛿2

Figure 3. Caractéristiques d’un pic chromatographique

4.4.3. Efficacité réelle (nombre de plateaux théoriques effectifs)

N est très utilisé en HPLC. Pourtant il serait plus judicieux d'utiliser Neff
(nombre de plateaux effectifs) puisqu'il dépend vraiment du temps passé dans la
phase stationnaire.

9
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

𝑡𝑟 ′ 2 𝑡𝑟 ′ 2
𝑁𝑒𝑓𝑓 = 16 = 5,54 (eq. 15)
ɷ2 𝛿2

4.4.4. Hauteur équivalent à un plateau théorique H

Connaissant la longueur L de la colonne et le nombre de plateaux théoriques N on
définit une Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique (HEPT ou H).
𝑳
𝑯𝑬𝑷𝑻 = (eq. 16)
𝑵

La HEPT permet de comparer entres elles des colonnes de différentes longueurs. Elle est
fonction de différents paramètres qui eux-mêmes sont susceptibles de varier avec la vitesse de
la phase mobile.

En HPLC les HEPT sont comprises entre 0,001 et 1 mm. Dans la théorie des plateaux,
la HEPT (= L . s2 / tr2) déduite de la variance n'apparaît que comme une mesure globale de
l'influence de tous les paramètres expérimentaux. Divers modèles ont été élaborés pour
préciser les divers paramètres intervenant dans l'élargissement des pics.

4.4.5. Modèle cinétique de la chromatographie

Ce modèle issu de la mécanique des fluides a été mis au point par J.J. Van Deemter.
En 1956, ce physicien a mis au point l'équation (eq. 17) qui relie H (HEPT) aux
caractéristiques physiques de la colonne et de la phase mobile.

H= A+B/u+C.u (eq.17).

Trois facteurs, représentés par les 3 termes de l'équation 17, contribuent à l'élargissement des
pics

 Diffusion turbulente (Terme A)

Suivant la taille et la forme des particules, ils

existent pour la phase mobile, plusieurs trajets
possibles, cette particularité contribue à
l'élargissement des pics d'où A = 2 l dp. l est une
constante voisine de 1. dp est le diamètre moyen des
particules. Donc, plus les particules sont petites et
plus le remplissage est homogène, plus l'efficacité de
la colonne augmente.

10
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

La contribution de A est nulle pour une colonne capillaire de chromatographie en phase

gazeuse.

 Diffusion longitudinale (Terme B)

Le terme B/u traduit la dispersion du soluté à cause de

la diffusion du soluté dans la colonne. Par exemple, dans
un flux liquide, les molécules au centre du flux progressent
plus vite que celles qui sont sur les bords au contact des
particules; on a B = 2 g Dm où g est une constante (g<1).
et Dm est le coefficient de diffusion du soluté dans la phase
mobile.

Le terme B/u est évidemment inversement proportionnel à u. L'efficacité d'une colonne

augmente avec la vitesse de la phase mobile.Ceci peut expliquer les bonnes séparations
obtenues en HPLC; de plus, comme le terme Dm est environ 5 fois plus grand en CPG qu'en
CPL, il en résulte que la contribution de la diffusion longitudinale est presque négligeable en
HPLC.

 Résistance au transfert de masse (Terme C)

Ce terme C*u représente la résistance au transfert du soluté entre les phases mobiles et
stationnaires, cette résistance empêche l'établissement de l'équilibre entre S(pm) et S(ps). Ce
phénomène est du par exemple au fait que certaines molécules stagnent dans les pores de la
phase stationnaire.

Plus la vitesse (u) de la phase mobile diminue, plus les molécules de soluté peuvent
pénétrer dans la phase stationnaire, plus l'équilibre entre les 2 phases est favorisé et plus la
colonne est performante.

11
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

Le terme C est proportionnel à (dp2/Dm), les colonnes les plus efficaces seront celles
régulièrement remplies et bien tassées où le diamètre des particules est le plus faible
possible. Il faut également utiliser des solvants de faible viscosité pour minimiser ce terme.

4.4.6. Courbe de Van Deemter

La représentation graphique de l'équation (eq. 17) est appelée courbe de Van Deemter
(figure 4). L’analyse de cette courbe montre l'existence d'un débit optimal de phase mobile
pour lequel l'efficacité de la colonne est maximum (HEPT minimum).

Réduire le débit de la phase mobile en deçà de ce débit optimal peut diminuer fortement le
pouvoir séparatif d'une colonne, surtout en CPG où la contribution du terme B/u est
importante

Contrairement à la CPG, en HPLC au-dessus du débit optimal, l'efficacité de la colonne

est pratiquement indépendante du débit de la phase mobile. Ceci permet de raccourcir les
temps d'analyse, sans perdre trop de pouvoir de séparation.

Ils existent d’autres formulations de l’équation de Van Deemter plus adaptées à la HPLC
.

Figure 4. Courbe de Van Deemter

Les trois coefficients numériques expérimentaux A, B et C sont reliés à divers

paramètres physico-chimiques, à la colonne et aux conditions opératoires. Si on choisit
d’exprimer H en cm, A sera en cm, B en cm2/s et C en s (la vitesse étant en cm/s). La courbe

12
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

représentative de cette fonction est une branche d’hyperbole qui passe par un minimum

B
(Hmin) pour : 𝑢opt. = C

En conclusion l'efficacité calculée d'une chromatographie, représentée par la HEPT, est

fonction de la vitesse de la phase mobile donc du débit, et de la qualité (régularité,
remplissage) de la phase stationnaire.

5. Qualité de la séparation

5.1. Sélectivité
Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics on utilise le
facteur de sélectivité :
𝒕𝒓𝟐−𝒕𝒎 𝑲′ 𝟐
𝜶= = (eq. 18)
𝒕𝒓𝟏−𝒕𝒎 𝑲′ 𝟏

Le facteur de sélectivité mesure la différence de distribution thermodynamique des deux

composés. On démontre que si (G°o) = G°2 - G°1 (différence des énergies libres de
distribution des deux composés) on a :

(G°) = - RT ln 

Figure 5. Facteurs de rétention et de séparation entre deux composés

adjacents.

13
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

5.2. Résolution

Si dans certaines conditions, deux constituants sortent à des temps proches, leurs pics
risquent de se chevaucher. En optimisant les conditions analytiques, il est possible
d’améliorer l’allure du chromatogramme. Le paramètre de résolution R quantifie la qualité de
cette séparation. Bien qu’on la mesure, en général, sur deux pics contigus, elle peut être
calculée sur n’importe quel couple de pics.
𝑡𝑟2 − 𝑡𝑟1
𝑅=2 (eq. 19)
𝜔 1 +𝜔 2

R < 1 : mauvaise résolution

1 < R < 1,4 : résolution acceptable

1,4 < R < 1,6 : résolution optimale

R > 1,6 : résolution trop bonne car le temps d'analyse est rallongé

Figure 6. Influence du terme R sur la séparation de deux pics d'intensité égale

Remarque : Si les pics sont gaussiens ɷ= 1,7 δ

Il est parfois utile d'exprimer cette résolution en fonction de la sélectivité et de l'efficacité du

dernier des 2 pics étudiés

(eq. 20)

6. Notion de pression
A l'intérieur d'une colonne la phase mobile frotte sur les parois de la colonne mais
aussi sur les particules de phase stationnaire. Ces frottements définissent la résistance à
l'écoulement. Les particules de phase stationnaire sont sphériques. Si l'on divise leur diamètre
14
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

par 10, on diminue leur surface d'un facteur 100 et leur volume d'un facteur 1000. On peut
donc placer dans la colonne 1000 fois plus de particules et donc augmenter de 10 fois la
surface en contact avec la phase mobile. La résistance à l'écoulement est donc augmentée.

En conséquence, pour maintenir le débit constant dans la colonne il faut augmenter la pression
plus la granulométrie de la phase stationnaire est faible.

En HPLC on travaille, en tête de colonne, à des pressions entre 20 et 150 bars. La perte de
charge qui est la différence de pression entre l’entrée et la sortie de la colonne est donnée par
la loi de Darcy :

∅ 𝜼𝑳𝒖
∆𝑷 = (Eq. 21)
𝑫𝟐
Φ (sans dimension) facteur de résistance à l’écoulement ;

D (m) diamètre moyen des particules ;

𝛈 (Pa . s) viscosité ;

L (m) longueur de la colonne ;

u (m . s-1) vitesse de la phase mobile.

Références bibliographiques

Burgot, G., Burgot, J.-L., 2011. Méthodes instrumentales d'analyse chimique et applications:
Méthodes chromatographiques, électrophorèses, méthodes spectrales et méthodes thermiques.
Lavoisier.

Huber, L., 1994. Principles and techniques of practical biochemistry. Wiley Online Library.

Khabchi, M.E., 1993. Chromatographie en phase liquide: contribution à l'optimisation d'une

séparation préparative en gradient d'élution.

Mendham, J., Denney, R., Barnes, J., Thomas, M., 2005. Analyse chimique quantitative de
Vogel. 1ère Edition edn. De Boeck.

Miller, J.M., 2005. Chromatography: concepts and contrasts. John Wiley & Sons.

Rosset, R., Caude, M., Jardy, A., 1982. Manuel pratique de chromatographie en phase liquide.
Issy-les-Moulineaux (Hauts-de-Seine): Masson.

15
Partie I Chromatographie et notions fondamentales

Rouessac, F., Rouessac, A., Cruché, D., 2004. Analyse chimique-6ème édition-Méthodes et
techniques instrumentales modernes: Méthodes et techniques instrumentales modernes.
Dunod.

Skoog, D.A., Holler, F.J., Nieman, T.A., 2003. Principes d'analyse instrumentale. De Boeck
Supérieur.

Yost, R.W., Ettre, L.S., Conlon, R.D., Vaumoron, J., 1981. Pratique de la chromatographie
liquide. Technique et Documentation.

Site Internet
https://www.emse.fr/fr/transfert/spin/formation/ressources/sam96/hplc97htm/sep.htm

file:///C:/Users/bcs/Desktop/Cour%20chromato/Chromato_liquide_2007%20(1).pdf

http://www.masterchimie1.u-psud.fr/Chromatoweb/theoriechromato2.html#A23

16
 Partie II :
Chromatographie
liquide à haute
performance
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

Partie II : Chromatographie liquide à

haute performance

La chromatographie liquide haute performance, souvent désignée par son abréviation

CLHP – HPLC en anglais –, constitue une technique analytique très générale d’emploi. Elle
dérive de la forme la plus ancienne de la chromatographie liquide sur colonne dont les
performances, en termes de sélectivité et de résolution, se sont trouvées grandement
améliorées par la miniaturisation et l’utilisation de phases stationnaires très élaborées.

Ces phases, constituées de micro-particules sphériques dont le diamètre est compris

entre 2 et 5 micromètres conduisent à une perte de charge importante dans la colonne. Ce qui
a conduit à exercer sur la phase mobile une forte pression pour obtenir un débit convenable.
Pour marquer cette particularité de la technique, la lettre P du sigle CLHP a pendant
longtemps correspondu au mot pression. Aujourd’hui le P a été attribué à Performance afin
de marquer l’innovation de cette technique de séparation.

1. Appareillage
Dans tout appareil de chromatographie liquide haute performance on retrouvera toujours
les éléments de base suivants :

 un ou plusieurs réservoirs de phase mobile contenant soit des solvants purs soit des
mélanges de solvants dans des concentrations connues.
 un système d'injection comportant une boucle d'échantillonnage calibrée
(généralement une vanne RHEODYNE).
 une colonne remplie, en acier inox, de quelques centimètres de long.
 Un détecteur permettant à la fois, de mettre en évidence la sortie des solutés de la
colonne et de donner un signal proportionnel à la quantité de chacun de ces solutés
dans un mélange.

La phase mobile est pompée à partir d’un réservoir et parcourt en permanence le

chromatographe : l’injecteur, la colonne dans le four et le détecteur. La température du four
est maintenue constante.

17
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

Le signal du détecteur est amplifié et enregistré.

Figure 1. Schéma d’un système de chromatographie en phase liquide

haute performance

L’utilisateur compose son installation en fonction des applications prévues. La

présentation en colonne des différents modules est commune à de très nombreux modèles
concurrents. Ici le chromatographe modèle HP 1100, comporte un injecteur automatique
permettant un fonctionnement en continu et une colonne thermostatée pour améliorer la
reproductibilité des séparations. Les composés élués, après passage par le détecteur UV sont
identifiés avec encore plus de certitude au moyen d’un spectromètre de masse situé à droite de
l’image.

18
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

2. Etude détaillée des éléments d’un appareil HPLC

2.1. Réservoir de solvant (éluant)
Il contient la phase mobile en quantité suffisante. Plusieurs flacons d'éluants
(solvants de polarités différentes) sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients
d'élution (mélange de plusieurs solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe
doseuse.

2.2. Pompe
Elle est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la
nature du solvant. Elle permet de travailler :
en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de
l'analyse.
en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants
du mélange d'éluants.
Les pompes actuelles ont des pressions maximales de refoulement voisines de 400 bar
et un débit variable de quelques µl à plusieurs ml/min.

Figure 2. Exemple de configuration pour gradient haute pression.

Les pompes sont appelées binaires, ternaires, quaternaires suivant le nombre de solvants
qu’elles peuvent mélanger (ici binaires).

19
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

2.3. Vanne d'injection

C'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents
volumes, nous utiliserons une boucle de 20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en
fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le
système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est
important pour l'analyse quantitative.

Figure 3. Injection avec une boucle.

a) Remplissage de la boucle. Dans cette étape, la seringue est introduite à la position
n◦ 4 ; b) injection dans la colonne (noter la nouvelle position de la manette).

2.4. Colonne
Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux
produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre
compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 crn. Au delà,
les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop
élevées. La colonne est souvent précédée d’une précolonne, dite colonne de garde,
courte (0,4 à 1 cm), remplie de la même phase stationnaire, ce qui sert à retenir
certaines impuretés (figure 4).

20
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

Figure 4. Colonne standard et précolonne de CLHP.

2.5. Phase stationnaire

2.5.1. Phase normale

La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut
donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits
polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en
tête. L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du
gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.

Figure 5. Le gel de silice pour chromatographie.

2.5.2. Phase inverse

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes
linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite
donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont les composés polaires
qui seront élués en premier. Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de
la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue
constante.

21
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

Figure 6. Gel de silice greffé

2.6. Phase mobile

L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire
normale ou à polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés. La polarité
de la phase stationnaire

permet de distinguer deux situations de principe :

- si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;

- si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (le
plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la
chromatographie en phase inverse.

En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des
composés. Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité. Avec
une phase greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les phases
normales. Ainsi avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu'un composé
apolaire. Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. On réalise des
gradients d'élution en diminuant au cours de la séparation la polarité de l'éluant (ex : mélange
eau /acétonitrile dont la concentration en acétonitrile va en croissant au cours de l'élution). On
peut, en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'élution de la phase mobile.

En plus du pouvoir d’élution le choix de la phase mobile dépend aussi d’un certain
nombre de facteurs dont les plus importants sont la solubilité de l’échantillon, la compatibilité
de la phase mobile avec le détecteur et la viscosité de la phase mobile. Aucun de ces

22
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

paramètres n’est une variable indépendante et le meilleur solvant est donc celui qui donne une
réponse optimale à toutes ces conditions.

Figure 7. « Force d’élution » des solvants utilisés comme phases

mobiles.

2.7. Détecteurs
Le détecteur suit en continu l’apparition des solutés. Pour détecter, on utilise différents
phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps.
Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de la
phase mobile seule.

Le détecteur le plus utilisé en CLHP est un spectrophotomètre d’absorption UV-visible

(190-600 nm) relié à la sortie de colonne.

Il existe d’autres détecteurs :

 réfractomètre différentiel

 UV à barrette de diodes

 électrochimique

 fluorimétrique...

ainsi que différents types de couplage :

23
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

 Spectrométrie infrarouge

 Spectrométrie de masse

 Résonance Magnétique Nucléaire...

3. Analyse quantitative
Cette analyse est basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est
proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé.

3.1. Méthode de l'étalonnage externe

Il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante du produit afin de faire une
courbe d'étalonnage Aire = f(masse ou concentration du produit), pour un volume injecté
constant V.

L'injection ultérieure du même volume V de l'échantillon à doser permet, à l'aide de la mesure

de l'aire du pic reportée sur la courbe d'étalonnage, de connaître la masse ou la concentration
recherchée. Cette méthode est plus précise que celle qui consiste à ne faire qu'une mesure
avec l'étalon et à utiliser une règle de trois :

Ae/Me = Aet/met

A: Aire des pics

e : échantillon

et : étalon

m : masse du produit remplaçable par la concentration

24
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

3.2. Méthode des ajouts

Comme la précédente, cette méthode nécessite de posséder le produit à analyser pur; après
avoir analysé l'échantillon, on ajoute à celui-ci des quantité connues Δm du produit avant de
le chromatographier à nouveau ( faire au minimum deux ajouts), ce qui entraîne une variation
de l'aire du pic ΔA.

Si m est la masse contenue dans l'échantillon à analyser,

(ΔA/Δm) = a/m soit m= A*(Δm/ΔA)

Si le produit ajouté est en solution, il faut tenir compte des effets de dilution.

1.1. Méthode de l'étalon interne (utilisée essentiellement en CPG) :

On compare la réponse du ou des produits à analyser à celle d'un étalon interne,
donc introduit dans le mélange à doser et convenablement choisi.

Une solution étalon est préparée avec le ou les produits que l'on veut doser. Les masses sont
connues m’1, m’2, et … me pur l'étalon ; à ces masses correspondent les aires A’1, A’2, …,
A'e, sur le chromatogramme. Dans l'échantillon contenant les masses m1, m2, … de solutés
on ajoute me de l'étalon, ce qui donne les aires A1, A2, Ae.

On obtient :
m'1 = α1 A’1
m'2 = α2 A’2

25
Partie II Chromatographie liquide à haute performance

me = αe A'e
avec α coefficient de proportionnalité
et k1 = (α1/αe) = (m'1 A’e /me A’1)
d'où la valeur k1 puisque toutes les données sont connues.
Dans l'échantillon inconnu on aura :
m1 = α1 A1
me = ae Ae
(m1/me) = (α1 A1/αe Ae) = k1(A1/Ae)
me, k1, A1, Ae sont connus.

Références bibliographiques

Burgot, G., Burgot, J.-L., 2011. Méthodes instrumentales d'analyse chimique et

applications: Méthodes chromatographiques, électrophorèses, méthodes spectrales et
méthodes thermiques. Lavoisier.
Heftmann, E., 1983. Chromatography: fundamentals and applications of
chromatographic and electrophoretic methods. P. A, Fundamentals and techniques.
Khabchi, M.E., 1993. Chromatographie en phase liquide: contribution à l'optimisation
d'une séparation préparative en gradient d'élution.
Mendham, J., Denney, R., Barnes, J., Thomas, M., 2005. Analyse chimique quantitative
de Vogel. 1ère Edition edn. De Boeck.
Rouessac, F., Rouessac, A., Cruché, D., 2004. Analyse chimique-6ème édition-Méthodes
et techniques instrumentales modernes: Méthodes et techniques instrumentales
modernes. Dunod.
Yost, R.W., Ettre, L.S., Conlon, R.D., Vaumoron, J., 1981. Pratique de la
chromatographie liquide. Technique et Documentation.
Site Internet
http://biotech.spip.ac-rouen.fr/spip.php?article9
http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html
http://www4.ac-nancy-metz.fr/physique/CHIM/Jumber/HPLC/Chromatographie
_en_phase_liquide.htm

26
 Partie III :
Chromatographie par
échange d’ions
Partie III Chromatographie par échange d’ions

Partie III : Chromatographie par

échange d’ions
La chromatographie à échange d’ions (ou chromatographie à ions ou chromatographie
échangeuse d'ions) est un type de chromatographie en phase liquide permettant d'isoler une
substance chargée électriquement d'un mélange de molécules chargées (liquide). Pour cela, on
fait passer le mélange sur une phase stationnaire (solide) chargée, déjà associée à des ions
connus et on remplace ces ions par les ions/molécules chargées du mélange à séparer. C’est
une technique chromatographique couramment utilisée en chimie analytique, notamment pour
le contrôle de la qualité de l’eau. La chromatographie ionique est devenue depuis quelques
années une des méthodes analytiques de références en analyse des eaux.

1. Schéma de principe d’une installation de chromatographie ionique.

On retrouve l’architecture modulaire classique de la chromatographie liquide, avec
pour différence de pouvoir utiliser un mode de détection original basé sur la conductance des
solutions. Cependant la nature et la concentration ionique de certaines phases mobiles sont à
l’origine de difficultés avec ce mode de détection. On fait alors appel à un montage particulier
comportant un « suppresseur », dispositif intercalé entre la colonne et le détecteur, qui a pour
rôle d’éliminer les ions de l’éluant par réaction de type acido basique (Figure 2).

Figure 1. Schéma de principe d’une installation de chromatographie ionique.

27
Partie III Chromatographie par échange d’ions

Figure 2. Principe de fonctionnement d’un suppresseur à membrane et

d’un suppresseur à régénération électrochimique.
Il existe deux types de membranes, les unes perméables aux cations (H+ et ici Na+), les autres aux anions (OH−
et ici Cl−). a) Le modèle à membrane microporeuse cationique est adapté à l’élution des anions. Seuls les cations
peuvent traverser la membrane (qui correspond en fait à une paroi polyanionique fixe repoussant, par
conséquent, les anions de la solution) ; b) le modèle à électro-désionisation fait ici appel à un suppresseur à
membrane anionique, utilisé, par opposition au modèle précédent, en aval d’une colonne cationique. Il est
régénéré en ions par électrolyse de l’eau. Noter, dans les deux cas, la circulation à contre-courant entre la phase

28
Partie III Chromatographie par échange d’ions

éluée et la solution du suppresseur post-colonne ; c) exemple d’une séparation de cations inorganiques

(concentrations de l’ordre du ppm) utilisant un suppresseur de ce type.

2. Résines échangeuses d’ions

En chromatographie ionique la phase stationnaire est une résine échangeuse d’ion. Les
échangeurs d'ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements ionisables,
qui ont la propriété d'échanger de façon réversible certains de leurs ions, au contact d'autres
ions provenant d'une solution.

2.1. Groupements fonctionnels

On les classe selon leur charge en deux catégories :

 Positif : Résine échangeuse d’anions, qui échange réversiblement des anions

+ - - + - -
Résine-G / X + anion <=> Résine-G / anion + X

 Négatif : Résine échangeuse de cations, qui échange réversiblement des cations

- + + - + +
Résine-G / X + cation <=> Résine-G / cation + X

29
Partie III Chromatographie par échange d’ions

Les groupements fonctionnels cationiques et anioniques sont classés selon

leur aptitude à l’ionisation :

Echangeur de cations Echangeur d’anions

Forts

Résine- SO3- Résine-N+(CH 3)3

Acide sulfonique Ammonium quaternaire

Faibles

Résine-COO- Résine-NH3+

Groupement carboxylique Amine primaire

Les groupements sont dit forts car leur capacité d’échange est
constante et indépendante du pH, les groupements faibles ne sont pas ionisé à
un certain pH.

2.2. Support

Les supports peuvent être de nature :

 Minérale : Silice
 Organique : synthétique ou naturelle
o Synthétique : Résine polystyrénique
o Naturelle : Cellulose ; Dextrane

Les phases stationnaires les plus connues sont obtenues par copolymérisation
styrène/divinylbenzène afin d’obtenir des phases réticulées, résistantes à l’écrasement. Elles
se présentent sous forme de particules sphériques d’un diamètre de quelques micromètres
(figure 3). Ces particules sont ensuite greffées pour en faire des polyanions ou polycations.

30
Partie III Chromatographie par échange d’ions

Figure 3. Résine échangeuse d’ions en polystyrène réticulé.

3. Principe

Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que
le groupement porté par l’échangeur d’ion soit ionisé :
 Dans le cas d’une base faible le pH doit être inférieur au pKa du groupement
ionisable (ex : pKa du diéthylaminoethylamonium est de 9,5)

C2H4-NH+(C2H5)

 Dans le cas d’un acide faible le pH doit être supérieur au pKa du groupement
ionisable (ex : pKa du carboxymethyl est de 4)

-O-CH2-COO-
 Dans le cas d’une base ou un acide fort le groupement fonctionnel porte une
charge net quelque soit le pH du milieu.

Pour comprendre le mécanisme d’une séparation, prenons pour exemple une colonne
anionique comportant des groupements ammonium quaternaire, en équilibre avec une phase
mobile riche en anions hydrogénocarbonates (contre-anions). Ainsi, tous les sites cationiques
de la phase stationnaire se trouvent appariés avec les ions de la phase mobile. Lorsqu’un
anion A−, apporté par l’échantillon, est entraîné par l’éluant, une suite d’équilibres réversibles
se produit, régis par une équation d’échange qui détermine sa répartition entre les deux
phases, mobile (PM) et stationnaire (PS).

31
Partie III Chromatographie par échange d’ions

Figure 4. Principe de la chromatographie échangeuse d’ion

4. Equilibre d’échange ionique

Quand un échangeur de type acide sulfonique est mis en contact avec un solvant aqueux
contenant un cation Mx+, il s’établit un équilibre décrit par

xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+

Solide Solution Solide Solution

Ou RSO3-H+ représente l’un des nombreux groupements acide sulfonique fixé sur une
molécule du polymère. De même, un échangeur de type base forte interagit avec un anion Ax-
selon la réaction

xRN(CH3)3+OH- + Ax- (RN(CH3)3)xAx- + xOH-

PS PM PS PM

L’équilibre de ces échanges ioniques est décrit par la loi d’action des masses.

Exp : Cas de la réaction entre un cation porteur d’une seule charge B+ et une résine de
type acide sulfonique placée dans une chromatographie
(1)
RSO3-H+ + B+ RSO3-B+ + H+ (1)
(2)
PS PM PS PM

L’élution par une solution d’acide chlorhydrique déplace l’équilibre dans le sens 2, ce

qui entraine un transfert de B+ dans la phase mobile. Ces ions progressent donc dans la

colonne par une succession de transfert entre les phases stationnaire et mobile. Ces ions
progressent par une succession de transfert entre les phases stationnaire et mobiles.

La constante d’équilibre Kex de la réaction d’échange (1) s’écrit sous la forme

32
Partie III Chromatographie par échange d’ions

RSO3-B+ 𝑠 H+ 𝑚
= Kex (2)
RSO3-H+ 𝑠 B+ 𝑚

[RSO3-B+]s et [RSO3-H+]s représentent les concentration de B+ et H+dans la phase

solide. En réarrangement les termes, on écrit

RSO3-B+ 𝑠 RSO3-H+ 𝑠
= K ex (3)
B+ 𝑚 H+ 𝑚

Pendant l’élution, la concentration des protons en solution aqueuse est supérieure à

celle des ions B+. De plus le nombre de sites de l’échangeur est beaucoup plus élevé que le

nombre de B+fixés. Par conséquent quand [RSO3-H+]s >> [RSO3-B+]s et [H+]m >>
[B+]m le membre de droite de l’équation (3) est pratiquement constant et on peut écrire :

RSO3-B+ 𝑠 Cs
+ = K= Cm (4)
B+ 𝑚

Ou K est une constante qui correspond à la constante de distribution

Dans l’equation (2) Kex représente l’affinité de la résine à l’ion B+ par rapport à un
autre ion (dans ce cas H+). Les expériences montrent que les ions polyvalents sont retenus
beaucoup plus fortement que les ions monovalents. Au sein d’un groupe d’ions de même
charge, les différences de Kex semblent surtout liées à la taille de l’ion hydraté. C’est ainsi que
pour une résine sulfoné échangeuse de cations les valeurs de Kex décroissent dans l’ordre Ag+
> Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > H+ > Li+. Pour les cations divalents, l’ordre est Ba2+> Pb2+ >
Sr2+> Ca2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+.

Dans le cas des anions, Kex pour une résine de type base forte décroit dans l’ordre
SO42- > C2O42- > I- > NO3- > Br- > Cl- > OH- > F-.

5. Séparation des acides aminés

La séparation et le dosage des mélanges d’acides aminés correspondent à une

application classique de la chromatographie ionique couplée à une méthode colorimétrique.
Les acides aminés ne pouvant être identifiés directement par absorption UV, on les fait réagir
en sortie de colonne sur la ninhydrine pour faire apparaître, quel que soit l’acide aminé, le
même dérivé coloré, aisément détectable par spectrophotométrie.

Pour séparer les acides aminés les uns des autres on utilise un appareillage spécialisé
qui comporte une colonne cationique (polystyrène sulfoné) équilibrée avec une solution

33
Partie III Chromatographie par échange d’ions

d’hydroxyde de lithium de façon à ce que les groupements acides sulfoniques soient sous
forme de sels de lithium (Figure 5). L’échantillon à doser étant porté à pH 2, les aminoacides,
sous forme cationique, déplacent les ions Li+ de la phase stationnaire et s’y fixent plus ou
moins solidement en fonction de leur degré d’ionisation. L’élution se fait en augmentant
progressivement le pH et les concentrations salines de la phase mobile. En sortie de colonne,
ils sont mélangés à un réactif contenant de la ninhydrine puis chauffés. Mis à part les acides
aminés secondaires (type R-NH-R’), qui donnent une coloration jaune (détectée à 440 nm),
les acides aminés primaires (type R-NH2) conduisent à la même coloration violette (détectée
à 570 nm). L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’acide aminé présente
dans le milieu réactionnel. Dans des conditions déterminées, le rapport d’absorption optique
570 nm/440 nm est caractéristique pour chaque acide aminé. La limite de détectabilité est
d’environ 30 picomoles.

Figure 5. Analyse des acides aminés

34
Partie III Chromatographie par échange d’ions

Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction
de leur point isoélectrique (pHi ou pI), elle porte une charge nette.

 Négative : Le pI de l’albumine du sérum bovin est de 4,9, cette protéine est

chargée négativement au pH 7.
 Nulle : lorsque le pI de la molécule = pH du milieu.
 Positive : Le pI de la cytochrome c est de 10,7, cette protéine est chargée
positivement à pH 7.

Il y a deux manière d’éluer les molécules fixées sur le résine :

 En modifiant le pH : de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui

sont chargées ne le soient plus ou qu’elles portent une charge du même signe
que l’échangeur d’ion.
 En ajoutant un sel à concentration croissante : qui apportent forcément un
ion de même charge que les molécules fixées à la résine ; cet ion s’appel un
contre ion.

Références bibliographiques
Mahuzier, G., Hamon, M., 1978. abrégé de chimie analytique, méthodes de séparation-tome
2, ed. masson.

Rouessac, F., Rouessac, A., Cruché, D., 2004. Analyse chimique-6ème édition-Méthodes et
techniques instrumentales modernes: Méthodes et techniques instrumentales modernes.
Dunod.

Skoog, D.A., Holler, F.J., Nieman, T.A., 2003. Principes d'analyse instrumentale. De Boeck
Supérieur.

Small, H., 2013. Ion chromatography. Springer Science & Business Media.

Small, H., Riviello, J., Pohl, C.A., 1997. Ion chromatography using frequent regeneration of
batch-type suppressor. Google Patents.

Small, H., Stevens, T.S., Bauman, W.C., 1975. Novel ion exchange chromatographic method
using conductimetric detection. Analytical Chemistry 47, 1801-1809.

Weis, J., 2008. Ion chromatography. John Wiley & Sons.

35
 Partie IV :
Chromatographie
d’exclusion stérique
Partie IV Chromatographie d’exclusion stérique

Partie IV : Chromatographie
d’exclusion stérique

La chromatographie de perméation, plus souvent appelée chromatographie d'exclusion

stérique "gel exclusion chromatography" (CES), gel filtration ou filtration sur gel ou tamisage
moléculaire. On emploie surtout les deux derniers termes quand le solvant est aqueux et que
la chromatographie se fait sous pression atmosphérique. On désigne la CES par perméation de
gel quand elle est hydrophobe (la phase mobile est un solvant organique).

Divers fabricants vendent des matrices de filtration sur gel: "Sephadex", "Bio-Gel",
ToyoPearl, etc. Il est à remarquer que l'usage le plus courant des résines "Sephadex" est bien
la filtration sur gel même si un "Séphadex" peut être utilisé comme colonne d'affinité pour les
protéines ayant une affinité pour les dérivés du dextran (glucose).

1. Principe
La chromatographie d’exclusion stérique (CES) est basée sur la différence de
pénétration des molécules de l’échantillon dans la phase stationnaire (Figure 1). La séparation
résulte de l’existence de pores dans la phase stationnaire, dont le diamètre est comparable à
celui des espèces présentes lorsqu’elles sont en solution dans la phase mobile.

Figure 1. Schéma de la chromatographie d’exclusion stérique

36
Partie IV Chromatographie d’exclusion stérique

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur
forme plus spécifiquement leur rayon de Stokes. Cependant, puisque la taille d'une molécule
d'une catégorie donnée est généralement proportionnelle à sa masse, cette technique est
appliquée à la séparation selon la masse. Cependant, il ne faut jamais oublier que les relations
entre le rayon de Stokes, la taille et la masse, sont affectées par de nombreux facteurs. La
géométrie de la molécule est un des principaux facteurs. En effet une protéine fibrillaire
(allongée) et une protéine globulaire de même masse ne se comporteront pas de la même
façon dans un gel.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et
sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ). Les petites et
moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est
freinée (Figure 2).

Figure 2. Représentation d'un gel d'exclusion.

Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une
relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

37
Partie IV Chromatographie d’exclusion stérique

2. Théorie de la CES
Le volume total Vt (ou VM : volume de la phase mobile) dans la colonne peut être
décomposé en deux parties : le volume interstitiel VI ou V0 (extérieur aux pores) et le volume
Vp qui est celui des pores. V0 représente le volume de phase mobile nécessaire pour
transporter, d’une extrémité à l’autre de la colonne, une grosse molécule supposée exclue des
pores (Figure 3).

Figure 3. Les volumes caractéristiques de la CES

Nous avons Vt le volume correspondant pour une petite molécule pouvant rentrer
dans tous les pores.

Vt = V0 + Vp, (1)

Les volumes d’élution Ve sont donc compris entre V0 et Vt On a :

𝑉𝑒 = V0 + 𝐾𝑉𝑝 (2)
𝑉𝑒 −V0
Soit 𝐾= (3)
𝑉𝑒 −𝑉𝑡

K, coefficient de diffusion, représente le degré de pénétration d’une espèce dissoute dans le

volume Vp (0 < K < 1). Pour la plupart des remplissages modernes.

38
Partie IV Chromatographie d’exclusion stérique

Lorsque K > 1, le comportement du composé dans la colonne ne suit plus seulement le

mécanisme d’exclusion stérique, mais il s’y ajoute des interactions physicochimiques avec le
support comme en CLHP.

Le raisonnement ci-dessus est vérifié dans la pratique : les molécules dont le diamètre est plus
grand que celui des plus larges pores (K = 0) sont exclues de la phase stationnaire (d’où vient
l’expression d’exclusion stérique). Elles traversent la colonne sans être retenues et forment un
seul pic sur le chromatogramme à la position V0

Figure 4. Principe de la migration dans la CES

Chromatogramme figurant une séparation de trois espèces (1,2,3) de tailles différentes en solution. Les
molécules les plus grosses 1 arrivent en tête, suivies des molécules moyennes 2 et enfin des petites
molécules 3. Les volumes d’élution sont compris entre VI et Vt = VP + VI. Image d’un gel poreux pour
illustrer la notion de séparation selon la taille des pores.

3. Phase stationnaire

Un gel donné a un domaine de fractionnement spécifique (exprimé en termes de masse

moléculaire) à l'intérieur duquel les protéines vont prendre, pour sortir du gel, un temps
proportionnel à leur taille, donc à leur poids. À l'intérieur de cette marge, les molécules
peuvent être séparées les unes des autres. Les molécules plus grosses que la limite supérieure
39
Partie IV Chromatographie d’exclusion stérique

de fractionnement, la limite d'exclusion, vont donc sortir ensemble, assez rapidement. Les
molécules plus petites que la limite inférieure sortiront ensemble beaucoup plus tard. Dans ces
deux cas il est évidemment impossible de séparer les molécules selon leur masse. Les
molécules ayant une masse entre ces deux limites pourront donc être séparées les unes des
autres. Ces limites sont appelées domaine de fractionnement.
Il existe de très nombreuses marques de gels de filtration différents par leur stabilité,
résistance à la pression et au débit, etc. On doit aussi comprendre que pour un gel ayant un
domaine de fractionnement donné, on peut obtenir des préparations ayant une résolution plus
ou moins fine. Les microbilles de faibles diamètres, de l'ordre de 20 mm, permettent d'obtenir
une résolution très fine, alors qu'une préparation de billes plus de l'ordre de 200 mm ne
permet qu'une résolution grossière.
C'est pourquoi certaines compagnies vendent des résines de qualités différentes, par
exemple "coarse", "medium", "fine", "superfine". Les résines ayant une résolution supérieure
ont l'inconvénient d'avoir un débit beaucoup plus lent et d'être beaucoup plus fragiles. De
plus, elles sont beaucoup plus dispendieuses. Ces deux caractéristiques limitent évidemment
leur emploi à des applications requérant une plus grande précision.
Exemples de gels de filtrations
Le Sephadex™ G, de la compagnie Pharmacia, est probablement la plus connue des résines
de filtration sur gel. Il est constitué de dextran (un polymère linéaire de glucose) dont les
fibres sont réticulées à l'épichlorohydrine pour former les microbilles poreuses. Les
différentes variantes (G-25, G-100, G-200, etc.) sont obtenues en contrôlant la réaction de
réticulation. Les variantes ont différentes capacités de rétention d'eau, porosités, domaines de
fractionnement, limites d'exclusion, etc.
Le Sephadex LH, toujours de Pharmacia, est un dérivé hydroxypropylé du Sephadex G. Il est
stable en présence de solvant organiques purs ou mélangés avec de l'eau.
Le Bio-Gel P est produit par Bio-Rad. C'est un polymère d'acrylamide réticulé avec du
bisacrylamide.
Le Sephacryl, de Pharmacia, est plus ou moins l'équivalent du Bio-Gel P, sauf qu'il c'est un
mélange composite de dextran et d'acrylamide.
Le Sepharose, de Pharmacia, est une préparation d'agarose gélifiée en microbilles et
débarrassée de la grande majorité de ses contaminants chargés. La stabilité de cette
matrice est due aux liens hydrogène qui lient les polymères d'agarose entre eux. On peut
contrôler le domaine de fractionnement en modulant la quantité d'agarose qu'on fait

40
Partie IV Chromatographie d’exclusion stérique

gélifier. Les limites d'exclusion sont extrêmement élevées, souvent de l'ordre du million
de Da.

Figure 4. Structure du gel Sephadex LH

4. Applications de la CES
Il existe deux grands types d'application des filtrations sur gel couramment utilisé en
biochimie: les séparations de groupe, pour obtenir une séparation grossière, et le
fractionnement moléculaire pour une séparation fine.
La séparation de groupe consiste à séparer les petites molécules des grosses, en deux
groupes distincts: les grosses molécules qui sortent dans le volume mort et les autres qui
sortent plus tard. Ainsi, la filtration sur gel peut servir au "dessalage" de solutions: séparation
brute des protéines d'une solution des molécules de petit poids moléculaire comme les sels
(d'où le terme "dessalage"), sucres, acides aminés, etc. Dans ce cas on utilise une résine ayant
un petit domaine de fractionnement où toutes les protéines iront dans le volume mort tandis
que les sels et autres petites molécules pourront entrer dans les pores du gel. Il est alors facile
de recueillir le volume mort contenant les protéines débarrassées des petites molécules.
Dans le fractionnement moléculaire, on sépare un mélange complexe (généralement de
protéines) en plusieurs fractions de poids moléculaire spécifique. Le principal usage de ce
type de procédure est la détermination de la masse moléculaire des protéines, ce qui est une
application "analytique". C'est une technique assez précise qui permet de travailler sur des
molécules non dénaturées et possédant encore leur structure quaternaire.

41
Partie IV Chromatographie d’exclusion stérique

On peut aussi se servir du fractionnement moléculaire pour purifier une protéine

donnée, ce qui est donc une application "préparative".

Références bibliographiques
Filtration, G., 1991. Principles and methods. Handbooks from Amersham Biosciences.[Can
be downloaded from the following website: http://kirschner. med. harvard.
edu/files/protocols/GE_gelfiltration. pdf].

Huber, L., 1994. Principles and techniques of practical biochemistry. Wiley Online Library.

Mahuzier, G., Hamon, M., 1978. abrégé de chimie analytique, méthodes de séparation-tome
2, ed. masson.

Rouessac, F., Rouessac, A., Cruché, D., 2004. Analyse chimique-6ème édition-Méthodes et
techniques instrumentales modernes: Méthodes et techniques instrumentales modernes.
Dunod.

Site internet

ww.123bio.net/cours/chromato/exclusion.html

http://www8.umoncton.ca/umcm-gauthier_didier/siitub/chrfilgel.html

42
 Partie V :
Chromatographie
planaire
Partie V Chromatographie planaire

Partie V : Chromatographie
planaire

1. Généralités
La chromatographie planaire est une technique complémentaire de la CLHP et qui
peut être une étape préliminaire à cette dernière, puisque le principe de la séparation et la
nature des phases reste le même, seul diffère la mise en œuvre des deux techniques.
Les méthodes de chromatographie planaire comprennent :
 La chromatographie sur papier
 La chromatographie sur couche mince
 L’électrochromatographie

Les méthodes de chromatographie planaires utilisent une couche plane, relativement

mince d’un matériau rigide ou déposé sur une surface de verre, de plastique ou de métal.

La phase mobile se déplace à travers la phase stationnaire par capillarité, par gravité ou
encore sous l’action d’une tension électrique.

2. Principe
Le principe de la séparation par chromatographie planaire diffère selon qu’il s’agit
d’une chromatographie sur papier ou d’une chromatographie sur couche mince, même si le
mode opératoire reste pratiquement pareil pour les deux types de chromatographie planaire.
 La chromatographie sur papier est une chromatographie de partage basée sur la
différence de solubilité des espèces à séparer. La phase stationnaire est formée par
l'eau liée ou adsorbée aux molécules de cellulose du papier. La phase mobile est un
liquide, l’éluant. Si une espèce est plus soluble dans l’éluant, elle se déplace plus
rapidement qu’une espèce qui l’est moins et inversement.
 La chromatographie sur couche mince est semblable à la chromatographie sur colonne
c’est une chromatographie d'absorption; elle est basée sur la différence d'adsorption
sur la phase stationnaire, des espèces à séparer entraînées par l'éluant. La phase
stationnaire est un solide, généralement de la silice.

43
Partie V Chromatographie planaire

3. Mode Opératoire
La mise en œuvre de la chromatographie planaire se fait en trois étapes :
3.1. Dépôt de l’échantillon : On dépose habituellement une goutte de solution contenant
0,01 à 0,1% de l’échantillon de 1 à 2cm du bord de la plaque.
Pour une meilleur séparation la tache doit avoir un diamètre minimum, environ
5mm pour une analyse qualitative et moins pour une analyse quantitative.
3.2. Développement de la plaque : (Processus au cours duquel l’échantillon est entrainé
par une phase mobile à travers la phase stationnaire)
 Marquer avec un crayon l’endroit ou est placée la goutte de l’échantillon.
 Après évaporation du solvant de
l’échantillon, la plaque est placée dans un
récipient clos que l’on sature par de la
vapeur du solvant du développement.
 On immerge une extrémité de la plaque
dans ce solvant, en prenant soin d’éviter
tout contact direct entre l’échantillon et le
solvant.
 Le solvant grimpe le long de la plaque par
capillarité en emportant l’échantillon.
 Lorsque le front de solvant a parcouru la moitié ou les 2/3 de la longueur de la plaque
on la retire du récipient et on la sèche.
3.3.Localisation de l’analyte : Plusieurs méthodes sont employées pour localiser les
constituants de l’échantillon après leur séparation :
 Méthodes s’appliquant à la plupart des mélanges organiques, consistent à vaporiser
une solution d’iodes ou d’acide sulfurique qui réagissent tous deux avec les
composés organique pour donner naissance à des produits sombres
 Méthodes s’appliquant à des espèces particulières
Exp : La ninhydrine pour localiser les acides aminés
 Une autre méthode de détection est basée sur l’incorporation d’un matériau
fluorescent à la phase stationnaire. Après développement, la plaque est examinée
sous un éclairage ultraviolet. La plaque sera fluorescente partout, sauf aux
endroits où se trouvent les constituants de l’échantillon.

44
Partie V Chromatographie planaire

4. Paramètres de la chromatographie planaire

4.1.Facteur de retard
En chromatographie planaire chaque soluté est défini par son facteur de retard Rf

Rf=dR/dM

Où dR : distance parcourue par le soluté

dM : distance parcourue par le front de solvant

dM

dR

Echantillon 1

Front du solvant
Echantillon 2

WB WA

Ligne de départ

4.2.Facteur de rétention
tm et tr correspondent aux temps nécessaire pour que la phase mobile et le soluté se
déplacent d’une distance donnée dans ce cas dR
Pour la phase mobile :

tm= dR /u (u : La vitesse de la phase mobile)

Le soluté n’atteint ce point que lorsque la phase mobile s’est déplacée de la

distance dM , on a donc :

tr= dM /u

𝑡𝑟 −𝑡𝑚
En combinant la relation 𝑘′ = avec les deux précédentes on trouve :
𝑡𝑚

45
Partie V Chromatographie planaire

′
𝑑𝑅 − 𝑑𝑀
𝑘 =
𝑑𝑅
Le facteur de rétention k’ peut être exprimé en terme de facteur de retard.

′
𝟏 − 𝑹𝒇
𝒌 =
𝑹𝒇
4.3. Nombre de plateaux théoriques

On définit l’efficacité N de la plaque pour un composé dont la distance de

migration est dR et le diamètre du spot W par la relation :

𝑑𝑅 2
𝑁=[ ]
𝑊

La hauteur équivalente à un plateau théorique est donc égale à :

𝑑𝑅
𝐻=
𝑁

4.4. Résolution
La résolution entre deux spot successive est définit par la relation :

𝑑𝑅2 − 𝑑𝑅1
𝑅=2
𝑊1 + 𝑊2

5. Application de la chromatographie planaire

 Application qualitative : L’identification d’une substance inconnue peut être
présumée en comparant son Rf avec celle de composés connus, déposés sur le
même chromatogramme. Cependant, une confirmation s’avère toutefois toujours
nécessaire.
 Application quantitative : Il existe différentes méthodes qui permettent une
analyse quantitative d’un soluté en chromatographie planaire.
 Une estimation semi-quantitative de la quantité d’un composant présent peut être
obtenue par comparaison de l’aire de la tache avec celle d’un étalon.

46
Partie V Chromatographie planaire

 La mise en solution la tache et détermination de sa concentration par une méthode

appropriée (spectrophotométrie, spectrofluorimétrie...).
 Mesure des propriétés de réflexion ou de fluorescence de la tache à l’aide d’un
densimètre.
 Etude préliminaire à la chromatographie liquide haute performance
(CCM) : La CCM permet la mise au point de système chromatographique pouvant
être ensuite transposés et adaptés sous certaines conditions à la chromatographie sur
colonne.

Références bibliographiques

Burgot, G., Burgot, J.-L., 2011. Méthodes instrumentales d'analyse chimique et applications:
Méthodes chromatographiques, électrophorèses, méthodes spectrales et méthodes thermiques.
Lavoisier.

Poole, C.F., 2003. The essence of chromatography. Elsevier.

Rouessac, F., Rouessac, A., Cruché, D., 2004. Analyse chimique-6ème édition-Méthodes et
techniques instrumentales modernes: Méthodes et techniques instrumentales modernes.
Dunod.

47
 Partie VI :
Chromatographie en
phase gazeuse
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

Partie VI : Chromatographie en
phase gazeuse

1. Introduction
Le concept de chromatographie en phase gazeuse a été introduit par Archer Martin et
Richard Synge (Anglais) en 1941. C’est une méthode de séparation des composés
gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. C'est
une chromatographie de partage dans laquelle la phase mobile est un gaz. Elle constitue
la méthode la plus puissante et la plus fine pour séparer, identifier et quantifier les corps
gazeux ou volatilisables. Elle permet ainsi l'analyse de mélanges éventuellement très
complexes dont les constituants peuvent différer de façon considérable par leur nature et
leur volatilité.

Il existe deux types de chromatographies en phase gazeuse (CPG) :

 Chromatographie gaz-solide (CGS) : C’est une chromatographie

d’adsorption, peu utilisée en raison des trainées dans les pics d’élutions
provoquées par la non linéarité du processus d’absorption
 Chromatographie gaz-liquide (CGL) : basé sur le partage des constituants à
séparer (les solutés) entre une phase gazeuse mobile inerte appelé gaz vecteur
et une phase liquide fixée sur la surface d’un support poreux inactif. Cette
dernière est très utilisée dans de nombreux domaines, son nom est parfois
abrégé en chromatographie en phase gazeuse.

2. Principe
 L’échantillon est vaporisé et injecté en tête de colonne. L’élution est assuré par un flux
de gaz inerte qui sert de phase mobile et qui n’interagit pas avec l’échantillon ; sa
seule fonction est le transport de l’analyte dans la colonne. Les gaz utilisés comme
phase mobile sont le dihydrogene ou l'helium ou le diazote ou le dioxyde de
carbone. La fonction du gaz phase mobile est d'être le vecteur d'entrainement à travers
la colonne des molécules analytes lorsqu'ils se trouvent à l'état gazeux en état de non
rétention par la phase stationnaire. A la sortie, la molécule est fragmentée puis un

48
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

détecteur mesure la quantité de débris qu'il envoie comme signal sur une table
traçante.

 On obtient un spectre où apparaissent des pics d'intégration proportionnelle à la

quantité de produit injecté. Le pic est caractérisé par son temps de rétention, porté en
abscisse.

 Selon la nature de la colonne (polaire ou pas) et de la température du four, du choix de

gradient de température, le temps de rétention est variable.

Quels sont les facteurs de séparation des analytes en CPG ? Ils sont de deux
ordres :

a) la volatilité (il suffira de comparer les valeurs de point d'ébullition des différents
analytes à séparer) différente des analytes. La phase mobile est un gaz, elle ne permet
donc l'avancement que des analytes qui sont à l'état gazeux à un instant donné. Ainsi, plus
un analyte est volatil, plus son élution sera rapide toutes choses étant égales par ailleurs.

b) les interactions (faibles) plus ou moins importantes entre les analytes et la phase
stationnaire :

- interactions faibles de surface de type adsorption en CPG gaz-solide

- solubilisations différentielles dans la phase stationnaire liquide en CPG gaz-liquide

On retiendra donc le couple (volatilité de l'analyte, interactions analyte-phase

stationnaire) comme étant le couple permettant de caractériser le comportement d'un
analyte.

3. Grandeurs de rétentions
3.1. Volume de rétention
La phase gazeuse mobile est compressible, la grandeur volume de rétention est utilisée
avec un facteur de correction plutôt que la grandeur temps de rétention.

Vr = tr . D
Vr : Volume de rétention ou d’élution d’un soluté retenu par la phase stationnaire.
tr : temps de rétention de ce soluté
D : Débit de la phase mobile (cm3/s) ou (ml/s).

Vm = tm . D

49
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

Vm : Volume mort ; volume de la phase mobile ou d’un soluté non retenu par la
phase stationnaire.
tm : temps mort ; temps de rétention d’un soluté non retenu par la phase
stationnaire.

Vr’= Vr - Vm
Vr’ : Volume de rétention réduit
3.2. Volume de rétention réduit corrigé (Vn)

Pour tenir compte du faite que le gaz vecteur est compressible et que la pression dans
la colonne augmente entre l’entrée et la sortie de la colonne et donc que le débit augmente,
Archer Martin a introduit le facteur de correction j

Vn = j . Vr’= j . tr’ . D
Vn : Volume de rétention réduit corrigé (volume net)
j = 3/2. [(P2-1)/(P3-1)]

P = Pe / Ps
j : Facteur de compression ou facteur de perte de charge
Pe : pression d’entrée
Ps : pression de sortie
3.3. Indice de rétention (I)
Kovats en 1958, a proposé l’indice de rétention I comme paramètre d’identification
des solutés. Le chromatogramme en régime isotherme d’un mélange de n alcane montre que
les log (t'r) croissent linéairement en fonction du nombre n d'atomes de carbone (C)
independamment du remplissage de la colonne, de T et des autres conditions de chromatogr.

I (n alcane) = 100 x nbre d'atomes de carbon

I (soluté) peut être obtenu a partir d'un mélange du soluté et d'au moins 2 alcanes normaux
(hydrocarbures aliphatiques linéaires saturés CnH2n+2) qui encadrent I (soluté).

Explication
soluté A dans phase mobile → soluté A dans phase stationnaire ΔrG0

pour qu'il y ait séparation chromatographique, il faut ΔrG0 < 0

50
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

K = [A]Stat / [A]Mob

K est donc la constante d'équilibre et le rapport de distribution

puisque ΔrG0 = RT. ln K (cf. chapitre "Equilibre chimique")

et que K = β. k' = β. tr' / tm (cf. chap. Notions fond. Chromatographie)

ln tr' = ln K + ln ( tm / β) ; ln tr' = ΔrG0 / RT + ln ( tm / β) pour A

La courbe ln tr' en fonction de n des n alcanes A, B, C, ... varie comme (ΔrG0 ) à T° cste.

Il en est de même pour log tr

'

Figure 1. Droite de Kovats

des 6 n alcanes de C4à C9 : log (tr'(n))= f(n) = a . n + b

La pente de la droite dépend de la colonne et du réglage du chromatographe.

L'indice de rétention ne dépend que de la phase stationnaire.

Indice de rétention du toluène =749

51
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

4. Instrumentation

Un appareil de chromatographie en phase gazeuse comporte trois parties : injecteur,

colonne et détecteur (figure 2) à travers lesquels un gaz vecteur entraîne les substances d’un
mélange à séparer. Le gaz vecteur le plus utilisé est l’hélium, les autres sont l’hydrogène,
l’azote ou l’argon. Il doit être très pur et surtout ne contenir ni oxygène, ni eau. Le débit du
gaz est ajusté par un régulateur.

Figure 2. Une installation de CPG

4.1. Échantillons
Les limites de sensibilité sont, selon les appareils, de l’ordre du nanogramme et même du
picogramme. Le traitement de l’échantillon varie selon les substances analysées :

- Lorsque les solutés sont directement volatilisables, les substances sont solubilisées dans un
solvant et chromatographiées.

- Lorsque les solutés ne sont pas volatils à la température du chromatographe ou bien sont
décomposés à cette température, il faut les transformer en dérivés volatils stables : les acides
aminés sont ainsi estérifiées par le butanol, les acides gras estérifiés par le méthanol, les oses
réduits en alditols, puis acétylés,…

4.2. Injecteur
Il sert à l’introduction du mélange à analyser dans la colonne. Cette opération est
faite :

52
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

 A l’aide d’une microseringue pour les liquides et les solutions.

 A l’aide d’une vanne à boucles pour les mélanges gazeux.

En règle générale, la chambre d’injection doit être à une température plus élevée que
celle de la colonne pour faciliter l’évaporation des échantillons. La température idéale est
celle qui est 20°C plus élevée que le point d’ébullition de la substance la moins volatile.
Le choix de l’injecteur est dicté par le type de colonne utilisée (remplie ou capillaire) et
par la nature des produits à séparer (leur résistance à la décomposition lorsqu’ils sont soumis
à de hautes températures).

Il y a essentiellement deux techniques d’injection, si on ne tient pas compte de colonne

d’une fraction de ce qui est injecté (split / splitless). Cette dernière technique est utilisée avec
les colonnes capillaires.

4.3. Colonnes
Elles peuvent être métalliques, en plastique pour des séparations à basse température, en
verre et joints Téflon. Diverses formes ont été utilisées : rectilignes, en U, en spirales (la plus
répandue).
Il existe deux grands types de colonnes avec des variantes (Figure 3) :
- Les colonnes remplies ou à garnissage (packed).

- Les colonnes capillaires (open tubular)

Figure 3. Colonnes en CPG

Représentation à la même échelle des sections des trois types de colonnes. a) Colonneremplie de 2 mm de
diamètre ; b) colonne capillaire « 530 » de 0,53 mm; c) colonne capillaire de 0,1 mm; détail d’une colonne
capillaire. À cette échelle, l’épaisseur de phase stationnaire serait à peine visible ; d) colonnes commerciales de
50 m de longueur.

53
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

 Caractéristiques des colonnes remplies ou à garnissage (packed)

o Diamètre interne : 1/8 ’’ (3,2 mm) ou ¼ ‘’ (6,4 mm).
o Longueur : 0,5 à 3 mètres.
o Tube : acier inoxydable (assez inerte et bon conducteur de chaleur) ou verre
(inerte mais mauvais conducteur de chaleur).
 Caractéristique des colonnes capillaires
o Diamètre interne : de 0,1 à 2 mm.
o Longueur : de 15 à 100 m.
o Tube : silice fondue recouverte d’une mince couche de polyimide.
o Grande efficacité : 200000 plateaux (≈ 1000 pour une colonne remplie). A
noter que le terme de remplissage A de l’eqt de Van Deemter est ici nul.
o coût, fragilité (casse, oxydation), faible capacité : injecteur split-splitless
Influence de l’épaisseur du film (colonne capillaire)
Pour comparer ou prévoir le comportement des colonnes capillaires, il est utile de
calculer le rapport de phase β = Vm/Vs. En appelant dC le diamètre interne de la colonne et e
l’épaisseur du film déposé.

Nous avons k’= K/β (k’ : facteur de capacité)

Le volume de la phase mobile est égal à Vm = 2πr2L (où L est la longueur de la colonne)
Le volume de la phase stationnaire est égal au volume de la couronne d'épaisseur e soit
Vs = 2πreL.
2𝜋𝒓2𝑳 𝑟 𝑑C
On obtient donc pour le rapport de phase : 𝛽= = = (eq. 1)
2𝜋𝑟 𝒆𝑳 2𝑒 4𝑒
tr−tm K 4Ke
et par conséquent : k’ = = = (eq. 2)
tm 𝛃 d
𝐾 4𝐾𝑒
𝑡𝑟 = 𝑡𝑚 1 + = 1+ (eq. 3)
𝛽 𝑑

54
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

D'après l'eq. 3, on peut déduire que le temps d'analyse (tr) augmente si :

- le diamètre intérieur de la colonne capillaire (d) diminue
- l'épaisseur du film de phase stationnaire (e) augmente.
En outre s'il n'y a aucune affinité entre un produit et la phase stationnaire soit K=0, on
a tr = tm , ce qui est le cas de l'air ou en première approximation du méthane.
On peut déduire de l'eq. 2 que :
- pour bien analyser une substance volatile, il faut augmenter k', donc diminuer le diamètre
(d) de la colonne et (ou) augmenter l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).
-pour bien analyser une substance peu volatile, il faut diminuer k', donc augmenter le diamètre
(d) de la colonne et (ou) diminuer l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).

En pratique si les composés à séparer sont volatils, on choisira une colonne dont le
rapport β sera petit (< 100), et inversement. Une colonne de 320 mm dont la phase
stationnaire fait 1 mm d’épaisseur, conduit à β = 80 alors que pour une colonne de 250 mm et
une épaisseur de phase de 0,2 mm, β = 310.

Remarque : β, accessible à partir des caractéristiques physiques de la colonne permet de

calculer les coefficients de partage K dont les valeurs sont généralement très grandes (1 000
par exemple), ce qui est dû à la nature de la phase mobile qui est ici un gaz.

4.4. Phases stationnaires

Pour les colonnes remplies, la technique d’imprégnation, de mise en œuvre très
simple, permet de choisir de nombreux composés organiques peu volatils à usage de phases
stationnaires. Mais, pour les colonnes capillaires, les contraintes de fabrication imposent un
choix beaucoup plus limité. Les phases actuelles correspondent à deux principaux types de
composés : les polysiloxanes et les polyéthylèneglycols, chaque catégorie pouvant faire l’objet
de modifications structurales mineures (Figure 4).

55
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

Figure 4. Structure des polysiloxanes (silicones), et des polyéthylèneglycols.

4.5. Détecteurs

Pratiquement toute propriété physique, et quelquefois chimique, des solutés peut servir à
constituer un système de détection.

4.5.1. Catharomètre

Le catharomètre est le premier détécteur à être monté sur une CPG commerciale. On
mesure la différence de conductibilité entre le gaz vecteur seul et le gaz vecteur chargé
d’échantillon.

Pour obtenir la plus grande réponse pour un soluté donné, il est donc nécessaire qu’il y
ait la plus grande différence possible entre la conductivité de ce soluté et celle du gaz porteur.
À cet effet, on utilise pratiquement toujours l’hydrogène (danger d’explosion) ou l’hélium
comme gaz vecteur.

56
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

Figure 5. Catharomètre

4.5.2. Détecteur à ionisation de flamme (FID)

C’est le détecteur par excellence de la CPG actuelle. Le courant gazeux issu de la

colonne pénètre dans la flamme d’un petit brûleur alimentée par un mélange d’hydrogène et
d’air. Ce détecteur détruit l’échantillon dont la combustion produit des ions et particules
chargées, responsables du passage d’un courant ionique extrêmement faible (10−12 A) entre
deux électrodes (ddp de 100 à 300V). L’extrémité du brûleur sert d’électrode de polarisation
(masse). La seconde électrode, de forme annulaire, entoure la flamme. Le signal est amplifié
par un électromètre en une tension mesurable (Figure 6).

4.5.3. Détecteur thermoionique (NPD)

Ce détecteur est très sensible aux composés azotés (N) ou phosphorés (P). Il comporte
un petit cylindre en céramique dopée avec un sel alcalin (ex. sulfate de rubidium) auquel on
applique une tension électrique pour entretenir un petit plasma (800 ◦C) alimenté par
combustion d’un mélange air/hydrogène (figure 6). À la différence du FID la flamme est plus
petite. Les composés contenant N ou P donnent, assez spécifiquement, des fragments de
décomposition transformés en ions négatifs. Ces ions sont recueillis sur une électrode
collectrice. Le diazote de l’air est inactif. La sensibilité est typiquement de 0,1 pg/s pour N ou
P.

57
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

Figure 6. Détecteur FID (a) et détecteur NPD (b).

4.5.4. Détecteur à capture d’électrons (ECD)

Une source telle que le tritium (3H) ou le (63Ni) envoie des électrons libres dans le
détecteur. Quand ce détecteur est traversé par des substances ayant une affinité pour les
électrons libres, il se produit des ions qui, comme pour le détecteur à ionisation de flamme,
dans le champ électrostatique existant, sont recueillis par une électrode et forment un courant
d’ionisation à amplifier convenablement.

Figure 7. Détecteur à capture d’électrons (ECD)

58
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

5. Optimisation d’une analyse CPG

En CPG il y a quatre paramètres opérationnels pour une phase stationnaire donnée : L,
longueur de la colonne et u, vitesse de la phase mobile (qui conditionnent N), T température
de la colonne et β rapport de phase (qui conditionnent k). Les réglages du chromatographe
permettent d’agir sur T et sur u, donc sur l’efficacité et sur les facteurs de rétention.

Figure 8. Efficacité en fonction de la nature et de la vitesse linéaire du gaz vecteur.

Ces courbes typiques de van Deemter montrent que l’hydrogène est, parmi les 3 gaz
étudiés, celui qui permet les séparations les plus rapides, à performances égales, tout en
donnant plus de souplesse en ce qui concerne le débit, ce qui est très utile en mode
programmation de température. Noter l’augmentation de la viscosité de ces gaz avec la
température T. On constate aussi que l’hélium est plus visqueux que le diazote, à température
égale.

Références bibliographiques
Burgot, G., Burgot, J.-L., 2011. Méthodes instrumentales d'analyse chimique et applications:
Méthodes chromatographiques, électrophorèses, méthodes spectrales et méthodes thermiques.
Lavoisier.

Heftmann, E., 1983. Chromatography: fundamentals and applications of chromatographic and

electrophoretic methods. P. A, Fundamentals and techniques.

Mendham, J., Denney, R., Barnes, J., Thomas, M., 2005. Analyse chimique quantitative de
Vogel. 1ère Edition edn. De Boeck.

59
Partie VI Chromatographie en phase gazeuse

Perrin-Drouin, Y., 1958. Chromatographie en phase gazeuse: méthode de partage gaz-liquide.

Poole, C.F., 2003. The essence of chromatography. Elsevier.

Rouessac, F., Rouessac, A., Cruché, D., 2004. Analyse chimique-6ème édition-Méthodes et
techniques instrumentales modernes: Méthodes et techniques instrumentales modernes.
Dunod.

Skoog, D.A., Holler, F.J., Nieman, T.A., 2003. Principes d'analyse instrumentale. De Boeck
Supérieur.

Sites internet

ftp://ftp.mn-net.com/francais/Flyer_Catalogs/Chromatographie/Catalogue-FR/KATFR200001-5CPG-
www.pdf

http://chemphys.u-strasbg.fr/mpb/teach/chromato3/chromato3.pdf.

http://licence3-chimie.u-bourgogne.fr/cours_supports/ CM_Denat_2010_Chromatographie.pdf

http://www.masterchimie1.u-psud.fr/Chromatoweb/CPG.html

60
 Partie VII :
Electrophorèse
capillaire
Partie VII Chromatographie en phase gazeuse

Partie VII : Electrophorèse

capillaire

1. Introduction

L'électrophorèse capillaire représente une famille de techniques qui utilisent des

capillaires étroits (diamètre interne de 10 à 200 mm) pour réaliser avec une très grande
efficacité la séparation électrophorétique de molécules de tailles très variables. Le domaine
d'application de cette technologie est très vaste et elle permet d'analyser des macromolécules
complexes telles que les protéines et les acides nucléiques ou des solutés de petite taille
comme les médicaments organiques, les anions et cations inorganiques. Des voltages très
importants (plusieurs dizaines de kV) sont utilisés pour séparer les molécules sur la base de
leur différence de rapport charge/taille.

2. Instrumentation
L'instrumentation est relativement simple et comporte les éléments principaux suivants
: un générateur de haut voltage, deux réservoirs de tampon et un capillaire que traverse un
système optique de détection relié à un module d'acquisition des données (figure
1). L'ensemble de l'instrument est contrôlé par un ordinateur.

Figure 1. Schéma montrant l’appareillage d’une électrophorèse capillaire

61
Partie VII Chromatographie en phase gazeuse

 Tube capillaire en silice fondue :

 50 à 100 µm de diamètre interne recouvert de polyimide à l’extérieur :
souplesse et régidité
 Les extrémités du capillaire plongent dans un réservoir de tampon
 Le capillaire se rempli de solution tampon
 Détection :
 Détection en ligne : fenêtre de détection au niveau d’une portion
capillaire dépourvu de polyimide
 Les systèmes de détection employés sur le capillaire sont issus des
technologies développées en chromatographie liquide à haute
performance. Les détecteurs les plus utilisés en électrophorèse
capillaire sont ceux utilisant les propriétés spécifiques des molécules
comme l’absorption dans l’ultraviolet, la fluorescence, la spectrométrie
de masse, l’électrochimie, la radiométrie et la spectroscopie Raman. Le
système de détection le plus simple et le plus utilisé en électrophorèse
capillaire est l’absorption en ultraviolet. La limite de détection de
l’absorption en ultraviolet, située entre 10-13 et 10-15 M, est
généralement plus élevée que celle des autres détecteurs de propriétés
spécifiques.
 Electrodes :
 Il existe une électrode de platine dans chaque flacon, qui sont reliées à
un générateur de tension (0 à 30 KV).

3. Principe
L’électrophorèse permet la séparation de molécules ou particules chargées. La
séparation des molécules s’effectue en appliquant un champ électrique à travers un fluide
conducteur contenant les substances à séparer. La vitesse de migration, appelée mobilité
électrophorétique, dépend de la nature, de la charge ainsi que du ratio charge/masse des
molécules. L’application de l’électrophorèse capillaire à l’étude des complexes est possible
lorsque les charges nettes portées par la protéine, le polysaccharide et le complexe ont des
valeurs suffisamment différentes.

3.1. Théorie de l’électrophorèse

Force agissant sur un ion sphérique de rayon r et de charge Q :
 Force électrique : F = QE, imprime à l’ion une vitesse croissante.

62
Partie VII Chromatographie en phase gazeuse

 Force de frottement : F’= 6πr𝛈v (loi de Stockes) qui s’applique en

sens inverse de F

A l’équilibre F = F’et la vitesse devient constante (v) ; soit QE = 6πr𝛈ν

𝑸𝑬
𝒗= (eq. 1)
𝟔𝛑𝐫𝛈

La vitesse dépend donc du :

 Champ électrique
 Charge
 Taille
 Viscosité

Les espèces présentes dans l’échantillon sont soumises à deux effets principaux qui se
manifestent pour les ions comme pour les molécules ou les micelles. Il s’agit d’une part de
leur mobilité électrophorétique propre et d’autre part du flux ou écoulement électroosmotique,

a) Mobilité électrophorétique (μe) : égale à la distance parcourue par la particule

dans l’unité de temps sous l’influence d’un champ électrique.

𝝂 𝑸
𝛍e = = (𝒆𝒒. 𝟑)
𝑬 𝟔𝝅𝒓𝜼

𝑲𝑩 𝑻
𝒓= (𝒆𝒒. 𝟒)
𝟔𝝅𝜼𝑫𝒎
r : rayon de Stock
KB : constante de Boltzman

Dm : coefficient de diffusion de l’analyte

La charge Q de la molécule est fonction du pH isoélectrique de la particule et du pH

du solvant, on appel pH isoélectrique d’une particule, le pH pour lequel cette particule ne
migre pas dans un champs électrique. La différence pH – pHi détermine le signe de la charge
Q d’une particule :

si pH > pHi charge nette négative (anion) migration vers l'anode

si pH < pHi charge nette positive (cation) migration vers la cathode

63
Partie VII Chromatographie en phase gazeuse

si pH = pHi charge nette nulle pas de migration

2 -1 -1
On affecte à la mobilité μe (cm V s ) le signe (+) ou (-) selon la nature de la charge
portée; elle est nulle pour une espèce sans charge nette.

b) Mobilité électro-osmotique — électro-osmose (μeos) :

La mobilité électro-osmotique μeos est due à l’ionisation de la paroi interne du

capillaire à partir du pH 2,5, les groupements silanols de la silice du capillaire vont s’ioniser
et se charger (-), d’autant plus que le pH sera élevé. Pour respecter l’électroneutralité, les
cations de l’électrolyte vont s’amasser vers la paroi et les anions seront repoussés.

On va assister à la formation d’une double couche (figure 2):

 1 Statique (+) solidement fixée à la paroi : c’est la couche de Stern.

 1 Diffuse : c’est la couche de Gouy-Chapman

Entre ces deux couches on a un potentiel ξ ( zêta ) qui caractérise la densité de charge
de la surface du capillaire. Quand on applique une tension, les cations de la couche diffuse
vont être entrainés vers la cathode et entrainer avec eux tout l’échantillon. Ces ions étant
solvatés par des molécules d’eau, il apparaît un flux d’électrolyte qui se dirige dans le même
sens. Plus au coeur de la solution, le champ électrique provoque la migration des cations vers
la cathode. Les anions sont aussi entraînés : ils progressent « contre-électro-osmotiquement »

Ce flux de cations s’appelle le flux électroosmotique µeos. Il est caractéristique de

l’électrolyte (nature, pH, force ionique) mais indépendant de la tension appliquée. Plus le pH
sera élevé, plus la paroi sera ionisée et plus ξ sera élevé ainsi que la mobilité.

 A pH alcalin ont aura une mobilité maximum.

 Au contraire, à un pH de 2,5-3, la mobilité sera faible.

NB : En fait, plus la force ionique est élevée, et plus la couche diffuse a une épaisseur réduite
et plus le mouvement sera faible.

On définit µeos par la relation : µeos = 𝝂eos /E = 𝝂eos L/V (𝒆𝒒. 𝟓)

64
Partie VII Chromatographie en phase gazeuse

Pour calculer µeos on doit déterminer veos. Celle-ci correspond à la vitesse

d’écoulement dans l’électrolyte des espèces sans charge globale. On y accède à partir du
temps de migration tmn que met un marqueur neutre à usage de traceur pour parcourir la
distance effective l du capillaire, veos = l/tmn (𝒆𝒒. 𝟔). On choisit comme marqueur une
molécule organique, non polaire au pH de l’électrolyte utilisé, et facilement détectable par
absorption dans le proche UV (ex. acétone, oxyde de mésityle ou alcool benzylique).

Figure 2. Effet de la double couche sur l’apparition d’un flux électro-

osmotique dans un capillaire rempli par un électrolyte.

c) Mobilité apparente (µapp)

La mobilité apparente correspond à la vitesse réelle de migration des molécules au sein
du capillaire et correspond à la somme de la mobilité électrophorétique et de la mobilité
électroosmotique. En électrophorèse capillaire, le temps de migration d’un analyte dépend
donc de sa mobilité électrophorétique et de la mobilité du flux.

vapp= ve + veos (eq. 7)

vapp est aisément calculable à partir de l’électrophorégramme à partir de l, longueur utile du

capillaire entre les points d’injection et de détection et de tm, son temps de migration.

vapp est donnée par la relation : vapp = l/tm (𝒆𝒒. 𝟖)

La mobilité électrophorétique apparente µapp, est définie par l’eq. 9, est telle que :

𝒍𝑳
µapp = vappE= vapp LV par conséquent on a : µapp =
𝒕𝒎 𝑽
(𝒆𝒒. 𝟗)

65
Partie VII Chromatographie en phase gazeuse

En combinant le flux électro-osmotique de l’électrolyte et la mobilité apparente il est donc

possible de calculer la mobilité électrophorétique vraie des espèces porteuses de charges. À
partir de l’eq. 7, on écrira :

µe = µapp − µeos (𝒆𝒒. 𝟏𝟎)

soit :

𝟏 𝟏
µ𝒆 = 𝑳 · 𝒍/𝑽 − (𝒆𝒒. 𝟏𝟏)
𝒕𝒎 𝒕𝒎𝒏

3.2. Ordre de migration

 On a d’abord les petites espèces avec une µe importante et accélérée par le flux.
 Puis les espèces plus grosses avec une µe > 0
 Puis les molécules neutres avec un µe = 0 qui migrent à la vitesse du flux.
 Les anions enfin qui seront entrainés vers la cathode par le flux (et donc à contre-sens,
les gros d’abord puis les petits (figure 3).

Figure 3. Ordre d’élution des molécules selon leur charge et taille

66
Partie VII Chromatographie en phase gazeuse

4. Efficacité et résolution

Le nombre de plateaux théoriques ou efficacité en électrophorèse capillaire est donné

𝝁𝒆 𝝂𝒍
par : 𝑵= (𝒆𝒒. 𝟏𝟐)
𝟐𝑫𝒎 𝑳

l : la longueur parcourue par le soluté

L : la longueur du capillaire.

𝒍
𝑯= (𝒆𝒒. 𝟏𝟑)
𝑵

Selon cette équation, l’efficacité de la séparation est seulement limitée par la diffusion
et est proportionnelle à l’intensité du champ électrique.

L’efficacité des séparations en électrophorèse capillaire est généralement plus grande

que celle d’autres méthodes de séparation tel que l’HPLC. Contrairement à l’HPLC,
l’électrophorèse capillaire n’implique pas de transfert de masse entre les phases.

Références bibliographiques
Ait-Adoubel, A., 2004. Nouvelles approches en électrophorèse capillaire pour
l'énantioséparation d'acides aminés aromatiques ou aliphatiques non dérivés.

Blessum, C., Jeppsson, J., Aguzzi, F., Bernon, H., Bienvenu, J., 1999. L’électrophorèse
capillaire: principe et applications au laboratoire de biologie clinique, Annales de Biologie
Clinique, pp. 643-657.

Girard, M., 2003. Etude qualitative et quantitative des interactions entre la β-lactoglobuline et
la pectine en système dilué. Université de Laval.

Rouessac, F., Rouessac, A., Cruché, D., 2004. Analyse chimique-6ème édition-Méthodes et
techniques instrumentales modernes: Méthodes et techniques instrumentales modernes.
Dunod.

Skoog, D.A., Holler, F.J., Nieman, T.A., 2003. Principes d'analyse instrumentale. De Boeck
Supérieur.

Sites internet

http://www.pharmaetudes.com/ressources/cours%20internat/section1/6-electrophorese-
capillaire.pdf

67